JPH02500638A - 抗副甲状線抗体調製物、かかる調製物の製造およびかかる調製物の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗開甲状腺抗体調製物、かかる調製 物の製造およびかかる調製物の使用 本発明は副甲状腺および腎臓疾唐の診断および治療に有用な抗体調製物に関する 。

「調製物」なる用語は本発明の抗体調製物の特異性が、関与する抗原決定基に関 しである様式でまたは他の様式で限定されていることを強調するために用いられ る。従って本発明による「抗体調製物」なる用語は抗体類がインビボで存在する 可能性があるかまたは抗体が副甲状腺および／または腎臓組織に独特でない抗原 決定基に対する他の抗体とインビトロで共存するような場合を何等包含しない。

原発性副甲状腺機能光道症（ＨＰＴ）の診断が下される症例の頻度が世界中で高 まっておシ、その結果として副甲状腺手術の数も増えてｂる。再手術は珍しいが ＨＰＴの場合には再手術は患者にひどく影響を及ぼす、なぜなら形成される搬痕 組織が解剖上の切開をかなシ妨げるであろうからである。副甲状腺が手術前に適 切に位置判定されているとＨＰＴ患者の再手術の結果が改善されようことは先に 示されている。

肥大した副甲状腺を手術前に位置判定するために今日検査の結果は明らかに腺の 寸法の如何によるもの、小さいかまたはほんの中程度までしか肥大してない腺の 位置判定はしばしば不可耗である。食道後方、鎖骨後方、および縦隔位置にある 腺は超音波法では検出できず、そして過形成性の腺はほんのわずかな程度にしか わからない。

最近磁気共鳴トモグラフィー（ＭＲＴ　）が副甲状腺疾患の場合の手術前位置判 定診断用具として導入された◇こ０種の検査で得られた診断結果が現在評価され ているが、ＭＲＴ　、のみならず位置判定診断に今まで用いられたＣＴおよび破 壊性方法は超音波検量と同じかまたは時にはそれよシ大きな困難によシ障害を受 けると思われる。明らかに、現在利用できる方法は非定型的位置にある小さな＠ 甲状腺、すなわち外科医が位置をつきとめるのが最も因難なものを可視化するこ とができない。さらに、超音波によｐ検出された代替物の同一性を確立するとい う問題が存在する。氾し易い誤シは例えば甲状腺結節およびリン／８節を誤って 副甲状腺と解釈してしまうことである。

それゆえ、誤った診断をする危険性を最小限に抑えるために時として方向を定め た微細針穿刺法が超音波検査およびＣＴ検査の補足物として報告されている。し かしながら適切な鑑別診断染色法がまだ利用可能でないので穿刺サンプルの評価 には、特に甲状腺上皮からの副甲状腺細胞の識別に関していくつかの困難が存在 する。

副甲状腺疾患の分野における診断上のいくつかの問題点は副甲状腺細胞に独特な 表面抗原に対する抗体調製物により解決されよう。かかる調製物をインビボでの 副甲状腺の手術前位置判定に使用できよう。その上かかる調製物は微細針穿刺法 により得られた検体の鑑別診断評価を改良するための手段として、そしてまたア デノーマ性および過形成性副甲状腺の組織病理学的診断における道具としても免 疫細胞化学的方法と一緒に利用できよう。

その他の利用分野としてあげられうるものは例えば全血、血清、血漿および尿検 体に放出された可能性のある前記した種類の独特の抗原の検出および定置である 。副甲状腺８胞上の細胞表面抗原に対する抗体調製物は最近記載されている（１ ）。この調製物は本発明のそれとは対照的に腎組織との反応が全く陰性であるこ とが判明している。

それゆえかかるＸ＞物は決して本発明の抗体ＨＨ物のような広い使用分野をカバ ーすることはできない。しかしながら、特許出願はそれに関するものである（１ ２）。

今、ヒトの腎臓のある領域、よシ正確には近位尿細管およびポーマンのうの壁層 の細胞上においても免疫学的に同定されうる決定基を有する独特の細胞表面抗原 を副甲状腺細胞が発現することが見出された。また、かかる独特の表面抗すが副 甲状腺細胞のカルシウム代謝に最重要であシうることも明白に示された。これら 表面抗原は一つのカルシウムレセプター／チャンネルに対応しうる。

副甲状腺細胞上にかかるレセプターが存在することば先特」である場合、このこ とは微量の同じ抗原が将来いつか他の場所でも検出されうるという可能性をもち ろん排除するものではない。

