JPH02273687A - チアミンリン酸塩の水溶液からリン酸を分離する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明嬬チアミンリン酸塩の水溶液からリン酸を分離す
る方法に関する。

〔従来の技術〕

構造式Ｉのコカルボキシツーゼ（を九テアミｙｔロリン
酸塩またはチアミンニリン酸とも云う）は補欠分子族と
して特殊なたん白質と共に、人間的および動物的生物体
の物質代謝において一連の重大な反応を接触する多くの
酵素を生成する。

ＯＨＯＨ ある条件下、例えば組織中に酵素機能不全のある場合を
次は酸素欠乏の場合にビタミンＢ１のコカルポ中シラー
ゼへのリン酸化機構は阻害されることがある。このより
な場合にコカルポキシツーゼによる治療は糖尿病の敗血
症の際、末梢血管病、神経痛ｔｘは帯状庖疹の一定の形
の場合と同様に重要である。

１９３７年に酵母ρλらコカルボキシラーぜの補酵素を
始めて分離して以来このものｔ−製造する有利な方＠を
開発するこころみは久くることはなかった。公知である
方法の概要は西ドイツ特許出願公開第１０８５５２７号
明細書に開示されている。コカルボキシラーゼの、記載
されている技術的に重要なすべての合成はチアミンから
出発し、該チアミンｔ一種々のリン酸化剤で反応せしめ
ている。最も多く使用されるリン酸化剤は高−度のリン
酸である。すでに西ドイツ特許出願公開第１０８５５２
７号明細書に開示され友よりに、高＠［のオルトリンａ
ｌはわずかに約２５−までビロリン１１１ｈら構成され
ているにすぎない。その結果コカルポキシラーゼは理論
的には最高で２５−の収率で生成され得るにすぎない。

該収率は副生成物として生成する高級チアミン−ポリリ
ン酸エステルｔ１この場合同時にコカルボキシラーゼ自
身は分解することなく、部分的に加水分解することだけ
で向上させることが出来る。

従ってコカルボキシラーゼ製造の主要のＪＩＩ点はチア
ミンをリン酸化する際に生じる、リン数および穆々のチ
アミンリン酸エステルからなる混合物からコカルボキシ
ラーゼ七できるだけ有利に分離することにある。さらに
チアミンリン酸エステルは酸に敏感であるために過剰の
リン＠ｔエステルの実際の単離前にできるだけ早く分離
することが合理的であると判明した。

リン酸の分１ＩＩＩは従来の技術によれは一般には、メ
タノール、またはア七トンのような＃沖」でチアミンリ
ン酸エステルを数回沈澱せしめてこれをリン酸水溶液か
ら分離することによって行う。

これに要する溶剤の童は相当なものである。それに加え
てこれによってリン酸の完全な分離は可能ではない。

ほかの手段はリン酸を含むチアミンリン酸浴液を塩基性
イオン交換体で処理することである。

この場合、イオン交換体の非常に多い倉か必要でかつ該
チアミンリン酸エステルはイオン交換処理により極めて
薄い溶液で生じるので不利である。

ところで、チアミンリン酸塩する際に生じるチアミンリ
ン酸塩溶液を適当な不水浴性第三アミンおよび水と混合
しない中程度の極性の溶剤ηλらなる混合物との液−液
抽出により過！＄１のりンＷ１１に完全に分離すること
かの能である仁とが見出された。この場合にはリン＠を
不水溶性のアミンで相応する塩にして、該塩ｔそれρλ
ら水と混合しない溶剤にニジ抽出する。非常に意外なこ
とはリン酸のこの抽出の際に同様にアミンと塩を生成す
ることのできるチアミンリン酸塩は抽出式れす、むしろ
殆ど定量的に水浴液に残っていることである。

〔発明が解決しようとする練聰〕

従って本発明の課題は例えはチアミンをリン酸化し、場
合により引き続いて部分的加水分解することによりコカ
ルボキシラーゼを製造する際に生じるチアミンリン酸塩
の水溶液からリン酸を分離する方法において、前記リン
Ｗｊｔｔ−経済的〃瓢つ完全に分離する方法を提供する
ことであつ九。

