JPH02503195A - 増殖因子のレセプターに関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 増殖因子のレセプターに関する改良 本発明は、増殖因子のレセプターに対するアンタゴニストおよび抗体に関し、と くにボンベシン（ｂｏｍｂｅｓｉｎ）レセプターに対するアンタゴニストおよび 抗体に関する。

ボンベシンｊ：構造的に関係する両生類のテトラデカペプチドボンベシン（６） および哺乳類のペプチドは、ガストリン解放性ペプチド（ＧＲＰ）およびニュー ロメジン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）類（７〜１２）を包含し、細胞の増殖の制御 に関係すると信じられる増殖因子である。ボンベシン様ペプチドは、小さい細胞 肺癌中に高い濃度で存在しく１８〜２１）、ここでそれらはオートクリン（ａｕ ｔｏｃｒｉｎｅ）増殖因子として作用できるであろう（２２）。ペプチドのボン ベシン基は細胞中でレセプターと相互作用するが、ある量はペプチドのボンベシ ン基の化学について知られているが、ボンベシン様ペプチドのレセプターの化学 については非常にわずかしか知られていない、細胞の増殖におけるボンベシン様 ペプチドの参加およびボンベシン／レセプターの相互作用の存在または不存在の 細胞の増殖への関係をかんがみて、レセプターの詳細な研究は重要であることが 明らかである。

今回、新規な化合物として特徴づけることができる、ボンベシン族のある種のペ プチドに対するある種のレセプターを同定することができる方法をわれわれは開 発し、そしてそれはこのようなレセプターを使用し、そして、さらに、本発明は 、このようなレセプターに対するアンタゴニストおよび抗体に関する。ペプチド のボンベシン族は、事実、ｓ互イｔ＝構造的な差を有するが、まｔ；、共通の７ −アミノ麩配列を有しそして、われわれが同定したレセプターは、ボンベシン様 ペプチドの由来の種に無関係に、ボンベシン族の種々の構成員として作用するこ とができると、われわれは信する。

１つの面において、本発明は、次の特徴：１５少なくとも２つのマンノース側鎖 を有する、単一鎖のグリコポリペプチドであり、 ２、ボンベシンタイプのポリペプチドに特異的に結合し、３．７５〜８５キロダ ルトン（Ｋｄ）の分子量を有し、４．６．４〜６．９の等電点を有し、 ５、フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのエンド−ベーターＮ−グルコサミ ニダーゼを使用して得られた、そのコアタンパク質は約４２Ｋｄの分子量を有し 、 ６、前に定義したように、アンタゴニストＡ８よびアンタゴニストＤの両者に結 合する、 を有するポリペプチドを提供する。

他の面において、われわれは上に定義したグリコポリペプチドのレセプターに対 するアンタゴニストを提供する。これらのアンタゴニストは、ボンベシンおよび ボンベシン様ペプチドと構造的に非常に異なるが、ボンベシンのレセプターに結 合し、そしてボンベシンの作用を阻害することができる物質であるが、われわれ は、そうでなければボンベシン様ペプチドにより占有されるであろう結合部位を 占有することによらないと、信する。ボンベシン様ペプチドは小さい細胞の肺癌 中に高い濃度で存在するとして同定され（１８〜２１）、そしてオートクリン増 殖因子として作用することができる（２２）ので、ボンベシンのアンタゴニスト は、レセプター／ボンベシンのペプチドの相互作用を妨害し、それゆえボンベシ ン様増殖因子により影響を受ける癌細胞増殖のパターンを妨害する手段を提供す るうえで重要である。今回、われわれが同定したボンベシンのアンタゴニストは ヒトの小さい細胞の肺癌（ｓｍａｌｌ　　ｃｅｌｌｌｕｎｇ　　ｃａｎｃｅｒン 　（ＳＣＬＣ）系統の増殖を阻害することができ、それゆえ、有望な治療的実在 物として重要であることを、われわれは示した。

レセプターに対する抗体は、そうでなければボンベシン様ペプチドにより占有さ れうるレセプター上の結合部位を占有することができ、そして、同様に、細胞の 増殖のパターンに影響を及ぼすことができることにおいて、同様に重要である。

いわゆ払サブスタンス（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）Ｐは、次の式を有する、痛みの伝 達の研究において重要な、１１−マーのニューロペプチドである： Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　１　 ｙ−Ｌ　ｅ　ｕ−Ｍｅ　ｔ　−ＮＨ！サブスタンスＰの商業的に入手可能な構造 的変異型、［Ｄ−Ａｒｇ’、Ｄ−Ｐｒｏ”、Ｄ−Ｔｒｐ’、”、Ｌ　ｅ　ｕ　” ］サブスタンスＰとして知られている、それゆえ、式： ％式％ をもち、われわれがアンタゴニストＡと呼び、そして、また、［Ｄ−Ｐｒｏ”ｌ サンタニドとして知られている、は、驚くべきことには、ポンベシンのアンタゴ ニストとして作用することができることを、われわれは発見した。したがって、 アンタゴニストＡは、本発明によれば、ボンベシン様ペプチドの存在により影響 を受ける細胞増殖の修飾において重要性をもつ。

また、サブスタンスＰの他の商業的に入手可能な構造的変異型、われわれはアン タゴニストＤと呼び、また、［Ｄ−Ｐｈｅ’］　スパンチドとして知られており 、そして式： ％式％ を有する、は、ボンベシンのアンタゴニストとしてアンタゴニストＡよりもなお 効力があり、それゆえ、また、ボンベシン様ペプチドの存在により影響を受ける 細胞増殖の修飾において大きい重要性をもつことをわれわれは発見した・ アンタゴニストＡおよびＤのわれわれの研究は、改良されｔ；ボンベシンのアン タゴニストを産生ずるこのタイプの化合物においてアミノＩｎ置５における構造 的重要性をわれわれに示しそして、本発明は、アンタゴニストＡ上のアミノ酸位 置５の変異型である新規な化合物に拡張され、そして、治療によりヒトまたは動 物の体を処置する方法において、あるいはヒトまたは動物の体について寅施され る診断の方法において、使用するためのアンタゴニストＡおよびアンタゴニスト Ｄのこのような位置５変異型に拡張される。

適当な位置５変ｊ［は、次のとおりである：Ｄ−Ｔ　ｒ　ｐ、　Ｄ−Ｔ　ｙ　ｒ およびＭｅ−Ｐｈｅ＊本発明の他の特徴は、ボンベシンのレセプターに対する抗 体からなる。

抗体は普通の方法によりレセプターに対してレイズ（ｒａｉｓｅ）することがで き、この方法は、を椎動物に免疫原として本発明のポリペプチドのレセプターを 注射する工程を包含し、そして抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル 抗体であることができる。

レセプターに対するポリクローナル抗体は、動物を免疫原の形態のレセプター分 子で免疫化し、次いでポリクローナル抗体を免疫化した動物の血液断片から回収 することを包含する普通の方法によりレイズすることができる。

レセプターに対するモノクローナル抗体は、試験動物、例えば、マウスを免疫原 の形態のレセプターで免疫化し、次いで免疫化マウスからの牌細胞を骨髄腫細胞 とハイブリダイゼーシヨンして、レセプターに対するモノクローナル抗体を分泌 するハイブリドーマ癌細胞を得ることを包含する普通の手順により発生すること ができる。

これらの方法において発生したモノクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペ プチドを有する固相と、あるいは本発明のポリペプチドをその表面に支持するス イス３Ｔ３細胞を有する固相と、抗体を接触させて、抗体／抗原の接合体を形成 し、そして前記接合体から精製された抗体を解放する工程を包含する、レセプタ ーを支持する細胞を有する固相に対する親和クロマトグラフィーにより精製する ことができる。

本発明のアンタゴニストまたは抗体は、製剤学的に許容されうる担体または希釈 剤、例えば、普通の非経口的担体と配合し、こうしてアンタゴニストまたは抗体 を非経口的に投与することができ、ここでそれらは診断または治療のためのヒト または動物を処理する方法において、およびより特に、制御されない細胞の成長 がボンベシン族のタンパク質の障害と関連する、癌の診断または治療において、 使用するために重要性をもつ。アンタゴニストおよび抗体は、また、制御されな い細胞の増殖の処理のための薬物の製造において使用するために重要性をもつ。

本発明のアンタゴニストまたは抗体は、制御されない細胞の増殖に悩まされる疑 いのある宿主からの体の試料を、アンタゴニストまｔ；は抗体を接触させる工程 を包含する、制御されない細胞の増殖の生体外診断方法において、使用するため に重要性をもつ。この方法は、組織学または血清のアッセイによる癌の診断にお いてとくに有用である。

本発明のレセプターの分離および分子の特徴づけは、それらの同定ののための手 順を必要とし、そして他の系において膜レセプターを同定するために既に使用さ れてきｆ：、ｃ２３〜２８）ある種の二官能性架橋試薬の使用を包含する系をわ れわれは開発した。われわれは、架橋剤のエチレングリコールビス（スクシニミ ジルスクシネート）を使用して　１．ｓｌｌ［識ガストリン解放性ペプチド（” ’Ｉ−ＧＲＰ）をスイス３Ｔ３細胞における表面タンパク質に共有結合した。こ の表面タンパク質は、スイス（Ｓｗｉｓｓ）３Ｔ３細胞から分離すると、ボンベ シン族のペプチドのための特異的レセプターの特性を表す。このタンパク質は、 ボンベシン様ペプチドのためのレセプターの性質を示さない他の細胞系中に存在 しない。

