JPH0227976A - 勾配―調節化・局在化シグナルを有する分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、流体試料を試験するのに有用な分析構成要素
、即ち装置の分野、並びにこの使用方法に関するもので
ある。更に特別には、本発明は、臨床的の診断用又は研
究用の生物学的又は他の流体の試験に使用する構成要素
即ち装置に関するものである。

（従来の技術） 分析構成要素又は試験装置は、未熟な個人達にとり使用
に便利であり、かつ付属器具を必要としない物が開発さ
れて来た。これらの装置の載物は、特許文献に記載され
ており、試験される試料に対しての応答性が、異なる度
合を有する構成部分又は複数の部分を提供している。下
記特許は典型的なものである。

ホラホストラ−セルの米国特許第３．９６４．８７１号
公報には、拮抗物質の消費量と同じ量の最終生成物と反
応するところの化学量論の拮抗物質試薬を開示している
。即ち、拮抗物質は、拮抗物質又は指示薬が反応におい
て完全に消費された時間まで、酸化された指示薬の蓄積
を、成る方法で防止することである。好適な装置は、非
吸収性又は疎水性の物質により相互から分離された複数
の指示薬試薬部位を有し、各々の部位は好適には、試薬
を置くに際して使用された溶剤と、及び試験されるべき
生物学的流体との逍と殆ど同じ量を吸収するであろう装
置である。

リーの米国特許第４．６５４．３１０号公報には、複数
の試験部分に分割された保持基質を開示している。各々
の試験部分は、分析物と反応性の同じ濃度の第一触媒と
、及び各々の部分の異なる濃度で存在する分析物と反応
性の対抗する第二の触媒とを有する。一つの触媒は、検
出可能な応答を与え、かつ他の触媒はそうでない。例え
ば、パーオキシダーゼとカタラーゼは、生成する過酸化
物に対して対抗する。割合は各々の部分において異なる
けれども、指示薬触媒の非指示薬触媒に対する割合が高
い試験部分において、指示薬反応の結果は、検出可能で
あり、かつ割合が低い試験部分において、指示薬反応の
結果は、検出不可能である。試料中の分析物の濃度は、
検出可能から検出不可能への指示薬反応転換が起こる点
を観察することにより推定出来る。

リオノタの米国特許第３．７２３．０６４号公報には、
分析物と反応して生成物を生成する試薬により浸漬され
た第一多孔質層と、各々の領域が生成物に対して異なる
浸透性を有する複数の領域を有する第一多孔質層に隣接
する膜とを有し、かつ指示薬層と反応する最終生成物の
どれも可視的に指示する指示薬を含む層を成す試験装置
を開示している。

従来技術の他の装置は、特定濃度以上のグルコースに対
して敏感である単一試薬を使用している。米国特許第２
．８９３．８４４号公報に開示された装置により示され
るように、これらの後者の装置はまた、グルコースと試
薬要素との反応に際して、形成される色により可視的指
示を操作者に与える。この装置は濃度範囲を指示しない
で、グルコースの一定の予め決定されたレベルが、存在
し又は試験されるべき溶液中で超過されるならば、指示
するだけである。

（発明が解決しようとする課題） 分析装置の分野における上記開発は、ある便宜を与える
けれども、これらの装置のどれも、定量的又は半定量的
応答の可視化を可能にする勾配と共同して、生成される
シグナルの局在化から、局在化媒体により達成される補
足的便宜を意図していない。

（課題を解決するための手段） 本発明は、試料中の分析物の存在を定ｍ的に検出する分
析装置を提供するものである。以前の公知又は記載され
た分析措成要素及び装置と異なり、本発明の装置は、因
子又は物質の勾配と結合した又は接触した、装置の一部
分中のシグナル局在化成分を含み、この因子又は物質は
、分析物又はそこから生成したシグナル先駆物質と相互
作用して、その際に装置上の又は中の検出可能なシグナ
ルの生成を調節するものである。本発明の装置は、未熟
者によってさえ、定量的測定に容易であるがしかし信頼
出来る使用に特別に適しており、例えば体液を試験しよ
うとする個人の、ある肉体的調子を表す体液成分を家庭
で試験する為の使用に適している。

本発明によると、試料中の分析物を検出する装置は、反
応性基質を備え、この反応性基質は： 溶液とシグナル局在化媒体、この媒体 中においてシグナルが前記局在化媒体に束縛されない前
記溶液中の分析物又は分析物誘導体から生成され得るも
のであり、かつ前記溶液中のこのようなどんなシグナル
の対流と拡散も、前記溶液上の前記局在化媒体の作用に
よって減少されるものであり； 勾配、これは前記基質の少なくとも前 記シグナル局在部分と結合又は接触され、かつ前記分析
物又は分析物誘導体と反応してそれからのシグナルの生
成を調節する因子の勾配であり：及び 一組成物、これはどの残留する分析物又は分析物誘導体
に露呈される時に、それから検出可能なシグナルを生成
するものであるこれら三要素を含むことを特徴とする装
置である。

好適見地において、本発明の装置は： （ａ）第一反応性基質、これは　（ｉ）関係する分析物
に露呈される時に、前記基質を通して拡散可能であると
ころの分析物誘導体を生成する第一組成物、及び　（ｊ
ｉ）前記第一反応性基質中にて、前記分析物誘導体と反
応して、それからの検出可能なシグナルの生成を調節す
る因子の勾配；　この両方を含むものであり、（ｂ）少
なくとも一つの追加的基質、これは前記第一基質の勾配
成分と接触する流体中にあり、かつ（ｉ）前記勾配因子
と順次的に接触した後に前記分析物誘導体により接触さ
れるように配置され、かつ前記分析物誘導体と反応して
検出可能なシグナルを生成するシグナル生成組成物と、
及び（ｉｉ）前記基質の少なくとも一部分中にて、溶液
と局在化基質とからなり、この局在化基質中にて、シグ
ナルが、前記局在化基質に束縛されない前記溶液中で生
成され、かつ前記溶液中のシグナルの対流と拡散が前記
溶液の上の前記局在化媒体の作用により減少されるとこ
ろのシグナル局在化成分の両方を含む追加的基質であり
、　この（ａ）と（ｂ）を備える装置である。

