JPH02219579A - 低分子量組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ配列 - Google Patents
低分子量組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ配列Info
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は分子量の小さい組換えタンパク質の発現を増大
させるタンパク質誘導体をコードしている新規’ｔｉ
Ｄ Ｎ Ａ配列に関するものである。組換えＤＮＡ技術
の進歩に伴い、生物が産生ずる特定のタンパク質の量の
増幅が可能となることに相応して所望のタンパク質の発
現が増加された。しかしながら、タンパク質の分子量が
小さいと、高発現を達成することは困難である。低分子
量のタンパク質の発現が低いことについて一般に認めら
れている説明には、そのようなタンパク質が極めて不安
定であるために、宿主細胞によって急速に分解されると
いう説がある。他の説明として、基本的な暗号配列の転
写または翻訳効率が損傷されているというものがある。
させるタンパク質誘導体をコードしている新規’ｔｉ
Ｄ Ｎ Ａ配列に関するものである。組換えＤＮＡ技術
の進歩に伴い、生物が産生ずる特定のタンパク質の量の
増幅が可能となることに相応して所望のタンパク質の発
現が増加された。しかしながら、タンパク質の分子量が
小さいと、高発現を達成することは困難である。低分子
量のタンパク質の発現が低いことについて一般に認めら
れている説明には、そのようなタンパク質が極めて不安
定であるために、宿主細胞によって急速に分解されると
いう説がある。他の説明として、基本的な暗号配列の転
写または翻訳効率が損傷されているというものがある。
本発明の誘導体は高発現を可能ならしめるものであって
、式：メチオニン−ｘ−トリプトファンータンパク質お
よびメチオニン−ｘ−ｘ’−タンパク質で示される。Ｘ
およびｘ’は下記の２０のアミノ酸のいずれかを表す： メチオニン（Ｍｅｔ） フェニルアラニン（Ｐ ｈｅ） イソロイシン（Ｉｌｅ） バリン（Ｖａｌ） セリン（Ｓｅｔ プロリン（Ｐ ｒｏ） スレオニン（Ｔｈｒ） アラニン（Ａｌａ） チロシン（Ｔｙｒ） ヒスチジン（Ｈｉｓ） グルタミン（Ｇｌｎ） アスパラギン（Ａｓｎ） リジン（Ｌ ｙｓ） アスパラギン酸（Ａｓｐ） グルタミン酸（Ｇｌｕ） システィン（Ｃｙｓ） トリプトファン（Ｔ ｒｐ） アルギニン（Ａｒｇ） グリシン（Ｇｌｙ） ロイシン（Ｌｅｕ） 理論によって拘束または制限されることを意図するもの
ではないが、本発明による高レベル発現の達成は広範な
因子によると思われる。１つの可能な理由は、例えばタ
ンパク質誘導体をコードしている遺伝子（ＤＮＡ配列）
が転写効率に影響を与えることによりメツセンジャーＲ
ＮＡのコピー数を増大するということである。他の説明
は、遺伝子をコードしているタンパク質誘導体が翻訳効
率に影響を与えることにより直接ポリペプチドの合成を
増大するということである。理論や説明とは無関係に、
本発明のタンパク質誘導体はそれらの天然の対応物と比
較してより高いレベルで発現する。本発明によれば、所
望のタンパク質を大量に発現させる能力を、特に低分子
量のタンパク質に適用することができる。
、式：メチオニン−ｘ−トリプトファンータンパク質お
よびメチオニン−ｘ−ｘ’−タンパク質で示される。Ｘ
およびｘ’は下記の２０のアミノ酸のいずれかを表す： メチオニン（Ｍｅｔ） フェニルアラニン（Ｐ ｈｅ） イソロイシン（Ｉｌｅ） バリン（Ｖａｌ） セリン（Ｓｅｔ プロリン（Ｐ ｒｏ） スレオニン（Ｔｈｒ） アラニン（Ａｌａ） チロシン（Ｔｙｒ） ヒスチジン（Ｈｉｓ） グルタミン（Ｇｌｎ） アスパラギン（Ａｓｎ） リジン（Ｌ ｙｓ） アスパラギン酸（Ａｓｐ） グルタミン酸（Ｇｌｕ） システィン（Ｃｙｓ） トリプトファン（Ｔ ｒｐ） アルギニン（Ａｒｇ） グリシン（Ｇｌｙ） ロイシン（Ｌｅｕ） 理論によって拘束または制限されることを意図するもの
ではないが、本発明による高レベル発現の達成は広範な
因子によると思われる。１つの可能な理由は、例えばタ
ンパク質誘導体をコードしている遺伝子（ＤＮＡ配列）
が転写効率に影響を与えることによりメツセンジャーＲ
ＮＡのコピー数を増大するということである。他の説明
は、遺伝子をコードしているタンパク質誘導体が翻訳効
率に影響を与えることにより直接ポリペプチドの合成を
増大するということである。理論や説明とは無関係に、
本発明のタンパク質誘導体はそれらの天然の対応物と比
較してより高いレベルで発現する。本発明によれば、所
望のタンパク質を大量に発現させる能力を、特に低分子
量のタンパク質に適用することができる。
本明細書で開示し、特許請求する本発明の目的から、以
下に語句を定義する。
下に語句を定義する。
組換えタンパク質二自律的に複製するか宿主細胞のゲノ
ムに組み込まれる組換えＤＮＡベクターの存在により微
生物内で発現されるタンパク質。
ムに組み込まれる組換えＤＮＡベクターの存在により微
生物内で発現されるタンパク質。
宿主細胞：組換えタンパク質を発現するように形質転換
されたまたはされ得る細胞。
されたまたはされ得る細胞。
形質転換：受容宿主細胞（その生存可能なプロトプラス
トをも含む）にＤＮＡを導入し、受容宿主細胞の遺伝型
を変化させること。
トをも含む）にＤＮＡを導入し、受容宿主細胞の遺伝型
を変化させること。
図面の説明
第１図ニブラスミドｐＫＣ２８３の制限（酵素切断部位
の）地図。
の）地図。
第２図ニブラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限地図。
第３図ニブラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限地図。
第４図ニブラスミドＰＫＣ２８３−ＬＢの制限地図。
第５図ニブラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の制限地図。
第６図ニブラスミドｐＬ３２の制限地図。
第７図ニブラス夷ドｐＮＭ７８９の制限地図。
第８図ニブラスミドル１２０の構築プロトコールの模式
図。
図。
第９図ニブラスミドｐＬ４７の制限地図。
第１０図ニブラスミドｐＰＲ１２の制限地図。
第１１図ニブラスミドＩ）ＰＲ１２ＡＲ１の制限地図。
第１２図ニブラスミドｐＬｌｌＯの制限地図。
第１３図ニブラスミドｐＬ１１０ｃの構築プロトコール
の模式図。
の模式図。
第１４図ニブラスミドｐＨＳ２４６の制限地図。
本発明は低分子量のタンパク質の発現を増大させるタン
パク質誘導体をコードしている新規なりＮＡ配列を開示
するものである。新規な読導体は、式：メチオニン−Ｘ
−トリプトファン−タンパク質およびメチオニン−ｘ−
ｘ’−タンパク質で示される。ここに、ＸおよびＸｏは
メチオニン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン
、セゾン、プロリン、スレオニン、アラニン、クルタミ
ン酸、グリシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、
アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、システィン、
トリプトファン、アルギニン、およびロイシンからなる
アミノ酸群から選択され、タンパク質は約１から約１０
０アミノ酸からなる生理学的に活性な任意のアミノ酸配
列である。さらに本発明は新規なタンパク質誘導体、リ
ンカ−類、発現ベクター、およびその形質転換体に関す
るものである。
パク質誘導体をコードしている新規なりＮＡ配列を開示
するものである。新規な読導体は、式：メチオニン−Ｘ
−トリプトファン−タンパク質およびメチオニン−ｘ−
ｘ’−タンパク質で示される。ここに、ＸおよびＸｏは
メチオニン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン
、セゾン、プロリン、スレオニン、アラニン、クルタミ
ン酸、グリシン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、
アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、システィン、
トリプトファン、アルギニン、およびロイシンからなる
アミノ酸群から選択され、タンパク質は約１から約１０
０アミノ酸からなる生理学的に活性な任意のアミノ酸配
列である。さらに本発明は新規なタンパク質誘導体、リ
ンカ−類、発現ベクター、およびその形質転換体に関す
るものである。
本発明は、イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ １２ Ｒ
Ｖ３０８をプラスミドｐＨ３２４６で形質転換すること
により構築、例示される。プラスミドｐＨ３２４６はイ
ンシュリン様成長因子■（ＩＧＦＩＩ）の発現をコード
している。ＩＧＦＩＩは３個のジスルフィド結合を有す
る分子量７４７１ダルトンの１本鎖ポリペプチドである
。インシュリン様成長因子■はインシュリン様活性を有
する成長促進ポリペプチドＩＧＦファミリーの仲間であ
る。［；Ｆ［は血糖値を下げ、傷の治癒を促進し、イン
シュリン分泌を阻止する等の治療における可能性が示さ
れている。λＰＬプロモーターと大腸菌リボプロティン
（ｌｐｐ）リポソーム結合部位（ｒｂｓ）からなる発現
カセットのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するプラ
スミドｐＨ３２４６を、プラスミドｐＬ ｌ １０Ｃお
よびプラスミドｐＨ３１９０の断片と式：％式％ （式中、Ａはデオキシリボグアニル、Ｇはデオキシリボ
グアニル、Ｃはデオキシリポジトシル、Ｔはチミジルを
表す） で示される合成リンカ−配列とを結合させることにより
構築した。この合成リンカ−配列は、Ａｐｐｔｉｅｄ
Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（８５０リンカーン・ドライブ
、フォスター・シティ、ＣＡ９４４０４）供給の３８０
ＢＤＮＡ合成装置を用いるか、ホスファイト・トリエス
テル合成［カルサース（Ｃａｒｕｔｈｕｒｓ、 Ｍ。
Ｖ３０８をプラスミドｐＨ３２４６で形質転換すること
により構築、例示される。プラスミドｐＨ３２４６はイ
ンシュリン様成長因子■（ＩＧＦＩＩ）の発現をコード
している。ＩＧＦＩＩは３個のジスルフィド結合を有す
る分子量７４７１ダルトンの１本鎖ポリペプチドである
。インシュリン様成長因子■はインシュリン様活性を有
する成長促進ポリペプチドＩＧＦファミリーの仲間であ
る。［；Ｆ［は血糖値を下げ、傷の治癒を促進し、イン
シュリン分泌を阻止する等の治療における可能性が示さ
れている。λＰＬプロモーターと大腸菌リボプロティン
（ｌｐｐ）リポソーム結合部位（ｒｂｓ）からなる発現
カセットのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するプラ
スミドｐＨ３２４６を、プラスミドｐＬ ｌ １０Ｃお
よびプラスミドｐＨ３１９０の断片と式：％式％ （式中、Ａはデオキシリボグアニル、Ｇはデオキシリボ