さらに詳しくは、本発明のポリペプチドのレセプターは、スイス３Ｔ３細胞の培 養物を　Ｉｌｌ　ｌ標識ガストリン解放性ペプチド（””Ｉ−ＧＲＰ）を含む培 地中でインキュベージ１ンし、さらに”’Ｉ−ＧＲＰ処理したスイス３Ｔ３細胞 を二官能性架橋試薬の存在下にインキュページ層ンし、そして生ずる”Ｉ−ＧＲ Ｐ／架橋試薬／ポリペプチドの接合体を可溶化して、前記細胞の表面からポリペ プチドを解放することからなる、方法により、分離することができる。

スイス３７３細胞は、実験の使用のｔ：めに広く入手可能であり、そしてアメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクシジン（ｔｈｅ　　Ａ、ｍｅｒｉｃａｎ　　 Ｔｙｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ米国ブリイラン州ロッ クビレ）から、受託番号ＡＴＣＣ−ＣＣＬ９２で入手可能である。

次の実施例により、本発明のレセプターの分離および特徴づけについて説明する 。

実施例１ ボンベシンおよびリドリンは、シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）から入手した。

ＧＲＰ、ＧＲＰの１４−２７アミノ酸断片および［Ｄ　−Ａ　ｒ　ｇ　’ｓ　Ｄ 　−Ｐｒｏ’、Ｄ−Ｔｒｐ’、”、Ｌ　ｅ　ｕ　”］サブスタンスＰはベイケム ・ファイン−ケミカルス（Ｂａｃｈｅｍ　　Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ） （英国サフロムワルデン）から入手し、そしてＧＲＰ（７）ｌ−１６断片および ニューロメジンＢはペニンスラ・ラボラトリーズ（ＰｅｎｉｎｓｕｌａＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）（カル７オルニア州サンカルロス）カら入手した。高度に精 製された血小板誘導増殖因子（ＰＤＧＦ）は、バイオプロセシング（Ｂｉｏｐｒ ｏｃａｓｓｉｎｇ）から入手した。エチレングリコールビス（スクシニミジルス フシネ−））（ＥＧＳ）、ジスクニミジルスベレー）（ＤＳＳ）、ジチオ−ビス （スクシニミジルプロピオネ−））（ＤＳＰ）およびビス【２−（スクシニミド オキシカルポミルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＣＯＥＳ）は、ピアース・ケ ミカル・カンバ＝−（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、）から購入 した。

”’Ｉ−ＧＲＰ　（２０００Ｃｉ／ミリモル；ｌｃｉ謀３７ＧＢｑ）は、ラジオ ケミカル・センター（Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｅｎｔｒｅ）（英国ア マ−ジャム）から入手したか、あるいは可溶性ラクトペルオキシダーゼ法（２９ ，３０）を使用してＧＲＰをＩＩｓ　１で標識することによって調製した。標識 したペプチドは未反応のＮ　ａ　”’　ｌから記載するようにして（８）分離し た。”’Ｉ−ＧＲＰは、非標識ペプチドを使用してＷＲ測される範囲と同様な範 囲内のミトゲン活性を示した。使用したすべての他の試薬は入手可能な最高の等 級であった。

レセプターへの”’Ｉ−ＧＲＰの化学的架橋スイス３Ｔ３細胞の全面および休止 の培養物を、１５℃に村いて、０゜１％のウシ血清アルブミンおよび適当な濃度 の目’Ｉ−ＧＲＰを補充した、０．１４モル（Ｍ）のＮａＣｌ、５ミリモル（ｍ Ｍ）のＫＣＩ、０゜０１モルｆ）Ｎａ２ＨＰ　Ｏｓｓ　　１．８　ミＵモルのに 、ＨＰＯ，，１，８ミリモルのＣａＣｌ□、１ミリモルの４−（２−ヒドロキシ エチル）−１−ピペリジンエタンスルホン酸（結合媒質）から成る１ｍｆｌの培 地、ｐＨ７゜０、中で、５００倍過剰の非標識ＧＲＰの存在下または不存在下に インキュベーションした。２．５時間後、細胞を３回１５℃においてリン酸塩緩 衝液ＣＰ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、次いで１５分間１５℃において１ｍＱの結合媒質 、ｐＨ７，４、中で適当な架橋剤の存在下に示した濃度においてインキュベージ １ンした。架橋剤（ＥＧＳ％ＤＳＳ、ＤＳＰおよびＢ５Ｃ０ＥＳ）を使用直前に ジメチルスルホキシド中に溶解し、そして媒質に１〜２％のジメチルスルホキシ ドの最終濃度に添加しｔ；。培養物を４℃においてＰＢＳで２回急速にすすぎ、 モしてＯ，１ｍ＋２の２×試料緩衝液　０．２モルのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ６， ８，１０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、６％のドデシルＶＭａナトリウム（ＳＤ Ｓ）（ｗ／ｗ）、４％のβ−メルカプトエタノール（Ｖ　／　Ｖ　）および２ミ リモルのエチレンジアミノテトラ酢酸中に可溶化した。試料を直ちに１００℃３ 〜５分間加熱し、モしてｌまたは２次元のゲル電気泳動により分析した。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動スラブゲル電気泳動を、分離用ゲル 中の７．５％のアクリルアミドおよびスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲル中 で５％および０．１％のＳＤＳを使用して実施した（３１）。電気泳動のゲルを 着色し、廃液し、そしてフジＸ線フィルム（フジ写真フィルム会社、日本）を使 用するオートラジオグラフィーのために紙上に乾燥した。乾燥したゲルをフィル ムに４〜８日間露出した。２次元のゲル電気泳動は、オーファレル（０°Ｆａｒ ｒｅｌｌ）（３２）に記載されているようにして、１次元において等電点電気泳 動および２次元において５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動（ＳＤＳ− ＰＡＧＥ）（８％のポリアクリルアミド）を使用して実施した。等電点電気泳動 のために、１．４％のＬＫＢ両性電解質、ｐＨ５−７、＋０．６％のＬＫＤ両性 電解質、ｐＨ３，５−１０，６モルの尿素、および２％のノニデット（Ｎｏｎｉ ｄｅｔ）Ｐ−４０を含有する試料を調製した。オートラジオグラフィーからの分 子量７５０００−８５０００のバンドをジ１イスーレーブル（Ｊｏｙｃｅ−Ｌｏ ｅｂｌ）の二重ビームのデンシトメーターを使用して走査し、そして特定のピー クの下の面積をヘウレットーパッード（Ｈｅｗｌｅｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）ディジ タイザ−（ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ）で測定した。

細胞培養手順（３３）、”Ｈ−チミジンキナーゼの組み込みによりＤＮＡ合成ｆ ）７ｙセ４　（３４）　８ヨＵ完全ｍ！Ｉ！Ｉヘノ””１−ＧＲＰｆ）ｅｘｉｔ （１３）を前述のようにして実施した。

結果および論考 全面および休止のスイス３Ｔ３細胞の培養物を”’Ｉ−ＧＲＰと１５℃において インキュベーションしたとき、細胞会合した放射能は２．５時間後に最大に到達 し、そして３７℃または４℃のいずれかににおける表面の結合に比較してかなり 増大した（発表されていない観察）。その５ナノモル（ｎＭ）の１！Ｓ　Ｉ　　 Ｇ　ＲＰと１５℃において２．５時間インキュページ謄ンし、そしてホモニ官能 性架橋剤ＥＧＳ％ＤＳＳ％ＤＳＰまたはＢ５Ｃ０ＥＳで処理した、細胞の５ＤＳ −ＰＡＧＥによる分析は、分子量７５０００〜８５０００の単一の主要なバンド を明らかにした（第１図）。われわれの実験室において”’Ｉ−ＧＲＰで標識し Ｉ；商業的に入手可能な”’Ｉ−ＧＲＰまたはＧＲＰを使用して、同一の結果が 得られた。５００倍過剰の非標識ＧＲＰ　（＋）の存在下に、このバンドは完全 に消滅した。ＥＧＳは架橋の最大の効率を示し、したがってこの架橋剤を引き続 く実験において使用した。分子量７５０００〜８５０００のタンパク質のレベル へのＥＧＳの作用は濃度依存性であった。ＥＧＳの１／２最大作用は２ミリモル の濃度において得られた（第１Ｃ図）。架橋の効率のランクの順序（ＥＧＳ＞Ｄ ＳＳ＞ＤＳＰ＞Ｂ５Ｃ０ＥＳ）は、これらの二官能性分子のアームの鎖長さに関 係付けることができる。こうして、最も短い鎖長さを有するＢ５Ｃ０ＥＳは、事 実上無効であった（第１Ｂ図）。第１次元において等電点電気泳動および第２次 元において５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して２次元のゲル電気泳動により、スイス３ Ｔ３細胞の架橋した培養物を分析したとき、分子量７５０００〜８５０００タン パク質は６，４〜６．９の等電点て移動する多成分のスポットとして現れｆ−、 、（結果は示されていない）。

架橋反応を、架橋剤の不存在下に、細胞を含まないプラスチック皿中で実施する か、あるいは他の細胞系、例えば、ラット（Ｒａｔ）−１゜全マウス胚線維芽お よびＢａ　］　ｂｃ／３Ｔ３　（それらは有意の特異的””Ｔ−ＧＲＰ結合しめ さず、またボンベシン関連ペプチドにミトゲン的に応答しない）を使用して実施 しｔ；とき、分子量７５０００〜８５０００バンドは得られなかった（１３）。

