JPH02501933A - 医薬の宿主感受性細胞に取り込まれる能力を向上させるためのニトロフェニル基の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 医薬の宿主感受性細胞に取り込まれる能力を向上させるためのニトロフェニル基 の使用 本発明は、医薬活性成分を被投与宿主の感受性細胞に取り込まれ易くするために 該医薬活性成分の変性に使用されるニトロフェニル基に係る。

ニトロフェニル基なる用語は、ジニトロフェニル基またはトリニトロフェニル基 を有する分子、及びそれらの誘導体を意味すると理解されたい。

感受性細胞なる用語は、宿主の細胞中でニトロフェニル基を認識し得る標的とな る細胞すべてを意味すると理解されたい、かかる標的細胞として特に、Ｔリンパ 球、Ｂリン病原体例えば悪、染性ウィルスと対応悪受性ａｒｍとの間のｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ相互作用によって、対応する怒染性疾患または自己免疫疾患に罹患した 宿主の天然抗体（＾ｃＮ）の抗体価が変化することは既に観察されている。この ような＾ｃＮは、ヒト及び動物の血清及び生物液体に含まれた抗体であり、「自 己」及び「非自己」の抗原（八２）を認識し得る。これらの＾ｃＮは、所定の病 原体に対して予め計画的に免疫化されていないヒト及び動物の生物液体中に存在 する。

＾ｃＮは多特異性を有しまたしばしば所与の抗原に対して高い親和性を有するの で（Ｔ、　Ｔｅｒｎｙｎｃｋ、　Ｓ、＾ｖｒｉｍｅａｓ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、　Ｒ ｅｖ、　１９８６）、病原体中に存在する複数の抗原を認識することが可能であ る。更に注目すべきは、これらの＾ｃＮのうちのいくつかは抗ジニトロフェニル （ＤＮＰ）型活性または抗トリニトロフェニル（丁ＨＦ）型活性を有しておりあ る種の病理状態（自己免疫疾患及びウィルス感染）ではこれらの血清抗体（抗Ｎ Ｐ）の抗体価が有意に変化することである（ｐ、　Ｍａｔｓｉｏｔａ等、Ｃｌ１ ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ。１９８７．　Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ　１９８７）。

説明の便宜上、１つ、好ましくは２つまたは３つのニトロ基をもつニトロフェニ ル基を含有する分子をＮＰなる用語で総称する０分子ＮＰは好ましくはニトロフ ェノール類である。その他の重要な分子としては特に、２，４−ジニトロフェニ ル（ＤＮＰ）または２，４．６−　）ジニトロフェニル（ＴＮＰ）がある。

このような自己免疫疾患またはウィルス感染が存在するとき、抗ＮＰ活性を有す る抗体（抗ＮＰＡｅ）の抗体価はその他の天然抗体の抗体価を有意に上回ること が知見された。これらの結果は、エイズウィルス（ＩＩＩＶ）を原因とする感染 症に関する研究（「抗ＲＩＶ陽性個体の血清中の天然自己抗体の検出」、Ｐ、　 Ｍａｔｓｉｏｔａ等、Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｉｍｍｕｎｏｌ 　１９８７゜１３８、２２３〜２３３）、及び、全身性エリテマトーデスに関す る研究（「全身性エリテマトーデスにおける天然抗体」、Ｐ。

Ｍａｔｓｉｏｔａ等、Ｃｌ１ｎ、　ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８７）６９ ．７９〜８８）を主題とした刊行物にも発表されている。

発明者等は、病原体に感受性の細胞と抗ＮＰ抗体によって認識されるＮＰ誘導体 とをｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで接触させると、大部分の場合には 、対応する感受性細胞においてＮＰの少なくとも一部のインターナリゼーション が生じることを知見した０本発明はこの知見に基づく。

言い替えると本発明は、発明者等が知見したＮＰの能力、即ち、ＮＰが感受性細 胞に侵入可能であり、ＮＰ特にＮＰのフェニル環の０１位またはフェノール位に 医薬活性成分を予め化学的に結合しておくと該活性成分がＮＰに随伴して感受性 細胞に侵入し得ることを利用したものである。言い替えるとＮＰは、医薬活性成 分に治療効果を発揮せしめる生物反応がその内部で生じる感受性細胞中に医薬活 性成分を誘発または有利に導入するベクター（運搬体）の機能を果たし得る。

