JP2957625B2

JP2957625B2 - オプティカルセンサー

Info

Publication number: JP2957625B2
Application number: JP5500790A
Authority: JP
Inventors: 光治大和久; 益男相澤; 義人碇山; 寛明篠原
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1990-03-08
Publication date: 1999-10-06
Anticipated expiration: 2014-10-06
Also published as: JPH03257370A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗原性を有する高分子の単分子膜あるいは累
積膜にpH依存性の発色団を有する色素を結合、吸着或い
は包括させた膜からなるオプティカルpHセンサー及び該
膜に抗体−酵素複合体を結合させた酵素固定膜からなる
オプティカルエンザイムセンサーに関する。

〔従来の技術〕

センシングに生体関連物質を含むいわゆるバイオセン
サーにおいて、アンペロメトリー（電流測定）やポテン
シオメトリー（電位測定）を用いた電気的検出法から、
光、熱、音などを測定する方式のセンサーの開発が進め
られつつある。特に物質の量を光変化で測定するいわゆ
るオプティカルバイオセンサーは、電気的磁気的ノイ
ズの発生や影響がない、光学的変化を生じさせる要素
（発光、吸光、蛍光）が多い、トランスデューサーに
感度の高いものが利用できるなどの利点を持つことから
注目されている。このオプティカルバイオセンサーは、
センシング部位にアクリルアミドゲル、アクリルアミド
膜、ナイロン膜、塩化ビニル膜、セルロース膜、セファ
ロース膜などの膜に直接酵素を結合させるか、あるいは
上記の膜のチューブのチャンバー中に酵素を固定化した
ビーズを封入して保持したものである。

又、現在発光を利用し過酸化水素、グルコース、AT
P、抗体、抗原を測定するセンサー、光の吸収を利用し
酵素、Ｐ−ニトロフェニルリン酸を測定するセンサー、
蛍光を利用しマグネシウムイオン、カルシウムイオン、
アルミニウムイオン、抗原を測定するセンサーが開発さ
れている。

そして、オプティカルpHセンサーについては、多孔質
ガラスビーズに色素を固定化したもの、リン脂質LB膜中
に色素を吸着したもの等があり、吸光度変化、蛍光変化
を測定するものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

オプティカルセンサーは、プローブ（測定部）が微小
なため、測定対象物に対する光学的変化（吸光、蛍光、
発光など）が大きくなるように工夫されたものでないと
大きな感度、速い応答速度が得られない。上記従来のオ
プティカルセンサーはアクリルアミド膜等の膜に酵素を
直接結合させる等するものであり、酵素の固定化量が少
ないこと、膜厚が厚く、微小化できないことのため満足
のいくセンサーとはなり得ないものであった。

したがって、酵素の固定量が多く、膜厚が薄く微小化
でき、センシング部位に好適に適用できるものからなる
オプティカルエンザイムセンサーの出現が望まれてい
た。

又オプティカルpHセンサーとしてリン脂質LB膜を使用
した超薄膜からなるオプティカルpHセンサーがあるが、
この場合、リン脂質の分子量は小さく、色素を単分子膜
の一部として使用するため、色素含量を増やすと単分子
膜が不安定となったり、使用できる色素が限られるとい
う欠点があった。

したがって、色素含量を増やしても単分子膜が安定な
超薄膜からなるオプティカルpHセンサーが望まれてい
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、前記の問題点を解決すべく鋭意研究の
結果、単分子膜形成物質として抗原性を有する高分子を
用い、これにpH依存性の発色団を持つ色素を結合して、
膜を形成したものが色素含量を増やしても安定な超薄膜
からなる有効なオプティカルpHセンサーとなること、そ
してこの膜に抗体−酵素の複合体を固定化したとき、酵
素密度が高くかつ超薄膜のオプティカルバイオセンサー
のセンシング部位に用いて好適なものが得られることを
見出し、本発明に到着したものである。