親和性標識しｊ；バンドがより高分子量のタンパク質の減成生成物である可能性 を、プロテアーゼ阻害因子のアブロニチン（１００μｇ／ｍＱ）、ペプスタチン （４μｇ　／　ｍ１２）、７ｚニルメチルスルホニルフルオライド（２ミリモル ）およびエチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ’　 −テトラ−酢Ｗ１（４ミリモル）の存在下に架橋反応した後、培養物を抽出する ことによって試験した。これらの処理は分子量７５０００〜８５０００タンパク 質のレベルに有意の作用をを有さす、そして高分子量のタンパク質を出現させな かった。配位子の内在化および劣化を防止するｔ；めに４℃において実施した他 の実験において、同一の結果が第１図に示すものに対して得られた（結果は示さ れていない）。こうして、分子量７５０００〜８５０００のタンパク質は、内在 化”’Ｉ−ＧＲＰと会合した細胞内成分またはペプチドの減成生成物ではなく、 またより大きい分子のタンパク質分解から生ずる断片ではなかった。さらに、０ ．６モルの２−メルカプトエタノールにより処理は、低分子量の追加のバンドを 出現させず、分子量７５０００〜８５０００のタンパク質は単一のポリペプチド 鎖から成ることを示唆した。これらの重要な対照は、分子量７５０００〜８５０ ００のバンドがボンベシン族のペプチドのためのレセプターに密接に関係するス イス３Ｔ３細胞の表面成分であることを示唆した。

上の結論は、さらに、非標識ペプチドの異なる濃度の存在下にインキュページ腑 ンした培養物に”’Ｉ−ＧＲＰを架橋することによって、実証された。非標識Ｇ ＲＰの濃度の増加とともの分子量７５０００〜８５０００バンドのレベルの減少 （第２Ａ図、闘いた記号）は、培養物の平行の組において”’Ｉ−ＧＲＰの同一 濃度の結合を阻害するＧＲＰの”’Ｉ−ＧＲＰの架橋は、また、ボンベシン、ニ ューロメジンＢ１リドリンおよびボンベシンアンタゴニスト［Ｄ−Ａ　ｒ　ｇ’ １Ｄ−Ｐ　ｒ　ｏ”、Ｄ−Ｔｒｐ’、”、Ｌｅｕ”］サブスタンスＰを包含する ＧＲＰに構造的に関係する他のペプチドにより、顕著に阻害された（Ｍ１３．１ ７．３５．３６）。”’Ｉ−ＧＲＰの結合を阻害せず、またＤＮＡの合成を刺激 しないＧＲＰのアミノ末端断片ＣＧＲＰ　（１−１６）　）　　（１３）は、分 子量７５０００〜８５０００タンパク質のレベルを減少させなかった（表１）、 ”’Ｉ−ＧＲＰが分子量７５０００〜ａｓｏｏｏタンパク質を認識する特異性を 確証するｔ；めに、スイス３７３細胞を”’Ｉ−ＧＲＰと、これらの細胞につい ての他のミトゲンの存在下にインキエペーシ層ンした０表１に示すように、ＥＧ Ｓで九理して得られたタンパク質のレベルは、ＰＤＧＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ ）、バンプレシン、インスリン、およびホルボール１２．１３−ジブチレートの 濃度を飽和することによって実質的に影響を受けなかった（１％　１３．３Ｂ） 。さらに、ニューロペプチドのサブスタンスＰ、サブスタンスにおよびソマトス タチンは、また、分子量７５０００〜８５０００バンドの親和性標識つけに影響 をもたなかっｆ−（表１＞、この結果は、完全３７３への”’Ｉ−ＧＲＰの結合 がこれらのミトゲンにより阻害されないという発見と一致する（１３）。

分子量７５０００〜８５０００タンパク質がスイス３Ｔ３細胞におけるボンベシ ン族のペプチドのためのレセプターの主要な成分であるという結論は、さらに、 放射線ヨウ化配位子の濃度の関数としてタンパク質のレベルを測定することによ って強化された。第２Ｂ図が示すように、分子量７５０００〜８５０００バンド への”’１−ＧＲＰの架橋は標識ペプチドの濃度の増加とともに飽和できる方法 で増加した。これらのデータの二重逆数のプロット（図示せず）は、直線を生成 し、そして１ナノモルのＫｄについである値を与え、この値は結合曲線のスカチ ャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析からのＫｄ　（０，５ｘｔｏ−’モル）と非 常によく匹敵する（１３）。さらに、１２″Ｉ−ＧＲＰ濃度への分子量７５００ ０〜８５０００タンパク質の親和性標識っけの依存性は、休止スイス３Ｔ３細胞 において種々の早期の生物学的応答（１６，１７）およびＤＮＡ（１３）の合成 を刺激するペプチドの能力と密接に平行する。

”’Ｉ−ＧＲＰの高い濃度において、はぼ分子量１６０．０００の高分子量のバ ンドが観察された（第２Ｂ図）、このバンドは、合計の架橋した物質の４％を表 わし、そしてより低い”’Ｉ−ＧＲＰのレベルまたは４℃においてほとんど検出 不可能であった。

胆１　使用した略号は次のとおりである：ＧＲＰ、ガストリン解放性ペプチド、 ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン、ＰＢＳ、リン酸塩緩衝生理的塩類溶液：ＥＧＦ、 表皮増殖因子：ＰＤＧＦ、血小板誘導増殖因子；ＥＧＳ、エチレングリコールビ ス（スクシニミジルスクシネート）；ＤＳ５１シスクシニミジルスベレート、Ｄ ＳＰ、ジチオ−ビス−（スクシニミジルスクシネート）；Ｂ５Ｃ０ＥＳ、ビス［ ２−（スクシニミドオキシ力ルポミルオキシ）エチル］スルホン、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ、　　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動。

実施例２ これはアンタゴニストＡより５倍以上のアンタゴニストＤの効能を説明する。

ＤＰｈｅ’　　スパンチドはＧＲＰ仲介有糸分裂誘発の効力のある阻害剤である サブスタンスＰは、ボンベシンとわずかのアミノ酸配列相同性を有しく表２）、 そしてスイス３Ｔ３細胞へのＧＲＰの結合を示さず、またＤＮＡの合成を刺激し ない、しかしながら、サブスタンスＰアンタゴニストとして合成した［ＤＰｒｏ ”］　スパンチド（アンタゴニストＡ１表２）は、膵臓腺房細胞においてボンベ シンのアンタゴニストであり、そしてスイス３Ｔ３細胞においてボンベシンの増 殖促進作用を遮断することが発見された。ボンベシン様ペプチドのより効力のあ るアンタゴニストを同定するために、われわれはｌＯのサブスタンスＰのアンタ ゴニストを５０Ｐモルにおいて（表２）ＧＲＰにより刺激された有糸分裂誘発を 阻害するそれらの能力について試験した。［ＤＰｈｅ’］スバンチド（アンタゴ ニストＤ）は、明らかにほとんどの効力のあるＧＲＰアンタゴニストであった。

対照的に、ペプチド、Ｂ％Ｃ，Ｅ％Ｆ％Ｇ、Ｈ％　Ｊおよルにおいてさえアンタ ゴニスト活性をもたなかった。ペプチドのいずれも、２０μモルにおいてインス リンをｌμｇ／ｍＱで使用して試験したとき、ＤＮＡの合成を刺激しなかった、 すなわち、いずれもアゴニスト活性を示さなかった。

最も有望なＧＲＰアンタゴニストとして［Ｄ　Ｐ　ｈ　ａ　’］　スパンチドの 同定後、われわれは［ＤＰｈｅ’ｌスバンチドの効力を［ＤＰｒｏ”］スパンチ ドのそれと比較した。第３図が示すように、［ＤＰｈｅ’］　スパンチドは２０ μモルにおいてＤＮＡの合成の１／２最大を生成するために要求されるＧＲＰ濃 度を顕著に増加させたが、２０μモルにおいて、また、　［ＤＰｒｏ”］　スパ ンチドを添加したとき、わずかの効果のみが得られたに過ぎなかった。［Ｄ　Ｐ 　ｈ　ｅ　’］　スパンチドによるＤＮＡの合成の阻害はＧＲＰの高い濃度によ り完全に逆転され、その阻害作用が競合的かつ可逆であることを示された。ＧＲ Ｐ３．６ナノモルの存在下の２つのアンタゴニストについての投与量応答曲線は 、第３図（右）に示されている。ＤＮＡの合成の１７２最大阻害は、２２μモル の［ＤＰｈｅ’］　スパンチドおよび１１８μモルの［ＤＰｒｏ”］スパンチド を使用して得られた。こうして、［ＤＰｈｅ’ｌスバンチドは、ＧＲＰにより誘 発されるＤＮＡの合成の阻害においてｓ　　［ＤＰ　ｒ　ｏ”］スパンチドより ５．４倍以上効力がある。

次の実施例は、アンタゴニストＤがボンベシン／ＧＲＰにより開始される事象の すべてを特別の方法で阻害することを実証する。

実施例３ ＤＰｈｅ’　　スバンチドはＧＲＰレセプターに　金的に結合する前の結果が実 証するようにｓ　　［Ｄ　Ｐ　ｈ　ｅ　”］スパンチドは他のミトゲンに対して 特異性を示すＧＲＰ誘発ＤＮＡの合成の効力のある阻害剤である。その作用の機 構を説明するために、われわれはスイス３Ｔ３細胞への［”Ｊ］　ＧＲＰの特異 的結合への［ＤＰｈｅ’］スパンチドの作用を検査した。第４図（左）が示すよ うに、　［ＤＰｒｏ”］　スバンチドおよび［ＤＰｈｅ’］　スパンチドの両者 は［”’Ｉ］　ＧＲＰ　（１ナノモル）の特異的結合における濃度依存性の阻害 を起こした。結合の１／２最大阻害は、１．３μモルの［ＤＰｈｅ″］スパンチ ドおよび１４μモルの［ＤＰｒｏ”］　スバンチド、効能の６．１倍の差、を使 用して達成された。これはＧＲＰにより誘発されるＤＮＡの合成の阻害における ２つのアンタゴニストの相対的効能と一致する。