もう一つの好適見地は、シグナル調節的勾配の層の存在
の為に、定量的シグナルを与えることが出来る競合免疫
学的試験装置であることである。この装置は、第−層、
この層は、標識した分析物又は分析物の類似物と複合化
された関係する分析物に対して、例えば、８−（Ｌ　６
−ジアミツヘキシル）−ＮＡＤ’に共有結合されたジゴ
キシンに対して既知量の抗体を組込まれた多孔基質から
なる層を有する。この装置は、第二層、この層は、関係
する分析物に対して、抗体の勾配を組込まれた多孔基質
からなる層を有する。

この装置は、第三層、この層はその中にシグナル生成組
成物を有する多孔基質、例えば、大腸菌ホモセリン脱水
素酵素、ホモセリン　ニトロテトラゾリウムブルー及び
ジアホラーゼからなる層を有する。操作に際して、分析
物は、第−層に点として置かれ、そこにて標識された分
析物が、分析物により抗体複合体から放出され、かつ調
節勾配層を通って拡散される。第三層に入った標識した
分析物又は分析物類似物は、ホルマジンの青色沈澱の生
成のような検出可能なシグナルの形成により指示される
。

シグナルは、シグナルの最初の点からシグナルの拡散を
制限する物質からなる媒体中で生成される為に、実質的
に局在化されて残る。本発明のこの見地を実施するのに
好適な媒体は、溶液と網状組織又は媒体に望まれる粘度
を付与する成分からなる。網状組織又は粘度成分は、シ
グナルの最初の点から、シグナルの拡散を制限する。網
状組織は、溶液に懸濁又は溶解され、一方粘度成分は、
溶液に溶解される。シグナルは一般的に蛍光化合物又は
発色化合物である。

シグナルの局在化は、増大する敏感性にて検定させる。

因子として使用するのに最も適する物質は、分析物又は
分析物誘導体と反応して、このような反応性因子の勾配
に沿ってシグナルの生成を防止する因子であって、これ
は、試験されるべき分析物に左右されるであろう。この
因子は、分析物又は分析物誘導体のアンタゴニスト、又
は分析物又は分析物誘導体のいずれかに対して、シグナ
ル生成組成物の成分に対する競合物であって良い。

勾配は、基質の少なくとも一部における濃度勾配であっ
て良い。濃度勾配は、勾配により規定される軸に沿って
、反応性因子が連続的に増大する項を付与する勾配であ
って良く、又は勾配は、この軸に沿って反応性因子の段
階的に増大する量を付与する勾配であって良い。代案と
して、この勾配は、基質の少なくとも一部を形成し、か
つ反応性因子の均一濃度を含む寸法的勾配であって良い
。

検出可能なシグナルは、抵抗の変化の生成、電荷移動錯
体の生成、色、蛍光ルミネッセンス、又は広範囲の既知
シグナル生成システムの変化の生成に起因して良い。

シグナル生成試薬は、単一層に結合されて良く、又は流
体接触される分離層に配置されても良い、第一番の見地
において、この試薬は、反応路程において、連続する酵
素のような試薬と共に結合されるのが極めて望ましいと
見做すことが出来る。

分析物部分は、アッセイで検出されるべき物質である。

検出は分析物特異的部分により、例えば、分析物部分と
複合体を形成する（例えば酵素／基質または抗原／抗体
）０分析物部分には、限定されるものではないが、微生
物、カビ、藻類、植物細胞、動物細胞、腫瘍細胞、リガ
ンド、多糖類、ポリペプチド、核酸、ポリヌクレオチド
、薬物並びに通常存在する体液の成分が包含される０分
析物部分は、血清、組織抽出物、細胞外質、尿、痰、排
泄物、唾液、口腔液（ｐｕｓｓ）　、性液、醗酵液、培
養培地、水画分、環境サンプル並びに食品から誘導する
ことができる。

装置のマトリックス（基質）の１つの態様は、ネットワ
ーク（網状組織）と溶液とがらなる、ネッヮークという
用語は、媒体に浸透する３次元形状の構造に及ぶ、溶液
という用語は、媒体中に存在する液体に及ぶ。

ネットワークは、ＫＡ続的まなは不連続的たり得、溶液
中にポリマが存在する結果形成される。ネットワークが
１つの一体・化ポリマからなる場合に連続的ネットワー
クが存在する。

ネットワークが１を越える一体化ボリマからなる場合に
不連続的ネットワーク単位が存在する。それぞれの一体
止ポリマのモノマは共有結合している。

ネットワークを与えるポリマは、有機モノマ、無機モノ
マ、または有機および無機モノマの組合せからなり得る
。ポリマは線状または分校たり得る。大きなポリマは全
ゆる形状に減滅することができるが、ビーズ形状が好適
である。ビーズは球形となり得、多孔質または非多孔質
となり得る。特に好適なのは球形多孔質ビーズである。

ポリマは、溶液中に懸濁または溶解することができる。

通常は溶液中に懸濁される有機モノマを含有するポリマ
からなるネットワークには、例えば、多糖類、澱粉、リ
ボサツカライド、メチルセルロース、粘液、［＃ＩＪガ
ム、セルロース、アガロース並びにセファロースが包含
される。好適なのは、アガロース、セファロース、並び
にデキストランのポリマである０通常は溶液中に懸濁さ
れる無機モノマを含有するポリマには、例えば、ゼオラ
イト、シリゲート、ホスフェート、サルフェート並びに
アルミネートが包含される。好適なのは、シリカおよび
アルミナのポリマである。

