JPH02242677A - 微生物学的に生産されたジアセチル―還元酵素、それらの生産方法およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の対象は、アセトイン、特に（１）−アセトイン
の生成に使用しうる酵素である。

アセトインは２例えばストレブトコカス・ラクチス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃｔｉｓ）　　ジアセ
チラクチス（ｄｉａｃｅＬｙＪａｃｔｉｓ）種によって
生産される芳香成分の構成成分である。実質的にこの細
菌は、アセトインのほかになおジアセチル、２．３−ブ
チレングリコールおよびエタノール、酢酸およびアセト
アルデヒドのようなＣ！−化合物を生産する〔例えばシ
ュミット（Ｐ、　Ｓｃｈｍｉ　ｔｔ）ら、アプライド・
ミクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａ
ｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ、）　（１９８８年）１　第２９巻第４３０−４３６
頁参照〕、この芳香物質生産のゆえＫＭ上記細菌は、し
ばしばミルク製品（例えばバター）に添加される。例え
ば、アセトインの単離のためのこれらの成分の分離は２
通例行なわれない。光学的に活性なアセトイン、しかし
また例えば２−ヒドロキシ−ベンクン−４−オンもまた
その上立体特異性合成のためのキラル型構成体として興
味がある。

化学的に製造されたアセトインは、（１）−および（−
）−成分のラセミ混合物であり、このものはこの形で例
えば食品添加剤としては適当ではない。

上記の化学的に製造された混合物の分離は、大抵のラセ
ミ化合物の場合のように高価でありそして費用がかかる
。

一般には、そのためＫＭ後続する化合物の分離を伴なう
異性体の一つと反応する酵素を利用する。

アセトインにはそのような方法が知られていないので、
光学的に活性なアセトインは、工業的には得られない。

従って１本発明の目的は、アセトイン、特に（１）−ア
セトインの酵素を用いる製造方法ならびにそれに適した
酵素である。

本発明による酵素は、補酵素ＮＡＤＨと一緒でジアセチ
ルをアセトインまで還元する能力のある。微生物学的に
生産された。　＞０．５Ｌｌ／ｍｇの活性を有するジア
セチル−還元酵素である。

好ましくは、このジアセチル、還元酵素は、ジアセチル
を（１）−アセトインへと選択的に還元する能力があり
、そしてラクトバチルス （Ｌ、ＪｃＬｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株から単離さ
れる。

ジアセチルの酵素的反応は２還元のための水素供給源と
して作用する補酵素ＮＡ叶の存在下に下記の弐に従って
起る： この反応の平衡は、アセトインの生成にとって有利なの
で、従って□例えば、補酵素の再生下に連続的に反応を
実施する場合には−この酵素は。

アセトイン合成に好適である。比較的低い活性をもって
、構造上類似するアセデルアセトン（２，４ペンタジオ
ン）　もまた（他の化合物と共に）基質として使用して
２−ヒドロキシ−４−ペンタノンを生成せしめ得る。

ジアセチル−還元酵素を生産するための出発物質として
は、検討された多数の微生物のうちで２バチルス、例え
ばバチルス・コアグランス（Ｂ、　ｃｏａｇｕｌａｎｓ
）およびバチルス・ズブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ）、プレヴイバクテリエン（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ
ｉｅｎ）　、セラチア・マルセセンス（ＳｅｒｒａＬｉ
ａ　ｍａｒｃｅｓｏｅｎｓ）およびグルコノバクチル・
オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｉｄ
ａｎｓ）および少量の球菌．例えばミクロコカス（Ｍｉ
ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）およびストレプトコカス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　と共にラクトバチルス属の菌
株および酵母が好適であることが立証された。

下記の表に，特に好ましいジアセチル−還元酵素を生産
するラクトバチルス属および酵母の菌株ならびに粗抽出
物（湿式粉砕および遠心分離した後の湿潤した上澄み）
の活性が記載されている。

これらのうちで酵母は，立体特異的に反応しないジアセ
チル−還元酵素をもたらし，一方うクトハチルスから単
離された酵素は，（１）−アセトインを生成する能力を
有する。