本発明は前記した細胞表面抗原に対して独特の特異性を有する抗体調製物を包含 するものである。すなわちこの調製物は副甲状腺細胞およびある種の腎臓細胞に 対して抗体活性を有するがしか一例示されているような（第１表参照）他の組織 に対しては有しない。近位尿細管の上皮７ｍ胞に関しては、本発明の抗体および 抗体調製物はその管の外側に面した細胞部分（管腔縁）に比較して内側に面した 細胞部分（ブラシ縁）と選択的に反応する。

反応性の細胞はボーマンのうまでの途中ずつと見出されようから、その抗原は多 数の腎糸球体の壁層の細胞中でも検出されうる。糸球体の内側の上皮細胞（内臓 細胞）または遠位尿細管では何等の反応性も示されなかった。

好ましい態様においては、調製物のすべての抗開甲状腺抗体−活性成分がこれら 独特の抗原決定基と反応する。

優先権主張期間中に本出願の抗体調製物は胎盤（細胞トロホブラスト細胞）とも 反応することを見出した。これは活性Ｃａ２＋輸送が手近の胎盤を横切るという 知られた事実と一致する。従って、本発明の抗体調製物は胎盤組織とも反応する 。

種々の腎腿抗原に関する特異性を有する抗体調製物Ｃま先に記載されている（例 えば３．４．５参照）。し力）しながら、これら調製物のいずれも本発明の調製 物と同じ抗原決定基に対して特異的なわけではない。本出願の抗体調製物の特許 性に関する評価を促進するために、本発明のものと混同されうると思われるこれ ら知られたモノクローナル抗体についである程度詳細にここで論議するとしよう 。ＴＮｌ−ＴＮＩＯ抗体のうちで、ＴＮｌおよびＴＮｌｏのみが別個の腎臓細胞 に独特の抗原と反応する（４）ｏ　ＴＮＩは近位尿細管中の上皮細胞のブラシ級 部分と反応するが、その反応性が細胞内成分に対するものであるという点で本発 明の抗体調製物とは異なる。壁層の上皮細胞との反応性は何等見られなかった。

ＴＮｌ　０に関しては、この抗体が細胞表面抗原に％異的であることは真実であ るがかかる特異性は糸球体の内臓上皮細胞に関してのみ例証されている。壁層お よび近位尿細管の上皮細胞はＴＮｌ　０に対して陰性である。ＡＪ８抗体は、事 実一方では近位尿細管および糸球体の上皮ＦＢ胞上に発現される抗原決定基に対 するものであるが（３）、それにもかかわらず前記抗原決定基はメラノサイトお よび繊維芽細胞上にも見出されようから独特の腎抗原に対するものであるとは言 えない（６、特に１７６頁第６表）。抗体Ｓ４は一般的に糸球体中に及び近位尿 細管中に発現される１６０ｋＤ糖タンノξり質を同定する（３．５）。

本発明の抗体調製物はモノクローナル抗体または抗血清（ポリクローナル抗体） の形態をとることができる。

調製物中に存在する抗体はフラグメント化されるかおよ意図べき重要なポイント はフラグメントおよび／または誘導体が前記した特異性および交差反応性を備え た生物特異的な免疫型アフィニティを有するべきことである。

この調製物はそれぞれの用途に必要とされる種々の化学薬品、例えば緩衝系およ び界面活性剤を添加した溶液の形態であることができる。重要なことは調製物が 意図する実際の使用な妨害する量の他の成分を含有すべきでないことである。好 ましい態様においては調製物はモノクローナルである。場合により限定された数 の、異なるモノクローナル抗体−活性成分の混合物であることもできる。調製物 の抗体がＩｇＧタイプであるのが好ましい。

本発明による抗体の種々の鍔環体化された形態に関しては、Ｆａｂ　、　Ｆａｂ ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントにカニえてあげられうる形態は完全無欠の 抗体または前記フラグメントの一つが放射性、螢光性、化学ルミネセンス性、酵 素活性性、ビオチニルその他の基のような分析的１て検出できる基に共有結合さ れたものである。抗体−活性成分はまた種々のｂわゆる固相、すなわち水性媒伸 子に不溶性である相に共有または吸着により結合されていることもできる。ある 種の態様においては、調製安の抗体−活性成分は例えば細胞毒性薬物のような薬 物に結合されていることができる。