グアニル、Ｃはデオキシリポジトシル、Ｔはチミジルを
表す） で示される合成リンカ−配列とを結合させることにより
構築した。この合成リンカ−配列は、Ａｐｐｔｉｅｄ
Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（８５０リンカーン・ドライブ
、フォスター・シティ、ＣＡ９４４０４）供給の３８０
ＢＤＮＡ合成装置を用いるか、ホスファイト・トリエス
テル合成［カルサース（Ｃａｒｕｔｈｕｒｓ、 Ｍ。
Ｈ，）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３０．２８
１−２８５（１９８５）］に従って合成することができ
る。プラスミドｐＨＳ２４６の制限地図を第１４図に示
す。
１−２８５（１９８５）］に従って合成することができ
る。プラスミドｐＨＳ２４６の制限地図を第１４図に示
す。
異なるＮ末端配列を有する他のＩＧＦＩＩ誘導体はＩＧ
ＦＩＩ遺伝子の開始コドンに続く最初の１個または２個
のコドンを変化させることにより得られる。そのような
誘導体は式： Ｍｅｔ −Ｘ −Ｔ ｒｐ −ＩＧＦＩ
ｆおよびＭｅｔ−Ｘ−Ｘ’−Ｔｒｐ −Ｉ Ｇ Ｆ Ｉ
ｆ （式中、Ｘおよびｘ’は上記の定義に従う）で示さ
れ、大腸菌内で高レベルに発現される。このコドンの特
定のヌクレオチド配列が、高発現をもたらすために重要
である。当業者ならば、遺伝コードの縮重により、アミ
ノ酸は１以上コドンでコードされ得ることを理解するで
あろう。結論として、コドンの選択並びにコードされて
いる特定のアミノ酸配列の両方が、高レベル発現のため
の構築物の生成における重要な因子である。
ＦＩＩ遺伝子の開始コドンに続く最初の１個または２個
のコドンを変化させることにより得られる。そのような
誘導体は式： Ｍｅｔ −Ｘ −Ｔ ｒｐ −ＩＧＦＩ
ｆおよびＭｅｔ−Ｘ−Ｘ’−Ｔｒｐ −Ｉ Ｇ Ｆ Ｉ
ｆ （式中、Ｘおよびｘ’は上記の定義に従う）で示さ
れ、大腸菌内で高レベルに発現される。このコドンの特
定のヌクレオチド配列が、高発現をもたらすために重要
である。当業者ならば、遺伝コードの縮重により、アミ
ノ酸は１以上コドンでコードされ得ることを理解するで
あろう。結論として、コドンの選択並びにコードされて
いる特定のアミノ酸配列の両方が、高レベル発現のため
の構築物の生成における重要な因子である。
本発明では、メチオニン−Ｘ−）リプトファンおよびメ
チオニン−Ｘ−Ｘ’（式中、Ｘおよびｘ’は上記２０ア
ミノ酸のいずれかである）で示されるオリゴヌクレオチ
ドリンカーを合成した。オリゴヌクレオチドの合成にお
いては、遺伝子コードノ縮重を考慮し、アミノ酸につい
て１以上のコドンを選択し得る可能性を利用した。ＩＧ
Ｆｍ遺伝子を含有するプラスミドへの挿入を容易にする
ために、オリゴヌクレオチドに制限部位をも導入した。
チオニン−Ｘ−Ｘ’（式中、Ｘおよびｘ’は上記２０ア
ミノ酸のいずれかである）で示されるオリゴヌクレオチ
ドリンカーを合成した。オリゴヌクレオチドの合成にお
いては、遺伝子コードノ縮重を考慮し、アミノ酸につい
て１以上のコドンを選択し得る可能性を利用した。ＩＧ
Ｆｍ遺伝子を含有するプラスミドへの挿入を容易にする
ために、オリゴヌクレオチドに制限部位をも導入した。
ＩＧＦＩ［遺伝子含有プラスミド内の適切に設計された
制限部位との関係において、適切に設計された制限部位
を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、ＩＧＦＩ［
暗号配列の保存並びに余分のアミノ酸のＮ−末端への配
置を可能にする。
制限部位との関係において、適切に設計された制限部位
を有するそのようなオリゴヌクレオチドは、ＩＧＦＩ［
暗号配列の保存並びに余分のアミノ酸のＮ−末端への配
置を可能にする。
本発明のＩＧＦＩＩ発現プラスミドの構築における親プ
ラスミドとしてプラスミドｐＬｌｌＯｃを用いた。プラ
スミドｐＬ１１０ｃはλＰＬプロモーター、大腸菌＋ｐ
ｐリポソーム結合部位およびテトラサイクリン耐性遺伝
子を含有している。プラスミドｐＨＳ１９０からＩＧＦ
■遺伝子を単離し、プラスミドｐＨ３１１０内に正しく
配置するために制限部位を与えた。ＩＧＦｉＩ遺伝子と
オリゴヌクレオチドリンカーとを結合させ、発現ベクタ
ーであるブラ゛スミドｐＬ１１０ｃが完成した。次いで
ＩＧＦＩ［発現ベクターを用いて大腸菌に１２ＲＶ３０
８細胞（ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４）を形質転換した
。
ラスミドとしてプラスミドｐＬｌｌＯｃを用いた。プラ
スミドｐＬ１１０ｃはλＰＬプロモーター、大腸菌＋ｐ
ｐリポソーム結合部位およびテトラサイクリン耐性遺伝
子を含有している。プラスミドｐＨＳ１９０からＩＧＦ
■遺伝子を単離し、プラスミドｐＨ３１１０内に正しく
配置するために制限部位を与えた。ＩＧＦｉＩ遺伝子と
オリゴヌクレオチドリンカーとを結合させ、発現ベクタ
ーであるブラ゛スミドｐＬ１１０ｃが完成した。次いで
ＩＧＦＩ［発現ベクターを用いて大腸菌に１２ＲＶ３０
８細胞（ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４）を形質転換した
。
誘導体として発現される低分子量ポリペプチドは単にＩ
ＧＦＩＩタンパク質に限定されない。分子量約１から約
１００アミノ酸の他の低分子量ポリペプチド、ヒトプロ
インシュリン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリ
ンＢ鎖、ヒトインシュリン様成長因子１（ＩＧＦＩ）、
成長ホルモン放出因子（Ｇ ＲＦ ）およびソマトスタ
チンもまた本発明の目的に用い得る。ＩＧＦＩＩ遺伝子
、オリゴヌクレオチドよび親プラスミドを結合させて多
くのｌＧＦ■誘導体を生成させたのと全く同様に、他の
所望のタンパク質の暗号配列を用い、実質上、本発明の
方法に従って本発明の範囲内の他の誘導体を生成させる
ことができる。
ＧＦＩＩタンパク質に限定されない。分子量約１から約
１００アミノ酸の他の低分子量ポリペプチド、ヒトプロ
インシュリン、ヒトインシュリンＡ鎖、ヒトインシュリ
ンＢ鎖、ヒトインシュリン様成長因子１（ＩＧＦＩ）、
成長ホルモン放出因子（Ｇ ＲＦ ）およびソマトスタ
チンもまた本発明の目的に用い得る。ＩＧＦＩＩ遺伝子
、オリゴヌクレオチドよび親プラスミドを結合させて多
くのｌＧＦ■誘導体を生成させたのと全く同様に、他の
所望のタンパク質の暗号配列を用い、実質上、本発明の
方法に従って本発明の範囲内の他の誘導体を生成させる
ことができる。
本発明は、プラスミドｐＬ１１ＯＣの使用に限定される
ものではない。λＰｔのみならず他の適当なプロモータ
ー、ｔｒｐ、 ＩＩ）ｐまたはｔａｃのようなプロモー
ターを含有する、または含有するように設計されたプラ
スミドをも用いることができる。
ものではない。λＰｔのみならず他の適当なプロモータ
ー、ｔｒｐ、 ＩＩ）ｐまたはｔａｃのようなプロモー
ターを含有する、または含有するように設計されたプラ
スミドをも用いることができる。
そのようなベクターにはｐＢＲ３２２およびプラスミド
ｐＣＣＺ３３４が含まれるがこれらに限定されない。本
発明が特定のプラスミドまたは特定のタンパク質をコー
ドしている遺伝子に限定されないと同様に、形質転換宿
主細胞も大腸菌に１２ＲＶ３０８のみに限定されない。
ｐＣＣＺ３３４が含まれるがこれらに限定されない。本
発明が特定のプラスミドまたは特定のタンパク質をコー
ドしている遺伝子に限定されないと同様に、形質転換宿
主細胞も大腸菌に１２ＲＶ３０８のみに限定されない。
所望の遺伝子を発現し得る任意の宿主細胞を用いること
ができる。従って、例えば大腸菌ＭＭ２９４、大腸ｍＪ
Ｍ１０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００、大腸菌
ＷＡ ７０４ 、バシラス（枯草菌）、ストレプトマイ
セス、および酵母なども本発明の目的のために用いるこ
とができる。特定のタンパク質のＮ末端に所望の追加の
アミノ酸配列を生成させるには当業者周知の数種類の方
法を用いることができる。そのような方法には、例えば
、古典的な液相、固相法による誘導や、組換えＤＮＡ法
などが含まれる。
ができる。従って、例えば大腸菌ＭＭ２９４、大腸ｍＪ
Ｍ１０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｃ６００、大腸菌
ＷＡ ７０４ 、バシラス（枯草菌）、ストレプトマイ
セス、および酵母なども本発明の目的のために用いるこ
とができる。特定のタンパク質のＮ末端に所望の追加の
アミノ酸配列を生成させるには当業者周知の数種類の方
法を用いることができる。そのような方法には、例えば
、古典的な液相、固相法による誘導や、組換えＤＮＡ法
などが含まれる。
ＩＧＦＵおよび他のタンパク質誘導体はヒトおよび他の
哺乳類に用いた場合に望ましくない免疫反応を惹起する
可能性がある。これらの反応は、天然のタンパク質には
含まれていない追加のアミノ酸配列によって引き起こさ
れると考えられる。
哺乳類に用いた場合に望ましくない免疫反応を惹起する
可能性がある。これらの反応は、天然のタンパク質には
含まれていない追加のアミノ酸配列によって引き起こさ
れると考えられる。
実際、非天然のアミノ酸配列は生体内で異種物質（外来
物質）と認識される。故に、追加アミノ酸配列が引き起
こす免疫学的応答を排除するために、追加アミノ酸配列
をタンパク質から切り離すことが望ましい。幾つかの化
学的または酵素的な切断法が当業者周知であり、それら
を、追加のアミノ酸配列を除去し、非免疫原性の固有の
タンパク質を得るために用いることができる。タンパク
質の切断に適した化学物質としては、例えば、臭化シア
ン、２−（２−二トロフェニルスルフェニル）＝３−ブ
ロモ−３゛−メチルインドリニウム（ＢＮＦＳ−アカト
ール）、ヒドロキシルアミン等を挙げることができる。
物質）と認識される。故に、追加アミノ酸配列が引き起
こす免疫学的応答を排除するために、追加アミノ酸配列
をタンパク質から切り離すことが望ましい。幾つかの化
学的または酵素的な切断法が当業者周知であり、それら
を、追加のアミノ酸配列を除去し、非免疫原性の固有の
タンパク質を得るために用いることができる。タンパク
質の切断に適した化学物質としては、例えば、臭化シア
ン、２−（２−二トロフェニルスルフェニル）＝３−ブ
ロモ−３゛−メチルインドリニウム（ＢＮＦＳ−アカト
ール）、ヒドロキシルアミン等を挙げることができる。
臭化シアンはメチオニン残基のＣ末端でタンパク質を開
裂する。従って、選択的な切断部位はメチオニン残基そ
のものである。ヒドロキシルアミンは−Ａｓｎ−Ｚ（こ
こに２はＧｌｙ、 ＬｅｕまたはＡｌａである）部分の
Ｃ末端を切断する。ＢＮＰＳ−アカトールはトリプトフ
ァン残基のＣ末端を切断する。
裂する。従って、選択的な切断部位はメチオニン残基そ
のものである。ヒドロキシルアミンは−Ａｓｎ−Ｚ（こ
こに２はＧｌｙ、 ＬｅｕまたはＡｌａである）部分の
Ｃ末端を切断する。ＢＮＰＳ−アカトールはトリプトフ
ァン残基のＣ末端を切断する。
切断に有用な酵素物質には、例えば、トリプシン、パパ
イン、ペプシン、フラスミン、トロンビン、エンテロキ
ナーゼ等を挙げることができる。