従って本発明は、感受性細胞中で認識させるかまたはインターナリゼーションを 生じさせるべき医薬活性成分とＮＰとの結合によって得られる結合体に係る。

より詳細には本発明は、医薬活性成分が抗ウィルス剤、抗菌剤または細胞静止剤 のごとき治療活性を有する任意の化合物から構成され夫々の治療活性をｉｎ　ｖ ｉｖｏで特に罹患感受性細胞において発揮し得る前記のごとき複合体を提供する 。

本発明の結合体の好ましい実施態様において、医薬活性成分はＨＰから成るベク ターのフェニル環のＣ１位またはフェノール位に共有結合によって結合している 。

注目すべきは、ＨＦ、特にそのフェニル環の０１またはフェノール位と医薬活性 成分との結合によって、同時に非変性ＮＰ分子の不測のｉｎ　ｖｉｖｏ毒性が中 和され、しかも抗ＮＰ抗体によって認識され得るＮＰの能力は損なわれないこと である。

一般的に、ＨＰ分子と選択された医薬活性成分との結合は、ＮＰのフェニル環の ０１位またはフェノール位と医薬活性成分が保有する反応性官能基との間の適当 な任意の化学反応によって生起され得る６例えば、医薬活性成分がアミン官能基 を含む場合、該アミン官能基とＮＰのヒドロキシル基とを互いに結合させる適当 な任意の技術を使用し得る。変性分子がカルボキシル官能基を含むときはエステ ル化反応を利用し得る。

例えば、相補的官能基が夫々カルボキシル基とアミン基またはその逆から成ると き縮合剤は、例えばＮ−シクロへキシル−Ｎ−β−（Ｎ−メチル−モルホリノ− エチル）−カルボジイミドのｐ−）ルエンスルホン酸塩、（３−メチル）−アミ ノプロピル−カルボジイミド塩酸塩またはジシクロへキシルカルボジイミド塩酸 塩のようなカルボジイミドから構成され得る。

この場合、タンパク質化学で常用の条件下にエステル化反応を生起する。

また、出発物質の相補的官能基が夫々スルフヒドリル基とアミン基またはその逆 であるときは、縮合剤は６−マレイミトーカプロイツクーアシルーＮ−ヒドロキ シスクシンイミドエステルまたはＮ−スクシニミジル−３−（２−ピリジル−ジ チオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）から構成されてもよい。

適当な反応条件はまた、以下の論文、Ｊ、　ＣＡＲＬＳＳＯＮ等、Ｂｉｏｃｂｅ ＠、　Ｊ、（１９７８）、１７３．７２７〜７３７またはＰ、　Ｅ、　Ｔｌｌ０ ＲＰＥ等、Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　（１９８１）、１１６−５４ ４７〜４５４に記載されている。

医薬活性成分と該活性成分に結合したＮＰ分子の能力との適合性は、抗ＮＰ抗体 と結合体との間で免疫複合体を任意に形成せしめる条件下に不溶固体支持体に予 め固定した抗ＮＰ抗体と結合体とを接触させ該免疫複合体を検出するｉｎ　ｖｉ ｔｒ。

テストによって確認できる。

また、結合と医薬活性成分の治療活性の維持との適合性は、該成分が治療効果を 発揮し得る同じ感受性細胞に対する結合体の薬理学的効果とＨＰ非結合医薬活性 成分の薬理学的効果とを比較することによって確認できる。

また特に、活性成分の活性が結合体によって定量できるが該活性が結合体の影響 を受けない場合には、細胞内でインターナリゼーションを達成した活性成分の割 合を測定することが可能である。この測定試験においては、形成された結合体と 感受性細胞とをｉｎ　ｖｉｔｒｏで接触させ、前記接触に用いた培地から細胞を 分離し回収し、該細胞に保持された定量可能な活性を測定する（必要な場合には 定量の前に細胞の細胞壁を破壊する）。

前記医薬活性成分と結合後に感受性細胞と反応し得るＮＰの能力を確認するため には例えば、該結合体と感受性細胞とをｉｎ　ｖｉｔｒｏ接触させ、該感受性細 胞に取り込まれた該結合体の割合を検出するとよい、また必要に応じて、医薬活 性成分非結合の同じＮＰを同じ条件下に感受性細胞と接触させて測定した非結合 ＮＰの細胞内取り込みの割合と比較するとよい。

本発明はまた、本発明の結合体を含む薬剤組成物に係る。

これらの薬剤組成物の使用に際しては、本発明の結合体に導入される医薬活性成 分の性質及び対抗すべき病原体の性質に従って適当な投与量が個々のケース毎に 決定されることに注目されたい、また、適当な投与量は勿論、選択された治療法 に対する患者の種々の感受性の検査結果に基づいて臨床医が決定すべきである。

