JPH02504224A - Ｍ‐１３フアージーｄｎａを精製する方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ−１３７フージーＤＮＡを精製する方法および装置サンガー（Ｓａｎｇｅｒ） 　Ｃ″’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、”　米国、第７４巻、 第５４頁〜第６３頁（１９７７年）ンによる配列決定の場合には、ＤＮＡ中に出 現する４つのるＤＮＡストランド中に実際に組込まれるが、それに続くデオキシ ヌクレオチドリン酸によシホスホジエステル架橋を形成する力がないので鎖はも はや成長しない。

配列決定のため分析すべきＤＮＡストランドを、分析すべきストランドの一端に 相補的でちる標識したＤＮＡの短かいフラグメント（プライマー）、ジデオキシ ヌクレオチド玉リン酸および６つの他の正電三リン酸塩と、ＤＮＡポリメラーゼ の存在で反応させると、プライマーから出発して測定すべきＤＮＡに対する相補 的ストランドが合成され、その鎖はジデオキシ化合物が組込まれる個所で切れる 。こうして４つのジデオキシヌクレオチド三す／酸のそれぞれ１つを有する４つ の付加物で一連の標識されたストランドが得られ、該ストランドは大きさによシ ｒルクロマトグラフイーによって分離し、その標識によシ可視的にされる。次に 、こうして得られた型から容易にＤＮＡの配列が測定される。

２゜方法の重大な欠点は、プライマーを構成しうるようにするために、差歯シ分 析すべきＤＮＡストランドの末端７２グメ／トの配列を決定しなければならない ことである。もう１つの欠点は、配列決定すべきＤＮＡの十分な量を利用するこ とが通常非常に困難であることである。

この難点は、Ｍ１３７アージ鋳型法（Ｊ、　”ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ１″ 、第１０１巻、第２０頁〜第７８頁（１９８３年〕）を用いると大体において避 けられる。この方法では、Ｍ１３ファージの２重鎖プラスミドが配列決定すべ＠ 　ＤＮＡのクローニングのためのベクターとして使用され、シラスミドが特定個 所で相応する制限エンドヌクレアーゼによシ切断され、切断部に公知方法で配列 決定すべきＤＮＡが挿入され、こうして得られたベクターが％Ｂ・コリ（Ｅ、　 Ｃｏ１１）にクローン化される。その際形成するＥ、コリＭ１３ファージが直接 に培地中へ分離され、ＤＮＡとして、配列決定すべきＤＮＡが存在する１本鎖の 組換えられた環状Ｍ　１３　ＤＮＡ　（Ｍ　１３−５ｓＤＮＡ　）を含有する。

このＤＮＡが挿入されて存在する切断個所に隣接するファージＤＮＡの配列は公 知でちるので、プライマーとして常にこの公知配列に相補的な配列を使用するこ とができ、どの配列決定すべきＤＮＡがプラスミド中へ挿入されたかは重要では ない。従って、唯１つのプライマー配列を用いて大多数のＤＮＡストランドを配 列決定することができる。

しかしこれの前提条件は、Ｅ＋コリから分離されたファージから、それに含まれ ているＤＮＡがそれを取シ囲むタンパク質不含で得られることである。従来この 精製は、ポリエチレングリコールで沈殿させ、次いでフェノールおよびクロロホ ルムで抽出することによって除タンパクし、最後にフェノール沈殿によってＤＮ Ａを濃縮することによって行なわれた（Ｍ　１３　Ｃ１口ｐｉｎｅ／　Ｄｉａｅ ｏ：ｃｙ　　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　　ｒｎｓｔｒｕ２ｔｉｏｎ　　ｕａｎｕａ ｌ　＋ｖ。

Ｂｅｔｈｅｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　１９８６年） ０この精製法は、該方法が極めて緩慢に進行し、オートメーション化できないと いう欠点を有する。

従って、本発明の課題は、この精製法を改善して、これらの欠点が除去され、方 法が著しく促進され、簡略化されるだけでなく、オートメーション化できるよう にすることである。