第１表：アセトインおよびアセチルアセトンのＮＡＤＨ
に依存する還元の活性菌株（ＤＳＭ　Ｎｏ、） ジアセチ ラクトバチルス属： ラクトバチルス・ブランフルム （Ｌｃ、　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）　　　　　　　（２０
１７４）ラクトバチルス・ブレヴイ （Ｌｃ、　　ｂｒｅｖｉ）　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　（２００５４ンラクトバチルス・ブチネリ （Ｌｃ、　ｂｕｃｈｎｅｒｉ）　　　　　　　（２００
５７）ラクトバチルス・ケフィル （Ｌｃ、　ｋｅｆｉｒ）　　　　　　　　（２０５８７
）ロイコノストック・クレモリス （ＬｅｕｃｏｎｏＳ、　ｃｒｅ＋＋＋ｏｒｉｓ）　　　
　（２０３４６）酵母： カンディダ・ボイディニ （Ｃａｎｄｆｄａ　ｂｏｉｄｉｎｉｉ）　　　　　（７
００３４）カンディダ・ボイディニー （Ｃａｎｄｉｄａ　ｂｏｉｄｔｎｉｉ）　　（ＡＴＣＣ
３２１９５）０．３４ ２、Ｏ４ ２，０１ ２，５７ ０，７３ ０，１１ ０，６４ ０，６２ ０，１２ ０，１１ ハンゼヌラ・ポリモルファ （ｌｌａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｌｌＩｏｒｐｈａ）
　　　（７０２７？）クルイヴエロミセス・ラクチス （Ｋｔｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　１ａｃｔｉｓ）　　　
（７０８００）トルロプシス・カンディダ （Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｃａｎｄｉｄａ）　　　　（
７０５９０）１．４２ ２．３１ ０．０３ ０．６１ （１）−アセトイン生成能力のあるジアセチル還元酵素
（国際命名法によればアセトイン−脱水素酵素、　ＥＣ
１，１，１，Ｘと表示される）の本質的パラメーターと
しては下記のものが挙げられる：（イ）　ＮＡＤＨ　に
コチンアミドアデニンジヌクレオチドー還元型）の存在
下におけるジアセチルとの（１）−アセトインの生成下
における反応性； （ロ）アセチルアセトン、フェニルピルバート。

ジアセチルベンゼンまたはヘキサンジオンのような他の
ジケトンと共ＫＭジアセチルビルバートおよびピルビン
酸エチルエステルに対する基質特異性； （ハ）　４．２５のρ■におけるジアセチルの還元に対
するｈ−値が３１０ｍＭ（Ｅ、）ないし６７ｍＭ（Ｈｚ
）であり；７セチルアセトンに対するＫＭ−値が５０１
１ＩＭである； （ニ）タンパク質１ｍｇ当り１０６１単位の比活性（高
純度）； （ホ）ジアセチル−還元酵素Ｅ１についての分子量６６
．０００±ｓ、ｏｏｏおよびＥ２についての分子量７４
．０００±ｓ　、　０００　； （へ）還元反応に対する至適ｐＨ：５±１；（ト）最適
温度ニア０℃； （チ）６℃および５ないしｌＯのｐＨ値において１週間
の貯蔵性で残存活性６０％、特にｐ１１９において１０
０％の残存活性； （す）５６℃（ｐＨ９）において６０分後の残存活性９
０％７（ヌ）　１ｍＭの濃度におけるＣｕＣ１ｇ＋　！
’ｅｃｌｚ＋　ＭｇＣ１ｚ。

ｔｌｇＣＩｇ、フェニルヒドラジン、　１．１０−フェ
ナントロリン、２，２−ジニトロ−５，５−ジチオ安息
香酸による強い抑制、　ＰＭＳＦによる比較的弱い抑制
（３０％までの残存活性）： （ル）酵素が下位単位に開裂する（ドテシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）による処理）条件下おいて。

本発明によるジアセチル−還元酵素は下位単位への開裂
を示さない。

特に高い比活性は、ラクトバチルス・ケフィル（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋｅｆｉｒ）（口ＳＭ　２０５
８７）の粗抽出物中に見出された。

従って、酵素生産のための下記の例は、上記のバクテリ
アに関するものである。この性質は、なかんずく添加の
図面の参照の下に説明される：第１図は、ラクトバチル
ス・ケフィルの生長および酵素生成と時間との関係を示
す図表であり。

０は生長の尺度としての光学密度を示し。

−はｐｈ値の推移を示し、１）は酵素の比活性を示し、
そして　−　は酵素の生長に関連する。

第２図は２種々の緩衝系における酵素活性とｐＨ値との
関係を示す図表であり、酵素Ｅ−およびＥ２についてそ
れぞれの活性が測定された。

第３図は、酵素活性と温度との関係を示す図表である。

第４図は１種々のｐＨ値を有する緩衝系中に貯蔵した場
合のジアセチル−還元酵素の安定性を示す図表である。

第５図は、ラセミ体アセトイン混合物のガスクロマトグ
ラフィーによる分離（第５図ａ）およびジアセチル−還
元酵素によるジアセチルの反応の生成物のそれ（第５図
ｂ）を示す図表である。

例１　ニジアセチル−還元酵素の生産 Ａ、ラクトバチルス・ケフィルの 酵素生産のためにラクトバチルス・ケフィルを下記の培
地中で培養した（ｌｌ当り）ニゲルコール　　　　　　
　　　　　２０ｇ酵母エキス　　　　　　　　　　　５
ｇ標準ペプトン　　　　　　　　　　１０ｇ肉エキス　
　　　　　　　　　　　５ｇクエン酸水素ジ−アンモニ
ウム　　２ｇ酢酸ナトリウム　　　　　　　　　　５゜
硫酸マグネシウム　　　　　　　　　０．１ｇ硫酸マン
ガン　　　　　　　　　　　０．０５ｇリン酸水素ジカ
リウム　　　　　　　２ｇ蒸留水　　　　　　　　　　
　　　ｌｌこの溶液のｐＨ値を６．５に調整し１次いで
１２１’Ｃ（２バール）において１５分間滅菌した。微
生物を嫌気培養し、そのためには培地をＮ２で覆うこと
で十分であった。１０！の計量容器内で３０℃の保温温
度に達した培地に２４時間令の前培養物３００　ｄを接
種した。そのような１０１バツチにおいては２例えば。