通常は溶液中に溶解される有機モノマを含有するポリマ
からなるネットワークには、例えば、カルボキシメチル
セルロース、ポリビニルアルコール、ポリグリコール、
グリコール、蛋白質、ポリペプチド、ペクチン、ムシン
（ｌｕｃｉｎｓ）　、リボプロティン、［ｌＮＡ　、Ｉ
？ＮＡ、並びにポリヌクレオチドが包含される。好適な
ポリマは、カルボキシメチルセルロース、ポリグリコー
ル、蛋白質、ポリペプチド、ＯＮ＾、ＲＮＡ　、ポリヌ
クレオチド、ムシン並びにペクチンである。

通常は溶液中に溶解される有機および無機モノマを含有
するポリマには、例えば、２価金属によって交差架橋さ
れた２官能価有機モノマからなるポリマが包含される。

この２官能価基には、例えば、アルデヒド、ゲトン、ア
ルコール、カルボン酸、アミン、アミド、並びにチオー
ルが包含される。

ネットワークが溶液中に固体として懸濁されたポリマか
らなる場合、固体ネットワークはバリヤを与え、これは
、溶液のバルク移動を低減する。ネットワークが溶液中
に溶解されたポリマからなる場合、溶液のバルク移動を
低減するバリヤを与えるネットワークは、溶解したポリ
マの相互の非共有結合的会合、相互作用、連結、並びに
結合により生起する。

この非共有結合的相互作用は、例えば、水素結合、イオ
ン対合、イオン性親和力たり得る。

ネットワークはシグナルと相互作用することによりシグ
ナルを更に局在化させ得ると考えられる。相互作用は非
共有結合または共有結合たり得る。非共有結合的相互作
用は、殻に、静電的相互作用であり、これには、例えば
、水素結合、イオン対合、双極子−双極子相互作用、並
びにファン・デル・ウォールズ親和力が包含される。共
有結合的相互作用は、ネットワークとシグナルとの結合
の形成による。

シグナルと共有結合的に相互作用し得るネッワークは、
官能基を含有する種々のポリマまたは官能基を含有する
化合物により被覆されたポリマからなる。これらには、
例えば、アルミナ、シリカゲル、並びに炭水化物のよう
な順相クロマトグラフに使用されるもの、オクタデシル
およびフェニル結合シリカのような逆相クロマトグラフ
に使用されるもの、並びに例えばシリコーンオイルまた
はポリエチレングリコールエステルで被覆された珪藻土
のようなガスクロマトグラフに使用されるしのか包含さ
れる。ネットワークとシグナルとの間の非共有結合的相
互作用の例には、オクタデシル結合シソ力からなるネッ
トワークがあり、シグナルはフェニレンジアミンである
。有機オクタデシル基は有機０−フェニレンジアミン分
子と非共有結合的に結合し、付加的なシグナル局在化を
与える。

シグナルと共有結合的に相互作用し得るネッ１へワーク
は、例えば、シグナルと例えばシック塩基の形成により
反応し得る官能性を有するものからなる。ネットワーク
とシグナルとの間の共有結合的相互作用の例は、アッセ
イに使用される前駆体がアルファ・ジホスホリル化（１
ｅｌジオールからなる芳香族色素である場合に存し、媒
体中のネットワークは第１アミン基を含むポリマであり
、分析物特異的部分に当接したシグナル化部分はアルカ
リ性ホスファターゼである。　ｇｅ１１ジオールからの
酵素によるホスフェート基の切断により、水分子が除去
されると共にアルデヒド含有螢光シグナルが形成される
。シグナル上のアルデヒド基はネットワーク上のアミン
基と反応し得てシッフ塩基を形成し、これにより、シグ
ナルをネットワークに固定化し、付加的なシグナル局在
化を与える。

本発明は、支持体上にて媒体中におけるシグナル生成ア
ッセイをも企図し、この場合、支持体はシグナルと相互
作用して付加的なシグナル局在化を与える。前記したよ
うに、相互作用は共有結合的または非共有結合的たり得
、この際、ネットワークはシグナルと相互作用する。

媒体中の溶液成分は、特定のアッセイおよびネットワー
クと和合性の全ゆる液体とし得る。水溶液または有機溶
液をシグナル化部分に使用することができ、これは、例
えば酵素のような触媒とする。　ＥｎＺｙ１！１ａｔｉ
Ｃｃａｔａｌｙｓｌｓｎ　　Ｏｒｇａｎｉｃ　　）ｌｅ
ｄｉａ　　ａｔ　　１００　　°Ｃ１八、　　２ａｋｓ
　　ａｎｄＡ、　Ｈ，Ｋ１１ｂａｎｏｖ　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　２２４　１２４９−１２５１（１９８４）およ
びＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏ
ｆＯｏｔｉｃａｌｌｙ　　Ａｃｔｉｖｅ　　Ｅｓｔｅｒ
ｓ　　ａｎｄ　　Ａｌｃｏｈｏｌｓｕｓｉｎｇ　　Ｅｓ
ｔｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｓｅｄ　　５ｔｅｒｅｏｓ
ｐｅｃｉｆｉｃＴｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｈｅｄ＋ａ　ｂｙ８、　　
Ｃａ１１ｂｕｖ　　ａｎｄ　　Ａ、　　Ｈ，Ｋ１１ｂａ
ｎｏｖ、　　Ｊ、　　ＡＩＩｅｒ。

ＣｈｅＩｌ、　Ｓａｃ、　１０６．２６８７−２６９２
　（１９８４）を参照することができ、これらをここに
参考として取り入れる。池の例では、ある種の有機溶媒
が、分析物を可溶化することにより、反応の促進に有用
である。　Ｒａｎｄｏｌｐｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３
８：３８７−３９０　（１９８８）を参照するとよい。