［■ｓＩ］ＧＲＰの異なる濃度ノ結合ヲ、ｌ　Ｏｐモルｆ）［ＤＰｈｅ’］スバ ンチドの不存在下まｔ；は存在下に測定した。これらのデータの二重逆数のプロ ット（ｄｏｕｂｌｅ　　ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　　ｐｌｏｔ）（第４図、中央） が示すように、　［ＤＰｈｅ’ｌ　スパンチドは［”’１１　ＧＲＰのレセプタ ーの親和性を顕著に減少させるが、結合部位の数は未変化である。これは［ＤＰ ｒｏ”］　スパンチドを使用して前に得られた結果と一致し、そしてこれらのペ プチドがＧＲＰレセプターに競合的に結合することを強く示唆する。

これらの発見をさらに実証するために、われわれは、推定上のボンベシンのレセ プターである、最近記載された分子量７５０００〜８５０００タンパク質の親和 性標識っけへの２つのアンタゴニストの作用を研究した（第４図、右）。それら の両者は、ＥＧＳを使用して［＋！１ｌｌＱＲＰをスイス３Ｔ３細胞へ架橋する ことによって得られた分子量７５０００〜８５０００タンパク質を示差的に阻害 することができｔ；。ｌ／２最大阻害（オートラジオグラフィーの走査デンシト メトリーにより得られた）は、５．５μモルの［Ｄ　Ｐ　ｈ　ｅ　’］　スパン チドおよび２０μモルの［ＤＰｒｏ’］スパンチドを使用して達成され、再び［ ＤＰｈｅ″コスバンチドの優秀性が実証された。

実箆例４ ＤＰｈｅ’ｌ　スパンチドはＧＲＰにより誘発される早期の事象を阻害する 休止のスイス３Ｔ３細胞へのボンベシンまｔ；はＧＲＰの添加により刺激された 早期の事象の１つは、細胞質ゾルのＣａ”濃度（［Ｃａ”°］　＋）の増加であ る。第５図（左）が示すように、休止のスイス３Ｔ３細胞へのＧＲＰ　（１ナノ モル）の添加により引き起こされるｒｃａ”］Ｉの上昇は２０μモルの［ＤＰｒ ｏ”］　スパンチドの添加により阻止されるが、５μモルにおいては阻止されな かった。対照的に、［ＤＰｈｅ’ｌスパンチドは５μモルにおいて有効でありｓ 　　［Ｄ　Ｐ　ｈ　ｅ　’］　スパンチドはこのアッセイにおいて少なくとも５ 倍［ＤＰｒｏ”］　スバンチドより効能があることが実証された。これらの効果 は特異的であり、そして可逆的であった。なぜなら、　［ＤＰｈｅ’］　スパン チドは５μモルにおいてＰＤＧＦへの応答を防止せず、そして５ナノモルのＧＲ Ｐへの応答におけるＣａ”の移動の防止におけるアンタゴニストの作用は５０ナ ノモルにおけるＧＲＰの添加により逆転したからである。

タンパク質キナーゼＣ通路により仲介される、ＧＲＰによる［１２％　１　］Ｅ ＧＦの阻害は、　［ＤＰｒｏ”ｌ　スパンチドおよび［ＤＰｈｅ’ｌ　スバンチ ドにより濃度依存性の方式で逆転されｆ−（第５図、右）。阻害のｌ／２最大阻 書は、８．７μモルの［ＤＰｈｅ’ｌ　スパンチドおよび３０μモルの［ＤＰｒ ｏ”］　スバンチドを使用して得られた。これらの発見は、さらに、　［ＤＰｈ ｅ’］　スバンチドは効力のあるＧＲＰアンタゴニストであるという結論を実証 する。

天真豊五 マウス３Ｔ３細胞においてボンベシン／ＧＲＰの細胞の作用の阻害の実証に加え て、われわれは、今回、アンタゴニストＡおよびアンタゴニストＤは特異的かつ 可逆的方式で５ＣＬＣの成長を阻害することができることを示した。

５ＣＬＣは、オートタリン増殖因子として作用することが示唆されている、ボン ベシン様ペプチドを分泌することが知られている。こうして、ボンベシン／ＧＲ Ｐに対するアンタゴニストが５ＣＬＣの成長を阻害するということがありうるが 、まだ証明されていないので、われわれは、今回、５ＣＬＣへの［ＤＰｒｏ月ス パンチドおよび［ＤＰｈｅ“］スパンチドの生体外効果を試験した。

第６図が示すように、血清不合培地中の５ＣＬＣ系統Ｈ６９、Ｈ１２８８よびＨ ４１７の成長速度は、スイス３Ｔ３細胞におけるＧＲＰ誘発有糸分裂誘発を可逆 的に阻害する濃度である、１５０μモルの［ＤＰｒｏ　２］　スパンチドの添加 により崩壊された。５ＣＬＣ系統におけるアンタゴニストによる成長の阻害は、 細胞を洗浄し、そして血清不合培地中に再懸濁することによって逆転された。

Ｈ６９への［ＤＰｒｏ”ｌスパンチドおよび［ＤＰｈｅ’ｌスバンチドの作用は 、第７図において比較されている。細胞は血清不合培地において約１２日で１０ 倍の数を達成する（インセット）。両者のアンタゴニストは投与量依存性の方法 で成長を阻害した：ｌ／２最大作用は［ＤＰｈｅ’］スパンチドで２４μモルお よび［ＤＰｒｏ”ｌスパンチドで８２μモルで見られた。効能の差はスイス３Ｔ ３細胞において実証されたものと同一の大きさであり、そしてボンベシン様ペプ チド（まｔ；はバンプレシン）が５ＣＬＣにとって重要な増殖因子であろうると いう考えを支台の時間依存性。培養物を洗浄し、次いで１５℃においてＩＺＳＩ −ＱＲＰ（２ナノモル）を含有する１ｍ（ｌの結合媒質中でインキュベージＢン した。種々の時間後、細胞を１ｍｇ／ｍＱのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補 充した冷（４℃）ＰＢＳで急速に４回洗浄し、次いで１ｍ１２の０．２モルの酢 ａ、０．５モルのＮａＣ１中で４℃において６分間インキュベーションして、細 胞表面の会合した配位子を除去した。次いで、この媒質を計数のために取り出し 、そして残りの細胞内会合放射能を２％のＮａ２ＣＯ３および１％のＳＤＳを含 有する１ｍ（ｌのＯ，１モルのＮａＯＨで抽出した。開いた正方形は、表面の結 合した配位子を示し、そして閉じた正方形は細胞内の放射能を示す。

Ｂ、ジスクシニミジル架橋剤を使用する分子量７５０００〜８５０００の細胞タ ンパク質の”’Ｉ−ＧＲＰ親和性標識つけ。スイス３Ｔ３細胞の全面培養物を洗 浄し、次いで０．９μモルの非標識ＧＲＰの存在（＋）または不存在（−）にお いてＩ！５Ｉ−ＧＲＰ（５ナノモル）と２．５時間１５℃においてインキュベー ジＢンしｔ；。細胞をすすいで遊離の配位子を除去し、そして、それぞれ、ＥＧ Ｓ、、ＤＳＳ％ＤＳＰまたはＢ５Ｃ０ＥＳで６ミリモル、２ミリモル、２ミリモ ルおよび４ミリモルの濃度において処理した。細胞をＳＤＳ試料緩衝液中で可溶 化し、そして７゜５％、のポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。矢印は 分子量７５０００〜８５０００タンパク質の位置を示す。この実験および同様な 実験において使用した実験の手順は１、材料および方法に記載されているとおり であった。低分子量において移動する広くかつ強い放射性バンドがすべてのわれ われのゲルにおいて観測された。この物質は過剰の非標識ＧＲＰの存在下に得ら れ、したがって未反応のタンパク質を表す可能性が最もつよい。

Ｃ０分子量７５０００〜８５０００のタンパク質の親和性標識っけへのルの”’ Ｉ−ＧＲＰと１５℃においてインキュベーションし、次いで示した種々の濃度の ＥＧＳで処理した。試料は材料および方法に記載するように５ＤＳ−ＰＡＧＥの ために調製した。矢印は、分子量７５０００〜８５０００タンパク質の位置を示 す。この実験および他の実験において、ＥＧＳを使用する架橋の効率は細胞表面 の会合しｔ；放射能の５〜ｌＯ％の範囲であった。

第２図７二Ａ、完全スイス３Ｔ３細胞への”’Ｉ−ＧＲＰの結合（・）および分 子量７５０００〜８５０００タンパク質の親和性標識つけ（０）への非標識ＧＲ Ｐの種々の濃度の効果、３Ｔ３細胞の全面培養物を５ナノモルの”’Ｉ−ＧＲＰ と、種々の濃度の非放射性配位子の存在下に、１５℃において２．５時間インキ ュベーションした。この時間後、多少の細胞を、１ｍｇ／ｍＱのＢＳＡを補充し た冷（４℃）ＰＢＳで４回洗浄し、可溶化し、次いで合計の細胞会合放射能をガ ンマカウンターで決定した。閉口の培養物をＰＢＳで１５℃においてすすぎ、次 いでＥＧＳ（６ミリモル）で処理して結合した”’Ｉ−ＧＲＰを架橋した。次い で、細胞を可溶化し、そして試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。電気泳動 後、ゲルを乾燥し、フィルムに露出し、そして材料および方法に記載されている ように走査した。分子量７５０００〜８５０００タンパク質についての個々のピ ークの下の面積を、非標識ペプチドの濃度の関数として示し、そして対照の百分 率として表す。インセットは走査のために使用したオートラジオグラフィーの領 域を示す。