本発明による抗体調製物の製造は、本発明による特異性を有する抗体を産生じつ る可能性のあるａ胞にかかる抗体を放出させ、かくして放出された抗体を単離し そして精製して特異性要件を満たさない抗体を除去することによシ打われる。を 椎動物（例えばマウスまたはラットのような唱乳動物）においては前記放出は適 当な免疫原で免疫した結果としてインビボで起シうる。かくして得られた免疫応 答によシ、所望の抗体／抗体類を免疫原中の他の決定基に対する抗体と混合して 含有する４リクロ一ナル抗体調製物が得られよう。他の決定基に対する抗体を除 去するためにいわゆるイムノソルベント精製（ＩＳ精製）を行うことができる。

ここで意図される抗体の場合、ＩＳ精製では収量が低くかつ面倒な作業過程を包 含するがそれでいて抗原が単離されるまでは恐らく何等実際的な重要性はないで あろう。

本発明による良好な尻体駒製物を得る最良の方法（＝いわゆるモノクローナル法 である。これは免疫化を誘導したのち抗体産生性細胞をミエローマ細胞と融合さ せて速やかにかつ不断に増殖させることにょシ行われる。本発明によると同じ特 異性を有する抗体を産生ずるハイブリッド８胞をクローニングおよび培養するこ とにより、原則的に副甲状腺および腎臓組織中の所望の抗原決定基とのみ反応す るモノクローナル抗体調製物乞生成させることができる。本発明の抗体ｗ４製物 を製造するために選択されたａ胞りローンの培養はインビトロで細胞培養物中で または腹水腫瘍の形で行われうる。精製および単離は抗体は対して普通に実施さ れると同じ方法で一般に塩沈オン交換クロマトグラフィー、アフイニティクロマ トグラフイー、ゲルクロマトグラフィーその他によシ行われ得る。

本発明による抗体を効果的な方法で得るためにはホルムダール（Ｈｏｌｍｄａｈ ｌ）他（７）の方法を全細胞免疫原に適用して使用するのが好ましい。その方法 の特徴は局所リンパ節を免疫化が行われたのち所定の日数の間隔で（例えば９日 ）エクスターナリゼーションし次にその腺のＢ８ｐを適当なマウスミエローマ細 胞系と融合させることである。

本発明の観点の一つは本発明の抗体に対する同種抗原を含有する免疫複合体の形 成への調製物の使用にある。

免疫複合体の形成は、免疫学的方法を技術的に適用する多くの場合例えばアフイ ニテイ精製において（例えばイムノソルイント精り、および抗原の存在をインビ ボおよびインビトロにおいて定性的または定量的に示すための免疫化学的アラ七 イにおいて本質的な部分をなしている。採られる実際的な措置は本発明による調 製物に対する同種抗原を含有する被験体（生きた哨乳動物例えばヒトを含む）に 本発明による調製物を投与して複合体を形成させることからなる。用いられる反 応条件はそれぞれの各適用分野で普通に用いられるものである。従ってインビ） ｅ７での作業には−および温度はそれぞれ５〜９および＋４〜＋４０℃の範囲か ら選択されるべきであシ、そして適当な緩衝剤および界面活性剤が添加されうる 。

多数のイムノアラ七イ法が利用できる。それぞれの場合にどの方法を最適なもの として選択すべきかの決定は当業者の技術範囲内である。種々の一般的方法のう ちあげられうるのはホモジニアス法およびヘテロシアニス法、いわゆるサンドイ ンチ法、二抗体法（例えばＤＡＳＰ　）、競合（に害）および非−競合法、粒子 凝集法、沈澱法、免疫電気泳動法、免疫拡散法、組織化学的および８胞化学的方 法、標識された抗体を用いるＢ微鏡法、および種種のツーカー系に従い呼ばれる 方法例えば放射線−１酵素−１螢光−１化学ルミネセンス−１酵素基質−、ピチ オニルー免疫化学的方法である。従って意図される抗原を発現する組織および細 胞を本発明による調製物を用いて知られた方法で免疫化学的に調査できる。特に 、副甲状腺および腎臓癌の場合に得られる染色パターンは対応する正常組織のそ れとははつきシと区別できる。同じことは正常な副甲状腺組織に比較した副甲状 腺アデノーマおよびぶ発性および続発性過形成にもあてはまる。本調製物はまた 細胞検体中の他の細胞から意図する細胞型を識別したシ、インビボで副甲状腺を シンチグラフィーにより位置判定するのにも用いられうる。

本発明のもう一つの観点は本発明の抗体！４製物の抗体活性成分と反応する抗原 タン・ξり質またはそのフラグメントに富んだタン／ξり質調製物にある。これ ら後者タン・ξり質調製物はこれら明細書の実験の部に記載されるよ来するタン パク質に関しては、この明細書に記載されるモノクローナル抗体と反応するタン パク質は実質的に純粋である、すなわち大抵の場合原料物質源からのタンパク質 ９０％（ｗ／ｍ）以上に達する。