すなわち、本発明は（１）pH依存性の発色団を持つ色
素を化学結合、吸着もしくは包括させた、抗原性を有す
る高分子の単分子膜或いはその累積膜からなるオプティ
カルpHセンサー、（２）pH依存性の発色団を持つ色素を
含有する抗原性を有する高分子の溶液又はエマルジョン
を、水溶液の水面上に展開して単分子膜となし、該膜を
固体基盤上に移し取り、そのまま又は更に該単分子膜を
累積することを特徴とするオプティカルpHセンサーの製
造方法、（３）pH依存性の発色団を持つ色素を化学結
合、吸着もしくは包括させた抗原性を有する高分子の単
分子膜或いはその累積膜に抗体−酵素複合体を固定化し
た酵素固定膜からなるオプティカルエンザイムセンサ
ー、及び（４）pH依存性の発色団を持つ色素を含有する
抗原性を有する高分子の溶液又はエマルジョンを、水溶
液の水面上に展開して単分子膜となし、該膜を固体基盤
上に移し取り、そのまま又は更に該単分子膜を累積した
後、これを該高分子膜に対する抗体と酵素の複合体と接
触させることにより、高分子膜上に酵素を固定化するこ
とを特徴とするオプティカルエンザイムセンサーの製造
方法に関する。

本発明で用いる抗原性を有する高分子は、水面に展開
可能なものであって、天然高分子もしくはハプテンと結
合した天然高分子、又はハプテンと結合した合成高分子
であり、天然高分子としては、ウシ血清アルブミン、ヒ
ト血清アルブミン、インシュリン、ヘモグロビン、卵白
アルブミン、シトクロムＣ、リゾチーム、トランスフェ
リン、ミオグロビン等があり、合成高分子としては、ポ
リイミド、ポリフマレート、ポリアミノ酸、ポリアクリ
ル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸、ポ
リメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸スチレンブロ
ックポリマー、ポリオキシエチレンスチレンブロックポ
リマー等が用いられる。これら天然高分子及び合成高分
子に結合させられるハプテンは、ジニトロフェノール、
パラアミノ安息香酸、ペニシリン、ステロイドホルモン
等が挙げられる。

本発明で用いられる色素は、pH依存性の発色団を持つ
色素であって、酵素活性の高いpH範囲で吸光度、蛍光強
度変化の大きい発色団を持つものが選択される。

pHによる吸光度変化の大きい発色団を持つ色素として
は、PH指示薬があり、例えば以下のようなものである。

PH コンゴーレッド 3.0〜5.0 エチルレッド 3.0〜5.0 メチルレッド 4.8〜6.0 ブロムチモールドブルー 6.0〜7.6 ニュートラルレッド 6.8〜8.0 メタクレゾールパープル 7.4〜9.0 チモールブルー 8.0〜9.6 アリザリンイエローＲ 10.1〜12.0 pHによる蛍光強度変化の大きい発色団を持つ色素とし
て、具体的には以下のようなものである。

蛍光色素 PH フルオレセイン２〜４ジクロロフルオレセイン４〜６ 3,6−ジオキシキサントン４〜６ β−メチルウンベリフェロン６〜８クマリン酸６〜８１−ナフトール−２スルフォン酸ナトリウム８〜10 クマリン 10〜12 又蛍光色素は上記の構造を分子構造中に含有する化合
物、例えばフルオレセインイソチオシアネートなども含
まれる。

これらの色素は抗原性を有する高分子に対して約0.2
〜１重量％或いはそれ以上の範囲の高含有量で用いるこ
とができる。

本発明で用いる抗体−酵素複合体としては、抗体につ
いては担体に累積された抗原性を有する高分子に対する
抗体であって、例えば担体に累積された抗原性を有する
高分子が、ウシ血清アルブミンの場合抗ウシ血清アルブ
ミン抗体、インシュリンの場合抗体インシュリン抗体で
あり、ハプテンが、ジニトロフェノールの場合抗ジニト
ロフェノール抗体、パラアミノ安息香酸の場合抗パラア
ミノ安息香酸抗体であり、又、酵素は酸化還元酵素、例
えばグルコースオキシターゼ、加水分解酵素、例えばリ
パーゼ、コレステロールエステラーゼ、コリンエステラ
ーゼであり任意に選ぶことができる。

そして、この抗体−酵素複合体は、化学結合法或いは
遺伝子操作法などにより作成したものであり、例えば抗
ウシ血清アルブミン抗体−コレステロールエステラー
ゼ、抗ウシ血清アルブミン抗体−コリンエステラーゼ、
抗ウシ血清アルブミン抗体−グルコースオキシターゼ、
抗ウシ血清アルブミン抗体−リパーゼ、抗インシュリン
抗体−リパーゼである。