イン、ペプシン、フラスミン、トロンビン、エンテロキ
ナーゼ等を挙げることができる。
これらは、それぞれが認識する特定のアミノ酸配列の位
置で切断する。例えば、エンテロキナーゼは、アミノ酸
配列−（Ａｓｐ）ｎ Ｌｙｓ （ここに、ｎは２〜
４の数字である）を認識する。
置で切断する。例えば、エンテロキナーゼは、アミノ酸
配列−（Ａｓｐ）ｎ Ｌｙｓ （ここに、ｎは２〜
４の数字である）を認識する。
エドマン分解はもう１つの開裂法であって、この場合に
はポリペプチドから一個のＮ末端アミノ酸が連続的に除
去される。本発明のＭｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ−ＩＧＦＩ［誘
導体の場合には、トリプトファン酸化的開裂を用いてト
リプトファン部位を開裂し、ＩＧＦｎの天然の配列を生
成することができる。
はポリペプチドから一個のＮ末端アミノ酸が連続的に除
去される。本発明のＭｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ−ＩＧＦＩ［誘
導体の場合には、トリプトファン酸化的開裂を用いてト
リプトファン部位を開裂し、ＩＧＦｎの天然の配列を生
成することができる。
固有の［ＧＦｎを得る方法は実施例３３に詳細に記載さ
れている。
れている。
本発明を用いて発現させる上で特に好ましいタンパク質
はインシュリン様成長因子ｎ（ＩＧＦＩＩ）である。イ
ンシュリン様成長因子■はインシュリン類似作用を有す
る成長促進ポリペプチドであるＩＧＦファミリーの一種
である。ＩＧＦＩＩは、血糖値の降下、傷の治癒促進、
およびインシュリン分泌の抑制等の治療に有望であるこ
とが示されている。多くの直接発現法に比較して本発明
方法によれば［１；Ｆｉ１発現の実質的な増大が達成さ
れた。
はインシュリン様成長因子ｎ（ＩＧＦＩＩ）である。イ
ンシュリン様成長因子■はインシュリン類似作用を有す
る成長促進ポリペプチドであるＩＧＦファミリーの一種
である。ＩＧＦＩＩは、血糖値の降下、傷の治癒促進、
およびインシュリン分泌の抑制等の治療に有望であるこ
とが示されている。多くの直接発現法に比較して本発明
方法によれば［１；Ｆｉ１発現の実質的な増大が達成さ
れた。
本発明の構築物の作成に用いる親プラスミドであるプラ
スミドｐＬ１１０ｃの構築の流れ図を略図の形で以下の
表１に示す。実施例中、特に明記しない限り、反応条件
、バッファー、およびプロトコールは、［マニアティス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｔｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１
９８２コに記載の組換えＤＮＡ技術の常法、例えば制限
酵素消化、ＤＮＡ断片の単離および精製、結合、および
形質転換法によるものとする。
スミドｐＬ１１０ｃの構築の流れ図を略図の形で以下の
表１に示す。実施例中、特に明記しない限り、反応条件
、バッファー、およびプロトコールは、［マニアティス
ら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、モレキュラー・クローニング
（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｔｏｎｉｎｇ）、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１
９８２コに記載の組換えＤＮＡ技術の常法、例えば制限
酵素消化、ＤＮＡ断片の単離および精製、結合、および
形質転換法によるものとする。
（以下余白）
表−１
プラスミドｐＬ１
１０Ｃ構築の流れ図
Ｌ１１０
↓ 実施例１Ｏ
Ｌ１１０Ａ
Ｍ１３ＴｃｌｌＯＢ
Ｌ１１０ｃ
本発明の詳細な説明するために以下に実施例を挙げるが
、これらはいかなる意味からも本発明を制限する意図に
よるものではない。本発明の構築に必要な説明および実
際の手法を適当な箇所に記載した。
、これらはいかなる意味からも本発明を制限する意図に
よるものではない。本発明の構築に必要な説明および実
際の手法を適当な箇所に記載した。
実施例１ プラスミドｐＫＣ２８３の単離［ノーザン・
リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
。
リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｔｈ
ｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
。
ｒａｔｏｒｙ）、ペオリア、イリノイ６１６０４］から
受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０の下、大腸菌に１２
ＢＥ １２０１／ｐＫＣ２８３の凍結乾燥品を入手する
。凍結乾燥品をＬＢ培地（バタトトリプトン１０ｇ、バ
クト酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２１０ｆ／Ｑ、ｐＨを７
．５に調節）ｌＯｘ１２を含有する管にデカントして入
れ、３２°Ｃで２時間インキュベートし、その時点で培
養物をアンピシリン５０μ９／ＲＱとした後、３２℃で
一夜インキコベートする。
受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５８３０の下、大腸菌に１２
ＢＥ １２０１／ｐＫＣ２８３の凍結乾燥品を入手する
。凍結乾燥品をＬＢ培地（バタトトリプトン１０ｇ、バ
クト酵母エキス５ｇ、ＮａＣｌ２１０ｆ／Ｑ、ｐＨを７
．５に調節）ｌＯｘ１２を含有する管にデカントして入
れ、３２°Ｃで２時間インキュベートし、その時点で培
養物をアンピシリン５０μ９／ＲＱとした後、３２℃で
一夜インキコベートする。
大腸菌Ｋ １２ＢＥ １２０１’／ｐＫＣ２８３細胞は
、細胞ＤＮＡに組み込まれた温度感受性のＣＩリプレッ
サーを含有しているので、３２℃でインキュベートする
。本明細書中、以後の実施例に記載されているように、
このプラスミドの単離工程に野生型のラムダｐｔ、リプ
レッサー遺伝子を含有しているかラムダｐＬプロモータ
ーを含有していない細胞を用いる場合のインキュベーシ
ョン温度は３７°Ｃである。
、細胞ＤＮＡに組み込まれた温度感受性のＣＩリプレッ
サーを含有しているので、３２℃でインキュベートする
。本明細書中、以後の実施例に記載されているように、
このプラスミドの単離工程に野生型のラムダｐｔ、リプ
レッサー遺伝子を含有しているかラムダｐＬプロモータ
ーを含有していない細胞を用いる場合のインキュベーシ
ョン温度は３７°Ｃである。
大腸菌Ｋ１２ ＢＥ１２０１／ｐＫＣ２８３の単一のコ
ロニー単離体が得られるような方法で一夜培養物の一部
をアンピシリン５０μ９／村含有しＢ−寒天（バクトー
寒天１５９／Ｑ含有ＬＢ−培地）プレートに置く。得ら
れた単一コロニーをアンピシリン５０μｇ／ ｍ（ｌ含
有ＬＢ培地１ＯＲＱに接種し、激しく撹拌しながら一夜
３２℃でインキュベートした。１ＯＲＱの一夜培養物を
アンピシリン５０μｙ／ ｔｘ（ｌ含有ＬＢ培地５００
１１２に接種し、培養物が定常期に達するまで激しく撹
拌しながら３２℃でインキュベートした。
ロニー単離体が得られるような方法で一夜培養物の一部
をアンピシリン５０μ９／村含有しＢ−寒天（バクトー
寒天１５９／Ｑ含有ＬＢ−培地）プレートに置く。得ら
れた単一コロニーをアンピシリン５０μｇ／ ｍ（ｌ含
有ＬＢ培地１ＯＲＱに接種し、激しく撹拌しながら一夜
３２℃でインキュベートした。１ＯＲＱの一夜培養物を
アンピシリン５０μｙ／ ｔｘ（ｌ含有ＬＢ培地５００
１１２に接種し、培養物が定常期に達するまで激しく撹
拌しながら３２℃でインキュベートした。
以下の工程はマニアティスらの方法（モレキュラー・ク
ローニング、１９８２、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−）の応用である。
ローニング、１９８２、コールド・スプリング・ハーバ
−・ラボラトリ−）の応用である。
細胞を４°Ｃにおいて４０００ｘ９で１０分間遠心して
収穫し、上清を捨てた。細胞ペレットを水冷ＳＴＥバッ
フｙ−（０，ＩＭ ＮａＣρ、ｌｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｃ（ｐｉ−１７，８）、およびＩｎ＋ＭＥＤＴＡ）１０
０＋Ｃ中で洗浄した。洗浄後、細胞ペレットをリゾチー
ム５ ｍ９／ ＊（ｌを含有する溶液１（５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ）（ｐＨ８，０）
、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍＱｋ、再懸濁し、
室温で１０分間放置した。溶液２（０，２Ｎ ＮａＯＨ
および１％５ＤＳ）２０ｘｅをリゾチーム処理細胞に加
え、溶液を転倒させて静かに撹拌した。混合物を水上で
１０分間インキュベートした。
収穫し、上清を捨てた。細胞ペレットを水冷ＳＴＥバッ
フｙ−（０，ＩＭ ＮａＣρ、ｌｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｃ（ｐｉ−１７，８）、およびＩｎ＋ＭＥＤＴＡ）１０
０＋Ｃ中で洗浄した。洗浄後、細胞ペレットをリゾチー
ム５ ｍ９／ ＊（ｌを含有する溶液１（５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ）（ｐＨ８，０）
、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１０ｍＱｋ、再懸濁し、
室温で１０分間放置した。溶液２（０，２Ｎ ＮａＯＨ
および１％５ＤＳ）２０ｘｅをリゾチーム処理細胞に加
え、溶液を転倒させて静かに撹拌した。混合物を水上で
１０分間インキュベートした。
溶解した細胞混合物に５Ｍ水冷酢酸カリウム（ｐＨ４，
８）１５５１１２を加え、溶液を倒置して混合した。
８）１５５１１２を加え、溶液を倒置して混合した。
溶液を水上で１０分間インキュベートした。氷酢酸１１
．５ｊｌ１２を水２８．５ｘＱおよび５Ｍ酢酸カリウム
６０Ｒσに加えて５Ｍ酢酸カリウム溶液を調製した；得
られた溶液はカリウムに関して３鎖、酢酸に関して５Ｍ
である。
．５ｊｌ１２を水２８．５ｘＱおよび５Ｍ酢酸カリウム
６０Ｒσに加えて５Ｍ酢酸カリウム溶液を調製した；得
られた溶液はカリウムに関して３鎖、酢酸に関して５Ｍ
である。
溶解した細胞混合物をベックマン（Ｂ ｅｃｋｍａｎ）
ＳＷ２７・ローター（またはその等個物）を用い、４
℃で２０分間２０．００Ｏｒｐｍで遠心した。細胞ＤＮ
Ａおよび屑がチューブの底にベレットを形成した。上清
的３６１１９を回収し、イソプロパツール０゜６容量を
加えて混合し、得られた溶液を室温で１５分間放置した
。室温で３０分間、１２．０００×９で遠心することに
より、プラスミドＤＮＡを収集した。上清を棄て、ＤＮ
Ａベレットを７０％エタノールで室温で洗浄した。エタ
ノール洗浄液をデカントして除き、ベレットを真空デシ
ケータ−中で乾燥した。次いでベレットをＴＥ緩衝液（
１０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ（ｐＨ８，０）およびｌ