本発明はこの明細書の一部分を構成する添付の請求の範囲でさらに明確にされる 。ここで本発明を相当する科学的操作によｐ説明しよう。

実験の部 材料および方法 バイオプシーおよび組織標本：甲状腺手術中に攬出された正常なヒト副甲状腺か ら、および副甲状腺機能亢進症で外科手術を受けた恵者達から取った正常なおよ びアデノーマ性の腺からバイオプシーを得た。その他のヒト組織検体はルーチン 外科手術中に取シ出された器官からまたは移植目的で取られた器官から得られた 。副甲状腺・２イオプシーおよび種々の組織検体は子牛、さる、およびラットか らも得られた。免疫組織化学に用いられる組織は氷冷されたヒストフン（Ｈｉｓ ｔｏｃｏｎ）（Ｈｉｓｚｏｌａｂ、　Ｂｅｔｈｌｅ−ｈｅｍ　ＴｒａａｉｂｇＬ ｔｄ、　ＧＯｔｈｅｎｂｕｒｇ、　Ｓｗｅｄｅｎ）中に置かれた。

分散細胞は副甲状豚アデノーマからこれまでに記載されたようにして（８）フラ ーゲナーゼ処理およびノミ−コール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ＋　Ｓｗｅｄｅ ｎ）　で精製することによりｍ製された。生紹胞を凍結させそして液体窒素中で 保存した。

この細胞は解凍すると新たに調製された細胞と同じ生存能力および外部Ｃａ２＋ に対する応答を示した（下記参照）。

免疫化およびハイブリドーマ生成：副甲状腺アデノーマ分散細胞５０μＪ（０， ５Ｘ１０６細胞／−）を解凍後に同量のフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃ ｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＵＳＡ）に懸濁させそして５匹の雄ＤＢＡ／１系マウ スを免疫するのに使用した。ハイブリドーマ生産のための最近記載されたプロト コル（７）に従い、免疫化９日後に腋窩（ひざ）およびそけい部（股間）リンパ 節を取シ出しそしてマウスミエローマ細Ｄ　（ＦＢ　ａ　Ｋ　Ｘ　−６３−６５ ３ｘＡｇ８　）とノ融合に用すだ。融合後ハイブリドーマをマイクロタイターウ ェル中ＨＡＴ含有培地でインキュイージョンしそして位相差顕微鏡によりハイブ リドーマの増殖についてスクリーニングした。第１回目の免疫組織化学的スクリ ーニング操作において、副甲状腺細胞と反応性である抗体を産生ずるハイブリド ーマを同定した。陽性であるハイブリドーマを限界希釈法（０，５細館／ウエル ）を用いてサブクローンし、そして得られるサブクローンを再び免疫組織化学的 にスクリーニングした。副甲状腺細胞の表面構造と特異的に反応する上溝を有す るハイブリドーマそｎぞれからの１サブクローンを次にインビトロで大規模抗体 生産させるために増殖させた。

免疫組織化学および螢光抗体法：副甲状腺細胞に関するハイブリドーマの特異性 を検量するために種々の組織のア七トン固定された、厚さ５μｍの冷凍されたセ クションに対し免疫組織化学的染色を行った。ＰＡＰ型（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｓ 第１の抗体は１：５に希釈されたハイブリドーマ上清または１〜５μＩ／ｖａｔ 湊度（ＰＢＳ中に溶解）の精製モノクローナル抗体であった。七ツクマーナル抗 −ＨＬＡ　−Ｄ　Ｒ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　５ｕｎｎｙｖ ａユｅ、　Ｃａ、　ＵＳＡ）が陽性対照として用いられ、そしてモノクローナル 抗フラーケ゛ン■抗体（１Ｄ）が陰性対照として用いられた。最初の免疫組織化 学的スクリーニングは正常ヒト副甲状腺、甲状腺およびリンパ節との反応性に関 する試験を含んだ。副甲状腺実質細胞の表面構造とのみ陽性反応を示す抗体、す なわち副甲状腺特異的な抗体をサブクローンして次に他のヒトおよび動物組織と の反応性に関して試験した。螢光抗体性染色は、生存能力のある副甲状腺アデノ ーマ分散細胞で、および健康な個体から末梢血液をフィコールイソＲイクグラジ エント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ＋　Ｓｗｅｄｅｎ）でグラジェント遠心分離 することによシ得られた白血球について実施された。用いられた最初の抗体は１ 〜１０μｇ／−濃度の精製された副甲状腺特異的抗体（下記参照）、と）Ｔ−細 胞レセプター抗−Ｌｅｕ　４に対するモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｎ ｃｋｌｎｓｏｎ＋　５ｕｎｎ７Ｖａｌｅ＋　Ｃａ、　ＵＳＡ）、および無関係な 抗フラーゲン■モノクローナル抗体（１０）であった。