〔昧ａｔを解決するための手段〕

前記腺題は本発明により、前記リン１ｍ！？！−Ｓ夾際
に水に不溶または極めてわずか可溶性の第三アミンで相
応する塩に導き、こＡ１１−実際に、水と混和しないか
または極めてわずかに混和可能な中ａ度の極性の溶剤で
抽出することにより解決される。

特に有利には、本発明による方法七久のように行りこと
である。すなわち、前記リン戚七夾際に水に不溶１７′
？、は極めてわすかに可溶性の第三アミンおよび実際に
水と混和しないかｌたは極めてわす刀１混和可能な中程
度の極性の浴剤との混合物で抽出することである。

該抽出剤はアルカリ性水溶液（例、Ｎａ０ＨｓＫＯＨ）
で簡単なストリッピングによって再生することができる
。該チアミンエステルホスフェートは抽出の後はチアミ
ンリン散エステルホスフェートとして水相に存在するが
、こｎは常法でイオン交換クロマトグラフにより分離す
ることができる。

該抽出に１９過剰のリン酸は完全に良く除去できるから
、ここではただ実質的にわすかな菫のイオン交換体が必
要であるにすぎない。

第三アミンとしては本発明による方法には今までの観測
によれば原則的にすべての第三アミンが適している。こ
れらは水に不溶ｔｆｃはわずかのａＴ浴性であるから、
それが官能基にもとづき他の方法で反応相手と反応でき
ない＠シはその化学的性質は問題にならない。久に例を
挙げる。

炭素原子総計で８〜４０個、有利には１２輪３６個を有
する脂肪製第三アミン、例、特にトリオクチルアミンな
らびにトリヘキシルアミンおよびトリドデシルアミン、 脂肪族一環式脂肪族第三アミン、例Ｎ、Ｎ−ゾメテルシ
クロへキシルアミンお工び 脂肪康−アリール脂肪族第三アミン、例Ｎ。

Ｎ−７メチルーペンンルアミン。

特に有利であるのは容易に入手しやすく、従って安価な
アミントリオクチルアミンおよびトリドデシルアミ／を
使用することである。

第三アミンは一般に、それが塩生成に必要であるような
量で使用する。特に有利なのは該塩生成を同様に抽出に
使用する、実際に水と混和しない中位の極性の溶剤の存
在ですぐに行うように加工することである。該リン酸會
水に不溶ｔｙｃ嫁極めてわすかに可溶性のアミンおよび
水と混和しないかは極めてわずかに水と混和可能な溶剤
とからなる混合物で抽出することが秀際に重要である。

このために該溶剤に対して１０〜８０、有利には４０〜
７０重量−の菫で該アミンを含む混合物を使用する。単
にわずかのアミンの量を富む混合物で作業するときは多
量のアミン−溶剤混合物の大量を使用するかさもなけｎ
ば抽出過ｌ！を数＠繰返さなけれはならない。

アミンを大量に含むアミン−溶剤混合物で作業すｎば、
九だ一回の抽出過程で十分である。

水と混和しないかま几は極めてわずか混和可能な中位の
極性の溶剤は主として、いわゆるＩＣＴ価、約５０〜約
３０Ｋｏａ１／ｍｏ１（２１１〜１２６　ｋｌｉ）／　
ｍｏｌ　）を有するような溶剤が考えられる（　Ｏｈｒ
、Ｒｎ１ｏｈａｒｄｔｒ１３ｏ１ｖｅｎｔ　ｌ１ｌｆｆ
＠ｃｔａ　ｉｎＯｒｇａｎｉｃ　ＣｈｅｍｉｓｔＰｙ　
’　Ｖｅｒｌａｇ　Ｏｈｅｍｉｅ　ｓ　　１９７９＃ｂ
ｅｓ、８．２４２〜４５）。例を舟けると炭素原子４〜
８個を有するアルコール、エーテル例ゾエテルエーテル
、メチル−ｔ−ブチルエーテル、ジフェニルエーテルお
ＬびＶ−ｒｓ−ｆｆルｘ−チル、ならびに炭素原子５〜
８個ｔ−Ｗするケトン、例クエテルケトン、メチルイン
ブチルケトン、アセトフェノンおよびシクロヘキサノン
およびシクロヘキサノンおよび炭化水素、例トルエン・
酢酸エチルエステルおよびハロゲン化炭化水素は原則的
にまた使用することができるけれども操作技術的理由か
らはあｔシ有利ではない。