本発明の別の技術的特徴は以下の実施例から明らかであろう、この実施例の主な 目的は、特に感受性細胞が攻撃物質または病原体によって刺激されたときに該感 受性細胞に取り込まれる変性ＮＰの能力、即ち到着すべき標的細胞に対して医薬 活性成分を選択的に供給し得るベクター機能を果たすＮＰ自体の能力を示すこと である。

及１匝Ｌ マウスの１ンバ・の　に・−付則１１１竺！と舛月−（ａ）ＮＰ誘導体の調製− Ｌｉｔｔｌｅ　＆　Ｅｉｓｅｎの方法でＴＮＰをウシ血清アルブミン（ＢＳ＾） に結合した。　ｐＨ９，５の０．ＩＭの炭酸−炭酸水素バッファ中の２０Ｈｏｗ ｌのＢＳ＾溶液１１１１を同じバッファ中の２ｍｇ／ｚｌのトリニトロベンゼン スルホン酸溶液１ｍｌに添加する。所望の置換次第で３０〜１２０分後に余剰反 応体をイオン交換器（ＤＯＩＩＩＥＸ　１ｘ４）で除去することによって反応を 停止させ透析する。　ＢＳ＾１分子あたり１４分子または３０分子のＴＮＰで置 換されたＢｓＡ調製物（ＴＮＰ、、−ＢＳ＾またはＴＮＰ、。−ＢＳ＾）を使用 した。

ＤＮＰ〜グリシン（ＤＮＰ−にＩｙ）及びＤＮＰ−リジン（ＤＮＰ−Ｌｙｓ）を Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ　Ｓｉｇ論ａから入手し培地中で直接可溶化する。

（ｂ）１ｍ二１１ マウスの膵臓または胸腺に由来の細胞を使用する。マウスを頚管転位によって殺 し、無菌的に摘出した膵臓または胸腺をＲＰ旧培地にのせる。細胞を解離させ、 培地で１回洗浄し、赤血球を低温下に１分間塩化アンモニウム（０，９％）に溶 解させ、次いで細胞を完全培地で再度洗浄する。

Ｂ細胞またはＴ細胞のサブ集団を以下のごとく分離する。

−Ｔ細胞サブ集団：磁性ビーズ（ＭａＢｏｇｅｌ）またはベトリ皿に固定したマ ウス抗１．抗体を用い表面抗ＪＪＫｈを保有する細胞（Ｂ細胞サブ集団）を除去 することによって膵臓の細胞集団からＴ細胞を得る。

−Ｂ＃Ｉｌ胞サブ集団：（Ｔ＃胞の単離後に）抗１ｇ抗体を介して固定された支 持体からＢ細胞を機械的に分離した後、または金膵臓細胞集団をモルモット補体 で追跡される抗Ｔ細胞抗体で処理してＴ細胞サブ気団を除去した後にＢ細胞を得 る。

一胸腺ジンバ球：胸腺リンパ球をＲＰＮＩに解離させ、単離した細胞を培養以前 に完全培地で洗浄する。

（ｅ）乱１ユ１１ ウシ胎児血清（５％）とピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）とＬ−グルタミン（１ ＋Ｍ）と２−メルカプトエタノール（０，０５ｄ）とペニシリン（１００μ／１ ）とストレプトマイシン（５０μｙ／ｉｆ）とを含むＲＰＭ１１６４０を培地と して使用する。

種々の刺激物質（またはマイトジェン）（４０ｄｇｈｌのリボ多糖、Ｈ，Ｓ、　 Ｔｙｐｈｏｓａｌ、２ｐｇ／ｗＲのコンカナバリンＡまたは種々の希釈度のモノ クローナル抗体を含む培養上清または最終濃度２００ｎｙ〜２００ｐｇ／ａｌの ＴＮＰ−ＢＳ＾溶液）の存在下または非存在下に平坦底部を有する９６ウエルの 培養皿に、各細胞集団の２Ｘ１０’の細胞と４Ｘ１０’の非分画膵臓細胞とを最 終容量２００μ！に分配した。５％ＣＯ３の雰囲気下に３７℃で４８〜９６時間 培養する。