本発明の方法は、沈澱性および可溶性アッセイの双方に
適用し得る。沈澱性アッセイについて、ネットワークに
より及ぶ低減は、シグナルの小容量への濃縮を可能にす
る。すなわち、シグナル局在化である。これにより、溶
液中のシグナル溶解性を越え、その結果、目に見える沈
澱物が形成される。可溶性アッセイについて、ネットワ
ークにより及ぶ低減は、シグナル分子の濃縮の維持を可
能とし、この結果、例えば、螢光、発光、または発色が
より迅速に認められる。

１つの態様では、本発明の媒体または７トリツクスは、
水性または有８！溶液中にネットワークを形成するポリ
マを懸濁または溶解することによりｙｉ製する０時によ
り、媒体を加熱し、その後これを冷却して均一なネット
ワーク分布を確実にするのが必要たり得る。必要に応じ
て、媒体はＭ漬液を更に含み得る。

本発明に要求される溶液中でのネットワークの濃度は、
特定のネットワークおよび特定の溶液に依存する。ポリ
マ性ネットワークについて、これは溶液中に懸濁される
が、存在する溶液の藍は、例えば、サイズ、形状、並び
にポリマの膨潤により得る。ポリマの膨潤は、一般に、
架橋結合のパーセントにより調節され、架橋結合のパー
セントに逆比例する膨潤を与える。高度に架橋結合した
ポリマは、低度に架橋結合したポリマと比較すると溶液
に対し高い比率のネットワークを有し、したがって堅質
のビーズを形成する。比較的堅質のビーズは、シグナル
の拡散を低減する点で有利たり得る。これらは濃密なネ
ットワークを与えるためである。低度の架橋結合ポリマ
は、高度の架橋結合ポリマと比較するとネットワークに
対し高い比率の溶液を含有し、軟質のビーズを形成する
が、これは、大量の溶液が所望された場合、例えば、前
駆体が溶液に比較的不溶性である場合に有利である。好
適な懸濁ネットワークはゲルである。架橋結合とポリマ
の膨潤との間の関係を決定する表は容易に利用可能であ
る。ファルマシア・ケミカル・カンパニ、ビス力タウエ
イ、ニュー・ジャージによるイオン交換クロマトグラフ
およびゲルー過クロマトグラフのパンフレットを参照す
るとよい、参考としてこれをここに取り入れる。

溶液中に溶解されるポリマ性ネットワークについて、ポ
リマは、一般に、溶液の約１％〜約５０％からなるべき
であり、好ましくは、２％〜３０％であり、更に好まし
くは５％〜２０％である（重量／容量）、ポリマの濃度
が高ければ極めて精巧なネットワークが与えられ、低い
濃度のポリマと比較するとシグナルの拡散を顕著に低減
することができる。しかしながら、高い濃度のポリマは
媒体を極めて粘稠にし得、したがって、媒体を支持体上
に注いだり重層するのが困難となる。よって、溶液中の
ポリマの至適濃度は、かくして実施されるアッセイの種
類に依存することとなる。これは、当業者によって容易
に実施される初歩的調節実験によって最良に決定される
。

溶解されたポリマによってネットワークが形成される媒
体の例が存し、２％カルボキシメチルセルロース（ｃｎ
ｃ　）　　（Ｗ／Ｖ）を水中で約５０℃に加熱して清澄
な媒体を形成し、その後媒体を放置して冷却する。４ａ
体は清澄に止まり、可溶性のネットワークは媒体中に均
質に分散される。懸濁されたポリマによってネットワー
クが形成される媒体の例が存し、２％アガロースを水中
で約６０℃に加熱して清澄な媒体を形成し、その後媒体
を放置して冷却する。冷却に際し、膨潤したアガロース
はビーズとして水から分離、静置する。ｌ［ｌ潤したビ
ーズおよび水を捕獲し、ビーズ間にて不溶性ネットワー
クからなる媒体を形成する。

本発明の装置を形成するマトリックス材料の第２のＢ様
は、媒体に対し少くとも１．５センチポアズの粘度を与
える材料に関する。溶液という用語は、媒体中の溶剤お
よび他の液体に及ぶ、シグナルが発色性または蛍光性化
合物である場合、溶液の粘度を増加させることによるこ
のシグナルの拡散の低減は、結果的に１つの領域におけ
るシグナルの局在化を与え、その検出を増強する。

粘性の成分は、溶液に可溶性で媒体の粘度を増加させ得
る全ゆる分子とし得る０本発明の目的のための粘性また
は原質の媒体は、少くとも１．５　ｃｐの粘度を有する
ものとして規定される。しかしながら、媒体の粘度は、
約１．５　ｃｐ〜約１　、０ＯＯｃｐの範囲とし得る。

シグナルの拡散は、粘度が約１．５　ｃｐ未満である媒
体中では顕著に阻害されない、粘度が約１０００ＣＤを
越える媒体は、分析物または分析物誘導体の拡散を妨害
し得、支持体上に重層または注油し得ない、しかしなが
ら、媒体を支持体に渡って重層し分析物または分析物誘
導体がシグナル生成組成物に拡散し得れば、１０００Ｃ
１１を越える粘度を有する媒体を使用することができる
。粘度は温度に依存する０本発明の特許請求の範囲記載
の媒体の粘度は、媒体中でシグナルが生成される時に確
定されることを企図する。よって、アッセイを室温、３
７℃、０°Ｃ，または全ゆる他の温度で行っても、これ
は、媒体の粘度を少くとも１．５　ｃｐ、好ましくは約
１．５　ｃｐ〜１０００ｃｐとすべき温度におけるもの
である。