特に有利にはメチル−イソブチルカルビノール、３−エ
チル−ペンタノール、１−ヘキサノール、メチル−シク
ロへキサノール、メチルインブチルケトンおよびメチル
−１−ブチルエーテル七使用する。

溶剤は一般に抽出すべきリン［１ｋｇ毎に１〜４ゆ有利
には１．５〜２に９の量で使用する。第三アミンを有す
る混合物では溶剤は第三アミンに対し２０〜９０、有利
には３０〜６０重量−の量で含まれる。

第三アミンおよび溶剤からなる混合物で作業ゼす、すな
わち、チアミンリン酸塩のリン酸水溶液を水と混和しな
い溶剤無しで第三アミンと混合するときは、生成せられ
る塩は油状の形で生じひいては後続の抽出の際には困ａ
ｔ−引き起すことが起り得る。

リン酸の抽出は、該水浴液が一値３〜４、籍に３．２〜
３．４になったとき終了する。

本発明による方法は、チアミンをリン酸化する際に生じ
るチアミンリン酸塩のリン酸水＊ａからリン＠全分離す
るのに適している。

チアミンのリン酸化の際に得らｎる、チアミンリン酸塩
の混合物の組成はリン酸の中に取り込まれるチアミン量
に依存する。低いチアミン／リン酸比率の際には殆ど５
０チの高級チアミンりン酸塩が生成し、高いチアミン／
リン酸比率の際はこれに対してチアミン−リン酸塩成分
は６０ｑ／ｂ以上に上昇する。

チアミンリン酸塩は酸性溶液中では加水分解する。この
場合にゾ、トリおよび高級リン酸塩社水溶性故に対して
チアミン−リン酸塩よりも著しく高い不安定性を示す。

ａ−Ａリン酸化生成物を水に溶解する際に達する１より
小名いβ値の場合、高級リン酸塩の加水分解速度は比較
的大きい。

＠製すン鍍化生成物が多量の高級チアミンリン酸塩を含
有するときは、リン酸化する際に生じる混合物を先づ部
分的加水分解させることか有利である。

この几めに一般にリン酸化の際に生じるチアをンー朝製
リン酸塩を水中でβ値０．５〜３有利には０．５〜１．
５で、温度６０〜１００、有利には５０〜８０℃に加熱
する。最も有利な条件はそｎそれの度毎にＨＰＸＪＯに
より該混合物を試験することにより見出すことができる
。水中のチアミン粗製ｖ′／ＩＲ塩を長く加熱すれは、
テアミン−りン敏塩の成分はそれだけ多くなる。引き蝙
はした部分的加水分解、すなわち、水中の該チアミン粗
製リン酸塩混合物を約２〜６時間加熱することにより、
所望の場合には主としてチアミン−リン酸塩１含んだリ
ン酸水溶液を得ることができ、これらの溶液からリン！
［−本発明による除去により拘単に同様に必要なチアミ
ン−リン酸塩を得ることができる。

過剰のリンｉ１！を抽出後該チアミンリン酸塩は常法で
分離することができる。

コカルポキシラーゼおよびチアミン−リン酸塩の単一は
有利には次のよりに行う。すなわち、リン酸を抽出する
ことにより遊離され九チオアミンリン酸エステルリン酸
塩溶液から低級アルコールまたはアセトンを加えること
によジチアミンーリン酸エステルの大部分を結晶チアミ
ン−リン酸エステルリン酸塩として沈澱せしめ富化し九
コカルポキシラーゼｔＷ童ｋＮする残つ九溶液から有機
溶剤を常法で留去した後イオン交換クロマトグラフィー
によりコカルボキシラーゼを収得する。