Ｂ３分子量７５０００−８５０００タンパク質の”’Ｉ−ＧＲｐＨＩ性標識っけ の濃度依存性。スイス３Ｔ３細胞の全面培養物を、異なる濃度の１２″Ｉ−ＧＲ Ｐと、１５℃において２．５時間インキュベーションした。任意の単位で表され た分子量７５０００〜ａｓｏｏｏタンパク質のレベルは、標識した配位子の濃度 の関数として示す。インセット：走査に使用したゲルのオートラジオグラフ：分 子量７５０００〜８５０００および１６０．０００のバンドは矢印で示されてい る。すべての他の実験は、材料および方法に記載されている通りであった。

第３図：　　［ＤＰｒｏ”］スパンチド（Ａ）および［ＤＰｈｅ’］スパンチド （Ｄ）によるＧＲＰ誘発ＤＮＡの合成の阻害、左：３５ｍｍのプラスチック皿中 のスイス３Ｔ３細胞の全面および休止の培養物を、ＤＭＥＭで２回洗浄し、次い で１ｐＣｉ／ｍｌ　　（１ｐｍ）の［”Ｈ］チミジン、ｌｔｔｇ／ｍＱのインス リンおよび増加する濃度のＧＲＰを含有する２ｍｇのＤＭＥＭ／ワイマウス（Ｗ ａｙｍｏｕｔｈ）媒質のｌ：ｌ混合物中で３７℃において、２０μモルのアンタ ゴニストＡ　（０）または２０μモルのアンタゴニストＤ（Δ）の不存在下（■ ）または存在下にインキュベージコンした。４０時間後、ＤＮＡの合成を酸沈澱 した物質中への［ＳＨ］チミジンの組み込みにより推定しｔ；。値は、アンタゴ ニスト（１００％−８，４ＸｌＯ’ｃｐｍ／皿）の不存在下に、ＧＲＰの飽和す るレベル（３６ナノモル）を使用して得られた［３Ｈ］チミジンの組み込みの百 分率として表わした。各点は反復実験の決定の平均を表す。右ニスイス３Ｔ３細 胞の培養物を上に示したように洗浄およびインキュベーションしたが、ただしＧ ＲＰの濃度は３．６ナノモルに固定し、種々の濃度のアンタゴニストＡ（・）お よびＤ（Δ）を使用した。値は、アンタゴニスト（１００％−８，４ＸＩＯ’ｃ ｐｍ／皿）の不存在下に得られた［３Ｈ］チミジンの組み込みの百分率として表 わした。

！工里ニスイス３Ｔ３細胞への１２−夏標識ＧＲＰ　（［”’１］　ＧＲＰ）の 結合への［ＤＰｒｏ”ｌスパンチド（Ａ）および［ＤＰｈｅ’］スパンチド（Ｄ ）の作用。左＝アンタゴニストＡおよびＤによる特異的［１２１１］　ＧＲＰの 結合の阻害。全面および休止の細胞を２回ＤＭＥＭで洗浄し、次いで１ナノモル の［”’１１　ＧＲＰおよび種々の濃度のアンタゴニストＡ　（０）およびＤ（ Δ）を含有する１ｍｆｌの結合媒質（３）中で３７℃においてインキュベージ履 ンした。３０分後、細胞会合した［１１Ｓ目ＧＲＰの結合を測定した。値は、ア ンタゴニストの不存在下に得られた特異的結合の百分率として表す。非特異的結 合は３００倍過剰の非標識ＧＲＰの添加により決定した。各点は３回の決定の平 均を表す。中央：　　［”Ｉ］　ＧＲＰについてのスイス３Ｔ３細胞中の結合部 位の親和性へのアンタゴニストＤの作用、全面および休止の細胞を２回ＤＭＥＭ で洗浄し、次いで種々の濃度の［”Ｉ］　ＧＲＰをを含有するｌｎＪの結合媒質 中でｌθμモルのＤの不存在（・）または存在（Δ）下に３７℃において３０分 間インキユベーシーンした。特異的結合（Ｂ）をピコモル（ｐｍｏｌ）／１０’ 細胞で表し、そして二重逆数プロットで示す。各点は２回の決定の平均を表す、 右：ポンベシンのレセプター会合分子量７５０００〜８５０００タンパク質の親 和性標識付けへのアンタゴニストＡおよびＤの作用。スイス３Ｔ３細胞の全面培 養物を２回ＤＭＥＭ？洗浄し、そし”Ｃ０，５＋１モル（７）［”’１３　ＧＲ ＰおＪ：び種々の濃度のアンタゴニストを含有する１ｍＭの結合媒質（ｐＨ７， ０）（１５）中で１５℃においてインキュベーションした。２時間後、培養物を ２回結合媒質で洗浄し、次いで６ミリモルのエチレングリコールビス（スクシニ ミジルスクシネート）（ＥＧＳ）を含有する１ｍ（皿中でｐＨ７，４および１５ ℃において１５５分間インキュページシンた。次いで、培養物を冷リン酸塩緩衝 生理的塩類溶液で２回洗浄し、０．１ｍＭの２×試料緩衝液中に可溶化し、次い で直ちに１００℃に５分間加熱し、そして１０％のポリアクリルアミドゲルの電 気泳動にかけた。

！ｉ厘：　Ｇ　ＲＰにより刺激された早期の細胞の応答への［ＤＰｒｏ”］スバ ンチド（Ａ）および［Ｄ　Ｐ　ｈ　ｅ　’］スパンチド（Ｄ）の作用。左＝［Ｃ ａ”］、へのアアンタボニスの作用。サイトデツクス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）２上で 成長させた休止のスイス３Ｔ３細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、そして１ミリモル のフラーテトラアセトキシメチルエステルとｌＯ分間インキニベーシ朦ンし、次 いで３回洗浄し、そして２ｍ（ｌの電解質溶液（６）中に３７℃において懸濁さ せ、そして撹拌した。蛍光を、３３５％Ｍの励起波長および５１０％Ｍの放射波 長でパーキン−エルマーＬＳＴルミネセンス分光光度計において連続的に記録し た。平衡化の期間後、次の添加を実施した：溶媒、且；アンタゴニストＡ、９μ モル紅旦および２０μモル、Ａ、２０；およびアンタゴニストＤ、５μモル、Ｐ 工ｊ−０冬場合において５分後、ＧＲＰをｌｐモル、旦または５０μモル、Ｇ、 ２０で添加した；　ＰＤＧＦ％　１ナノモル、旦、右：アンタゴニストＡおよび ＤはＧＲＰにより誘発された［”’！］　ＥＧＦの結合の阻害を逆転する。スイ ス３Ｔ３細胞の全面および休止の培養物をＤＭＥＭで２回洗浄し、次いで０．２ ナノモルの［”’Ｉ］　ＥＧＦおよび３．６ナノモルのＧＲＰを含有する１ｍ１ ２の結合媒質（９）の単独（−）中であるいは種々の濃度のＡ（○）またはＤ（ △）の存在下に１時間３７℃においてインキュベージ１ンした。値は、０．２ナ ノモルの［＋！１１　］ＥＧＦ単独を使用して得られた特異的結合の百分率とし て表す、非特異的結合は５００倍過剰の非標識ＥＧＦの添加により得られｔ；。

各点は６回の決定の平均を表す。

第６図：　　［ＤＰｒｏ”］スパンチドは５ＣＬＣの成長を可逆的に阻害する。

細胞系Ｈ６９、Ｈ１２８８よびＨ４１７の原培養物を、１０％の胎児子ウシ血清 （加熱不活性化した）を有するＲＰＭＩ　　１６４０中で１０％のＣＯ２：９０ ％の空気の加湿した雰囲気中で３７℃において維持Ｌｔ：。ＨＩＴＥＳ　（２９ ）（ヒドロコルチゾン、ｌＯナノモル；インスリン、５　／ｌ　ｇ／ｍＱ　；　 ）ランス７エリン、１００μｇ／ｍ１２　　；　ｌ　７β−エストラジオール、 ｌＯナノモル；ナトリウムセレナイト、３０ナノモル）および０．２５％のウシ 血清アルブミンを補充しＩ：ＲＰＭＩ　　１６４０の血清不合媒質中で、同一の 結果が得られた。細胞を２回ＲＰＭ１　１６４０で洗浄し、次いで１５０μモル の［ＤＰｒｏ”］　スパンチドの不存在（・）または存在（口、■）においてイ ンキュベーションした。４日後、それらを再び２回ＲＰＭＩ　　１６４０媒質で 洗浄し、次いで５Ｘ１０’細胞／ｍ１２の密度で、１５０μモルの［ＤＰｒｏ” ］スパンチドのの不存在（・、口）ま１；は存在（■）において再懸濁した（第 ０日）、１９Ｇおよび２１Ｇの針に通過させることにより細胞Ｐ塊を破壊ｔ、　 ｔ：　ｔ　、細胞の数をコールタ−カウンターで１４日間にわｔ；つだ間隔を置 いて決定した。各点は３回の決定の平均を表す。