フルオレセイン標識されたブタの抗マウスエｇＧ抗体が第２の抗体として用いら れた（Ｈ鑓およびＬ鎖と反応性、Ｓｗｅｄｉｓｈ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ＳＢＬ＋３ｗ６ｄｅｎ　）　。

アイソタイプ判定および抗体Ｗ！製：副甲状腺特異的な抗体のアイソタイプはに ルオキシダーゼ接合されたアイソタイプ特異的ヤギの抗体（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　Ｔｉｌ−ｂｕｒｇ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ）およびアルカ リホスファターゼ接合されたモノクローナルラット抗体を用いるＥＬ　Ｉ　ＳＡ 法によシ判定された。これら抗体のいずれもに鎖特異的である。副甲状腺特異的 抗体の精製はＰＨ８でプロティン人−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ 、　Ｓｗｅｄｅｎ）でのアフイニテイクｏ’ｖトゲラフイーおよび各アイソタイ プそれぞれに推奨されるーでの溶離によりＮわれた。

細胞質カルシウムへの作、甲：前記のようにして採取され、フラーゲナーゼ処理 された副甲状腺バイオプシーから得られた副甲状腺分散Ｂ胞を、細Ｄ　’ＲＣａ ”　Ｃ−Ｃｅ−１）に及ぼす抗体の作用について調査するのに用いた。これらの 調査は７う（ｆｕｒａ）　−２を負荷された（２）個々の′ａ胞をミクロ螢光定 量法によシ記録することによシ打われだ。実施された実検では、副甲状腺細胞を 倒立二フンシア７オツ）　（Ｎｉｋｏｎ　Ｄｉａｐｈｏｔ）　Ｑ微鏡（Ｎｉｋｏ ｎ、　Ｊａｐａｎ）中に備えられた培養室のカバースリップに付層させた。この 顕微鏡はミクロ螢光定量法のための５４０および３６　Ｄ　ｎｍの励起波長を備 えている（放出４７０ｎコ）。Ｃａ２＋を副甲状腺特異的抗体、無関係の抗フラ ーゲン■抗体および抗−ＨＬＡ抗体それぞれな添加または添加せずして外部カル シウム濃度Ｏ，Ｓ〜己、ＯｚＭで監視した。

ィ）を用い次のようにして抗原（抗体結合性分子）を測定した二マイクロタイタ ープレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）をＥ１１抗体で被覆した（　１０　、ｕ９／１ ｒｓｔ／ウェル、−皮、４℃）。次に尿（全、沈降物または上清）＆ＩＤＯμｌ ／ウェル量で添加し、室温で２時間放置し、次にビオチニル化抗体Ｇｉ１を加え （５β／−／ウェル）そして室温で２時間反応させた。アビジン接合されたアル カリホスファターゼ（１：２０００）を加え、室温で２時間放置し、次にジェタ ノールアミン緩衝液ＩＣ溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミジルピオチン（Ｓ ｉｇｍａ）　（１０％、ｐ）１９．８）を加えた。呈色反応をタイターチック、 　？　ルチスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉ−５ｋａｎ　）を用い４０５ ｎコで測定した。

腎臓の抗体結合性分子の特注化 用いられた方法はルピン・ケー（Ｒｕｂｉｎ　Ｋ）他ＩＣよシ記載されている（ １１）。位置判定された腎臓細胞癌の外科手術中に取シ出された正常なヒト腎臓 の一部分を冷凍し、−２０’Ｃで貯蔵した。解凍した腎皮質３０ｇを紹かく砕き そしてミクロソーム綴衝液中でホモジナイズした。このホモジネートを数層のガ ーゼ包帯に通しそして初めＧＳＡ中１０．００　Ｏｒｐｍでそして次に２回１０ ０．ＤＯＯＸ、９で１時間遠心分離した。ｋレットを可溶化緩衝液中でホモジナ イズしそして１００．ＤＯＯＸｇで１時間遠心分離した。上清をレクチンセファ ロースカラム（Ｌｅｃｔｉｎｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ■ｃｏｌｕｚｎ　Ｌｅｎｓ 　Ｃｕ１ｉｎａｒｉｓ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用しそして結合性タン・ξり 質を溶離してプールした。次にこのプールされたタンパク質フラクションを検査 してＥＬ：ＳＡ　（前記参照）によればｙ応性であると判った。このプールされ たタンパク質フラクションを次に、一方はウサギ１ｇＧ　（免疫前）を含有しそ してもう一方が抗体Ｅ１１、Ｇ１１　およびＢ６（抗体２８■）を含有する２檀 のイムノアフィニティ七７アロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からなる 再循環系に適用した。第２のカラムに吸着されたタンパク質を溶離し、プールし そしてＥＬ工ＳＡで検査した。７アストシステム（Ｐｂａｓｔ　５ｙｓｔｅＩ！ １）（Ｐ！：ａｒｐａｃｉａ）を用いてファストゲル（Ｐｈａｓｔ　Ｇｅ１）（ Ｐｈａｒ＝ａｃｉと）グラジェント１０〜ｉ５−で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