酵素活性の時間についての経過は、異なった時間に試料
を採取しそして細胞の砕解後にジアセチル−還元酵素の
活性を測定することによって測定された。第１図にその
ような経過が示されており、ジアセチル−還元酵素の活
性は、比較的短かい時間の後に最大値に達し、それは比
較長い時間保たれる。７０Ｉｔの計量容器においては、
微生物は、室温において培養され、７５時間後に４，１
５のｐＨ値および４．１２の０Ｄａａａの際に分離する
ことにより湿潤した細胞塊を得た。この細胞塊は、−２
０℃において氷結して貯蔵することができ、その場合数
ケ月に亘って失活は、認められなかった。

旦−酢濃葛華離 細胞よりの酵素の遊離は５それ自体知られた方法（超音
波、高圧−均質化、湿式粉砕その他）によって行なわれ
うる。ここでは、細胞は、ビーズを用いる湿式粉砕によ
って砕解された。そのためＫＭバクテリア塊（８０ｇ）
を２−メルカプトエタノール０．１％の添加下にトリス
−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９，０）　１００１中に懸濁せし
めた。従って、湿潤細胞塊の濃度は４０％であった（最
終体積２００ｍ１）。細胞内容物質は、冷却された懸濁
液（４℃）からビーズミル〔デイノー　ミル（Ｄｙｎｏ
−Ｍｉｌｌ）　＋　　バショフエン（Ｂａｃｈｏｆｅｎ
）社製〕を用いる機械的砕解によって遊離された。３４
０ｍ１入りの粉砕容器にビーズ（０，５ｍｍ）を充填し
たので、嵩容積が２９０　ｄであることが判明した（８
５％の充填度）。砕解は、　２００Ｏｒρｍの攪拌ロー
ル回転数において実施された。冷却ジャケットおよび攪
拌ロールは、操作中冷却された。

バクテリア湿潤塊８０ｇは、１３６単位／１ｎ２の容積
活性および２９．４ｍｇ／ｄのタンパク賞金〒を有する
粗抽出物１３８艶をもたらした。

旦−醍素猜失 一加熱沈殿 ラクトバチルスのアセトイン−脱水素酵素は予備実験に
おいて極めて熱安定性であることが立証された。この理
由から、細胞断片を除去しそして最初の酵素の濃縮を達
成するために１選択的加熱変性が行なわれた。そのため
ＫＭ可溶化された細胞塊は、５０℃におい一ζ３０〜４
５分間培養され、それによって１．８〜２．１の精製係
数が９７〜１００％の収量において達成された。

一〇−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ｆｆ　”
’　を用いるイオン交換クロマトグラフィー ラクトバチルス−酵素のその後の精製は、Ω−セファロ
ース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　ｆｆ（１）　〔イオン交
換体；ファルマチア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｆｒｅ
ｉｂｕｒｇ、　ＢＲＤ）製］を用いるクロマトグラフィ
ーによって行なわれた。

しかしながら、加熱変性後の抽出は、イオ・ン交換樹脂
への不十分な結合のゆえに予め５０１Ｍの緩衝液により
脱塩されなければならなかった。これはＡＣＡ　５４ゲ
ルを用いて達成され、９８％の収量において１．９の付
加的な精製係数が得られた。陽イオン交換体の場合には
、酵素は、トリス−１１ＣＩ緩衝１夜５０１中での０〜
５００ｍＭ　ＮａＣ１の直線勾配を適用することにより
ＮａＣ１３８０ｍＭにおいてｐＨ９，０で溶出された。

−緒にされた活性なフラクションは、タンパク質１ｍｇ
当り７８．５単位の比活性を示した。これは４の精製係
数に相当する。適用された酵素の量のうちの９０％が回
収された。

八ＣＡ　５４”’　を用いるゲル濾過 アミコン（＾ｍ１ｃｏｎ）２００００限外濾過セルによ
って４−に容積縮少された後、　ＡＣＡ−５４ゲル（フ
ァルマチア（円＋ａｒｍａｃｉａ）社、西独フライブル
ク市所在、）を用いてゲル濾過を実施した。これによっ
て比活性を１３０．５０／ｍｇまで１．７のファクター
で向上せしめることができた（収量９７％）。

ｐ−」１忙捧梨 七ノ（門ｏｎｏ）−（＋　（イオン交換体）を用いる高
速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）酵素
の精密精製のためＫＭゲル濾過の活性〆容出液を、今度
はモノー〇カラムを用いて新たにイオン交換クロマトグ
ラフィーをイオン交換体クロマトグラフィーにかけた。