第７図：　　［ＤＰｒｏ”］　スバンチドおよび［ＤＰｈｅ’］　スバンチドに よる５ＣＬＣの成長の阻害は、濃度依存性である。Ｈ６９細胞の培養物を２回Ｒ ＰＭＩ　　１６４０で洗浄し、次いで血清不合媒質で（第６図におけるように） 種々の濃度の［ＤＰｒｏ”］　スパンチド（Ｏ％Ａ）および［Ｄ　Ｐ　ｈ　ｅ　 ’］スパンチド（△、Ｄ）の不存在（・）または存在においてインキュベーショ ンした。１９Ｇおよび２１Ｇの針に通過させることにより細胞の塊を破壊した後 、細胞の数をコールタ−カウンターで決定した。試料を１３日間インキュベージ タンし、このとき、矢印により示した、対照（インセット）は１０倍の数に到達 した。各点は５回の決定の平均（±標準偏差）を表す。

表１ 分子量７５０００〜８５０００タンパク質の”’Ｉ−ＧＲＰ親和標識っけの特異 性 添加　　　　　　　　　　　　対照の分子量７５０００−８５０００タンパク質 の％ＧＲＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８ＧＲＰ（１ ４−２７）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　”ボスベシン　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　０・５リドリン　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　２ニユーロメジン　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌＯ［Ｄ− Ａｒｇ”、Ｄ−Ｐｒｏ”、Ｄ−Ｔｒｐ’＊−Ｌｅｕ”］　　　　　　　　　　　 ９．７サブスタンス ＧＲＰ（１−１６）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９３ＰＤＧＦ　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９９インスリン　　　　　　　　 　　　　　　　　　　９０ホルボール１２．１３−ジブチレート９９サブスタン スＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　９１サブスタンスＫ　　　　　　　　 　　　　　　　　　９４ソマトスタチン　　　　　　　　　　　　　　　　９７ ニユーロテンシン　　　　　　　　　　　　　　　９３スイス３Ｔ３細胞の全面 培養物を、１２″Ｉ−ＧＲＰ　（０，５ナノモル）と、示す濃度において次のＧ ＲＰ関連ペプチドの不存在（−）または存在において１５℃において２．５時間 インキュベーションした：ＧＲＰ（３６０ナノモル）、ＧＲＰの１４−２７アミ ノ酸断片（ＧＲＰ　（１４−２７））（３０ナノモル）、ボンベシン（３０ナノ モル）、リドリン（９２ナノモル）、ニューロメジンＢ（２２０ナノモル）、ボ ンベシンのアンタゴニスト［Ｄ−Ａ　ｒ　ｇ’ｓ　Ｄ−Ｐ　ｒ　ｏ”、Ｄ−Ｔｒ ｐ’、ｓ、ＬｅＵロ］サブスタンスＰ（１００ナノモル）およびＧＲＰの１−１ ６アミノ酸断片（ＧＲＰ　（１−１６））（３２３０ナノモル）、平行の培養物 を同一濃度の”’Ｉ−ＧＲＰと、次の無関係の因子の存在下にインキュベーショ ンした：　ＰＤＧＦ　（５ナノモル）　、ＥＧＦ　（８３ナノモル）、バンプレ シン（１０００ナノモル）、インスリン（ｌｐｇ／ｍ＜１）、ホルボール１２． １３ジブチレート（２０００ナノモル）、サブスタンスＰ（７４０ナノモル）、 サブスタンスＫ（８８０ナノモル）、ソマトスタチン（６１０ナノモル）および ニューロテンシン（６００ナノモル）。

インキュベージ２ン期間後、培養物を材料および方法に記載するように６ミリモ ルのＥＧＳで処理した。６値は添加なしく−）で得られた分子量７５０００〜８ ５０００タンパク質のレベルの百分率としてを表す。

他の実験の詳細は材料および方法に記載されている通りである。

Ｘ−里 Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、７６．１２８４−１２８７゜２、　Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、 Ｅ、およびＳｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉｔｈ、Ｊ、（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８０．２９３６−２９４０゜ ３、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、Ｊ、ｖｏｎ　Ｅｕ１ｅｒ、Ａ、Ｍ、およびＤａｌｓｇａ ａｒｄ、Ｃ，Ｊ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１５゜６１−６３゜ ４、　Ｐａｙａｎ、Ｄ、Ｇ、（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒ ｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１３０．１０４−１０９゜５、　Ｓｉｎｇｈ、Ｐ、、Ｗａ ｌｋｅｒ、Ｐ、、Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｃ，Ｍ、ＪｒおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ　、 　Ｊ　、Ｃ（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５−４６．１６１２−１６１６゜６ 、　Ａｎａｓｔａｓｉ、Ａ、、Ｅｒｐｓａｍｅｒ、ＶおよびＢｕｃｃｉ、Ｍ、（ １９７１）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　２７．１６６−１６７゜ ７、　ＭｃＤｏｎａｌｄ、Ｔ、Ｊ、　、　Ｊｏｒｎｖａｌ　１．Ｈ，、Ｎｉ　１ ｓｓｏｎ、Ｇ、　、Ｖａｇｎｅ、Ｍ、　、Ｇｈａｔｅｉ　、l、　、Ｂｌｏｏｍ 。

Ｓ、Ｒ，およびＭｕ　ｔ　ｔ　、　ｖ、ｔ　１９７９）Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、Ｂ 　１ｏｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ　、９０　＋　２Q７−２３３ｓ ８、　Ｗｈａｒｔｏｎ、Ｊ、、Ｐｏ１ａｋ、Ｊ、Ｍ、、Ｂｌｏｏｍ、Ｓ、Ｒ，、 Ｇｈａｔｅｉ、Ｍ、Ａ、、５ｏｌｉｃｉａ、Ｅ、、Ｂｒｏｗ氏B Ｍ、Ｒ，およびＰｅａｒｓｅ、Ａ、Ｅ、Ｇ、（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７３． ７６９　−７７（Ｌ９、　Ｍｏｏｄｙ、Ｔ、Ｗ、およびＰｅｒ　ｔ　、Ｃ、Ｂ　 、　（１９７９）Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、Ｂ　ｉ　ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ　、Ｃｏ＋ 盾＝{ｕｎ、９０　＊ ７−１４゜ １０、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、　、Ｋａｎｇａｗａ、に、およびＭａｔｓｕｏ、 Ｈ，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、ｃｏａ＋＋ａｕｎ、１１４．５４１−５４８゜１１、Ｍｉｎａａ＋ｉｎ ｏ、Ｎ、　、Ｋａｎｇａｗａ、に、ｉｉよびＭａ　ｔ　ｓｕｏ　＊　Ｈ、（１９ ８４）Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅ＋＊　、Ｂ@ｉ　ｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、ｌ１９．１４−２０゜１２、Ｍｉｎａｍｉｎｏ、Ｎ、、 ５ｕｄｏｈ、Ｔ、Ｊａｎｇａｗａ、に、８よびＭａｔｓｕｏ、Ｈ，（１９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１３０．６８５−６９１ｍ１３　、Ｚ ａｃｈａｒｙ　＊　１　＋およびＲｏｚｅｎｇｕｒ　ｔ　、Ｅ　、　（１９８５ ）Ｐｒｏｃ　、Ｎａ　ｔ　１　、Ａｃａｄ　、Ｓメ@ｉ　、ＵＳＡ　、８２゜ ７６１６−７６２０゜ １４、Ｂｒｏｗｎ、に、Ｄ、　、Ｂｌａｙ、　Ｊ、　、　Ｉ　ｒｖｉｎｅ　、Ｒ ，Ｆ、　、Ｈｅｓ　ｌｏｐ、　Ｊ、Ｐ、およびＢｅｒｒｉｄ■■AＭ、Ｊ。

（１９８４）Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍ、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ 、　１２３　、３７７−３８４゜１５、Ｗａｋｅ　ｌａｍ、　Ｍ、Ｊ　、０．Ｄ ａｖｉｅｓ　、　Ｓ、Ａ、　、　Ｈｏｕｓ　ｌａｙ、　Ｍ、Ｄ、　、　Ｍａｌａ ｙ、　Ｉ　、@、　Ｍａｒｓｈａｌ　１　、Ｃ，Ｊ およびＨａｌ　ｌ　、Ａ、（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２３．１７３−１７６゜ １６．１ｌｅｎｄｏｚａ　、Ｓ、Ａ　、　＋　５ｅｈｎａｉｄｅｒ　、　Ｊ　、 Ａ、　、　Ｌｏｐｅｚ−Ｒｉｖａｓ　、　Ａ　、　、　５ｉ獅獅■狽煤|Ｓｉｎ １Ｌｈ　＋　Ｊ　、　Ｗ。

およびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、（１９８６）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１０２ ．２２２３−２２３３゜１７、Ｚａｃｈａｒｙ、１．、Ｓｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉ ｔｈ、Ｊ、Ｗ、およびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、（１９８６）Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉ ｏ１．１０２．２２１１−２２２２゜１ｇ、Ｍｏｏｄｙ、　Ｔ　、Ｗ、　、Ｐｅ ｒｔ　、　Ｃ，Ｂ、　、Ｇａｚｄａｒ　、　Ａ、Ｆ、　、　Ｃａｒｎｅｙ、　Ｄ 、Ｎ、およびＭｉ獅獅＝AＪ、Ｄ− （１９８１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１４．１２４６−１２４８゜１９、Ｗｏｏｄ　 、　Ｓ、Ｍ、Ｗｏｏｄ　、　Ｊ　、Ｒ，、Ｇｈａｔｅ　ｉ　、ＭＪ、　、Ｌｅｅ 、Ｙ、Ｃ，、Ｏ’　Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓ凵@、　Ｄ、およ びＢｌｏｏｍ、Ｓ　、Ｒ，（１９８１）Ｊ　、ＣＩ　ｉｎ、Ｅｎｄｏｃｒ　ｉｎ 、Ｍｅｔａｂ、５３　、１３１０−１３１２゜２０、Ｅｒ　ｉｓｍａｎ　、　Ｍ 、Ｄ、　、　Ｌ　１ｎｎｏｉ　ｌａ、　Ｒ，１，、Ｈａｒｎａｎｄｅｚ　、Ｏ， 、ＤｉＡｕｇｕｓｔ　ｉｍ■A　Ｒ，Ｐ、およ びＬａｚａｒｕｓ　、Ｌ　、Ｈ、（１９８２）Ｐｒｏｃ　、Ｎａ　ｔ　１　、Ａ ｃａｄ　、Ｓｃ　ｉ　、　ＵＳＡ　、７９．２３７９−２３W３゜ ２１　、Ｒｏｔｈ　、　Ｋ、Ａ　、　、　Ｅｖａｎｓ　、Ｃ，Ｊ　、　、　Ｗｅ ｂｅｒ　、Ｅ、　、Ｂａｒｃｈａｓ　、　Ｊ、Ｄ、　、　Ｂ盾唐狽浴@ｉｃｋ、 　Ｄ、Ｇ、およ びＢｅｒｓｃｈ、に、Ｇ、（１９８３）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３．５４１１ −５４１５゜２２、Ｃｕｔｔ　ｉｔａ　、Ｆ、　、Ｃａｒｎｅｙ、Ｄ、Ｎ　、　 、　Ｍｕ　１ｓｈｉｎｅ　、　Ｊ　、　、　Ｍｏｏｄｙ、　Ｔ　、Ｕ、　AＦｅ ｄｏｒｋｏ、　Ｊ　、　。

Ｆｉｓｃｈｌｅｒ、Ａ、およびＭｉｎｎａ、Ｊ、Ｄ、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ 　３１６．８２３−８２６゜２３、Ｐｉｌｃｈ、Ｐ、Ｆ、およびＣｚｅｃｈ、Ｍ 、Ｐ、（１９７９）Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２５４．３３７５−３３８１− ２４、Ｍａｓａｑｕｅ、Ｊ、　、Ｇｕｉｌｌｅｔｔａ、Ｂ、Ｊ、およびＣｚｅｃ ｈ、Ｍ、Ｐ、Ｃ，（１９８１）Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ。

２５６．２１２２−２１２５゜ ２５、Ｇｌｅｎｎ、に、　、Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ、Ｄ、Ｆ、およびＲｏｓｓ、 Ｒ，（１９８２）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７゜５１７２−５１７６゜ ２６、Ｗｏｏｄ、Ｃ，Ｌ、およびＯ’　Ｄｏｒ　ｉｓ　ｉｏ、Ｍ、Ｓ、（１９８ ５）Ｊ　、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２６０．１２４３−１２S７゜ ２７、Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｍ、Ｂ、　、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、　１．５．および ５ｔｒｏａ＋ｉｎｇｅｒ、Ｊ、Ｌ、（１９８５）Ｃｅ１１４０．１８３−１９０ ゜ ２８．５ｏｒｅｎｓｅｎ　、　Ｐ、　、　Ｆａｒｂｅｒ　、　Ｎ、Ｍ、およびＫ ｒｙｓｔａｌ　、Ｇ、（１９８６）Ｊ　、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈ■{ｍ、２６１　。

９０９４−９０９７゜ ２９、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、　、Ｂｒｏｗｎ、に、Ｄ、およびＰｅｔｔｉｃ ａｎ、Ｐ、（１９８１）Ｊ−Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｗ、２５６゜７１６−７２２゜ ３０、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、　、Ｃｏｌ　１ｉｎｓ、Ｍ、　、Ｂｒｏｗｎ、 に、Ｄ、およびＰｅｔｔｉｃａｎ、Ｐ、（１９８２）Ｊ。

Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、２５７．３６８０−３６８６゜３１　、Ｌａｅｍｍｌ　 ｉ　、Ｕ、に、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５゜３２．０ ’　Ｆａｒｒｅ　ｌ　、　Ｐ、Ｍ、（１９７５）Ｊ、Ｂ　ｉｏ　ｌ　、Ｃｈｅｍ 、２５０　、４００７−４０２１−３３、Ｔｏｄａｒｏ、Ｇ、Ｊ、およびＧｒｅ ｅｎ、Ｈ，（１９６３）Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｏｉｌ、１７．２９９−３１３゜３４ 、Ｄｉｃｋｅｒ、Ｐ、およびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、（１９８０）Ｎａｔｕｒ ｅ　２８７．６０７−６１２ｍ３５、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｒ，Ｔ、　、　Ｊｏｎｅｓ 、Ｓ、Ｗ、　、Ｆｏｌｋｅｒｓ、に、およびＧａｒｄｎｅｒ、Ｊ−Ｄ、（１９８ ４）Ｎａｔｕｒｅ　３０９，６１−６３゜ ３６、Ｚａｃｈａｒｙ、！、およびＲｏｚｅｎｇｕｒ　ｔ　、　Ｅ　、　（１９ ８６）Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ　、Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ　＋bｏｍｍｕｎ＋ １３７、１３５−１４１゜ ３７、Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ　、　Ｅ、　、　５ｔｒｏｏｂａｎｖ　、　Ｐ、　、 　Ｗａｔｅｒｆ　１ｅｌｄ　、　Ｍ、Ｄ、　、　Ｄｅｕｅｌ@、丁、Ｆ、および Ｋｅｅｈａｎ、Ｍ、（１９８３）Ｃｅｌｌ　３４．２６５−２７２゜３８、Ｄｉ ｃｋｅｒ、Ｐ、およびＲｏｚｅｎｇｕｒｔ、Ｅ、（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ　２ ７６．７２３−７２６゜３９、Ｗｒａｙ、Ｗ、　、Ｂｏｕｌ　１ｋａｓ、Ｔ、　 、Ｗｒａｙ、Ｖ、Ｐ、およびＨａｎｃｏｃｋ、Ｒ，（１９８１）Ａｎａｌｙ−Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、１１８．１９７−２０３゜対照の％ 分子量７５０００−８５０００．　　任’ｔノｌＩＬ位［３Ｈ１チミジンの組み 込み、。１０ ＩＣａ２°１．、ｎＭ ペプチドの結合１％ 細胞の数ｔ　ｉＱ−” 細胞の数、ｉｏ”５ 補正口の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００２５５ ２、発明の名称 増殖因子のレセプターに関する改良 ３、特許出願人 ４、代理人　〒１０７ ６、添付書類の目録 （１）補正口の写しく翻訳文）　　　　　　　　　　１通本発明は、増殖因子の レセプターに対するアンタゴニスト、とくにボンベシン（ｂｏｍｂａｓ　ｉｎ） レセプターに対するアンタゴニストｊ二関する。

ボンベシンに構造的に関係する両生類のテトラデ力ペプチドポンペシン（６）お よび哺乳類のペプチドは、ガストリン解放性ペプチド（ＧＲＰ）およびニューロ メジン（ｎｅｕｒｏｍｅｄｉｎ）類（７〜１２）を包含し、細胞の増殖の制御に 関係すると信じられる増殖因子である。ボンベシン様ペプチドは、小さい細胞肺 癌中に高い濃度で存在しく１８〜２１）、ここでそれらはオートクリン（ａｕｔ ｏｃｒｉｎｅ）増殖因子として作用できるであろう（２２）。ペプチドのボンベ シン基は細胞中でレセプターと相互作用するが、ある量はペプチドのボンベシン 基の化学について知られているが、ボンベシン様ペプチドのレセプターの化学に ついては非常にわずかしか知られていない。細胞の増殖におけるボンベシン様ペ プチドの参加およびボンベシン／レセプターの相互作用の存在または不存在の細 胞の増殖への関係をかんがみて、レセプターの詳細な研究は重要であることが明 らかである。

今回、特徴づけることができる、ボンベシン族のある種のペプチドに対するある 種のレセプターを同定することができる方法をわれわれは開発した。、そしてそ れはこのようなレセプターを使用し、そして、さらに、本発明は、このようなレ セプターに対するアンタゴニストおよび抗体に関する。ペプチドのボンベシン族 は、事実、お互いに構造的な差を有するが、また、共通の７−アミノ酸配列を有 しそして、われわれが同定したレセプターは、ボンベシン様ペプチドの由来の種 に無関係に、ボンベシン族の種々の構成員として作用することができると、われ われは信する。

われわれが同定したレセプターは、次の特徴を有するポリペプチドである： １１少なくとも２つのマンノース側鎖を有する、単一鎖のグリコポリペプチドで あり、 ２、ボンベシンタイプのポリペプチドに特異的に結合し、３．７５〜８５キロダ ルトン（Ｋｄ）の分子量を有し、４．６．４〜６．９の等電点を有し、 ５、フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのエンド−ベーターＮ−グルコサミ ニダーゼを使用して得られた、そのコアタンパク質は約４２Ｋｄの分子量を有し 、 ６、前に定義したように、アンタゴニストＡおよびアンタゴニストＤの両者に結 合する。

本発明は、他の面において、上に定義したグリコポリペプチドのレセプターに対 するアンタゴニストを提供する。これらのアンタゴニストは、ボンベシンおよび ボンベシン様ペプチドと構造的に非常に異なるが、ボンベシンのレセプターに結 合し、そしてボンベシンの作用を阻害する３七ができる物質であるが、われわれ は、そうでなければボンベシン様ペプチドにより占有されるであろう結合部位を 占有することによらないと、信する。ボンベシン様ペプチドは小さい細胞の肝癌 中に高い濃度で存在するとして同定され（１８〜２１）、そしてオートクリン増 殖因子として作用することができる（２２）ので、ボンベシンのアンタゴニスト は、レセプター／ボンベシンのペプチドの相互作用を妨害し、それゆえボンベシ ン様増殖因子により影響を受ける癌細胞増殖のパターンを妨害する手段を提供す るうえで重要である。今回、われわれが同定したボンベシンのアンタゴニストは ヒトの小さい細胞の肺＄：（ｓｍａｌｌ　　ｃｅｌｌｌｕｎｇ　　ｃａｎｃｅｒ ）（ＳＣＬＣ）系統の増殖を阻害することができ、それゆえ、有望な治療的寅在 物として重要であることを、われわれは示しｔ二。