粘性の成分は、分析物または分析物誘導体を用いる勾配
またはシグナル生成系の反応種の反応に単に影響を与え
ない。

約１．５　ＣＤまたはこれを越える粘度を与えるのに要
求される粘性成分の濃度は、特定の粘性成分によって変
動し得る。変動する濃度の異なる成分を含有する溶液の
粘度を開示する表か利用可能である０例えば、Ｂ＋ｎｇ
ｈａｌｌとＪａｃｋｓｏｎ　、　Ｂｕｒｅａｕ　５ｔａ
ｎｄａｒｄｓ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、　１４５９　（１９
１８）　、Ｈ，Ｌ、　５ｈｅｅｌｅｙ、　Ｉｎｄ、　Ｅ
ｎａＣｈｅｌｌ、、　２４．１０６０　（１９３２）並
びにＳｅｇｕｒと０ｂｅｒｓｔａｒ、　Ｉｎｄ、　Ｅｎ
ａ、　Ｃｈｅｎ、、　４３．２１１７（１９５１）を参
照するとよい、溶液の粘度を増加させるのに有用な他の
成分については、必要な材料の量は、例えは粘度計によ
って測定されるものとして所望の粘度が得られるまで材
料を徐々に添加することにより当業者によって容易に決
定され得る。

適切な粘性成分には、溶液に可溶性のモノマ、オリゴマ
並びにポリマが包含される０例えば、糖、アルコール、
グリコール、蛋白質、ポリペプチド、アミノ酸、デオキ
シｉｔ、リボ核酸、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド、
ヌクレオシド、塩基、脂肪酸、ペクチン、ムシン、ポリ
サッカライド、ステロイド、フラボノイド、アルカロイ
ド、テルペン、ビタミン、補酵素、並びにプロスタグラ
ンジン、炭化水素、芳香族炭化水素、芳香族炭化水素、
並びにポルフィリンか包含される。

好適な粘性成分には、例えば、糖グリコール、蛋白質、
ポリペプチド、アミノ酸、デオキシ核酸、リボ核酸、ポ
リヌクレオチド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、塩基、
ペクチン、ムシン、並びにポリサッカライドが包含され
る。

媒体の粘度を増加させることによりシグナルの核酸を抑
制するのに加えて幾つかの特定のシグナルは、媒体中で
ネットワークを形成することにより対流を介して同様に
拡散を減少させ得る。この種の成分の例はカルボキシメ
チルセルロースである。

特定の成分は、媒体の剪断勾配または剪断に１合を増加
させることによりシグナルの拡散を抑制し、これは、効
果として、媒体の粘度を増加させるよう作用する。特定
の成分による媒体の粘度の増加の程度は、軸比率、形状
、並びに特定の成分のサイズに依存する。特定の成分か
らなる媒体の粘度は、当業界で公知の方法によって測定
し得る。この種の方法には、例えば、オストワルド・キ
ャピラリ粘度計、ウベロード・キャピラリ粘度計、クエ
ット粘度計、ジムークローサのフローティング・ロータ
粘度計、並びにカーテシアン・ダイバ回転シリンダ粘度
計が包含される６例えば、Ｄａｖｉｄ　Ｆｒｅｉｆｅｌ
ｄｅｒによるＰｈｙｓｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｌｉｓｔｒ
ｙ、　ｐｐ、　３５９−３６３を参照するとよい。

粘性マトリックスは、水・ｉまたは有機溶液中に少くと
も１．５０ｃｐの粘度を与える一定量の成分を懸濁また
は溶解することによって調製することができる。幾つか
の比較的不溶性の成分については、最初に溶液を加熱し
た後放置して冷却して均質な成分分布の確実化を図るの
が必要たり得る。マトリックスは必要に応じて更に緩衝
液を含み得る。

高粘度のマトリックスは、低い粘度のものよりシグナル
を局在化させる点でより有効であるが、過度の高粘度は
分析物または分析物誘導体の拡散を抑制し得、よって、
シグナル化部分がシグナル前駆体を迅速に含有し反応す
るのを阻害する。よって、媒体について実際に選択され
る粘度は、特定のアッセイに依存する。特定のアッセイ
についての至適粘度は、標準的方法を使用して当業者に
よって容易に決定される。

媒体の溶液部分は、分析物、分析物誘導体、シグナル生
成組成物並びに勾配の反応性化学種と和合性の全ゆる液
体とすることができる。

水性溶液または有機溶液をシグナル成分について使用す
ることができ、これは、例えば、酵素どする。場合によ
っては、有機溶液が好適である。　Ｅｎｚｙｎ＋ａｔｉ
ｃ　Ｃａｔａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＭｅｄ
ｉａ　　ａｔ　　１００°ＣＡ、　　２ａｋｓ　　とＡ
、　　Ｈ，Ｋ１１ｂａｎｏｖ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．１２４９−１２５１　（１
９８４）、およびＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　　Ｐｒｏｃ
ｌｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　０ｐｔｉｃａｌｌｙ八ｃｔ
ｉｖｅ　　ＥＳｔｅｒＳ　　ａｎｄ　　Ａｌｃｏｈｏｌ
ｓ　　ｕｓｉｎｇＥｓｔｅｒａｓｅ−Ｃａｔａｌｙｓｅ
ｄ　　５ｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃＴｒａｎｓｅＳｔ
ｅｒｉｆｉＣａｔｉＯｎ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｍｅ
ｄｉａ、８゜Ｃａｍｔ＋ｕｖとＡ、Ｈ，Ｋ１１ｂａｎｏ
ｖ、Ｊ、Ａｍｅｒ、Ｓａｃ。

１０６、２６８７−２６９２　（１９８４）を参照する
とよい。

これらをここに参考として取り入れる。所定の有機溶媒
は、分析物を可溶化することにより反応を促進するのに
有用たり得る０例えば、この種の有機溶媒は、結合した
コレステロールを可溶化するのに有利である。

シグナル　　摩　゛ 「シグナル生成組成物」という用語は、シグナル前駆体
および分析物または分析物誘導体の存在に応答してシグ
ナル前駆体を変換してそれより検出可能な化学種を生成
するのに必要な付加的な変換試薬に及ぶ。

分析物誘導体が過酸化水素であり、シグナル変換体がペ
ルオキシダーゼである場合、シグナル前駆体は、例えは
、４−クロロナフトールテトラメチルベンチジン、アミ
ノアンチピリンおよびフェノール、澱粉およびヨウ化カ
リウムまたはオルトフェニレンジアミンとすることがで
きる。