ｌ　Ｑ　ｍｌを１ｄ宛に分けてカラムに適用し、そして
トリス−１１０＋緩衝液５０ｍＭ中での１５０〜４００
ｎ＋Ｈの直線的ＮａＣ１勾配においてｐＨ値９．、ｏに
おいて溶出した。この方法においては、２種の活性酵素
に互いに分離されることができ、その一方は（以下にお
いてＥｌと称する）　１Ｊａｃ１２３０ｍＭにおいて溶
出され、他方（Ｅ２）は、　ＮａＣ１２９０ｍＭにおい
て溶出された。Ｅ１対ε２の比は、　４：１附近であっ
た。

Ｅｌは、　３５６Ｕ／ｍｇの比活性を有して３倍富化さ
れて存在するが、他方Ｅ２については１６６１１７ｍｇ
が測定された。ＥｌおよびＣ２の合計は、適用された酵
素量の８６％をなしていた。

一スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　ＴＭ１２　”’　
を用いるｒ’ＰＬｃ両方の酵素を別々にセントリコン（
Ｃｅｎ　ｔｒｉｃｏｎ）２００００−細管において濃縮
した後に（限外濾過）スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）
ＴＭ１２　（ファルマチア社製）によって更に精製した
。Ｅｌは１０６１０／ｍｇの、そしてＣ２は３６６１／
ｍｇの比活性となるまで精製された。この最後の工程は
、認められる程の損失なく進行した。

最高に精製されたフラクションを用いて調整された５Ｏ
Ｓ−ゲルは、　１０６１Ｕ／ｍｇＯ比活性を有する［ｌ
は。

９０％を超えるまで精製されて存在したことを示した。

それに対してＣ２の場合には２ゲルはなお若干のバンド
を示した。

ジアセチル−還元酵素の活性の精製について第２表に要
約して示す。

第２表　ラクトバチルス属よりの酵素の精製精製工程 容量 粗抽出物 加熱変性 脱塩ＡＣＡ　５４ Ｑ〜セファロース 限外濾過 ゲルｉｌｌ過ＡＣ＾５４ Ｅｌ モノ−〇 セントリコン２００００　　各０．５ １！１　　　　４．５ スペロース ［！２ ４．０ タンパク質 １．２ ０．７３ ０．５３ 全量 ＋９４ 比活性　収量 Ｕ／ｓＨ％ ４．６３ ９．１８ １７．４４ ７８．５ ７８．６ １３０．５ ６ｆｉ Ｅ、ジアセチル−゛５−酵素の特 一反応のｐＨ−依存度 適当なｐＨ値を有する１Ｍ緩衝液１０７０μβ中１．１
台ジアセチルの溶液５０１Ｊｌをキュベツト内で２５℃
において２時間保温することによって、活性のρ］１値
への依存度を測定した。そこでこの時間の後になおジア
セチル−比吸収度の変化が存在するか否か楡べた。それ
は必要ならば相殺された。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｉｔ　溶液を添
加することによって補酵素−比異種活性（Ｃｏｅｎｚｙ
ｍ−ｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅ　Ｆｒｅｍｄａｋｔｉｖｊ
ｔ５ｔ）を測定した。酵素溶液を添加した後ＫＭそれぞ
れの反応速度を測定することができた。

９．０を超えるｐＨ値においては、活性は、もはや測定
できなかった。何故ならばジアセチルは、この場合不安
定であるからである。

第２図は、ラクトバチルス・ケフィルー酵素Ｅ１および
Ｃ２によるジアセチルの還元のｐＨ依存度を示す。第２
図から、ρ１１値のみならずまた緩衝液の種類もまた反
応速度に対して決定的要因であることが判明する。すな
わち２例えば、　Ｃ２は、　ｐＨ７，５のトリス−）１
ｃＩ緩衝液中では、同じｐＨ値のＫＰｉ緩衝液に比較し
て１．８倍の活性を示す。

酵素Ｅ１およびＣ２は、類似したρＩ（特性を示すがこ
のことはジアセチルの構造変化のｐｌ＋依存性に帰せら
れる。極大値に相違がある：Ｅ１は、　ｐＨ４，２５の
アセテート緩衝液中で最大の活性を示すが、一方Ｅ２の
最大値は、　ＫＰｉ緩衝液中でｐＨ５，０において存在
する（ＫＰｉ緩衝液養液ン酸カリウム緩衝液）。

補酵素としてＮＡＤを用いるアセトインの酸化反応は、
ｐ１１値の変動および酵素、補酵素および基質の試験濃
度の変動にもかかわらず全く認められなかった。

一酵素活性の温度最適性 温度特性を測定するためＫＭ試験用バッチを調節可能キ
ュベツト容器に入れて所望の温度に達するまで保温した
。反応は、酵素溶液の添加により開始された。ラクトバ
チルス・ケフィルによる活性は、　ＩＥＩおよびＣ２が
なお互いに分離されていない場合には２０倍も富化され
た後に開始された。第３図は、酵素活性とそれぞれの反
応温度との相関関係を示す。