＋ｎＭＥＤＴＡ）８＊１２に再懸濁した。
ＳＷ２７・ローター（またはその等個物）を用い、４
℃で２０分間２０．００Ｏｒｐｍで遠心した。細胞ＤＮ
Ａおよび屑がチューブの底にベレットを形成した。上清
的３６１１９を回収し、イソプロパツール０゜６容量を
加えて混合し、得られた溶液を室温で１５分間放置した
。室温で３０分間、１２．０００×９で遠心することに
より、プラスミドＤＮＡを収集した。上清を棄て、ＤＮ
Ａベレットを７０％エタノールで室温で洗浄した。エタ
ノール洗浄液をデカントして除き、ベレットを真空デシ
ケータ−中で乾燥した。次いでベレットをＴＥ緩衝液（
１０＋ｎＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｇ（ｐＨ８，０）およびｌ
＋ｎＭＥＤＴＡ）８＊１２に再懸濁した。
Ｃ５ＣＱ Ｂ９をＤＮＡ溶液に加えた。ＣｓＣｆｆ−Ｄ
ＮＡ溶液各１０ｘｆｆ当たり、臭化エチジウム水溶液（
１０ｍｙ／１ｘ（１＞約０．８村を添加した。溶液の最
終密度は約１．５５９／ｘＱであり、臭化エチジウムの
濃度は約６００μ９／酎であった。この溶液をべ・ツク
マン５０型の遠心管に移し、その上端までパラフィン油
を満たし、密封して２０°Ｃで２４時間、４５．００Ｏ
ｒｐｍで遠心した。遠心後、普通光の下で２本のＤＮＡ
バンドが観察された。チューブのキャップを除き、＃２
１の皮下用注射針を付けた注射器を用い、遠心管の側方
から挿入して、下方のＤＮＡバンドを回収した。
ＮＡ溶液各１０ｘｆｆ当たり、臭化エチジウム水溶液（
１０ｍｙ／１ｘ（１＞約０．８村を添加した。溶液の最
終密度は約１．５５９／ｘＱであり、臭化エチジウムの
濃度は約６００μ９／酎であった。この溶液をべ・ツク
マン５０型の遠心管に移し、その上端までパラフィン油
を満たし、密封して２０°Ｃで２４時間、４５．００Ｏ
ｒｐｍで遠心した。遠心後、普通光の下で２本のＤＮＡ
バンドが観察された。チューブのキャップを除き、＃２
１の皮下用注射針を付けた注射器を用い、遠心管の側方
から挿入して、下方のＤＮＡバンドを回収した。
水を飽和した１−ブタノールで数回抽出することにより
、臭化エチジウムを除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析
することにより、ＣａＣＱを除去した。緩衝化フェノー
ル、次いでクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡを沈殿さ
せ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。プラスミド
ｐＫＣ２８３約１ｊＩ９を得、ＴＥバッファー中、濃度
約１μ９／μｅで４°Ｃにおいて保存した。プラスミド
ｐＫ Ｃ２８３の制限部位および機能地図を第１図に示
す。
、臭化エチジウムを除去した。ＴＥ緩衝液に対して透析
することにより、ＣａＣＱを除去した。緩衝化フェノー
ル、次いでクロロホルムで抽出した後、ＤＮＡを沈殿さ
せ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した。プラスミド
ｐＫＣ２８３約１ｊＩ９を得、ＴＥバッファー中、濃度
約１μ９／μｅで４°Ｃにおいて保存した。プラスミド
ｐＫ Ｃ２８３の制限部位および機能地図を第１図に示
す。
実施例２ プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの構築実施例１
で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ約１０μａを
ＩＯＸ中塩中限制限バッファー００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ！（ｐＨ７，５）、５００＋ＭＮａＣＱ、１００ｇ
＋Ｍ ＭｇＣＱ、および１０＋ａＭＤＴＴコ２０ｔｔＱ
％ １ｎ／ｍ（ＩＢｓＡ ２０ｔｔ（１，制限酵素Ｐｖ
ｕｌｌ ５μａ［〜５０単位、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（Ｂ ＲＬ）の定義による二本明細書で
用いる酵素はすべてＢＲＬから供給された］および水１
４５μｅと混合し、得られた反応混合物を３７℃で２時
間インキニベートした。本明細書に記載の制限酵素反応
は、通常の方法でフェノール抽出、次いでクロロホルム
抽出して終結した後、析出するＤＮＡをエタノールで洗
浄し、ＤＮＡをＴＥバ・ノファーに再懸濁した。上記の
ごと（にしてＰｖｕＩＩ消化を停止させた後、プラスミ
ドｐＫＣ２８３を沈澱させ、次いでＴＥバッファー５μ
Ｑに再懸濁した。
で調製したプラスミドｐＫＣ２８３ＤＮＡ約１０μａを
ＩＯＸ中塩中限制限バッファー００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ！（ｐＨ７，５）、５００＋ＭＮａＣＱ、１００ｇ
＋Ｍ ＭｇＣＱ、および１０＋ａＭＤＴＴコ２０ｔｔＱ
％ １ｎ／ｍ（ＩＢｓＡ ２０ｔｔ（１，制限酵素Ｐｖ
ｕｌｌ ５μａ［〜５０単位、ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ（Ｂ ＲＬ）の定義による二本明細書で
用いる酵素はすべてＢＲＬから供給された］および水１
４５μｅと混合し、得られた反応混合物を３７℃で２時
間インキニベートした。本明細書に記載の制限酵素反応
は、通常の方法でフェノール抽出、次いでクロロホルム
抽出して終結した後、析出するＤＮＡをエタノールで洗
浄し、ＤＮＡをＴＥバ・ノファーに再懸濁した。上記の
ごと（にしてＰｖｕＩＩ消化を停止させた後、プラスミ
ドｐＫＣ２８３を沈澱させ、次いでＴＥバッファー５μ
Ｑに再懸濁した。
Ｘｈｏｌリンカ−（５°−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’）約
６００ピコモル（ｐＭ）を５ｘキナーゼバツフアー［３
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ＰＨ７，８）、５０ｍ
ＭＭｇＣムおよび２５ｍＭ ＤＴＴ］ ｌ ０μｍ７
，５ａ＋ＭＡＴＰ５μＱ％Ｈ，０２４μＱおよびＴ４ヌ
クレオチドキナーゼ０．５μＱ（Ｐ−Ｌバイオケミカル
スの定義により約２．５単位）、１ ｘ９／ｍＱＢ Ｓ
Ａ５μＱ１およびｌＱｍＭスペルミジン５μＱを含有
する混合物中、該混合物を３７°Ｃで１０分間インキニ
ベートすることでキナーゼ処理した。
６００ピコモル（ｐＭ）を５ｘキナーゼバツフアー［３
００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ＰＨ７，８）、５０ｍ
ＭＭｇＣムおよび２５ｍＭ ＤＴＴ］ ｌ ０μｍ７
，５ａ＋ＭＡＴＰ５μＱ％Ｈ，０２４μＱおよびＴ４ヌ
クレオチドキナーゼ０．５μＱ（Ｐ−Ｌバイオケミカル
スの定義により約２．５単位）、１ ｘ９／ｍＱＢ Ｓ
Ａ５μＱ１およびｌＱｍＭスペルミジン５μＱを含有
する混合物中、該混合物を３７°Ｃで１０分間インキニ
ベートすることでキナーゼ処理した。
キナーゼ処理したＸｈｏｌりンカー約１２．５μｇをＰ
ｖｕ［Ｉ消化プラスミドｐＫｃ２８３ＤＮＡ５μ１２に
加えた後、このＤＮＡ混合物に１０ｘリガーゼバツフア
ー［３００１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，６，１
００ｍＭ ＭｇＣ（Ｌ１５０ｍＭ ＤＴＴ）２．５ｔｔ
Ｑ−。
ｖｕ［Ｉ消化プラスミドｐＫｃ２８３ＤＮＡ５μ１２に
加えた後、このＤＮＡ混合物に１０ｘリガーゼバツフア
ー［３００１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ（！（ｐＨ７，６，１
００ｍＭ ＭｇＣ（Ｌ１５０ｍＭ ＤＴＴ）２．５ｔｔ
Ｑ−。
ｌｘｙ／ｘ（ｌ Ｂ Ｓ Ａ ２．５ ａＱ、５ｍＭ
ＡＴ Ｐ ７１１（１゜Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ２．５ｕ
ＱＣＰ−Ｌ、ｔｔイｔケミカルスの定義によると約２．
５単位）、１０１１１Ｍスペルミジン２，５μｅおよび
水３μｇを加えた。得られた反応混合物を４℃で一夜イ
ンキコベートした。ライゲーション反応の後、反応混合
物が高塩バッファー組成［０，１Ｍ ＮａＣＱ、０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１２（ｐＨ７、，５）、１０．
ＯｍＭ ＭｇＣＱ、、１ｍＭＤＴＴ］を有するように調
整した。この混合物に制限酵素Ｘｈｏｌ約１０μｍ２（
１００単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃で２
時間インキ二べ一トした。
ＡＴ Ｐ ７１１（１゜Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ２．５ｕ
ＱＣＰ−Ｌ、ｔｔイｔケミカルスの定義によると約２．
５単位）、１０１１１Ｍスペルミジン２，５μｅおよび
水３μｇを加えた。得られた反応混合物を４℃で一夜イ
ンキコベートした。ライゲーション反応の後、反応混合
物が高塩バッファー組成［０，１Ｍ ＮａＣＱ、０．０
５Ｍ Ｔｒｉｓ −ＨＣ１２（ｐＨ７、，５）、１０．
ＯｍＭ ＭｇＣＱ、、１ｍＭＤＴＴ］を有するように調
整した。この混合物に制限酵素Ｘｈｏｌ約１０μｍ２（
１００単位）を加え、得られた反応混合物を３７℃で２
時間インキ二べ一トした。
反応を終了させ、Ｘｈｏｌ消化ＤＮＡを沈澱させ、再懸
濁し、ライゲーション混合物にＸｈｏＩリンカ−を加え
ないことを除き、上記と同様に結合させた。ライゲート
したＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを構成
していた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位およ
び機能地図を添付の第２図に示す。
濁し、ライゲーション混合物にＸｈｏＩリンカ−を加え
ないことを除き、上記と同様に結合させた。ライゲート
したＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸを構成
していた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位およ
び機能地図を添付の第２図に示す。
実施例３ 大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λ”）／ｐＫ Ｃ２８
３ＰＸの構築 大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λつはノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリーズ（ＮＲＲＬ）から受託番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１５９９３の下で凍結乾燥品の形で入手
可能である。大腸菌に１２Ｍ０（λつは野生型のラムダ
ｐＬｃｌリプレッサー遺伝子を有するので本発明のハイ
ブリ、ドブロモータ−ｐ鎖、−１ｐｐからの転写は大腸
菌に１２Ｍ０（λ゛）細胞では起こらない。増殖培地に
アンピシリンを加えないことと、インキュベーション温