この！！題は本発明によシ最初に記載した種類の方法において、Ｅ、コリ細胞を 成長培地から酢酸でＭ１３ファージを沈殿させ、こうして得られた懸濁液をガラ ス繊維フィルターを通して濾過し、ガラス繊維フィルターをカオトロピツクイオ ンの溶液で処理することによって解決される。

本発明方法を実施するためには、Ｅ、コリ細菌を成長培地から遠心分離し、得ら れる上澄みに酢酸を加える。

使用される酢酸量は広い範囲で変えることができ、１％〜ｉｏｓの最終濃度が精 製ＤＮＡの実際に同じ収率を生じた。ポリエチレングリコールの代シに酢酸を用 いる沈殿の特別な利点は、ＤＮＡが高い収率で実際に遅滞なしに、つｔシ酢酸の 添加後直ちに懸濁液を濾過することによって得られることである。従って、約０ ．５〜３０分の作用時間を使用することができ、その際作用時間の増加につれて 収率は僅かに増加する。常温で一般に１〜５分、とくに約２分の短かい、作用時 間後、ガラス繊維フィルターを通して濾過する、有利には液体を吸引濾過するこ とができる。

次の工程で、ＤＮＡをガラス繊維フィルター中のガラスに結合させる。原則とし てこの工程には、７アーゾＤＮＡから７フージタンパク質の解離を惹起しうる強 カオトロピンクイオンが適当でおる。最良の結果はＮａＣｊＯ４溶液を用いて得 られ、その際とくに３〜ｉ　ｏ　ｙ／ｉ　、殊に望ましくは４〜８　Ｍ／ｌ！の 濃度が使用される。良好表結果は、カオトロピック剤として塩酸グアニジニウム を使用しても得られる。

カオトロぎツクイオンの溶液での処理は、簡単にフィルター上に滴加し、吸引濾 過することによって行なうことができる。

望ましい実施形では、ガラス繊維フィルターを過塩素酸塩溶液（ｆＪ（６，５〜 ８．５、殊にｐＨ７〜８〕で処理する。これは有利には滴加し、吸引濾過するこ とによって行なわれる。殊に望ましくは、このために、４〜８Ｍ／ｌのＮａＣｆ ０４．５〜２０　ｄｌのトリスニ（−７〜８）および０．５〜２−ｌのＥＤＴＡ を含有する溶液が使用される。

カオトロピック溶液、殊に過塩素酸ナトリウム溶液を除去した後、とくに含水エ タノール、有利には６０〜８０％のエタノールで後洗浄される。次いで、フィル ターを乾燥した後、溶離を常法で、たとえば”Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、”、第１０１巻、第３６９頁〜第３４１頁（１９８０年）に記 載されているように、合意塩水溶液を用いて行なう。望ましい溶離剤は、０．０ ５〜０．２ｍＭ１ｌのＥＤＴＡ　（以下ＴＥと呼称ンを含有する、０．５〜２２ ：ＩルｑのトリスＨＣ２（…７〜８）である。７．６〜７．６のβ値がとくに望 ましい。

他の適当な溶離剤はたとえば０．１％のＳＤＳのような希洗剤溶液であるが、こ れよシ少量も望ましい。

本発明のもう１つの対象は、濾過および溶離ユニットの形の、本発明方法をオー トマチックに実施する装置に関する。該装置は、下方の板２および上方の板３で 覆われ、その間にガラス繊維フィルター４が存在する真空室１を特依とする。板 ２および３は、ガラス繊維フィルター４によって分けられる、互いに整列する多 数の孔を有する。板２＞よび３はそれぞれ、それ自体が２つの絶縁プラスチック 板（２ａｙ　　２ｂ；３ａｔ３ｂ）の間に導電性金属板（２ｃ、３ｃ）が配置さ れているサンドイッチ構造からなる。金属板（２ｃ、　３ｃ）は、とくに不銹鋼 からなる。合板２および３中の２つの金属板（２ｃ、３ｃ）は、双方の板の間に 電気泳動を実施するのに適当な電圧を印加することのできる電圧源と結合するた めの手段を有する。真空室１と複合室蓋板との間に、たとえばデムまたはグリー スからなるパツキンが配置されていてもよい。