ジアセチル−還元酵素の活性は、７０℃の温度まで増大
する。

一各種金属陽イオンおよびインヒビターの影響金属陽イ
オンおよび抑制物質の存在下におけるジアセチル−還元
活性の挙動を楡べるためＫＭアッセイ５ｍＭの濃縮物中
に対応する物質を添加し。

そして２０℃において５分間の保温時間の後に活性を測
定した。ジアセチルの吸収特性は、２つの空白値を定め
ることを必要とし、これは一方では酵素溶液の交換によ
り、他方では緩衝液に対する基質の交換により確認され
た。

第３表：各種金属陽イオンおよびインヒビターの影響金
属陽イオン／阻害物質　　　　酵素の残存活性／％１ｓ
ａｃ　　ｚ ａｃ　　ｚ ｏＣｔ ＣｕＣ１□ ｅＣＩｚ ＦｅＣＩ□ ＭｇＣ１□ ＭｎＣ１゜ ｉＣＩｇ １１ｇｃ１゜ ＺｎＣ１゜ Ｌ−シクロセリン フェニルヒドラジン ヨードアセト７ミド ヨード酢酸 １．１０．フェナントロリン ジエチルマロン酸 ２．２〜ビピリジン ２．２−ジニトロ−５，５−ジチオ安息香酸グルタチオ
ン ジチオトレイトール ■、４−ジチオエリドリフト ρ−ヒドロキシメルクリヘンゾエート Ｎ−エチルマレインイミド ＤＴＡ トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）　Ｘ−１００ＭＳＦ −酵素の安定性に対するマンガンイオンの影響酵素を種
々の塩化マンガン？眉度において水浴中に１時間保温し
た。それに従ってそれぞれの活性を測定し、そして１５
分後および３０分後に新たにＮ　Ａ　Ｄ　ＩＩを添加す
ることにより再度活性を測定した。

第４表は、塩化マンガン５ｍＭを添加することにより酵
素は明らかに安定化されたことを示す。

第４表：長期活性のマンガン濃度への依存性マンガン濃
度　　　　　比活性／％ ｔ−０１５ｍ１ｎ　　３０ｍｔｎ 比較例　Ｍｎ　　なし　１００　　　　５０　　　０．
３１　　ｍＭ　　　　　　　　　１００　　　　　　６
９　　　　０．３２　醜Ｍ　　　　　　　　　　１００
　　　　　　　７９　　　　　２５５　醜１’ｌ　　　
　　　　　　　　１００　　　　　　　　　Ｂ８　　　
　　３９１０ｎＭ　　　　　　　　　１００　　　　　
　４６　　　　１９−酵素の貯蔵安定性に対するｐＨ値
の影響適当なｐＨ値の滅菌されたＩＭの緩衝液中に酵素
溶液を１：１０に希釈し、そして６℃において１週間保
温することによって、精製されたＬｃ、酵素のｐＨ安定
性を試験した。第４図は９種々のｐＨ値において貯蔵し
た場合の酵素活性に及ぼす影響を示す。

両方の酵素は、５ないし９またはＥｌにおいては１０．
５．のｐｌ＋範囲において広い最大安定性を示しそして
ＩＥＩ（１００ｏ／６）についてはρ１１９．０におい
て最高値を、そしてＥ２　（９８％）についてはｐ１１
７において最高値を示す。それにもかかわらず、記録さ
れた１員失は、予期されたものよりも高かった。このこ
とは、おそらく、いずれにせよ正しく「希釈されたＪ　
０．５ｍｇ／ｍｊ！以下のタンパク質を含有する酵素）
容液が更にもう一度１：１０に希釈されたということに
原因を帰せられるであろう。他の酵素調製物は。

グリセリン４３％の添加の下に６℃においてそしてまた
一１８℃において数週間に亘って損失なく貯蔵すること
ができた。

−ジアセチルー還元酵素Ｅ１およびＥ２の分子量の測酵
素の分子量をスペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｃ）　Ｔ旧２
を用いてゲルクロマトグラフィーによって測定した。

１２３００（チトクロムＣ）ないし４５００００　（フ
ェリチン）の分子量範囲内のタンパク質標準を用いて１
カラムをｐＨ７，５においてＮａＣ１１５０ｍＭの添加
の下にＫＩ’ｉ緩衝液５０ｍＭについて目盛を補正した
。測定ゲージを用いてＥｌについては６６０００の分子
量を１　そしてＥ２については７４０００の分子量を測
定することができた。５ＯＳ−電気泳動を用いた場合に
は、すなわら酵素が構成単位に分解する条件下において
は１両方の酵素について７７０００の分子量が測定され
た。