チアミンりン酸塩を分離することについての詳細なデー
タは例えばすでに前記記載の西ドイツ特許出願公開第１
０８５５２７号明細書に開示されている。

単離する際に含まれたコカルボキシラーゼから常法でま
たコカルボキシラーゼの所望の塩を製造することができ
る。

本発明による方法によって、チア（ンのリン酸化の際に
生じる、オルトリン酸および橋々のチアミンリン酸エス
テルからなる混合物から簡単でかつ有′利にコカルボキ
シラーゼを単一することができる。

完全な抽出によるリンＩＩＩ！Ｏ除去により得られたチ
アミンリン酸エステルリン酸塩溶液のさらに有利な点は
メタノール、エタノールｔた紘アセトンのような有機溶
剤を添加することによりテアミンーリン酸エステルの大
部分が直にチアミン−リン酸エステルリン酸塩として結
晶（ＩＩ＆売可能の市場製品）として得られることであ
る。

富化されたコカルＭ中シラーゼ成分を有、する残つた溶
液社常法で有機溶剤を留去せしめ友後イオン交換クロマ
トグラフィーにより純化することができる。この溶液の
減少したチアミン−リン酸エステル成分により極めて少
量のイオン交換体を必要とするにすぎない。

チアミンをリン酸化することにより得られるチアミンリ
ン酸塩の溶液を延長した部分的加水分解、引き続いてリ
ン酸の抽出およびメタノール、エタノールまたはアセト
ンのような有機溶剤を添加によりチアミンリン酸塩の殆
ど全宮量を簡単に結晶、販売可能なチアミン−リン酸塩
の形で分離することができる。

〔実施例〕

以下例により本発明による方法を詳細に説明。

する。

これらの例に先だちその際利用するチアミンリン酸塩の
分析法について２．３の説明をする。

チアミンリン酸化生成物の分析は逆相−シリカゲルカラ
ムでＨＰＬＯにより行う（ＭＪｕｍｕｒａａｔ　１Ｌｌ
ｓＪ、０ｈｒＯ！Ｉｌｌ！ＬｔＯｇｒ＆ｐｌｋ７）　　
３３２　（１９８５）、ｊ［１８１〜１８８参照）。

カラＡ　：　ＲＰ　１８．７μｍ　２５０８８謳展開剤
：水中０．２　ｍ　ＮａＥ１ＰＯ４の緩衝液９９７ｄア
セトニトリル３ｄ 圧力　：１１５パール チアミンおよびリン酸化生成物の構出にはλ−２３５ｎ
ｍでＵＶ検出器により鋤定し、りン酸の検出は後続の赤
外線分析器で行う。

リン酸化生成物比の測定はＵＶ−積分器表示により行わ
れ種々のリン酸化反応生成物のモル収率には相応しない
、これらは個々のリン酸塩特定種の相違する吸光係数の
関係によって得られる。しかしリン酸化反応を相対的に
比較するためにはこれは必要ではない。

例１ Ａ）チアミンクロリド−塩酸塩のリン酸化チアミンクロ
リド−塩酸塩２００　、？　（０，５９モル）ｔ１００
℃で１時間オルトリンａ２２５０ｇと混合し友。該混合
管ｔ１２０℃に加熱後五酸化りン２００！ｉ加え、その
結果生じるＨＯＪガス発生を普通した。さらに１５分間
の反応時間の後該反応混合物を冷却した。ＨＰＬＯによ
る次の組成１に有するリン酸を含むチアミンリン酸エス
テル−混合物５４１”ｋ得た。

コカルポキシラーゼ　　　　　　　　３３．７　ｔｓチ
アミン−リン酸塩　　　　　　　　３７．２饅チアミン
三リン酸塩　　　　　　　　１５．０チチアミン四リン
酸塩　　　　　　　　１３．１　％Ｂ）チアミンリン酸
塩エステル混合物の部分的加水分解 ガラス状の固化した粗製リン酸塩（５４４，？）を水１
０８８ｓｌに溶解し、ｆｌＸ溶液を引き続いて７０℃に
１時間加熱し九。引き続き該ｉ！＃液をＨア−ｃ１使用
して試験した。これは次の組成であつ九。