適用に先立ち検体を水で透析しそして一２０″Ｃのエタノールで処理した。検体 なβ−メルカプトエタノール（最終濃度１０％）を用いて還元しそして３分間煮 醇した。このケ゛ルをクーマシーブリリアントプルーＲ−２５０で染色した。見 かけの分子量を下記砿泡タン・ξり質（Ｐｈａｒ＝＋ａｃｉａ）に比較した移動 から計算した：ウシ血清フルブミ＞　（６９０００）、鶏卵フルプミ＞　（４３ ０００）、ウシ赤血球カルヨニツクアンヒドラーゼ（３００００）、大豆トリプ シンインヒビター（２０１［：ｌＯ）　８よびウシ乳−ラクトアルブミン（ｉ４ ４００）。

種の増殖性ハイブリドーマが得られた。これらバイブリド−！のうちの１９種の 上清が正常なヒト副甲状腺と免実質細胞のみを染色し、他のものは腺のストロー マｓＨ中に局在した。前記１４抗体のうち１２種が実質細胞の表面抗原と反応し 、残る２種がよシ一様な染色・ξターンを示し、このことは細胞質構造をも認識 することを示唆している。副甲状腺上皮細胞の表面構造を染色しうる抗体を産生 ずるハイブリドーマのうち、４種が正常なヒト甲状腺および正常なヒトリンパ節 のセクションとは反応しなかった。（これら４種のハイブリドーマはそれぞれＥ ｌｌ、０１１、Ｂ６およびＥ５と名づけられた。）これら４種の副甲状腺特異的 なハイブリドーマをサブクローニングしても放出される抗体の特異性は変化しな かった。

螢光孤体法によるＸｉでは、抗体Ｅ１１、Ｇ１１、Ｂ６およびＥ５が副甲状腺分 散細胞の表面をはつきシと染色させることが示された。これら抗体は対照として 用いられた正常なヒト白血球とは反応せず、一方抗−Ｌｅｕ　４抗体は白血球の 約７０％と強く反応したが副甲状腺細胞を染色しなかった。対照として用いられ た抗フラーゲン抗体は２種の細胞のいずれとも反応しなかった。副甲状腺特異的 抗体（Ｅｌｌ、０１１、Ｂ６およびＥ５）をサブクローンしたものを多数の他の 種類の組織との反応性に関しても調査した。第１表ではこれら４種の抗体のすべ てが近位尿細管の上皮細胞、１つのそして同じ腎臓のいくつかの糸球体のボーマ ンのうの壁層、および胎盤の細胞トロホブラスト細胞にも結合すること、および その上副甲状腺および腎臓の癌とも反応するが調査された他の種類の組織とは全 く反応しながったことが示される。Ｅｉ１抗体が最良の染色物であった。腎臓お よび副甲状腺の癌の染色・ξターンはルーチン型組織病理学的染色と比較した場 合対応する正常組織で得られたパターンとは鮮明に相異していた。副甲状腺アデ ノーマおよび原発性および続発性過形成は正常な副甲状腺組織と比較して染色が 低下した。ある種の絨毛癌細胞系とのそれらの反応性（第１表参照）によシ絨毛 癌の治療および診断への使用が暗示される。

’ｐ２５ハイフリトーマが、意図する腎ｅＡＤｌと明らかに反応する１ｇＭ抗体 を産生することに注目することば特に興味がある。従ってＥ５は副甲状腺特異的 であると言われてきたこれまで昶られているＩｇＭ抗体（１）とけはつきちと状 ！ｌｌ特異的な抗体のアイソタイプはＥｌｌの場合ＩｇＧ　１、Ｇ１１およびＢ ６の場合Ｉｇ０２Ｂ、そしてＥ５の場合工ｇＭであると判定された。これら４種 すべてはに型り鎖を有していた。３種のＩｇＧ抗体はすべて正常な腎および副甲 状腺細胞とのそれらの排他的ｙ応性を失うことなくプロティンＡ−セファロース でのアフィニティクロマトグラフイーにより精製できた。