その際、標準タンパク質の分布は、現われた偏差がこの
方法の精度の範囲内にあることを示した。

しかしながら２両方の酵素が単量体で存在することは確
実にいえることである。

一酵素活性と基質１度との関係（Ｋ、値の測定）Ｋ、値
を測定するために１両方のラクトバチルス酵素の活性の
、基質濃度との相関関係を扮べた。

ＥｌおよびＥ２の場合には、基質の飽和は、　ＩＦＩを
超えて初めて現われ、その際、ジアセチルの濃度が非常
に高い場合には酵素の変性が活性の損失下に現われるこ
とがあることに留意すべきである。

ラインウィーヴアーーバーク（Ｌｉｎｅｈｅａｖｅｒ−
Ｂｕｒｋ）曲線の直線的退行により下記のに１〜値が得
られた； Ｅｌ　：　　Ｋ、＝３１０ Ｅ２：　ＫＭ＝　　６７ｍＮ ジアセチル−還元酵素Ｈ１およびＥｔの基質スペクトル Ｌｃ、−酵素Ｅ１およびＥ２の最高に精製された調製物
を用いて、各種の基質の試験を行なった。濃度を変動さ
せることにより、それぞれの基質について最高の反応速
度およびに力値を測定することができた。得られた結果
を第５表に要約して示す。

第５表二基質スペクトル 基質 ｒｅｌ、Ｖｍａｘ ε１１！２ ＫＭ　　／　　Ｍ ｔ ジアセチル ＡＤＲ ７セチルアセトン ２．５−ヘキサンジオン ビルバート ピルビン酸エチル β−フェニルビルバート ３−ケト酪酸エチル ５−Ｃ１−２−ペンタノン １．３−シクロヘキサンジオ ジアセチルベンゼン α−ケトゲルタール酸 ン １．３ ３．１　Ｘ　　１０−’　　６．７　Ｘ　１０−”３、
ＯＸ　　１０−’　　３．６　Ｘ　１０−’５、ＯＸ　
　１０−” ２．６Ｘ　　１０−１ ５．７　Ｘ　　１０−’　　１．３　Ｘ　　１０−’２
．４　Ｘ　　１０−３２．Ｉ　　Ｘ　　１０−’４．８
Ｘ　　１０−　　１．３Ｘ１０ 上記のデータから、ジアセチル−還元酵素の場合には、
しばしば生ずる乳酸脱水素酵素が重要であると推定され
る。しかしながら、市販の乳酸脱水素酵素を使用した場
合には、このものにジアセチルが反応しないことが立証
される。

０（−）−乳酸およびＬ（１）−乳酸の酸化による立体
特異性の立証 それぞれのヒドロキシ化合物の酸化による脱水素酵素（
または還元酵素）の立体特異性を測定する方法は、ジア
セチルの還元については実施できない。すなわち、光学
的に純粋な（１）−および（−）−アセトインがな（、
そしてこの酵素の場合には、逆反応は起らない。この酵
素は、しかしながら□第５表に示されているように□ビ
ルバートも還元しうるので、この場合には。

（１）−および（−）−乳酸の一対の基質を用いて立体
特異性を測定することができる。Ｄ（−）−および／ま
たはしく１）−乳酸およびＮＡ口°を用いてリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７，０）中で行なった試験バッチにお
いては、　Ｄ（−）−乳酸は１両方の酵素Ｅ１およびＥ
ｔと掻めて反応することができたが、それに反してしく
−）−乳酸は＋　ａｔとは５％の活性をもって、そして
Ｅ２とは４％の活性をもって反応することができた。

勇」 バッチ式出発物質におけるアセトインの酵素触媒的製造
および生成物の検出 酵素Ｅ１および／またはε２を用いる若干のバッチ式反
応を補酵素の再生下に実施した。再生のためにホルマー
トおよびギ酸−説水素酵素を使用した。

一方では両方の酵素Ｅ、およびＥ、を未だ互いに分離さ
れていない酵素調製物が使用され、他方ではＬｌおよび
Ｅ２の高冨化された調製物が使用された。各成分および
それらの濃度は下記の第６表から明らかである。

第６表：ＮＡＤＩＩ−再生酵素系の存在下におけるジア
セチルのアセトインへの反応 Ｌｃ、−酵素　　　ＥＩ　　　　Ｅ２ 全体積 ｐＨ−値 酵素量 〔ジアセチル〕 （ＮＡＤＨ） 酵素量ＦＤ）ｌ 〔ギ酸塩〕 時間 変換率 共通回転角 測定濃度 比施光度 １１００　　ｕｌ　　　１０００　ｕｌ５．４　　　　
　７．５ ６Ｕ　　　　　　２１１ ２００　ｍＭ　　　　１００　ｍＭ ５端Ｍ　　　　　５　ｍＭ １２Ｕ　　　　　　２Ｕ ３００　ｍＭ　　　　５００　ｍＭ １６ｈ　　　　　　８ｈ ８５％　　　　５２％ ０．０７＠ １２．１　　ｍＭ ７１” １０００　　ｕｌ ７．５ Ｕ １００　ｓ＋Ｍ 　　ｍＭ Ｕ ３００　　ｍと ｈ ６２　％ ０．０８５゜ １５．０　＋ｍＭ ６５　　。