本発明のオプティカルpHセンサー及びオプティカルエ
ンザイムセンサーは、例えば以下のような方法でLB法を
適用して行うことができる。

即ち、抗原性を有する高分子と色素を溶媒に混合溶解
し、反応させ、化学結合又は吸着或いは包括させる。未
反応の色素をカラムクロマトにより分離し、高分子−色
素のフラクション溶液を得る。この溶液をLB装置におい
て水面上に滴下し、展開させる。気液界面には上記高分
子単分子膜が形成される。この膜を膜が破壊される圧力
より低い表面圧に圧縮保持し、固体基盤上に移し取る。
単分子膜の累積を行う場合は、なるべく高い表面圧力に
圧縮する事が好ましい。

ここで溶媒は水あるいはベンゼン、クロロホルムなど
の有機溶媒であり、該高分子の濃度は0.05〜1g/lであ
る。又膜への圧縮圧は高分子が単分子状態を保つ事がで
きる圧力で通常10mN/m〜60mN/mである。固体基盤として
は、通常ガラス、石英、金属（金、白金）、プラスチッ
クが用いられる。

又、水面上に展開した単分子膜が水相に溶出するよう
な場合は、架橋剤を水相に添加し膜を安定化した後、担
体表面に移し取り、或いは累積する。架橋剤としては、
グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナー
ト、ヘキサメチレンジイソチオシアナート、ビスジアゾ
ベンジジン等である。

又抗原性を有する色素含有高分子膜を更に累積した累
積膜は常法により得ることができ、例えば水面上に高分
子の単分子膜を形成した後、水平付着法あるいは垂直上
下法により単分子膜を基盤上に移し取るといった操作を
繰り返すことにより色素含有累積膜を得ることができ
る。累積膜即ち多重層膜とすることにより色素含有量の
多い膜となる。このようにして得られたこの色素含有膜
はオプティカルpHセンサーとして有用である。このオプ
ティカルpHセンサーは、色素により種々のpH範囲、例え
ばpH2〜12の範囲で測定が可能である。

次いで、このようにして得られた高分子膜を、この膜
の抗原に対する抗体−酵素複合体溶液中に浸漬等の方法
で接触させる事により、該高分子膜上に酵素を固定化す
る。得られた酵素固定化膜を例えば生理的リン酸緩衝液
で洗浄し、抗原−抗体反応以外で吸着している抗体−酵
素複合体を除去する。これにより固体基盤上に固定化酵
素超薄膜を得ることができる。

又、累積膜の場合には、同種又は異種の抗体−酵素複
合体を作用させることにより、同種又は異種の酵素が積
み重ねられた酵素固定膜を得ることも可能である。

このように固定化された酵素固定膜は、酵素の安定性
に優れ、高い酵素密度を有する。

〔作用）本発明のオプティカルpHセンサーは、抗原性を有する
高分子に色素を結合或いは吸着させた単分子膜或いはそ
の累積膜は、オプティカルpHセンサーとして作用し、色
素と薄膜を形成する高分子を組み合わせることにより、
pH2〜12の間のセンサーとして有用である。

又、色素を結合或いは吸着した抗原性を有する高分子
膜に抗体−酵素複合体を結合させた色素含有酵素固定膜
は、強固で高密度な酵素膜とすることができ、又、膜厚
もコントロールすることができる。

この光酵素センサーは、膜に固定された酵素がトリグ
リセライド等の基質と接触し、その基質を分解し、その
ときに酸或いは塩基を生成するが、この酸或いは塩基に
より膜表面のpHが変化するので、この膜中に存在させて
あるpH依存性の発色団を持つ色素の吸光度、蛍光強度が
変化することを利用するものであり、基質濃度を測定す
るものである。このセンサーは酵素密度が高く、超薄膜
であり、高感度、応答速度の速いものが得られ、高分子
膜に固定された酵素と色素とを選択することにより、各
種の基質の濃度等の測定が可能となる。

基質としては、グルコース、アセチルコリン、モノア
シルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシル
グリセロール（トリグリセライド）、コレステロールエ
ステル等が挙げられる。

色素、抗体−酵素複合体及び基質の組み合わせとして
は、例えば以下の通りである。

本発明のオプティカルエンザイムセンサーは、基質の
０〜１％という低濃度のものまで測定でき、極めて優れ
たものである。

〔実施例〕以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。

実施例１オプティカルpHセンサーウシ血清アルブミン12mg、フルオレセインイソチオシ
アネート（オレンジ色）0.67mgを0.2M炭酸バッファー
（pH9.1）1mlに溶かし、25℃16時間反応させる。反応液
をセファデックスＧ−25カラムでウシ血清アルブミンと
フルオレセインイソチオシアネートの反応物と未反応フ
ルオレセインイソチオシアネートを分離する。得られた
反応物フラクションを用いて単分子膜を作製する。