溶離は微量滴定遠心分離機を用いて行なうこともでき、この場合板２および３と フィルター４からなる全複合体を遠心機中へ入れることができる。この場合、金 属板２ｃ、３ｃを電圧源と結合する手段は不要である。

本発明方法は、とくにＤＮＡ配列決定の範囲内で使用される。しかし、部位特異 的変異誘発（ＫｒａｍｅｒによるＤＮＡの目的とする突然変異誘発、”　ＮｕＣ ｊ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、”第１２巻、第９４４１頁（１９８４年））におい て必要とされるような、迅速かつ確実な、Ｍ　１３５ｓＤＮＡの製造方法として 使用することもできる。

次側において、本発明を添付図百につき詳述する。

図面において、 第１図は、１ａがＤＮＡ収率と酢酸濃度（容量％）との関係を示し、１ｂがＤＮ Ａ収率と、酢酸添加と２１！過の間の時間との関係を示し、１ＣがＤＮＡ収率と 使用した過塩素酸ナトリクム濃度との関係を示す曲線図を表わす。

菓２図は、真空ポンプ（図示せず）への接続部を有し、下方のプラスチック／金 Ｒ／プラスチックサンドインチ板２および上方のプラスチック／金属／プラスチ ックサンドインチ板（その間にガラス線維フィルター４が挿入されている）で覆 われている真空室１を有する、本発明による濾過および溶離ユニットの斜視図を 示す。上方および下方のサンドイツチ板は、互いに整列され、上方の板３におい ては漏斗状に構成され、下方の板２においては円筒形に構成されている１連の孔 を有する。

第３図はこれら板構造体の断面図を示す。

第４図は、上方および下方のサンドインチ板および挿入されたガラス繊維フリー スの断面図を、部分的拡大図として示す。絶縁プラスチック板２ａおよび２ｂな いしは３ａおよび３ｂの間には、それぞれ相応する導電性金属板２ｃなりしは３ ｃが配置されておシ、これらは板２Ｃが陽極として働き、板３Ｃが陰極として働 くように電気的に接続することができる。

図示の実施形は９６個の孔を有し、従って９６個の種々のＭ１３鋳型を同時に精 製できる。

例　　１ ８００個の塩基長のプロティンキナーゼｃＤＮＡインサートを含有する、”　Ｐ ｒｏｔ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、”米国、第８３巻、第１３００頁 〜第１３０４頁（１９８６年）に記載されるＭ　１３ｍｐ　ｉ　８組換え７アー ゾを使用した。この組換えファージは、ｐＵＣ８ベクターからのインサートを２ 本鎖複製形のＭ１３ｍｐ１８ファージ中へ挿入し、それとともに適格なＴＭ１０ ３Ｅ、コリ細胞をトランス化（Ｔｒａｎｓｆｉｚｉｅｒｅｎ）することによって 得られる。澄明なプラークを取出し、２ｍｌの成長培地中で６時間成長させた。

次いで、細菌を遠心分離した。

こうして得られたファージ懸濁液１１ｎｌを１．５ゴの遠心分離小管に入れ、氷 酢酸１０μｔを加え、小管を密閉し、１回回転させた。室温で２分後に懸濁液を 、７ｎの直径を有する板２および３の孔を通して、本発明による９６個の孔を有 する濾過および溶離ユニットに、第２図〜第４図に示したように接している直径 ７ｘｘのガラス繊維フィルター（英国のＷｈａｔｍａｎ　Ｉｎｔ、　Ｌｔｄ、社 のＯＦ／Ｃ）上へ注いだ。