光学対字体選択性 ９４％ 明細書の浄書（内容（：変！２！４　シ）エダクトであ
るジアセチルの存在下における生成物アセトインの定量
的および定性的決定の分析方法として、ｈす層クロマト
グラフィーならびにガスクロマトグラフィーが好適であ
った。

薄膜クロマトグラフィー それによってアセトインの生成が定性的に確認され得た
。検出のための両方の物質のＦｉ’ｌ　ｌｆｆ１クロマ
トグラフイーによる分離のためＫＭ２．４−ジニトロフ
ェニルヒドラジンによる黄色に着色されたヒドラゾンへ
の誘導体化を実施しなければならなかった。２：１の割
合の展開剤たる石油エーテル／ジオキサンの使用下にＵ
ｖインジケーターを用いてシリカゲルＧ板上ＫＭアセト
インヒドラゾンに対する０、６９のＲｒ値およびジアセ
チルヒドラゾンに対する０、９１のＰ、値が確認された
。

最初のバッチの試料の薄層クロマトグラフィの分離によ
り、生成物アセトインを確認することができた。

ガスクロマトグラフィー： ガスクロマトグラフィーによる分離は２反応の定量を可
能にし、この分離は、充填されたボロバック（Ｐｏｒｏ
ｐａｋ）−ローカラム〔マチニレ−・ラント・ナーゲル
社（Ｍａｃｈｅｒｅｙ　ｕｎｄ　Ｎａｇｅｌ）製、西独
デュレン所在〕を用いて行なわれた。２００℃のインジ
ェクター／デテクター温度および水溶液ｌμｌの１８０
°等温操作においては、ジアセチルは８．３５分後ＫＭ
そしてアセトインは、　１９．５分後に溶出された。第
６表に記載された変換値は、この方法を用いて測定され
た。

比旋光度の測定： アセトインの比旋光度を測定するためＫＭバッチ式仕込
物Ｅ、およびＥｔのそれぞれ３００μｌからセントリコ
ン１ｏｏｏｏ細管を用いて（限外濾過）を用いてタンパ
ク質が分離された。１１．０１−で希釈した後、　ｌｄ
ｍのキュベツト中で偏光計を用いて５７８ｎＲＩにおい
て測定された。Ｅ１試料については十０．０７５°旋光
角が認められ、そしてＥ２については＋０．０８５°の
それが認められたくタンパク質の存在しない場合のブラ
インド値ニー０．００３°）。

５２％および６５％の変換率を用いることにより、それ
から＋７１．０”の比旋光度（Ｅｌの場合）および＋６
３．５°の比旋光度（Ｅ２の場合）が算出することがで
きた。

デイッシエルーシエリッヒ（Ｄｉｓｃｈｅｒｌ−５ｃｈ
ｉｊｌｌｉｇ）の研究（１９３８年）−その場合には水
溶液中のく−）アセトインについては−４６ないし−４
８゜（若干の試験においてはまた一１０５°）であった
□に比較すると、上記の測定値は、予想される範囲内に
存在する。