上記フラクションをマイクロシリンジを用い50μｌ水
面上に展開し、14mN/nの表面圧に保ち、25％グルタルア
ルデヒドを水槽中へ終濃度が0.5％になるように注入し
１時間反応させ、単分子膜を架橋安定化した。この単分
子膜をステアリルトリクロルシランで疎水化した石英基
盤上に一層移し取る。この膜のpH依存性を示したのが第
１図である。この膜はpHが上がると共に膜中の蛍光物質
フルオレセインの蛍光強度が上昇する性質を持ってい
る。

実施例２トリグリセライド測定用オプティカルエンザイムセンサ
ー実施例１で作製したフルオレセイン含有ウシ血清アル
ブミン累積石英基盤を、化学結合法（グルタルアルデヒ
ド２段法）で作製した抗ウシ血清アルブミン抗体−リパ
ーゼ複合体のリン酸バッファー溶液（pH7.0）に２時間
浸漬し、リン酸バッファー生理食塩水で十分洗浄し、抗
ウシ血清アルブミン抗体−リパーゼ複合体を固定化し
た。

オリーブ油をトリトンＸ−100で超音波で乳化したエ
マルション（オリーブ油５％、トリトンＸ−100 5％）
を種々の濃度にリン酸バッファー（pH8.0）で希釈し、
上記酵素固定膜の応答を測定した。結果を第２図に示
す。オリーブ油の濃度の上昇と共に膜中の蛍光剤フルオ
レセインの蛍光強度が減少する。これは、膜上に固定化
されたリパーゼによりオリーブ油は下記の反応をし、脂肪酸が生成し、膜表面のpHが減少する為である。第１
図に示した膜の性質、すなわちpHが減少すると蛍光強度
が減少する事から、第２図に示すような直線が得られ
る。これによりトリグリセライドの濃度が測定できる。

又、オリーブ油のかわりに流動パラフィンを同様に乳
化し、この膜の応答性を調べたのが第３図である。

この膜上のリパーゼは流動パラフィンを基質としない
ため、酵素反応により脂肪酸を生成せず、膜表面でpH変
化が起こらないため、膜中の蛍光強度が変化しない。以
上のことから、膜中の蛍光剤フルオレセインの応答は、
酵素反応によるものであることを確認できる。

〔発明の効果〕

本発明のオプティカルpHセンサーは、pH依存性の色素
を含有する抗原性を有する高分子をLB法により、基盤に
単層あるいは多重層積層したpH依存性超薄膜からなるも
ので、従来のものに比べ10倍以上の高濃度の色素含有量
を有する安定な膜からなるものである。又、本発明のオ
プティカルエンザイムセンサーは上記超薄膜からなるオ
プティカルpHセンサー膜上に抗原抗体反応により酵素を
固定化したものからなるものである。オプティカルセン
サーはセンシング部である膜を例えば光ファイバー先端
に固定することが必要であるが、従来のものは微小化に
限界があり作製も難しいのが実状であった。しかし本セ
ンサーはLB法を用いることにより光ファイバー先端にセ
ンシング部位を直接構築することができるため微小化が
可能で、かつ製作が容易にである。しかも、酵素密度が
高く、厚さが数100オングストロームの薄膜でセンシン
グ光変換を行うことが出来るためオプティカルバイオセ
ンサーのセンシング部位に用いて好適であり、又、色
素、抗体−酵素、基質との選択、組合せにより広範囲の
基質の濃度等の測定が高感度、高速度で可能となり、極
めて有用なものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のオプティカルpHセンサーの膜のpH応答
性を示すpH−蛍光強度グラフ、第２図は本発明のオプテ
ィカルエンザイムセンサーのオリーブ油に対する応答性
を示す、オリーブ油濃度−蛍光強度グラフ、第３図は本
発明のオプティカルエンザイムセンサーの流動パラフィ
ンに対する応答性を示す流動パラフィン濃度−蛍光強度
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭61−247965（ＪＰ，Ａ) 特開昭50−93494（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−38164（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−67548（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) G01N 21/75 - 21/83 G01N 33/543 G01N 33/547