いわゆるサブスタンス（Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）Ｐは、次の式を有する、痛みの伝 達の研究において重要な、１１−マーのニューロペプチドである二 Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌ　 ｙ−Ｌｅ　ｕ−Ｍｅ　ｔ　−ＮＨ。

アンタボニス）ＡおよびＤのわれわれの研究は、改良されｔ；ボンベシンのアン タゴニストを産生ずるこのタイプの化合物においてアミノ酸位置５における構造 的重要性をわれわれに示しそして、本発明は、位置５におけるアミノ酸がＤ−Ｔ 　ｒ　ｐ％Ｄ−Ｔｙ　ｒまたはＭｅ−Ｐｈｅである、アンタゴニストＡ上のアミ ノ酸位置５の変異型である新規な化合物に拡張され、そして、制御されないａｍ の成長がボンベシン族のタンパク質の障害に関連する癌の治療または診断により ヒトまたは動物の体を処置する方法において、使用するためのアンタゴニストＡ およびアンタゴニストＤのこのような位置５変異型に拡張される。

適当な位置５変異型は、次のとおりである：本発明のアンタゴニストは、製剤学 的に許容されうる担体または希釈剤、例えば、普通の非経口的担体と配合し、こ うしてアンタゴニストを非経口的に投与することができ、ここでそれらは制御さ れない細胞の成長がボンベシン族のタンパク質の障害と関連する、癌の診断まｌ ；は治療において、使用するために重要性をもつ。アンタゴニストは、まｔ；、 制御されない細胞の増殖の処理のための薬物の製造において使用するために重要 性をもつ。

本発明のアンタゴニストは、制御されない細胞の増殖に悩まされる疑いのある宿 主からの体の試料を、アンタゴニストまたは抗体を接触させる工程を包含する、 制御されない細胞の増殖の生体外診断方法において、使用するために重要性をも つ。この方法は、組織学まｔ；は血清のアッセイによる癌の診断においてとくに 有用である。

レセプターの分離および分子の特徴づけは、それらの同定ののための手順を必要 とし、そして他の系において膜レセプターを同定するために既に使用されてきた （２３〜２８）ある種の二官能性架橋試薬の使用を包含する系をわれわれは開発 した。われわれは、架橋剤のエチレングリフールビス（スクシニミジルスクシネ ート）を使用して　＋２ｓｌ標識ガ゛　ストリン解放性ペプチドＣ！″１−ＧＲ Ｐ）をスイス３Ｔ３細胞における表面タンパク質に共有結合しｔ；。この表面タ ンパク質は、スイス（Ｓｗｉ　ｓ　ｓ）３７３ｍ胞から分離すると、ボンベシン 族のペプチドのｔ；めの特異的レセプターの特性を表す。このタンパク質は、ボ ンベシン様ペプチドのためのレセプターの性質を示さない他の細胞系中に存在し ない。

さらに詳しくは、本発明のポリペプチドのレセプターは、スイス３Ｔ３細胞の培 養物を、１２５１標識ガストリン解放性ペプチド（”Ｉ−ＧＲＰ）を含む培地中 でインキュベージコンし、さらに”’Ｉ−ＧＲＰ処理したスイス３Ｔ３細胞を二 官能性架橋試薬の存在下にインキュベージコンし、そして生ずる＋ｘｓ■−ＱＲ Ｐ／架橋試薬／ポリペプチドの接合体を可溶化して、前記細胞の表面からポリペ プチドを解放することからなる、方法により、分離することができる。

スイス３Ｔ３細胞は、実験の使用のために広く入手可能であり、そしてアメリカ ン・タイプ・カルチャー・コレクシ謬ン（ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙ ｐｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、米国マリイラン州ロックビ レ）から、受託番号ＡＴＣＣ−ＣＣＬ９２で入手可能である。

次の寅施例によって、本発明をさらに説明する。

請求の範囲 １、位置５におけるアミノ酸がＤ−Ｔｒｐ％Ｄ−ＴｙｒまたはＭｅ　−Ｐｈｅで ある、アンタゴニストＡまｔ；はアンタゴニストＤの位置５変異型。

２、請求の範囲第１項記載の位置５変異型および製剤学的に許容されうる担体ま たは希釈剤からなる製剤学的組成物。

３、治療によるヒトまたは動物の体の処置の方法において、あるいは診断の方法 において使用するための、上記第１項記載の位置５変異型。

４、制御されない細胞の増殖の処置のための薬物の製造において使用するための 、アンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤまたは請求の範囲第１項において定 義した位置５変異型。

５、制御されない細胞の増殖１；悩まされる疑いのある宿主からの体の試料およ びアンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤまたは請求の範囲第１項において定 義した位置５変異型をお互いに接触させる工程を包含する、制御されない細胞の 増殖の生体外診断方法。

６、処置を必要とする宿主に、有効量のアンタゴニストＡまたはアンタゴニスト Ｄまたは請求の範囲第１項において定義した位置５変Ａｆｆｉを非経口的に投与 することからなる、宿主における制御されない細胞の増殖を処置する方法。

国際調査報告 １ｍｓ、、、ａｅ〜ｌ　ａｅ−ａ＋ｎ＋、　ｈ。　　ＰＣ：・Ｇ＝　ε８１００ ２三ニー２−１汽ｕ−―−＋虐＠ｌｊ＾−ＮＩＵ、＠ｌＴ１１・？Ｃ：！Ｇ２ミ εε、：：：三；国際調査報告 Ｇ；託００２５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の特徴： １、少なくとも２つのマンノース側鎖を有する、単一鎖のグリコポリペプチドで あり、 ２、ボンベシンタイプのポリペプチドに特異的に結合し、３、７５〜８５キロダ ルトン（Ｋｄ）の分子量を有し、４、６．４〜６．９の等電点を有し、 ５、フラボバクテリウム・メニンゴセプチクム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）からのエンドーベータ−Ｎ−グルコサミニ ダーゼを使用して得られた、そのコアタンパク質は約４２Ｋｄの分子量を有し、 ６、前に定義したように、アンタゴニストＡおよびアンタゴニストＤの両者に結 合する、 を有するポリペプチド。 ２、スイス（Ｓｗｉｓｓ）３Ｔ３細胞の培養物を、１２５Ｉ標識ガストリン解放 性ペプチド（１２５Ｉ−ＧＲＰ）を含む培地中でインキュベーションし、さらに １２５Ｉ−ＧＲＰ処理したスイス３Ｔ３細胞を二官能性架橋試薬の存在下にイン キュベーションし、そして生ずる１２５Ｉ−ＧＲＰ／架橋試薬／ポリペプチドの 接合体を可溶化して、前記細胞の表面からポリペプチドを解放することからなる 、請求の範囲第１項記載のポリペプチドの分離方法。 ３、前記架橋試薬はエチレングリコールビス（スクシニミジルスクシネート）で ある、請求の範囲第２項記載の方法。 ４、前記接合体を会合した不純物からゲル電気泳動により分離する、請求の範囲 第２または３項記載の方法。 ５、アンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤの位置５変異型。 ６、位置５はＤ−Ｔｒｐ、Ｄ−ＴｙｒまたはＭｅ−Ｐｈｅにより置換されている 、請求の範囲第５項記載の位置５変異型。 ７、請求の範囲第１項において定義したポリペプチドに対する抗体。 ８、請求の範囲第７項記載のモノクローナル抗体。 ９、脊椎動物に免疫原として請求の範囲第１項において定義したポリペプチドを 注射する工程をふくむ、請求の範囲第７または８項において定義した抗体を産生 する方法。 １０、請求の範囲第１項において定義したポリペプチドを有する固相と、あるい は請求の範囲第１項において定義したポリペプチドをその表面に支持するスイス ３Ｔ３細胞を有する固相と、抗体を接触させて、抗体／抗原の接合体を形成し、 そして前記接合体から構製された抗体を解放する工程を包含する、請求の範囲第 ７または８項において定義した抗体を精製する方法。 １１、請求の範囲第５または６項記載の位置５変異型あるいは請求の範囲第７ま たは８項記載の抗体および製剤学的に許容されうる担体または希釈剤からなる製 剤学的組成物。 １２、治療によるヒトまたは動物の体の処置の方法において、あるいは診断の方 法において使用するための、アンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤまたは請 求の範囲第５または６項において定義した位置５変異型または請求の範囲第７ま たは８項において定義した抗体。 １３、制御されない細胞の増殖の処置のための薬物の製造において使用するため の、アンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤまたは請求の範囲第５または６項 において定義した位置５変異型または請求の範囲第７または８項において定義し た抗体。 １４、制御されない細胞の増殖に悩まされる疑いのある宿主からの体の試料およ びアンタゴニストＡまたはアンタゴニストＤまたは請求の範囲第５または６項に おいて定義した位置５変異型または請求の範囲第７または８項において定義した 抗体をお互いに接触させる工程を包含する、制御されない細胞の増殖の生体外診 断方法。 １５、処置を必要とする宿主に、有効量のアンタゴニストＡまたはアンタゴニス トＤまたは請求の範囲第５または６項において定義した位置５変異型または請求 の範囲第７または８項において定義した抗体を非経口的に投与することからなる 、宿主における制御されない細胞の増殖を処置する方法。