チアミン−リン酸塩　　　　　　　　６１．４％コカル
ボキクラーゼ　　　　　　　　３１．５％デアミン三リ
ン酸塩　　　　　　　　　２．６−〇）りン麿の抽出 前記溶液を冷却し九る後遊陥リン酸の主なる量を除去す
る九めトリーｎ−オクテルアζン７５重量％を含有する
メチルイノブチルカルビノールからなる混合勧告１！で
２回抽出した（抽出剤は回収できる）０次の組成の粗製
リン酸塩溶液（−３，３）９０７．９１−得た。

チアミン−リン酸塩　　　　　　　　６６．９　％コカ
ルボキシラーゼ　　　　　　　　５０．２チテアミン三
リン酸塩　　　　　　　　　１．５饅Ｄ）イオン交換体
によるチアミンリン酸塩エステルの分離 粗製リン酸塩を抽出したる後に得られるチアミンリン酸
塩エステル溶液（９０７，９）をイオン交換カラム２個
を介して分離した。該コラムは下記の交換体を含む、す
なわち、 １）　　Ａｍ’ｂ＠ｒｌｉｔｅ　Ｉ　ＲＡ　９５　（弱
塩基性１．　”ｏＨ形）０Ｏ− ２）　　Ｌｅｗａｔｉｔ　Ｉ　Ｒ−１２０（強酸性、Ｈ
＋形）３０００＊ 弱塩基性イオン交換体（Ｉ　ＲＡ　９５　）から流ｎ出
た溶液を直ぐに酸性のイオン交換体Ｌ・ｗａｔｉｔｌＲ
−１２０に供給した。６００−を先に流した後久Ｏ組成
の＝カルボキシラーゼ１．２１　ｔ−％た・ コカルボキクラーゼ　　　　　　　　９９．５チテア考
ンーリン酸塩　　　　　　　　　　０．５％該ココカル
ボキシラーゼ溶液　１．２４　）　ｔ−４０ζリパール
で約１００−に蒸発せしめ、メタノール４００４ｔ−加
えた後にコカルポキシラーゼー四水化物５４ｇ（使用し
たチアミンｘ　Ｈｃｌに対し１８ｑＩＩ）１に得た。

Ｂ）イオン交換体の再生およびチアミン−オルトリン酸
−ビス−塩酸塩の収得 ＆）弱塩基性イオン交換体（Ａｍｂ＠ｒｌｔｅ　Ｉ　Ｒ
Ａ９５）’ｋ　１．５４　Ｎａ０Ｂ水溶液１．０！で再
生し、ａｇ。

３ノで中性洗浄し死後に、さらに分離に使用可能であっ
た。

ｂ）酸性イオン交換体ＩＲ−１２０を１ｏ慢ＨＯＪ水Ｓ
液５ｊで再生し、ＨｓＯ２０１で中性洗浄のｖｋ社さら
に分離に使用可能であった。塩酸の再生溶液（５，１）
　ｔ４００ｄｌＩＣ７１１ＮシーＬＣ約４０ミリバール
でＬｍｅｏａ２ノを加えることによりテアミンーオルト
リン識−げスー塩酸塩１５３、？（使用し九チアミン塩
酸塩に対し５７％）を収得した。これはチアミンクロリ
ド・塩酸塩の代フにさらにリン酸化の九めに使用するこ
とができ次。

同様にチアミンクリド改化し、必簀ならは引き続いて部
分的加水分解して製造されたチアミンリン酸塩の水醪液
からりン酸を実際に定電的抽出分離することができた。

すなわち、ａ）　）リー二一ドデシル−アミン４０１１
１％およびメチル−ｔ−ブチルエーテル６０Ｘ量％から
なる混合物で３回抽出し、 ｂ）　）ソーｎ−オクチル７ば７５０重量−および１−
ヘキサノール５０重量％からなる混合物で２回抽出し、 Ｃ）　トリーｎ−へキシルアルミン６０重量Ｓおよび３
−エチル−ペンタノール４０重量−からなる１合物で６
１抽出し、ならびに ｌ１ｌ）トリーｎ−ブチルアミン４０］［量−およびメ
チル−インブチルケトン６０重量−からなる混合物で３
回抽出を行うことである。