分析物誘導体がヨウ素であり、シグナル変換体が澱粉で
ある場合、シグナル前駆体は、例えば、ヨウ化カリウム
とし得る。

分析物誘導体がＮ＾叶またはＮＡＯＰＨであり、シグナ
ル変換体がフェナジンメトサルフェートまたはジアホラ
ーゼである場合、シグナル前駆体は、例えは、全ゆる種
類のテトラゾリウム塩とし得る。

分析物誘導体がＮＡＤまたはＮＡＤＰに共有結合した抗
原であり、シグナル変換体がＨＡＤまたはＮＡＤＰ依存
性酸化還元酵素およびその基質（更にフェナジンメトサ
ルフェートまたはジアホラーゼ）である場合、シグナル
前駆体は、例えば、全ゆる種類のテトラゾリウム塩とし
得る。

分析物誘導体がヨウ素である場合、シグナル前駆体は、
ポリアセチレンのものとし得る。

シグナルは、ポリアセチレンの導電率の増加よりなり得
る。

本発明の方法は、沈澱性および可溶性アッセイの双方に
適用し得る。沈澱性アッセイについて、拡散における遅
延によりシグナルが小容量に：ａａされるのを可能にす
ると共に、これにより溶液中でのこれらの溶解性を越え
て目に見える沈澱物が形成される。可溶性アッセイにつ
いて、拡散における遅延によりシグナル分子が濃縮され
たまま止まるのを可能として螢光、発光、または発色性
物質がより容易に認められるのを可能とする。

と乙ヱ土皿且旦Ｉ 分析物または分析物誘導体（調節化字種）と相互作用し
てこれに由来するこの種の調節化字種の勾配に沿ったシ
グナルの生成を回避する化字種として使用するのに最も
適切な材料は、試験されるべき分析物およびシグナルの
潜在的生成に使用される試薬組成物に依存し得る。

分析物が抗原であり、分析物特異的部分がＮＡＤまたは
ＮＡＤＰにより共有結合的にラベルされた抗原に複合し
たその抗原に対する抗体であり、分析物誘導体がＮＡＤ
またはＮＡＤＰにより共有結合的にラベルされた抗原で
ある場合、調節または相互作用化字種は抗原に対する抗
体とし得る。

分析物がコレステロールである場合、調節または相互作
用化字種はジギトニンまたはトマチンとし得る。

分析物がコレステロールまたはグルコースまたは尿酸で
あり、分析物特異的部分がコレステロールオキシダーゼ
またはグルコースオキシダーゼまたは尿酸オキシダーゼ
であり、またはいずれかの分析物、および分析物特異的
部分がコレステロールオキシダーゼまたはグルコースオ
キシダーゼまたは尿酸オキシダーゼまたは適切な基質に
より分析物から化学量論的に過酸化水素を生成し得る全
ゆる酵素の組合せであり、分析物誘導体が過酸化水素で
ある場合、調節または相互作用化学種はカタラーゼまた
はヨウ素またはフェリシアン化物または第一水銀塩また
はペルオキシダーゼおよびフェノールまたはポリフェノ
ール、芳香族アミンまたはポリアミンのような酸化性化
字種とし得る。

分析物がコレステロールまたはグルコースまたは尿酸ま
たはいずれかの分析物であり、分析物特異的部分がコレ
ステロールオキシダーセまたはグルコースオキシダーゼ
または尿酸オキシダーゼまたは適切な基質を用いて分析
物から化学量論的に過酸化水素を生成し得る酵素の全ゆ
る組合せであり、第１の分析物誘導体が過酸化水素であ
り、第２の分析物誘導体がヨウ素である場合、調節また
は相互作用化字種はアシルヒドラジドまたはチロシンま
たはポリチロシンとし得る。

分析物がコレステロールであり、分析物特異的部分かコ
レステロールデヒドロゲナーゼであり、分析物誘導体が
Ｎ　Ａ　Ｄ　ＨまたはＮＡ［］ＰＩ＋である場合、調節
または相互作用化字種はヨウ素またはキノンまたはＮ　
Ａ　Ｄ　ＨまたはＮＡＤＰＨ要求性酵素（例えばグルタ
チオンレダクターゼ）とし得る。

勾配は、少くともマトリックスの一部における濃度勾配
とし得る。勾配は、勾配によって規定される軸に沿って
増加する量の分析物または分析物誘導体反応性化字種を
与える連続勾配とし得、または勾配は、軸に沿って順次
増加する量の反応性化学種のステップ勾配とし得る。そ
の他、勾配は、マトリックスの少くとも一部を形成し均
一な濃度の反応性化学種を含有する次元勾配とし得る。

［実施例］ 本発明の方法は、以下の例示的な実施例からより明瞭に
理解されよう。

割１■ユ 本実施例は、本発明によるステップ勾配を有するコレス
テロールについての３層試験装置の製造および使用を記
載する。

層１：４−クロロナフトール（１０ｎＨ）　、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（１Ｍｇ／ｌ）、ウシ血清アルブミ
ン（ｌｎａ／ｎｌ）、酢酸ナトリウム（ｐｌ−１５，６
、０，１Ｍ　）　、アガロース（０，７％ｗ７ｖ＞並び
にｎ−ブタノール（９％Ｖ／Ｖ　）からなる組成物から
底部層を形成した。

層２：カタラーゼ（０〜０．１ｈｇ／　１）　、酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５，６，０，１Ｍ　）　、アガロース（
０，７％Ｗ／Ｖ）並びにｎ−ブタノール（９％Ｖ／Ｖ　
）からなる組成物から中間層を形成した。