度が３７°Ｃであることを除き、実質上、実施例１記載
の方法に従って凍結乾燥品を再構成し、ＭＯ（λ°）の
単一コロニーを単離してＭＯ（λ°）細胞の一夜培養物
１０ｊｌ１２を調製した。
３ＰＸの構築 大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λつはノーザン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリーズ（ＮＲＲＬ）から受託番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１５９９３の下で凍結乾燥品の形で入手
可能である。大腸菌に１２Ｍ０（λつは野生型のラムダ
ｐＬｃｌリプレッサー遺伝子を有するので本発明のハイ
ブリ、ドブロモータ−ｐ鎖、−１ｐｐからの転写は大腸
菌に１２Ｍ０（λ゛）細胞では起こらない。増殖培地に
アンピシリンを加えないことと、インキュベーション温
度が３７°Ｃであることを除き、実質上、実施例１記載
の方法に従って凍結乾燥品を再構成し、ＭＯ（λ°）の
単一コロニーを単離してＭＯ（λ°）細胞の一夜培養物
１０ｊｌ１２を調製した。
一夜培養物５０μＱを、１０ ｍＭ ＭｇＳ Ｏ、およ
び１０ ｍＭ ＭｇＣ（１，を含有しティるＬＢ培地５
ｍ（１に接種した。この培養を一夜、激しく撹拌しなが
ら３７℃でインキュベートした。翌朝、この培養を１０
＋ａＭ Ｍｇ５Ｏ，およびｌ ＯｍＭ ＭｇＣＩ２ｔを
含有しているし一ブロスで２００ｍ１２に希釈した。細
胞密度が約ｌＸｌ０”細胞／Ｒ（ｌであることを示す、
５５０ｚｍの吸収（Ａ□。）が約０．５になるまで、希
釈した培養物を激しく撹拌しながら３７°Ｃでインキュ
ベートした。培養物を氷水浴で１０分間冷却した後、４
℃で１０分間、４０００Ｘ９で遠心して細胞を収集した
。細胞ベレットを冷却した１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ−１００
１１２に再懸濁し、直ちに遠心し再度ペレット化した。
び１０ ｍＭ ＭｇＣ（１，を含有しティるＬＢ培地５
ｍ（１に接種した。この培養を一夜、激しく撹拌しなが
ら３７℃でインキュベートした。翌朝、この培養を１０
＋ａＭ Ｍｇ５Ｏ，およびｌ ＯｍＭ ＭｇＣＩ２ｔを
含有しているし一ブロスで２００ｍ１２に希釈した。細
胞密度が約ｌＸｌ０”細胞／Ｒ（ｌであることを示す、
５５０ｚｍの吸収（Ａ□。）が約０．５になるまで、希
釈した培養物を激しく撹拌しながら３７°Ｃでインキュ
ベートした。培養物を氷水浴で１０分間冷却した後、４
℃で１０分間、４０００Ｘ９で遠心して細胞を収集した
。細胞ベレットを冷却した１０ｍＭ Ｍｇ５Ｏ−１００
１１２に再懸濁し、直ちに遠心し再度ペレット化した。
細胞ペレットを３０ｍＭＣａｃＱ１１００ｗＱに再懸濁
し、水上で２０分間インキュベートした。
し、水上で２０分間インキュベートした。
遠心により細胞を再度収集し、３０ｍＭ ＣａＣＱ＊１
０１１２に再懸濁した。細胞０．５ＲＱを、実施例２で
調製した、結合したＤＮＡに加えた（このＤＮＡは予め
３０ｍＭ ＣａＣＱ＊に調製したものである）。
０１１２に再懸濁した。細胞０．５ＲＱを、実施例２で
調製した、結合したＤＮＡに加えた（このＤＮＡは予め
３０ｍＭ ＣａＣＱ＊に調製したものである）。
細胞−ＤＮＡ混合物を水上で１時間インキュベートし、
４２℃で９０秒間、熱シヨツク処理をした後、氷上で約
２分間冷却した。細胞−ＤＮＡ混合物を、１２５ｚ（ｌ
のフラスコ中のＬＢ培地１０ｆｆ１２で希釈し、３７℃
で１時間インキュベートした。反応混合物ｌＯＯμＱを
、アンピシリン含有ＬＢ−寒天プレート上でコロニーが
現れるまで平板培養した。
４２℃で９０秒間、熱シヨツク処理をした後、氷上で約
２分間冷却した。細胞−ＤＮＡ混合物を、１２５ｚ（ｌ
のフラスコ中のＬＢ培地１０ｆｆ１２で希釈し、３７℃
で１時間インキュベートした。反応混合物ｌＯＯμＱを
、アンピシリン含有ＬＢ−寒天プレート上でコロニーが
現れるまで平板培養した。
コロニーを個別に培養し、個々のコロニーのプラスミド
ＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気泳動によって試験
した。プラスミドＤＮＡの単離は実施例１記載の方法に
従って小規模で行ったが所望の大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ’
）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同定されるまでＣ５
Ｃ（ｌグラディエント工程は行わなかった。プラスミド
ｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の第
２図に示す。
ＤＮＡを制限酵素分析およびゲル電気泳動によって試験
した。プラスミドＤＮＡの単離は実施例１記載の方法に
従って小規模で行ったが所望の大腸菌Ｋ１２Ｍ０（λ’
）／ｐＫＣ２８３ＰＸ形質転換体が同定されるまでＣ５
Ｃ（ｌグラディエント工程は行わなかった。プラスミド
ｐＫＣ２８３ＰＸの制限部位および機能地図を添付の第
２図に示す。
実施例４ 大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫ Ｃ２８３
−Ｌの構築 実施例１記載の方法に従って調製したプラスミＦｐＫＣ
２８３ＰＸ１０１を１０×高塩バ’／ ７７−［５Ｍ）
リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，５）、ＩＭ ＮａＣＱ。
−Ｌの構築 実施例１記載の方法に従って調製したプラスミＦｐＫＣ
２８３ＰＸ１０１を１０×高塩バ’／ ７７−［５Ｍ）
リス−ＨＣ１２（ｐＨ７，５）、ＩＭ ＮａＣＱ。
０ 、１ Ｍ ＭｇＣＱ、および０．０１Ｍ ＤＴＴ］
２０μｅ、Ｉｇ９／ｍ１２Ｂ Ｓ Ａ ２０ ｕＱ、制
限酵素Ｂｇｌ１１ ５μ（（〜５０単位）、制限酵素Ｘ
ｈｏＴ５μｉ２（〜５０単位）および水１５０μＣに溶
解し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベ
ートした。反応を終了させ、ＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ消化
ＤＮＡを沈澱させた後、ＤＮＡをＴＥバッファー５μＱ
に再懸濁した。
２０μｅ、Ｉｇ９／ｍ１２Ｂ Ｓ Ａ ２０ ｕＱ、制
限酵素Ｂｇｌ１１ ５μ（（〜５０単位）、制限酵素Ｘ
ｈｏＴ５μｉ２（〜５０単位）および水１５０μＣに溶
解し、得られた反応混合物を３７℃で２時間インキュベ
ートした。反応を終了させ、ＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ消化
ＤＮＡを沈澱させた後、ＤＮＡをＴＥバッファー５μＱ
に再懸濁した。
ＢｇｌｎおよびＸｈｏｌ制限酵素による切断特性を有す
る１本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカ−を合成し、
キナーゼ処理した。リンカ−のキナーゼ処理は実質上、
実施例２記載の方法で行った。
る１本鎖ＤＮＡ末端を有するＤＮＡリンカ−を合成し、
キナーゼ処理した。リンカ−のキナーゼ処理は実質上、
実施例２記載の方法で行った。
該ＤＮＡリンカ−の構造を以下に示す。
上記のリンカ−は、当業者周知の方法で１本鎖デオキシ
オリゴヌクレオチドから合成された。１本鎖デオキシオ
リゴヌクレオチドは、市販されている装置、例えばホス
ホラミダイトの化学を利用するアプライド・バイオシス
テム（カリフォルニア９４４０４、フォスター・シティ
、リンカーン・センター・ドライブ８５０）供給の３８
０Ａ ＤＮＡ合成装置等を用いて合成することができる
。その他のＤＮＡ合成法も当業者には周知である。伝統
的な改良ホスホトリエステル法はイタクラら（■ｔａｋ
ｕｒａ）、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、１９８：
１０５６（１９７７）によって報告された。また、特に
好ましいＤＮＡ合成法がヒュングら（Ｈｓｉｕｎｇ）、
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１１：３２２７（１９
８３）、およびナラングら（Ｎ ａｒａｎｇ）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８ ： ９０（１９８０）
によって開示されている。
オリゴヌクレオチドから合成された。１本鎖デオキシオ
リゴヌクレオチドは、市販されている装置、例えばホス
ホラミダイトの化学を利用するアプライド・バイオシス
テム（カリフォルニア９４４０４、フォスター・シティ
、リンカーン・センター・ドライブ８５０）供給の３８
０Ａ ＤＮＡ合成装置等を用いて合成することができる
。その他のＤＮＡ合成法も当業者には周知である。伝統
的な改良ホスホトリエステル法はイタクラら（■ｔａｋ
ｕｒａ）、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）、１９８：
１０５６（１９７７）によって報告された。また、特に
好ましいＤＮＡ合成法がヒュングら（Ｈｓｉｕｎｇ）、
ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１１：３２２７（１９
８３）、およびナラングら（Ｎ ａｒａｎｇ）、メソッ
ズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８ ： ９０（１９８０）
によって開示されている。
実質上、実施例２記載の方法に従ってＢｇｌＩＩ −Ｘ
ｈｏｌ消化プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸとリンカ−とを
結合させた。結合したＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ
２８３−Ｌを構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３−
Ｌの制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。プ
ラ゛スミドｐＫＣ２８３−Ｌを用いて大腸菌に１２Ｍ０
（λ°）を形質転換し、得られた大腸菌Ｋ ｌ ２Ｍ０
（λ’）／ｐＫ Ｃ２８３−Ｌ形質転換体を実質上、実
施例３記載の方法で同定した。
ｈｏｌ消化プラスミドｐＫＣ２８３ＰＸとリンカ−とを
結合させた。結合したＤＮＡは所望のプラスミドｐＫＣ
２８３−Ｌを構成していた。プラスミドｐＫＣ２８３−
Ｌの制限部位および機能地図を添付の第３図に示す。プ
ラ゛スミドｐＫＣ２８３−Ｌを用いて大腸菌に１２Ｍ０
（λ°）を形質転換し、得られた大腸菌Ｋ ｌ ２Ｍ０
（λ’）／ｐＫ Ｃ２８３−Ｌ形質転換体を実質上、実
施例３記載の方法で同定した。
実施例５ 大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λ”）／Ｉ）ＫＣ２８
３−ＬＢの構築 実質上、実施例１記載の方法に従って調製したプラスミ
ドｐＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡ約１０μ２をｔＯＸ高塩
バッフｙ−２０μ（Ｉｓ １ｎ／ｍＱＢｓＡ２０ａ（
１、制限酵素Ｘｈｏｌ ５ ｕ（１（〜５０単位）およ
び水１５５μＱに溶解し、３７℃で２時間インキニベー
トした。次いで、３容量の９５％エタノールおよびｌ／
１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてＸｈｏｌ消化プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＤＮＡを沈澱させ、ドライア
イス−エタノール浴中で５分間インキュベートし、遠心
した。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗
浄し、乾燥し、ニックトランスレーションンバッファ−
［０，５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，２）、Ｏ，ＩＭ
ＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ］２μｇに再懸濁し、デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート類の２１１１Ｍ溶液
各１μｇ１水１５μｇ、フレノウ（大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大きい断片）１μ７２（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルスの定義によれば〜６単位）および１ ｔｎ／ｍＱＢ
Ｓ Ａ１８ｇに再懸濁した。得られた反応混合物を２
５００で３０分間インキュベートし、溶液を７０°Ｃで
５分間インキニベートして反応を終了させた。
３−ＬＢの構築 実質上、実施例１記載の方法に従って調製したプラスミ
ドｐＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡ約１０μ２をｔＯＸ高塩
バッフｙ−２０μ（Ｉｓ １ｎ／ｍＱＢｓＡ２０ａ（
１、制限酵素Ｘｈｏｌ ５ ｕ（１（〜５０単位）およ
び水１５５μＱに溶解し、３７℃で２時間インキニベー
トした。次いで、３容量の９５％エタノールおよびｌ／
１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムを加えてＸｈｏｌ消化プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＤＮＡを沈澱させ、ドライア
イス−エタノール浴中で５分間インキュベートし、遠心
した。得られたＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗
浄し、乾燥し、ニックトランスレーションンバッファ−
［０，５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ（ｐＨ７，２）、Ｏ，ＩＭ
ＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ］２μｇに再懸濁し、デオ
キシヌクレオチドトリホスフェート類の２１１１Ｍ溶液
各１μｇ１水１５μｇ、フレノウ（大腸菌ＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大きい断片）１μ７２（Ｐ−Ｌバイオケミカ
ルスの定義によれば〜６単位）および１ ｔｎ／ｍＱＢ
Ｓ Ａ１８ｇに再懸濁した。得られた反応混合物を２
５００で３０分間インキュベートし、溶液を７０°Ｃで
５分間インキニベートして反応を終了させた。
実質上、実施例２記載の方法に従い、ＢａｍＨＩリンカ
−（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−３“）をキナーゼ処
理し、Ｘｈｏｌ消化し、フレノウ処理したプラスミドｐ
ＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡと結合させた。
−（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧ−３“）をキナーゼ処
理し、Ｘｈｏｌ消化し、フレノウ処理したプラスミドｐ
ＫＣ２８３−Ｌ ＤＮＡと結合させた。
ライゲーション反応の後、ＤＮＡを高塩バッファー中、
３７°Ｃで２時間、ＢａｍＨＩ約ｌＯＯ単位で消化した
。ＢａｍＨＩ消化の後、実質上、実施例２記載の方法に
従い、ライゲーション川のＤＮＡを調製した。
３７°Ｃで２時間、ＢａｍＨＩ約ｌＯＯ単位で消化した
。ＢａｍＨＩ消化の後、実質上、実施例２記載の方法に
従い、ライゲーション川のＤＮＡを調製した。
ライゲーションにより〜５．９ｋｂのＢａｍＨＩ制限断
片を閉環し、実質上、実施例２および３記載の方法に従
い、大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）を形質転換シタ。大腸菌
Ｋ １２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体
を同定した後、実質上、実施例１記載の方法に従い、プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ ＤＮＡを調製した。プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図
を添付の第４図に示す。
片を閉環し、実質上、実施例２および３記載の方法に従
い、大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）を形質転換シタ。大腸菌
Ｋ １２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３−ＬＢ形質転換体
を同定した後、実質上、実施例１記載の方法に従い、プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ ＤＮＡを調製した。プ
ラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限部位および機能地図
を添付の第４図に示す。
実施例６ 大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ ３２の構
築 出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−が異なる外は
実質上、実施例５記載の方法に従い、プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸ約ｌＯμ９を高塩バッファー中、制限酵素Ｓ
ａ目で消化し、フレノウ処理し、ＥｃｏＲＩリンカ−（
５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３°）と結合させた
。制限酵素ＥｃｏＲＩ消化によって〜２．１ｋｂのＤＮ
Ａを除去した後、〜４．Ｏｋｂ ＥｃｏＲＩ制限断片を
ライゲージコンによって閉環させ、プラスミドｐＫＣ２
８３ＰＲＳを得た。
築 出発プラスミド、制限酵素およびリンカ−が異なる外は
実質上、実施例５記載の方法に従い、プラスミドｐＫＣ
２８３ＰＸ約ｌＯμ９を高塩バッファー中、制限酵素Ｓ
ａ目で消化し、フレノウ処理し、ＥｃｏＲＩリンカ−（
５’−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣ−３°）と結合させた
。制限酵素ＥｃｏＲＩ消化によって〜２．１ｋｂのＤＮ
Ａを除去した後、〜４．Ｏｋｂ ＥｃｏＲＩ制限断片を
ライゲージコンによって閉環させ、プラスミドｐＫＣ２
８３ＰＲＳを得た。
結合したＤＮＡを用い、大腸菌に１２Ｍ０（λ゛）を実
質−上、実施例３記載の方法に従って形質転換した。大
腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３ＰＲＳ形質転換
体を同定した後、実質上、実施例１記載の方法に従い、
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳＤＮＡを調製した。プラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＲ８Ｂの制限部位および機能地図
を添付の第５図に示す。
質−上、実施例３記載の方法に従って形質転換した。大
腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＫＣ２８３ＰＲＳ形質転換
体を同定した後、実質上、実施例１記載の方法に従い、
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳＤＮＡを調製した。プラ
スミドｐＫＣ２８３ＰＲ８Ｂの制限部位および機能地図
を添付の第５図に示す。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ８約ｌＯμ９を高塩バッフ
ァー２００μｅ中、それぞれ約５０単位ずつの制限酵素
ＰｓｔｌおよびＳ ｐｈ ！で消化した。反応混合物を
３７℃で約２時間インキュベートした後、反応混合物を
０．６％低ゲル化温度のアガロース（ＦＭＣコーポレー
ション、マリン・コロイズ・デイビジョン、ロックラン
ド、メイン０４８４１）上、Ｔｒｉｓ−酢酸バッファー
中、〜１３０Ｖ。
ァー２００μｅ中、それぞれ約５０単位ずつの制限酵素
ＰｓｔｌおよびＳ ｐｈ ！で消化した。反応混合物を
３７℃で約２時間インキュベートした後、反応混合物を
０．６％低ゲル化温度のアガロース（ＦＭＣコーポレー
ション、マリン・コロイズ・デイビジョン、ロックラン
ド、メイン０４８４１）上、Ｔｒｉｓ−酢酸バッファー
中、〜１３０Ｖ。
〜７５ＩｌｌＡで電気泳動した。
ゲルを臭化エチジウムの希釈溶液で染色し、〜０．８５
ｋｂ Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ制限断片を構成するＤＮＡバ
ンドを長波長ＵＶ光により観察してゲルから小断片とし
て切り取った。セグメントの容量をセグメントの重さと
密度から求め、該セグメントを入れた管に等容量のＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）を加えた。次いで７２℃
でインキュベートすることにより、セグメントを融解さ
せた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ
ＰｓｔＩ −３ｐｈｌ制限断片約１μ９を容量約１０
０ｕ１２中に得た。同様の方法でプラスミドｐＫＣ２８
３−ＬＢを制限酵素Ｐｓｔｌおよびｓ ｐｈ ｔで消化
し、得られた〜３、Ｏｋｂ制限断片をアガロースゲル電
気泳動で単離しライゲーション用に調製した。
ｋｂ Ｐｓｔｌ−３ｐｈｌ制限断片を構成するＤＮＡバ
ンドを長波長ＵＶ光により観察してゲルから小断片とし
て切り取った。セグメントの容量をセグメントの重さと
密度から求め、該セグメントを入れた管に等容量のＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７，６）を加えた。次いで７２℃