が、それらのうちの２種、すなわちＢ６およびＧ１１（いずれもｘｇｏ２ｂタイ プ）は、細胞外Ｃａ２＋がＱ、　５　ｍＭから３．０鮨に増大した場合に通常得 られるＣａ２＋増大を完全にかつ濃度依存的に消滅させた。第３の副甲状腺反応 性抗体（Ｉｇ（）１タイプ）および無関係のモノクローナルＩｇＧ抗フラーゲン ■抗体はこの作用を住じなかった。″ａ胞外Ｃａ２＋を３．　ＯｍＭに増大させ たのち副甲状腺分散細胞に抗れによってもわずかに減少された。ここでもまた第 ３の抗開甲状腺特異的抗体（Ｅｌｌ）もそして無関係の抗フラーゲン■抗体も何 ら作用を有しないことに注目できた。乙種の抗開甲状腺特異的抗体のうちの１種 がＣａ２＋　ｍ節を妨ユ 害しないという事実は、とのプ定１でより確かめられる現象が他の２種の抗体の 特異的な特徴であることを示していた。インキ二に一ジョン後に行われた竺存能 力試験では、観察される作用がその抗体の紹肱毒作用の結果ではないことを示し て−だ。

抗Ｉ検出 高力価の腎臓抗原は腎臓＃檀の拒絶に関連して居中に、および血液量減少性シミ ツクのせいで腎不全、ｅ者で見ら還元された検体も還元されてない検体も６００ ００ダルトンでのバンドとよび２００００ダルトンで比較的弱いノζンドを示し た。一対照である免疫前の溶離された検体はゲル正に何のバンドも生じなかった 。

論　議 副甲状腺細胞に特異的なモノクローナル抗体を産生させるための努力は２つの仮 定に基いて行われている、すなわち（１）副甲状腺細胞はそれらが非常ＩＣ特別 な機能を有するゆえに限定さまた数の独特の細胞表面構造を有する：および（２ ）かかる推定構造はそれら細胞に独特の機能に関与していよう。本特許出碩で示 される結果によりこれら仮定のいずれも確認される。これら論点の第１に関して １＝、ある種の腎臓ａ胞および副甲状腺細胞に独特であシうる少くとも１セツト の免疫原構造が存在することが本出願のデータにより例記さする。４種の副甲状 腺特異的な抗体が同じ組織反応性パターンを示したという観察は、それらがすべ て同じ分子（類）を認識しうろことを暗示していよう。その結果かかる分子（類 ）は非常に少数の免疫原性分子のうちでも副手状ＲＦＢｐおよびある種の腎臓細 胞に独特かつ井通であると推定されうる。２種のモノクローナル抗体が細胞室Ｃ ａ　の調節に活性に影響できたので、これらが副甲状腺および腎尿細管細胞に独 特のＣａ２＋知覚メカニズムに関与する分子を認識すると想定するための非常に 良い理ヨが存在する。副甲状腺特異的な抗体のうちの２種および無関係の抗：ラ ーゲン■抗体が同じ作用を生じ得なかった事実にかんがみ、この観察された現象 が特異的である確率は高い。

および腎臓病理生理学の研究において、およびさらに副甲状腺および腎臓組織の 細胞学的および組織病理学的同定にとって、ならび１ｃ同じ組成をインビボで手 術前シンチグラフィー位置判定する場合の助けとして重要な補助道具であること が示さする。この調製物は腎臓価および／または副手状１！ｌｌｊ癌に罹ってい る思考の治療において、およびここに意図される構造物、例えば腎尿細管に影響 する疾患の診断におじで使用できる可能性がある。かかる疾患で本発明の抗体に 対応する抗原的に相同の分子が放出さする限シ、かかる診断操作が体液特に尿に おけるこれら抗Ｊのアラ七イも包含しうろことは想到できぬことではない。

第１表 器官および腫逼における抗体１ｊ１、Ｇ１１、Ｂ６およびＥ５との免疫反応性。

非仄応性のヒト組織および紹胞：甲状豚（正常、広汎性、毒性、多節性、非毒性 ）、胸腺、リン・９節、肺、肝臓、膵臓、皮青、筋肉、膵臓、小腸、前立腺、唾 液腺、副腎腺、骨、乳房、Ｍ機甲状腺癌、膵臓インスリノーマ、中膓類癌腫１Ｌ 　コン腫傷、クツシング遍遜、クロム親和性細胞腫、白血球および肉腫細胞系。