懸濁液の装入は、０　、ｉ　ｍｌの分割量で行なった。各分割量は、先行分量が 吸引濾過された後にはじめて装入した。幾つかの試料が同時に処理された場合に は、各試料のそのフィルターへの添加は、次の試料が次のフィルターに装入され る以前に行なわれた。

引き続き、各フィルターを、４Ｍ／ｌのＮａＣｌＯ２，１０ｍＭ／ｌのトリスＨ Ｃ２（ｐＨ７，５）　、１　コｌのＥＤＴＡ合計１ｔｎｌで処理し、その際同様 にｏ、ｉ　ａｇの分割量をフィルター上に滴下し、吸引濾過した。

引き続き、同様に７０％の含水アルコール１ｄで洗浄した。次いで、濾過ユニッ トを５分間空気で乾燥し、引き続きＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５）を用い、電気溶離 のための電圧を印加して溶離したが、その際溶離用の真空室１は、その個々の凹 みが再びサンドイツチ板２および３の孔と整列している９６個の孔を有する微量 滴定板によって代えた。

こうして得ら′れたＤＮＡ　Ｉ！ｌｌ製物を、プライマーの放射性標識化ならび に螢光標識化を用いる配列決定用鋳型として使用した。酵素として、Ｅ、コリＤ ＮＡポリメラーゼ１またはＴ　７　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメント を使用した。この場合、放射性標識化を用いると、１チの酢酸濃度および４　Ｍ ／ｌのＮａＣｊＯ４を使用する場合に最良の結果が生じ、螢光標識化を用いると 、１〜５チ酢酸および４〜６ＭのＮａＣＪＯ４の範囲内で最良の結果が得られた 。

国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．二Ｅ・コリ宿主菌株から培地中へ遠心分離された組換えられたＭ１３ファー ジを沈殿させ、成長培地から分離し、皮腹タンパク質を抽出することによつて組 換えられたＭ１３ｓｓＤＮＡを精製する方法において、成長培地からＭ１３フア ージを酢酸を用いて沈殿させ、得られる懸濁液をガラス繊維フィルターを通して 濾過し、ガラスフィルターをカオトロピツクイオンの溶液で処理することを特徴 とするＭ１３ファージＤＮＡの精製方法。
2. ２．カオトロピツク溶液として過塩素酸塩溶液を使用する請求項１記載の方法。
3. ３．４〜８Ｍ／ｌの過塩素酸塩溶液（ＰＨ６．５〜８．５）を使用する請求項２ 記載の方法。
4. ４．沈殿のため培地を、酢酸１％〜１０％の最終濃度にもたらす請求項１から３ までのいずれか１項記載の方法。
5. ５．ガラス繊維フィルターを、カオトロピツクイオンの溶液で処理した後、含水 エタノールで洗浄する請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. ６．精製されたＤＮＡを、ガラスフィルターから、希塊水溶液を用いて溶離する 請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. ７．溶離を、０．０５〜０．２ｍＭ／ｌのＥＤＴＡを含有する０．５〜２ｍＭ／ ｌ（ＰＨ７〜８）のトリスＨＣｌを用いて実施する請求項１から６までのいずれ か１項記載の方法。
8. ８．板２で覆われ、その上方に板３が配置されている真空室１および板２と３の 間のガラス繊維フィルターを有し、板２かよび３は互いに整列する多数の孔を有 し、かつ２つの絶縁性プラスチック板（２ａ，２ｂ；３ａ，３ｂ）の間に導電性 金属板（２ｃ，３ｃ）が配置されていることを特徴とする請求項１から７までの 方法を実施する装置。
9. ９．金属板２ｃ，３ｃが電圧源と結合するための手段を有する請求項８記載の装 置。
10. １０．孔は上方の板では漏斗状に構成され、下方の板２中では円筒状に構成され ている請求項８または９記載の装置。
11. １１．サンガーの鎖切断法によるＤＮＡ配列決定のため、請求項１から７までの 方法によつて製造されたＭ１３ｓｓＤＮＡの使用。