（ｄ）綴１ｕｌｌ覧ｍ 培養終了の６〜８時間前に各培養ウェルから１００μ！の上清を採取し抗体濃度 を試験する。　５０ｕＣｉ／ｚｌ’の３Ｈ−チミジン溶液１０Ｉ１１（比活性＝ ５μＣｉ＝　１８５ＧＢｑ／輸Ｍ）を培養物に添加して追跡する。自動コレクタ ーによって各ウェルの細胞をフィルターベーパーに収集し、乾燥後、フィルター ペーパーを液体シンチレータ−で測定する。

所与の細胞に対するＨＰ誘導体の作用に関して得られた結果を表Ｉに示す。

友Ｌ マウスら１ンバ　に　ＮＰ；　の　、 単独培地（Ｍ）またはリボ多糖添加培地（ＬＰＳ）またはコンカナバリン（ｅｏ ｎ＾）添加培地で得られた値に対する増加率（十）または阻害率（−）を計算す る。

シー 車：ＮＰ誘導体で細胞を４８時間処理した後にマイトジェンとしてコンカナバン ＾（ｅｏｎ　八）またはリボ多糖（ＬＰＳ）を細胞に添加し２４〜４８時間培養 を継続する。

ＮＰ誘導体ＴＮＰ−ＢＳＡ　ＤＮＰ−’！ＪシンＴＮＰ−！ＪシンＭ　ｃｏｎＡ ＊ＬＰｓ車　Ｍ　ｅｏｏＡ＊ＬＰｓ＊　Ｍ　ｅｏｎＡ＊ＬＰｓ本脛ｌＵ壮ｌ− ２００ｔＪ９／ｘｌ　＋５０＋４６　＋３０　−６４−５０　−６０　０　−６ 　−３１２　＋１０＋２８　０　−１０−３０　０　０　０　０２００ｕｔ／ｌ ｌ＋１００ｎｔ　＋１８　−９０ｎｔ　−８０−５０ｎｔ　ｎｔ５０　＋５０ｎ ｔ　Ｏ−６０ｎｔ　−６４−３０ｎｔ　ｎｔ１２　０ｎｔ　Ｏ−５０ｎｔ　−４ ０−５０ｎｔ　ｎｔ３　０ｎｔ　Ｏ−２５ｎｔ　−７−４０ｎｔ）　２００ｕｇ ／ｘｌｌ　＋３０−５０　ｎｔ　＋４　−４５　ｎｔ　＋３２−５０　ｎｔ５０ 　４１８−２５．、ｎｔ　＋３０−１５　ｎｔ　４２０−２０　ｎｔ１２　◆２ ０−２０　ｎｔ　Ｏ−４ｎｔ　０−２０　ｎｔ３　０−４０　ｎｔ　Ｏ−５ｎｔ 　０−１０　ｎｔｏ、７　０−５０　ｎｔ　４５０　０　ｎｔ　ＯＯｎｔ結」１ これらの結果より、リンパ球細胞の増殖に対するＨＰ誘導体の活性が存在するこ とが判明した。従ってリンパ球細胞は本発明における凛的感受性細胞であると考 えてよい。

えｆｆｌ マウスのｔンパ・に・　るＮＰ・　び　ＴＮＰ　の・・びに　にお番　これ　の 　の　六 以下の実験で生じる免疫反応（混合リンパ球反応、ＭＬＲ）は、組織不適合細胞 の組織適合性抗原によってリンパ球が開部されることに基づく０種々の組織適合 性抗原を保有する細胞（被曝細胞または樹枝状細胞）と共にインキュベートされ たリンパ球は形質転換し増殖する。トリチウム標識したチミジン取り込みに基づ いて増殖を測定する。培養物中のＴＮＰ／ＢＳへの存在は（培養５日後または培 養終了の４８時間前）測定細胞数ｃｐＩＩの増加または非増加によって増殖を変 化させる。

（ａ）ＴＮＰ／ＢＳＡＧよ混合リンパ球反応を増加させる。この刺激は投与量に 依存する。最適投与量は（２，５〜２５μｇ／ｍｌ）の範囲で個体によって異な る０反応の振幅は細胞系及び個体によって異なる。