対掌体選択性の測定： 酵素の対字体選択性は、キラルシルーハル（Ｃｈｉｒａ
ｌｓｉｌ−ｖａｌ）毛管カラム（マチニレ−・ラント・
ナーゲル社製、西独デュレン所在）を用いてガスクロマ
トグラフィーにより測定された。そのためＫＭバッチ式
仕込物１の生成物が多段抽出により水性相から有機酢酸
エチルエステル相中に移された。イソプロピルイソシア
ネートによるアセトインの誘導体化の後、生成したアセ
トインウレタンは、カラムのし一バリンー第三ブチルア
ミド固定相に対して、光学的対掌体に分離されるのに−
）分なＥｌｌ方力示した。１２０°の等温操作の場合に
は、左旋性の対掌体が７．４９分後に溶出され、右旋性
の対字体は７．８０分名とに溶出された。１１０°の場
合には、　１０．３９分間および１０．８’５分間の保
持時間が示された。第７図は１士アセトインのラセミ混
合物（第５図ａ）の分離ならびに第６表のバッチ１の分
離（第５図ｂ）を示す。このクロマトグラムは、ラクト
バチルス・ケフイルから単離された酵素が右旋性のアセ
トイン光学対掌体を９７％まで合成することを明らかに
示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ラクトバチルス・ゲフイルの生長および酵素
生成と時間との関係を示す図表であり′は生長の尺度と
しての光学密度を示し−はρ１１値の推移を示し、Ｏは
酵素の比活性を示し、そして　−　は酵素の生長に関連
する酵素活性を示す。 第２図は２種々の緩衝系における酵素活性とρ１１値と
の関係を示す図表であり、酵素Ｅ＋およびＥ２について
それぞれの活性が測定された。 第３図は、酵素活性と温度との関係を示す図表である。 第４図は２種々のｐＨ値を何する緩衝系中に貯蔵した場
合のジアセチル−還元酵素の安定性を示す図表である。 第５図は、ラセミ体アセトイン混合物のガスクロマトグ
ラフィーによる分離（第５図ａ）およびジアセチル−還
元酵素によるジアセチルの反応の生成物のそれ（第５図
ｂ）を示す図表である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、補酵素ＮＡＤＨと一緒でジアセチルをアセトインま
   で還元する能力のある、微生物学的に生産された、＞０
   ．５Ｕ／ｍｇの活性を有するジアセチル−還元酵素。 ２、ジアセチル−還元酵素を生産するラクトバチルス（
   Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌株から単離された
   、ジアセチルを（＋）−アセトインに選択的に還元する
   能力のある請求項１記載のジアセチル−還元酵素。 ３、下記のパラメーターによって特徴づけられる請求項
   ２記載のジアセチル−還元酵素； （イ）ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ド−還元型）の存在下におけるジアセチルとの（＋）−
   アセトインの生成下の反応性；（ロ）アセチルアセトン
   、フェニルピルバート、ジアセチルベンゼンまたはヘキ
   サンジオンのような他のジケトンと共に、ジアセチル、
   ピルバートおよびピルビン酸エチルエステルに対する基
   質特異性； （ハ）４．２５のｐＨにおけるジアセチルの還元に対す
   るＫ＿Ｍ−値が３１０ｍＭ（Ｅ＿１）ないし６７ｍＭ（
   Ｅ＿２）であり；アセチルアセトンに対するＫ＿Ｍ−値
   が５０ｍＭである； （ニ）タンパク質１ｍｇ当り１０６１単位の比活性（高
   純度）； （ホ）ジアセチル−還元酵素Ｅ＿１についての分子量６
   ６，０００±５，０００およびＥ＿２についての分子量
   ７４，０００±５，０００； （ヘ）還元反応に対する至適ｐＨ：５±１；（ト）最適
   温度：７０℃； （チ）６℃および５ないし１０のｐＨ値において１週間
   の貯蔵性で残存活性６０％、特にｐＨ９において１００
   ％の残存活性； （リ）５６℃（ｐＨ９）において６０分後の残存活性９
   ０％；（ヌ）１ｍＭの濃度におけるＣｕＣｌ＿２、Ｆｅ
   Ｃｌ＿２、ＭｇＣｌ＿２、ＨｇＣｌ＿２、フェニルヒド
   ラジン、１，１０−フェナントロリン、２，２−ジニト
   ロ−５，５−ジチオ安息香酸による強い抑制、ＰＭＳＦ
   による比較的弱い抑制（３０％までの残存活性）； （ル）酵素が下位単位に開裂する（ドデシル硫酸ナトリ
   ウム（ＳＤＳ）による処理）条件下おいて、本発明によ
   るジアセチル−還元酵素は下位単位への開裂を示さない
   。 ４、ラクトバチルス・ケフィール（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
   ｌｌｕｓｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・プランタルム
   （Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブレビ
   ス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ブチネリ（
   Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）より；ロイコノストック・クレ
   モリス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃｃｒｅｍｏｒｉｓ）、
   カンジダ・ボイジニー（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉ
   ｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ
   ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、クルイベロミセス・ラクチス（
   Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびトル
   ロプシス・カンジダ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｃａｎｄｉ
   ｄａ）より単離された請求項１記載のジアセチル−還元
   酵素。 ５、ラクトバチルス・ケフィール、ラクトバチルス・プ
   ランタルム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチル
   ス・ブチネリおよびロイコノストック・クレモリスより
   単離された請求項２記載のジアセチル−還元酵素。 ６、ラチトバチルス属より選択されたジアセチル−還元
   酵素を生産する菌株または対応する酵母を培養し、細胞
   塊を分離し、そして可溶化しそして得られた粗抽出物を
   場合によっては次いで精製にかけることを特徴とする請
   求項１〜５のいずれかによるジアセチル−還元酵素の生
   産方法。 ７、精製するために、５０℃における加熱沈殿、イオン
   交換クロマトグラフィー、ゲル濾過およびＦＰＬＣによ
   る最終的細密精製にかける請求項６に記載の方法。 ８、ＮＡＤＨの存在下に請求項１〜５のいずれかに記載
   のジアセチル−還元酵素を用いてジアセチルを酵素的に
   反応せしめそして生成したアセトインを単離することを
   特徴とするアセトインの製造方法。 ９、請求項２に記載のジアセチル−還元酵素を使用しそ
   して生成された（＋）−アセトインを単離する請求項８
   に記載の方法。 １０、ＮＡＤＨの存在下に請求項１〜５のいずれかによ
   るジアセチル−還元酵素を用いてアセチルアセトンを含
   有する水溶液を酵素的に反応せしめそして生成した２−
   ヒドロキシペンタン−（４）−オンを単離することを特
   徴とする２−ヒドロキシペンタン−（４）−オンの製造
   方法。