例２ チアミンクロリド・塩酸塩２００ＩＩｔ−オルトリン酸
２５０ｇと例１人に相応してリン酸化し、得られ九チア
ミンリン酸エステル混合物を例１Ｂと同様に部分的に加
水分解し、その際得られ九溶液を例１ｏと同様にトリー
ｎ−オクチルアミン７５重量％”ｔｔ有するメチルーイ
ソブチルーカルピノルからなる混合勧告１）で２回抽出
した。

抽出した溶ｇ、１１００−は次の組成の乾燥物質（ｒａ
）５１８ｇを含んでい友。

チアミン−リン酸塩　　　　　　　７２．７　％コカル
ボキシラーゼ　　　　　　　２３．４チチアξン三リン
Ｉ！　　　　　　　　　　　１．０％抽出し死相製リン
酸塩溶液１１００ｙに５０℃でエタノール１１０Ｃ１ｄ
ｔ添加し、得らｎ−混合物ｔ−寛温に１時間以内に冷却
した。続いてなお約３０分間室温に放置し、それから沈
澱し九結晶を濾別した。

該結晶物（１８０ｇＴ８　’）は下記の成分會含んでい
几。

チアミン−りンＩＩ！　　　　　　　　　　９８．０慢
コカルボキシクーゼ　　　　　　　　１．５ｓ該結晶物
は４０℃減圧で乾燥した。これはこのままでも使用でき
るけれどもリン酸化反応に戻し九。

前記母ｇ（１３７ｇ（ｒ８））は次の成分を含んでい友
。

チアミン−リン酸塩　　　　　　　３５．８９！コカル
ボキシラーゼ　　　　　　　５３．５％チア電ンエトロ
リン識塩　　　　　　２．３饅該母ｆｉ？エタノールを
分離するため減圧下、３０〜４０℃で蒸留した。得た残
渣ｔｓｓａｄ　Ａｍｂ＠ｒｌｉｔｅ　Ｉ　ＲＡ　９６（
弱塩基性、ＯＨ−形）およびＬ・貰ａｔｉｔ　Ｉ　Ｒ−
１２０のイオン交換クロマトグラフィーによｐ常法で和
製した。

コカルボキシラーゼ含Ｗ＃ｇ１０００ＷＪｔ−得九が、
これｔ−蒸発して結晶させ死後にコカＡ／ボキシラーゼ
四水和物５４９１−得た。

例３ チアミンクロリド・塩’ｅ１１ｍ２００１１にオルトリ
ン酸２５０ｇおよびｐ、ｏ５２００１１からなる混合物
で、例１Ａと同様にリン酸化し、得られたチアミンりン
畝エステル混合物を６．５時間、７０℃に加熱により部
分的に加水分解し、その際得らｆｉ次溶液七例１０と同
様にトリーｎ−オクチルアミン７５１ｋｘｌチを含有す
るメチルーイソプチルーカルピノルからなる混合１１で
２回抽出した。

該抽出した溶液の１１００１Ｉｊは久の組成の乾燥物質
（ｒｅ）３１８ｇを含んでいた。

チアミンモノリン酸塩　　　　　　　９４％コカルポキ
シラーゼ　　　　　　　　　６チ該抽出し次リン酸塩溶
液の１１００＋ｗｊに５０℃でエタノール１１００ｓ＋
Ｊを加え、得られ几混合物ｔ−１時間以内に嵐温に冷却
した。引き就いてなお約６０分間室温に放置し、それか
ら沈澱した結晶を濾別した。

該結晶物（２４０ＪｙｌＴ８）はチアミン−リン陵塩９
９．６−を含んでいた。

該結晶物ｔ−４０℃で減圧して乾燥した。これはこのｔ
′を使用することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、チアミンをリン酸化および場合により引き続いて部
   分的加水分解の際に生じるチアミンリン酸塩の水溶液か
   らリン酸を分離する方法において、該リン酸を実際に不
   溶または極めてわずかの水溶性の第三アミンで相応する
   塩に導き、これを実際に不混合または極めてわずかに水
   と混合し得る中程度の極性の溶剤で抽出することを特徴
   とするチアミンリン酸塩の水溶液からリン酸を分離する
   方法。