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】pH依存性の発色団を持つ色素を化学結合、
吸着もしくは包括させた、抗原性を有する高分子の単分
子膜或いはその累積膜からなるオプティカルpHセンサ
ー。
【請求項２】抗原性を有する高分子が、水面に展開可能
な天然高分子もしくはハプテンと結合した天然高分子、
又はハプテンと結合した合成高分子である請求項１記載
のオプティカルpHセンサー。
【請求項３】天然高分子が、ウシ血清アルブミン、ヒト
血清アルブミン、インシュリン、ヘモグロビン、卵白ア
ルブミン、シトクロムＣ、リゾチーム、トランスフェリ
ン、ミオグロビンである請求項２記載のオプティカルpH
センサー。
【請求項４】合成高分子が、ポリイミド、ポリフマレー
ト、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エ
ステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステ
ル、ポリアクリル酸スチレンブロックポリマー、ポリオ
キシエチレンスチレンブロックポリマーである請求項２
記載のオプティカルpHセンサー。
【請求項５】ハプテンが、ジニトロフェノール、パラア
ミノ安息香酸、ペニシリン、ステロイドホルモンである
請求項２記載のオプティカルpHセンサー。
【請求項６】pH依存性の発色団を持つ色素を含有する抗
原性を有する高分子の溶液又はエマルジョンを、水溶液
の水面上に展開して単分子膜となし、該膜を固体基盤上
に移し取り、そのまま又は更に該単分子膜を累積するこ
とを特徴とするオプティカルpHセンサーの製造方法。
【請求項７】水相に高分子の架橋剤を添加する請求項６
記載のオプティカルpHセンサーの製造方法。
【請求項８】pH依存性の発色団を持つ色素を化学結合、
吸着もしくは包括させた、抗原性を有する高分子の単分
子膜あるいはその累積膜に抗体−酵素複合体を固定化し
た酵素固定膜からなるオプティカルエンザイムセンサ
ー。
【請求項９】抗原性を有する高分子が、水面に展開可能
な天然高分子もしくはハプテンと結合した天然高分子、
又はハプテンと結合した合成高分子である請求項８記載
のオプティカルエンザイムセンサー。
【請求項１０】天然高分子が、ウシ血清アルブミン、ヒ
ト血清アルブミン、インシュリン、ヘモグロビン、卵白
アルブミン、シトクロムＣ、リゾチーム、トランスフェ
リン、ミオグロビンである請求項９記載のオプティカル
エンザイムセンサー。
【請求項１１】合成高分子が、ポリイミド、ポリフマレ
ート、ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸
エステル、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸エステ
ル、ポリアクリル酸スチレンブロックポリマー、ポリオ
キシエチレンスチレンブロックポリマーである請求項９
記載のオプティカルエンザイムセンサー。
【請求項１２】ハプテンが、ジニトロフェノール、パラ
アミノ安息香酸、ペニシリン、ステロイドホルモンであ
る請求項９記載のオプティカルエンザイムセンサー。
【請求項１３】pH依存性の発色団を持つ色素が、酵素活
性の高いpH範囲で吸光度、蛍光強度変化の大きい発色団
を持つものである請求項８記載のオプティカルエンザイ
ムセンサー。
【請求項１４】抗体−酵素複合体が、抗原性を有する高
分子に対する抗体及び酵素からなるものである請求項８
記載のオプティカルエンザイムセンサー。
【請求項１５】抗体−酵素複合体が、抗ウシ血清アルブ
ミン抗体−コレステロールエステラーゼ、抗ウシ血清ア
ルブミン抗体−グルコースオキシダーゼ、抗ウシ血清ア
ルブミン抗体−リパーゼ、抗インシュリン抗体−リパー
ゼである請求項８又は14記載のオプティカルエンザイム
センサー。
【請求項１６】pH依存性の発色団を持つ色素を含有する
抗原性を有する高分子の溶液又はエマルジョンを、水溶
液の水面上に展開して単分子膜となし、該膜を固体基盤
上に移し取り、そのまま又は更に該単分子膜を累積した
後、これを該高分子膜に対する抗体と酵素の複合体と接
触させることにより、高分子膜上に酵素を固定化するこ
とを特徴とするオプティカルエンザイムセンサーの製造
方法。
【請求項１７】水相に高分子の架橋剤を添加する請求項
16記載のオプティカルエンザイムセンサーの製造方法。