ロホブラス）！胞）、腎臓ａ胞癌および副甲状腺優。特に、仄応性細胞が近位尿 細管の、および１つのそして同じ腎臓の多数の糸球体中のボーマンのうの壁層内 の上皮細胞であることが観察された。近位尿細管においては、細胞のブラシ縁が 管腔縁よシ効率的に染色された。遠位尿細管は全く染色されなかった。

非厘応性のサル組＠（ジノモルゲスからの）：甲状腺、胸腺、９２７９節、肺、 肝臓、膵臓、卵巣および小腸。

反応性を有するサル組織（ジノモルゲスから）：副甲状腺および腎臓。

肝臓、膵臓、心臓、膵臓、胃、小腸、大脳皮質、視床下部および膵臓。

反応性を有するラット組織：副甲状腺および腎臓。

細胞系ヌ応性：絨毛癌細胞系（Ｊ：ＥＧおよびｙｐ−ｏ　）。

５１用文献 １、カンス、ダブリニー・ジー（Ｃａｎｃｅ、　ｗ、ｃ、）他、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、人Ｃ＆Ｑ、　５Ｃ１−＋　０３人　８３（１９Ｂ６）６１１２−６２、ギ ルフニ、イー（Ｇｙｌｆｅ、　ＩＩＬ、）他、ＦＥＢＳ　２０５（１９８１）３ 、バンダー、エヌ・エッチ（Ｂａｒｚｄｅｒ＋　Ｎ、Ｈ，）他、Ｃｏｎｔｒ、　 ０ｎｃｏ１．１９（１９８４）　１０５−２０４、ミューラー、ジー・ニー（Ｍ ｕ　１１　ｅ　Ｔ　ｒ　Ｇ　−Ａ　−）他、Ｋ１１ｎ。

Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ　６１　（１９８５）　８９３−９０２５、ウエダ、アー ル（Ｕｅｄａ、Ｒ，）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　７８　（１９８１）　５１２２−６６　Ｉ：Ｉイド、ケー ・オー（Ｌｌｏｙ６．に、Ｏ，）他、ｊＢａｓｉｃ　ａｎｄビー（Ｈｅｒｂｅｒ ｍａｎ、　Ｒ，Ｂ、）　ｊｉｉ集、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎｉｊ　Ｈｏｆｔ出版（ １９８３）　１５９−２１４特に１６７頁。

７、ホルムダール、アール（Ｈｏｌ＝ａａｈｌ　ｒ　Ｒ−）他、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、８３　（１９８５）３７９−８４８、ラドパーグツ シー（Ｒｕｄｂｅｒｇ、　Ｃ，）他、Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈ。

Ｍｘｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、５ｃａｎｄ、５ｅｃｔ、Ａ　９４　（１ ９８６）９、クラレスフグ、エル（Ｋｌａｒｅｓｋｏｇ、　Ｌ、　）他、５ｃａ ｎｄ。

Ｊ、ｆｔｎｕｎｏｌ、１６　（１９８２）５０１−７１０　ホルムダール、アー ル（Ｈｏｌｎｄａｈｌ　、　Ｒ，）他、Ａｒｔｈｒｉ−ｔｉｓ　ａｎｄ　Ｒｈｅ ｕｚａｔｉｓｍ　２９　（１９８６）４００−１０１１、ルピン、ケー（Ｒｕｂ ｉ二、　Ｋ、）他、Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、’＋６４１２、ワシントン大 学医学校（Ｗａｓｈｉｎｇｚｏｎ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌ　ｏｒ　 Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（カンス（Ｃａｎｃｅ）他）ヨーロツ／ξ特許−人−２２７ ，３９１ 補正音の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成元年　４月２７日

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトの副甲状腺および腎臓の近位尿細管に独特である表面抗原に対して特異 的であることを特徴とする抗副甲状腺抗体調製物。
2. ２．副甲状腺中に存在する場合に前記表面抗原が完全にまたは部分的にＣａ２＋ 感知に関与していることを特徴とする請求項１記載の抗体調製物。
3. ３．モノクローナルであることを特徴とする請求項１または２紀載の抗体調製物 。
4. ４．副甲状腺およひ近位尿細管に独特であるヒト表面抗原に対して特異的である 抗副甲状腺抗体調製物を、これら表面抗原の１種が抗原として存在する免疫複合 体の形成に使用すること。
5. ５．用いられる抗体がモノクローナルである請求項４記載の使用。