層３：コレステロールオキシダーゼ （Ｎｏｃａｒｄｉｕｌｅｒｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　）　　
（２Ｕ／１１１）、コレステロールエステラーゼ（ウシ
膵臓）（２Ｕ／ｒａｔ）、タウロコール酸（７，５ｎｃ
＋／ｎ１）（ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）　、
ウシ血清アルブミン（１ｍｃ＋／ｍｌ）　、酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，６，０，１Ｍ）並びにｎ−ブタノール（
９％Ｖ／Ｖ　）からなる組成物から上部層を形成した。

層１についての組成物（２００ｐｊ）、層２についての
組成物（４００，目並びに層３についての組成物（１０
０μｍ）を順次５１１のポリエチレン培養チューブ（１
１１１１直径）に添加した。

それぞれの組成物を放置して０℃にて形成層に固化させ
た後、続く組成物を添加した。完全なセットは、０〜０
．１６μｇ／ｉｔの範囲の５つのカタラーゼ濃度よりな
る。

ヒト血清の両分を０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，６を
用いて５０μノに希釈し、上部層の上部に重層した。６
０〜８０分後、層１と！２との間の青色沈澱物の存在ま
たは非存在によりチューブをマークした。結果を第１表
に示す。

第１表 火皿１ チューブ　カタラーゼ（μ（１／ＩＩ＋）　　５　　、
ａｊｌｔｌ　　　１０μｍ皇漬　　２０μＩぬ渣１　　
　　　　０、００　　　　　　　　＋　　　　　　　十
＋２　　　　　　０．０２　　　　　　　−　　　　　
　　十　　　　　　＋３　　０．０４　　　−　　−　
　　＋４　　　　　０．０８ ５０゜１６ 前記結果は、装置中に存在するカタラーゼの濃度勾配に
よる調節およびシグナル生成を示す。

Ｋ止■ス 本実施例は、本発明による次元勾配を有する試験装置の
製造および使用を記載する。

層１：４−クロロナフトール（１０１１８）　、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（１層ｇ／ＩＩ）　、ウシ血清ア
ルブミン（１ｎｑ／１）　、酢酸ナトリウム（＋）Ｈ５
，６，０，１Ｍ　）並びにアガロース（０，７％Ｗ／Ｖ
）からなる組成物から底部層を形成した。

Ｍ２：カタラーゼ（０，０層ｇ／ＩＩ）　、酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５，６，０，１Ｍ　）並びにアガロース（０
，７％Ｗ／Ｖ）からなる組成物から中間層を形成した。

層３：酢酸ナトリウム（ｐＨ５，６，０，１Ｍ＞および
アガロース（０，７％Ｗ／Ｖ）からなる組成物から上部
層を形成しな。

層１（２１）を成形した方形ＰＶＣプラスチック容器（
測定寸法４５Ｉｌｒａ長さ、３０ｎ４幅、１４１１高さ
）に注いだ０層を平坦表面上で放置して室温にて固化さ
せた。容器の幅方向端部をその後５ｉｍ上げ、層２　（
４，５ｎｌ）を注いだ、この層をこの位置で放置して固
化させた。よって、この層は層１の上にくさび形を形成
する。

容器を再び平坦表面上に置くに際し層３（４，５１＋）
を注ぐ。

０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，６中の種々の濃度の
過酸化水素溶液の両分（２１）を前記ゲルに添加した。

３〜４時間後、ゲルの長さ（ｈ）に沿う青色の沈澱物の
高さを測定した。

結果を第２表に示す。

１呈羞 Ｈ２０２（１）４）　　　ｈ　（１１１１＞２、５　　
　　　　２．０ ５、　Ｏ２，７ 前記結果は、分析物誘導体（過酸化水素）の濃度は、勾
配の開始（これに沿ってシグナルが現れる）からの距離
に直接相関す′ることを示す。

艮土■旦 種々の有機溶媒を含有するコレステロール酸化溶液を次
のように調製した。

第１の組成物を次のものを含有するよう調製しな： コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　
　　　０．１５Ｕ／１（Ｎｏｃａｒｄｉａ　　ｅｒｔｈ
ｏｐｏｌｉｓ　　）ｉ！洋シワサビペルオキシダーゼ　
　　　　　　　　　　　　　　０．２５１１＠／ｎ！ア
ミノアンチピリン　　　　　１゜２５１Ｈ３，５−ジク
ロロ−２−ヒドロキシ　　　　　　　　　　　１０．０
　　ＩＮベンゼンスルホン象 タウロコール酸　　　　　　　７．５　ｉｇ／ｉｔ酢酸
ナトリウム（ｐＨ６，０）　　　０．１　Ｍ最終組成物
を形成すべく、エタノール、１〜プロパツール並びにｎ
−ブタノールを含む種々の量の脂肪族アルコールを添加
した。２，４Ｈ／ｉｆの全コレステロール（結合および
非結合）を含有する５１のヒト血清を添加することによ
り反応を開始した。サンプルを２５℃でインキュベート
し、時間と共に吸光度をモニタした（５００　ｎｎ）　
。

５０％の反応に必要な時間として相対的酸化速度を算出
した。アルコールを含有しない酸化溶液に対してこれら
を標準化した。コレステロールオキシダーゼによるコレ
ステロール酸化に対するアルコールの効果を第３表に示
す。

エタノール　ｌ　　　１．１　１．８　２．１　１．８
イソアロパノール　　　　１　　　　　−　　　　−　
　　　−”　　　　　９．８０−１タノール　　　　　
１　　　　　−　　　　　７．０前記結果は、脂肪族ア
ルコールは血清中のコレステロールの酸化率を増強させ
ることを示す。

特許請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲を逸
脱することなく種々の変換、改 変並びに変更を当業者かなし得ることは明らかたり得る
。