でインキュベートすることにより、セグメントを融解さ
せた。プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ３の〜０．８５ｋｂ
ＰｓｔＩ −３ｐｈｌ制限断片約１μ９を容量約１０
０ｕ１２中に得た。同様の方法でプラスミドｐＫＣ２８
３−ＬＢを制限酵素Ｐｓｔｌおよびｓ ｐｈ ｔで消化
し、得られた〜３、Ｏｋｂ制限断片をアガロースゲル電
気泳動で単離しライゲーション用に調製した。
プラスミドｐＫＣ２８３ＰＲ８の〜０．８５ｋｂＰｓｔ
ｌ−３ｐｈＩ制限断片とプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ
の〜３．Ｏｋｂ ＰｓｔＩ−Ｓｐｈｌ制限断片とを実質
上、実施例２記載の方法に従って結合させた。結合した
ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ３２を構成していた。プ
ラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地図を添付の第
６図に示す。実質上、実施例３記載の方法に従い、プラ
スミドｐＬ ３２で大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λ゛）細胞を
形質転換した。
ｌ−３ｐｈＩ制限断片とプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢ
の〜３．Ｏｋｂ ＰｓｔＩ−Ｓｐｈｌ制限断片とを実質
上、実施例２記載の方法に従って結合させた。結合した
ＤＮＡは所望のプラスミドｐＬ３２を構成していた。プ
ラスミドｐＬ３２の制限部位および機能地図を添付の第
６図に示す。実質上、実施例３記載の方法に従い、プラ
スミドｐＬ ３２で大腸菌Ｋ １２Ｍ０（λ゛）細胞を
形質転換した。
実質上、実施例１記載の方法に従い、大腸菌Ｋ１２Ｍ０
（λ’）／ｐＬ ３２形質転換体からプラスミドｐＬ３
２ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬ３２ＤＮＡの分析
により、１以上のＥｃｏＲＩリンカ−がプラスミドｐＫ
Ｃ２８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌｌ末端に付加さ
れていることが分かった。１以上のＥｃｏＲＩリンカ−
の存在はプラスミドｐＬ３２またはプラスミドｐＬ３２
の誘導体の有用性に影響するものではなく、２個のＥｃ
ｏＲＩリンカ−が−緒に結合した場合には常に生成する
Ｘｈｏｌ制限部位の存在によって検出することができる
。
（λ’）／ｐＬ ３２形質転換体からプラスミドｐＬ３
２ＤＮＡを調製した。プラスミドｐＬ３２ＤＮＡの分析
により、１以上のＥｃｏＲＩリンカ−がプラスミドｐＫ
Ｃ２８３ＰＸのフレノウ処理した５ａｌｌ末端に付加さ
れていることが分かった。１以上のＥｃｏＲＩリンカ−
の存在はプラスミドｐＬ３２またはプラスミドｐＬ３２
の誘導体の有用性に影響するものではなく、２個のＥｃ
ｏＲＩリンカ−が−緒に結合した場合には常に生成する
Ｘｈｏｌ制限部位の存在によって検出することができる
。
またはプラスミドｐＬ３２は、実施例の最初のパラグラ
フで行った５ａｉｌ−ＥｃｏＲＴ切除およびライゲーシ
ョンをプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢについて行うこと
によって構築してもよい。
フで行った５ａｉｌ−ＥｃｏＲＴ切除およびライゲーシ
ョンをプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢについて行うこと
によって構築してもよい。
実施例７ 大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／ｐＬ ４７の構
築 大腸菌に１２ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８９はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリーズから受託番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８２１６の下、凍結乾燥品の形で入手し
得る。ｐＮＭ７８９の制限部位および機能地図を添付の
第７図に示す。インキュベーション温度が３７°Ｃであ
ることを除き、実質上、実施例１記載の方法に従って培
養物から抽出する。１０μｙのｐＮＭ７８９をＰｖｕＩ
［バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７
，５）、６０ＩＩＩＭＮａＣＱミロ ｍＭ ＭｇＣＱ＊
） ２００ μＱに懸濁した。
築 大腸菌に１２ＲＶ３０８／ｐＮＭ７８９はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・ラボラトリーズから受託番号Ｎ
ＲＲＬ Ｂ−１８２１６の下、凍結乾燥品の形で入手し
得る。ｐＮＭ７８９の制限部位および機能地図を添付の
第７図に示す。インキュベーション温度が３７°Ｃであ
ることを除き、実質上、実施例１記載の方法に従って培
養物から抽出する。１０μｙのｐＮＭ７８９をＰｖｕＩ
［バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ７
，５）、６０ＩＩＩＭＮａＣＱミロ ｍＭ ＭｇＣＱ＊
） ２００ μＱに懸濁した。
Ｐｖｕ■１単位を加え、得られた反応混合物を３７℃で
５分間インキュベートする。６５℃で５分間インキュベ
ートして酵素を不活化する。次いで、ｌＱｘＢａｍＨＩ
バッフｙ−［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８
，０）、１ＭＮａＣｌ２．７０ ＩＩＩＭ ＭｇＣＱ、
）３０μＱ１水７０μＱおよび制限酵素ＢａｍＨＩｌＯ
単位を加え、反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュベ
ートする。次にアルカリホスファターゼ５単位を加え、
６５°Ｃで１時間インキュベートする。
５分間インキュベートする。６５℃で５分間インキュベ
ートして酵素を不活化する。次いで、ｌＱｘＢａｍＨＩ
バッフｙ−［２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐＨ８
，０）、１ＭＮａＣｌ２．７０ ＩＩＩＭ ＭｇＣＱ、
）３０μＱ１水７０μＱおよび制限酵素ＢａｍＨＩｌＯ
単位を加え、反応混合物を３７°Ｃで１時間インキュベ
ートする。次にアルカリホスファターゼ５単位を加え、
６５°Ｃで１時間インキュベートする。
１％アガロースゲル上でＤＮＡ断片を分離し、単一の切
断による断片の大きさを有するＤＮＡ断片（第８図）を
精製する。
断による断片の大きさを有するＤＮＡ断片（第８図）を
精製する。
実質上、実施例４記載の方法により平滑末端化されたＰ
ｖｕＩ［末端およびＢａｍＨＩ末端を有する合成りＮＡ
リンカ−を合成する。このリンカ−の構造を以下に示す
。
ｖｕＩ［末端およびＢａｍＨＩ末端を有する合成りＮＡ
リンカ−を合成する。このリンカ−の構造を以下に示す
。
５°−ＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧ−３’このリンカ−
をキナーゼ処理し、実質上、実施例２記載の方法により
ＢａｍＨＩ −Ｐｖｕｎ消化プラスミドｐＮＭ７８９に
挿入する。このライゲージコン混合物を用いて大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８細胞を形質転換し、実質上、実施例３記
載の方法に従ってこれらの形質転換体からのプラスミド
の単離を行う。適当な大きさのＰｖｕｌｌ断片（４９４
ｂｐ）およびＸｂａｌ −ＢａｍＨＩ断片（６２８ｂｐ
）を含有する幾つかのプラスミドを選択する。これらの
少なくとも２個の配列を、Ｂａ’ｉＨ［部位から唯一（
ユニーク）のＳ ｍａ １方向に向けての配列決定によ
って決定し、所望の配列を冑する１個のクローンを選択
する。この中間体プラスミドをプラスミドｐ１２０と命
名した。この工程の模式図およびプラスミドｐ１２０の
制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。
をキナーゼ処理し、実質上、実施例２記載の方法により
ＢａｍＨＩ −Ｐｖｕｎ消化プラスミドｐＮＭ７８９に
挿入する。このライゲージコン混合物を用いて大腸菌Ｋ
１２ＲＶ３０８細胞を形質転換し、実質上、実施例３記
載の方法に従ってこれらの形質転換体からのプラスミド
の単離を行う。適当な大きさのＰｖｕｌｌ断片（４９４
ｂｐ）およびＸｂａｌ −ＢａｍＨＩ断片（６２８ｂｐ
）を含有する幾つかのプラスミドを選択する。これらの
少なくとも２個の配列を、Ｂａ’ｉＨ［部位から唯一（
ユニーク）のＳ ｍａ １方向に向けての配列決定によ
って決定し、所望の配列を冑する１個のクローンを選択
する。この中間体プラスミドをプラスミドｐ１２０と命
名した。この工程の模式図およびプラスミドｐ１２０の
制限部位および機能地図を添付の第８図に示す。
ＢＧＨをコードしているＤＮＡを単離するためにプラス
ミドル１２０約１０μ９を各５０単位の制限酵素Ｘｂａ
ｌおよびＢａｍＨＩを含有する高塩バッファー２００μ
Ｑ中で消化する。消化産物をアガロースゲル電気泳動に
よって分離し、実質上、実施例６記載の方法に従い、Ｂ
ＧＨをコードしている〜０．６ｋｂ Ｘｂａｌ −Ｂａ
ｓＨＩ制限断片を単離し、結合に備えた。
ミドル１２０約１０μ９を各５０単位の制限酵素Ｘｂａ
ｌおよびＢａｍＨＩを含有する高塩バッファー２００μ
Ｑ中で消化する。消化産物をアガロースゲル電気泳動に
よって分離し、実質上、実施例６記載の方法に従い、Ｂ
ＧＨをコードしている〜０．６ｋｂ Ｘｂａｌ −Ｂａ
ｓＨＩ制限断片を単離し、結合に備えた。
プラスミドｐＬ３２を制限酵素ＸｂａｌおよびＢａ５Ｈ
［で消化し、〜３．９ｋｂ制限断片を単離し、ライゲー
ションに備えた。実質上、実施例２記載の方法によりプ
ラスミドｐＬ３２の〜３．９ｋｂＸｂａ１−ＢａｍＨＩ
制限断片とプラスミドｐ１２０の〜０．６ｋｂ Ｘｂａ
ｌ −ＢａｍＨＩ制限断片とを結合させ、プラスミドｐ
Ｌ４７を調製する。プラスミドｐＬ４７の制限部位およ
び機能地図を添付の第９図に示す。実質上、実施例３記
載の方法に従ってプラスミドｐＬ４７で大腸菌に１２Ｍ
０（λ゛）を形質転換し、大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／
ｐＬ ４７形質転換体を同定した。実施例、実施例１記
載の方法により形質転換体からプラスミドｐＬ４７ＤＮ
Ａを調製した。
［で消化し、〜３．９ｋｂ制限断片を単離し、ライゲー
ションに備えた。実質上、実施例２記載の方法によりプ
ラスミドｐＬ３２の〜３．９ｋｂＸｂａ１−ＢａｍＨＩ
制限断片とプラスミドｐ１２０の〜０．６ｋｂ Ｘｂａ
ｌ −ＢａｍＨＩ制限断片とを結合させ、プラスミドｐ
Ｌ４７を調製する。プラスミドｐＬ４７の制限部位およ
び機能地図を添付の第９図に示す。実質上、実施例３記
載の方法に従ってプラスミドｐＬ４７で大腸菌に１２Ｍ
０（λ゛）を形質転換し、大腸菌に１２Ｍ０（λ”）／