ＴＮＰ／ＢＳ＾の添加によるｃｐ−の増加ＴＮＰ／ＢＳ＾の量（ｕｔｔ／ｗ１） ２５０　２５　２．５　０．２５　０．０２５　０．００３Ｆ１２−に／Ｈ２− ｄ ＣＢＡ　ｎｏ、１／ＤＢＡ２　５７０００　６Ｂ０００　６９０００３６０００ 　１４０００１２０００ＣＢＡｎｏ、２／ＤＢＡ２　４４０００　５４０００　 ５５０００２２０００　０　０ＣＢＡ／ＢＡＬＢ　２９０００　７２０００　７ ５０００４４０００　４００００２５０００８２−に／Ｈ２−ｄ ＣＢＡ　ｎｏ、１／Ｂｅ　６２０００　９５０００　１０００００８６０００　 １０３０００６８０００ＣＢＡｎｏ、２／Ｂ６　１１０００　２１０００　２７ ０００１２０００　２９０００　０［（２−ｄ／Ｆ［２−ｂ ＤＢＡ２／Ｂ８　２３０００　１６０００　１１０００８５０００　７１０００ ６００００ＢＡＬＢ／Ｂ８　２０００　４００００　１２０００　４０００　３ ０００　０ＤＢＡｎｏ、１／Ｂ６　２１０００　４０００　１０００　１０００ 　１０００　２０００ｎｏ、２／Ｂ６　２４０００　７０００　４０００　３０ ０　３０００　５０００ｎｏ、３／ＢＳ　、３０００　８０００　１０００　０ 　０　０ｎｏ、４／Ｂ６　９０００　４０００　０　０　０　０Ｈ２−ｂ／［２ −ｃｌ Ｂ６　ｎｏ、１／ＤＢ＾２　２００００　１４０００　８２０００４２０００　 ６２０００　０ＢＳｎｏ、１／ＤＢＡ２　３４０００　１８０００　８０００　 ４０００　６０００　７０００Ｂ６／ＢＡＬＢ　５５０００　１００００　３０ ００　７０００　６０００　０（ｂ）ＴＮＰ／ＢＳ人は同型（ｓｙｎｇｅｎｉｑ ｕｅ）リンパ球反応を刺激する。

最適投与量及び反応の振幅は細胞系及び個体によって異なる。

ＴＮＰ／ＢＳ八〇量（μへ／１１１） ２５０　２５　２．５　０．２５　０．０３　０．００３Ｈ２−ｄ／８２−ｄ ＢＡＬＢ／Ｃ／ＤＢ＾２　３５０００　０　２０００　８０００　１５０００６ ０００（２）抗Ｊ旦り抗］Ｌは： ａ／混合リンパ球反応に対して効果がある。

Ｈ２−ｂ／８２〜ｄ ５７Ｂ６ ＋抗ＴＮＰ　７０００　３０００　２０００　２０００　０／ＤＢ＾２ ＋抗ＴＮＰ　３３０００　１８０００　１３０００　１１０００　３０００ｂ／ 同型リンパ球反応ＢＡＬＢ／Ｃ／ＤＢ＾２に対してはく抗体がＢＡＬＢ／Ｃに由 来するにもかかわらず）効果がない。

ＢＡＬＢ／Ｃｎｏ、１ ＋抗ＴＮＰ　５０００　９０００　１０００　０／ＤＢ＾２ ＋抗ＴＮＰ　Ｏ３０００００ ＢＡＬＢ／Ｃｎｏ、２ 十抗ＴＮＰ　１３３０００　８０００　２０００　２０００／ＤＢ八２ 十抗ＴＮＰ　−１００００−２００００結Ｊ１ ＮＰ誘導体は組織不適合リンパ球間の刺激を増加することによってリンパ球の認 識反応を変化させる。最適投与量及び反応の振幅は細胞系及び個体によって異な る。

抗ＴＮＰ抗体は抗体を提供したＢＡＬＢマウスに以外におけるこれらの反応に対 して有意な増幅効果を有する。

国際調査報告

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．医薬活性成分とニトロフェニルとの結合によって得られた結合体であって、 医薬活性成分を病原体に感受性の細胞内に誘発または有利に導入し得、前記細胞 中で病原体に対する活性成分の治療効果の基礎となる生物作用を生じ得ることを 特徴とする前記結合体。
2. ２．結合体がニトロフェニル基を含み、フェニル環のＣ１位またはそのフェノー ル位に共有結合が存在することを特徴とする請求項１に記載の結合体。
3. ３．ニトロフェニルが２，４−ジニトロフェニルであることを特徴とする請求項 ２に記載の結合体。
4. ４．ニトロフェニルが２，４，６−トリニトロフェニルであることを特徴とする 請求項２に記載の結合体。
5. ５．請求項１から３のいずれか一項の結合体を薬剤として許容されるベヒクルと 共に含むことを特徴とする薬剤組成物。
6. ６．結合体中の医薬活性成分と同じ医薬活性成分を遊離状態で使用することによ って治療される疾患と同様の疾患の治療用薬剤を製造するための請求項１から４ のいずれか一項の結合体の使用。