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料中の分析物を検出する装置において、この装
   置は反応性基質を備え、この反応性基質は： −溶液とシグナル局在化媒体、この媒体中においてシグ
   ナルが前記局在化媒体に束縛されない前記溶液中の分析
   物又は分析物誘導体から生成され得るものであり、かつ
   前記溶液中のこのようなどんなシグナルの対流と拡散も
   、前記溶液上の前記局在化媒体の作用によって減少され
   るものであり； −勾配、これは前記基質の少なくとも前記シグナル局在
   部分と結合又は接触され、かつ前記分析物又は分析物誘
   導体と反応してそれからのシグナルの生成を調節する因
   子の勾配であり；及び −組成物、これはどの残留する分析物又は分析物誘導体
   に露呈される時に、それから検出可能なシグナルを生成
   するものである これら三要素を含むことを特徴とする装置。
2. （２）勾配が、少なくとも基質の一部分中の濃度勾配で
   ある請求項１記載の装置。
3. （３）勾配が、少なくとも前記基質の一部分を形成しか
   つ前記反応性因子の均一濃度を含む寸法的勾配である請
   求項１記載の装置。
4. （４）前記シグナル局在化成分が、高分子網状組織と粘
   度促進剤からなる群から選択される請求項１〜３のいず
   れか１項に記載の装置。
5. （５）前記分析物が、コレステロールであり、かつ前記
   勾配因子が脂質親和性である請求項１〜３のいずれか１
   項に記載の装置。
6. （６）前記基質が、実質的に均一多孔質の不動化基質か
   らなる請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
7. （７）前記勾配が、分析物誘導体と反応する為のシグナ
   ル生成組成物の成分と対抗し、かつそれ自体検出可能な
   シグナルを生成しない因子の勾配である請求項１〜３の
   いずれか１項に記載の装置。
8. （８）前記勾配が、前記分析物誘導体と相互作用するこ
   とにより、前記シグナル生成組成物により検出可能なシ
   グナルの生成を出来なくさせられる因子の勾配である請
   求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
9. （９）前記勾配が、勾配軸に沿って前記反応性因子の量
   が連続的に増加する勾配からなる請求項１〜３のいずれ
   か１項に記載の装置。
10. （１０）前記勾配が、勾配軸に沿って前記反応性因子の
    量が順次的に増加する段階的勾配からなる請求項１〜３
    のいずれか１項に記載の装置。
11. （１１）前記シグナルが、沈澱可能な反応生成物に起因
    する請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
12. （１２）前記シグナルが、抵抗における変化の生成に起
    因する請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
13. （１３）前記シグナルが、電荷移動錯体の生成に起因す
    る請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
14. （１４）前記第一基質の前記勾配部分が、前記勾配の軸
    に沿ってどの検出可能なシグナルも検出可能にするのに
    充分な寸法の勾配部分である請求項１〜３のいずれか１
    項に記載の装置。
15. （１５）試料中の分析物の存在を定量的に検出する装置
    において、この装置は： （ａ）第一反応性基質、これは （ｉ）関係する分析物に露呈される時に、 前記基質を通して拡散可能であるところの分析物誘導体
    を生成する第一組成物、及び （ｉｉ）前記第一反応性基質中にて、前記分析物誘導体
    と反応して、それからの検出可能なシグナルの生成を調
    節する因子の勾配；この両方を含むものであり、 （ｂ）少なくとも一つの追加的基質、これは前記第一基
    質の勾配成分と接触する流体中にあり、かつ （ｉ）前記勾配因子と順次的に接触した後に前記分析物
    誘導体により接触されるように配置され、かつ前記分析
    物誘導体と反応して検出可能なシグナルを生成するシグ
    ナル生成組成物と、及び （ｉｉ）前記基質の少なくとも一部分中にて、溶液と局
    在化基質とからなり、この局在化基質中にて、シグナル
    が、前記局在化基質に束縛されない前記溶液中で生成さ
    れ、かつ前記溶液中のシグナルの対流と拡散が前記溶液
    の上の前記局在化媒体の作用により減少されるところの
    シグナル局在化成分 の両方を含む追加的基質であり、 この（ａ）と（ｂ）を備える装置。
16. （１６）勾配が、第一基質の少なくとも一部分中にて、
    前記基質に接触する面に実質的に平行な軸に沿う反応性
    因子の濃度勾配である請求項１５記載の装置。
17. （１７）勾配が、前記反応性因子の均一濃度を含む寸法
    的勾配であり、かつ前記基質に接触する面に実質的に平
    行である軸に沿う第一基質の一部分を形成する勾配であ
    る請求項１５記載の装置。
18. （１８）前記シグナル局在化成分が、高分子網状組織と
    粘度促進剤からなる群から選択される請求項１５〜１７
    のいずれか１項に記載の装置。
19. （１９）前記第一反応性基質が、実質的に均一な多孔質
    のゲル組成物からなる請求項１５〜１７のいずれか１項
    に記載の装置。
20. （２０）前記第一反応性基質が、単一ゲル層からなる請
    求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
21. （２１）前記第一反応性基質が、その中に前記第一組成
    物を有する第一ゲル層と、それと接触する流体中にて、
    その中に前記反応性因子勾配を有する第二ゲル層とから
    なる請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
22. （２２）前記勾配が、勾配軸に沿って前記反応性生成物
    の反応性因子の量が連続的に増加する勾配からなる請求
    項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
23. （２３）前記勾配が、勾配軸に沿って前記反応性生成物
    の反応性因子の量が順次的に増加する一連の領域からな
    る請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
24. （２４）前記シグナルが、沈澱可能な反応生成物である
    請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
25. （２５）前記シグナルが、抵抗の変化の生成に起因する
    請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
26. （２６）前記シグナルが、電荷移動錯体の生成に起因す
    る請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の装置。
27. （２７）競合する免疫学的検定試験装置において、この
    装置は： 第一層、この層は、標識した分析物又は分析物の類似物
    と複合化された関係する分析物に対して、既知量の抗体
    を組込まれた多孔基質からなり、 第二層、この層は、関係する分析物に対して、抗体の勾
    配を組込まれた多孔基質からなり、及び 第三層、この層はその中にシグナル生成組成物を有する
    多孔基質からなる この３つの層を備えることを特徴とする装置。