ｐＬ ４７形質転換体を同定した。実施例、実施例１記
載の方法により形質転換体からプラスミドｐＬ４７ＤＮ
Ａを調製した。
実施例８ 大腸菌Ｋ １２ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２ＡＲ
１の構築 プラスミドｐＰＲ１２は温度感受性ｐＬ、リプレッサー
遺伝子ｃ１８５７およびプラスミドｐＢ Ｒ３２２のテ
トラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。
１の構築 プラスミドｐＰＲ１２は温度感受性ｐＬ、リプレッサー
遺伝子ｃ１８５７およびプラスミドｐＢ Ｒ３２２のテ
トラサイクリン耐性付与遺伝子を含有している。
プラスミドｐＰＲ１２は米国特許第４．４３６゜８１５
号（１９８４年３月１３日発行）により開示され、特許
請求の対象である。プラスミドｐＰＲ１２の制限部位お
よび機能地図を添付の第１０図に示す。
号（１９８４年３月１３日発行）により開示され、特許
請求の対象である。プラスミドｐＰＲ１２の制限部位お
よび機能地図を添付の第１０図に示す。
高塩バッファー２００μｅ中、３７℃で２時間、プラス
ミドｐＰＲ１２約ｌＯμ９を制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０
単位により消化した。ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＰＲ
ＩＤＮＡを実質上、実施例５記載の方法に従って沈澱さ
せ、フレノウ処理した。フレノウ反応の後、ＥｃｏＲＩ
消化し、フレノウ処理したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡ
を実質上、実施例２記載の方法に従ってライゲーション
により再度閉環した。所望のプラスミドｐＰＲ１２△Ｒ
１を構成する結合したＤＮＡを用い、選択をアンピシリ
ン耐性ではなくテトラサイクリン耐性（５μ９／酎）に
基づいて行う外は実質上、実施例３記載の方法に従い大
腸菌に１２ＲＶ３０８を形質転換した。大腸菌Ｋ１２Ｒ
ｖ３０８はＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６
２４の下で入手できる。
ミドｐＰＲ１２約ｌＯμ９を制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０
単位により消化した。ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＰＲ
ＩＤＮＡを実質上、実施例５記載の方法に従って沈澱さ
せ、フレノウ処理した。フレノウ反応の後、ＥｃｏＲＩ
消化し、フレノウ処理したプラスミドｐＰＲ１２ＤＮＡ
を実質上、実施例２記載の方法に従ってライゲーション
により再度閉環した。所望のプラスミドｐＰＲ１２△Ｒ
１を構成する結合したＤＮＡを用い、選択をアンピシリ
ン耐性ではなくテトラサイクリン耐性（５μ９／酎）に
基づいて行う外は実質上、実施例３記載の方法に従い大
腸菌に１２ＲＶ３０８を形質転換した。大腸菌Ｋ１２Ｒ
ｖ３０８はＮＲＲＬから受託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５６
２４の下で入手できる。
大腸菌Ｋ１２ＲＶ３０８／ｐＰＲ１２△Ｒｌ形質転換体
を同定した後、実質上、実施例１記載の方法で形質転換
体からプラスミドｐＰＲ１２△ＲＩＤＮＡを調製した。
を同定した後、実質上、実施例１記載の方法で形質転換
体からプラスミドｐＰＲ１２△ＲＩＤＮＡを調製した。
中限バッファー２００μｅ中、３７℃で２時間、プラス
ミドｐＰＲ１２△Ｒ１約１０μ９を制限酵素Ａｖａｌ約
５０単位により消化した。Ａｖａ！消化プラスミドｐＰ
Ｒ１２△ＲＩＤＮＡを実質上、実施例５記載の方法に従
って沈澱させ、フレノウ処理した。フレノウ反応の後、
Ａｖａｌ消化し、フレノウ処理したプラスミドｐＰＲ１
２ΔＲｌＤＮＡを実質上、実施例２記載の方法に従って
ＥｃｏＲＩ！Ｊンカー（５°−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴ
Ｃ−３°）と結合させた。リンカ−との結合の後、ＤＮ
Ａを沈澱させ、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単位を含有す
る高塩バッファー約２００μａに再懸濁した。得られた
反応混合物を３７℃で約２時間インキュベートオした。
ミドｐＰＲ１２△Ｒ１約１０μ９を制限酵素Ａｖａｌ約
５０単位により消化した。Ａｖａ！消化プラスミドｐＰ
Ｒ１２△ＲＩＤＮＡを実質上、実施例５記載の方法に従
って沈澱させ、フレノウ処理した。フレノウ反応の後、
Ａｖａｌ消化し、フレノウ処理したプラスミドｐＰＲ１
２ΔＲｌＤＮＡを実質上、実施例２記載の方法に従って
ＥｃｏＲＩ！Ｊンカー（５°−ＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴ
Ｃ−３°）と結合させた。リンカ−との結合の後、ＤＮ
Ａを沈澱させ、制限酵素ＥｃｏＲＩ約５０単位を含有す
る高塩バッファー約２００μａに再懸濁した。得られた
反応混合物を３７℃で約２時間インキュベートオした。
ＥｃｏＲＩ消化の後、反応混合物をアガロースゲルに載
せ、実質上、実施例６記載の方法に従い、〜５．１ ｋ
ｂ ＥｃｏＲｒ制限断片を精製した。
せ、実質上、実施例６記載の方法に従い、〜５．１ ｋ
ｂ ＥｃｏＲｒ制限断片を精製した。
実質上、実施例２記載の方法に従い、〜５．１ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片をライゲーションにより再度閉環した。ライ
ゲーション後のＤＮＡは所望のプラスミドｐＰＲ１２Ａ
Ｒｌを構成していた。選択をアンピシリン耐性ではなく
テトラサイクリン耐性に基づいて行う外は実質上、実施
例３記載の方法に従いプラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩＤＮ
Ａにより大腸菌に１２ＲＶ３０８を形質転換した。大腸
菌Ｋ１２ ＲＶ ３０８／ｐＰ Ｒ１２ＡＲ１形質転ｍ
体ヲ同定した後、実質上、実施例１記載の方法で形質転
換体からプラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１を調製した。
ｏＲＩ断片をライゲーションにより再度閉環した。ライ
ゲーション後のＤＮＡは所望のプラスミドｐＰＲ１２Ａ
Ｒｌを構成していた。選択をアンピシリン耐性ではなく
テトラサイクリン耐性に基づいて行う外は実質上、実施
例３記載の方法に従いプラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩＤＮ
Ａにより大腸菌に１２ＲＶ３０８を形質転換した。大腸
菌Ｋ１２ ＲＶ ３０８／ｐＰ Ｒ１２ＡＲ１形質転ｍ
体ヲ同定した後、実質上、実施例１記載の方法で形質転
換体からプラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１を調製した。
プラスミドｐＰＲ１２ＡＲ１の制限部位および機能地図
を添付の第１１図に示す。
を添付の第１１図に示す。
実施例９ 大腸菌に１２ＲＶ３０８／ｐＬ１１０の構築
プラスミドｐＰＲ１２ＡＲＩＤＮＡ約１０μ９を制限酵
素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩの各々を約５０単位含有す
る高塩バッファー２００μｅに懸濁し、消化反応混合物
を３７℃で約２時間インキュベートした。次いで、反応
混合物をアガロースゲルに載せ、実質上、実施例６記載
の方法に従い、〜２゜９ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＥｃｏＲＩ
制限断片を単離し、ライゲーション用に調製した。
素ＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩの各々を約５０単位含有す
る高塩バッファー２００μｅに懸濁し、消化反応混合物
を３７℃で約２時間インキュベートした。次いで、反応
混合物をアガロースゲルに載せ、実質上、実施例６記載
の方法に従い、〜２゜９ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＥｃｏＲＩ
制限断片を単離し、ライゲーション用に調製した。
プラスミドｐＬ４７約１０μ２を制限酵素Ｐｓｔｌおよ
びＢａｍＨＩ含有高塩バッファー２００μρ中、３７℃
で２時間消化した。ＰｓｔＩ−Ｂａａ＋ＨＩ消化ＤＮＡ
をアガロースゲルに載せ、実質上、実施例６記載の方法
に従い、複製起点とアンピシリン耐性付与遺伝子部分を
含有する〜２．９ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＢａｍＨＩ制限断
片を単離し、ライゲーション用に調製した。別の反応で
、実質上、実施例６記載の方法に従い、高塩バッファー
２００μσ中、３７℃で約２時間インキュベートするこ
とによりプラスミドＰＬ４７ＤＮＡ約１０１１９を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、新規な転写
および翻訳活性化配列とＢＧＨをコードしているＤＮＡ
とを含有する〜１．０３ｋｂ ＥｃｏＲＩ −Ｂａａ＋
ＨＩ制限断片を単離し、ライゲーション用に調製した。
びＢａｍＨＩ含有高塩バッファー２００μρ中、３７℃
で２時間消化した。ＰｓｔＩ−Ｂａａ＋ＨＩ消化ＤＮＡ
をアガロースゲルに載せ、実質上、実施例６記載の方法
に従い、複製起点とアンピシリン耐性付与遺伝子部分を
含有する〜２．９ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＢａｍＨＩ制限断
片を単離し、ライゲーション用に調製した。別の反応で
、実質上、実施例６記載の方法に従い、高塩バッファー
２００μσ中、３７℃で約２時間インキュベートするこ
とによりプラスミドＰＬ４７ＤＮＡ約１０１１９を制限
酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、新規な転写
および翻訳活性化配列とＢＧＨをコードしているＤＮＡ
とを含有する〜１．０３ｋｂ ＥｃｏＲＩ −Ｂａａ＋
ＨＩ制限断片を単離し、ライゲーション用に調製した。
得られた〜０．０３ｋｂ ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限
断片をプラスミドｐＬ１１０の構築に用いた。
断片をプラスミドｐＬ１１０の構築に用いた。
プラスミドｐＬ１１０を構築するためにプラスミドｐＬ
４７の〜２．７ｋｂ Ｐｓｔｌ−ＢａｍＨＩおよび〜１
．０３ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＢａｍＨＩ制限断片をブラス
ミ ドｐＰＲ１２ＡＲ１の〜２．９ｋｂ ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ制限断片と結合させ、結合したＤＮＡを用
い、形質転換体の選択をアンピシリン耐性ではな（テト
ラサイクリン耐性に基づいて行う外は実質上、実施例２
および３記載の方法に従い、大腸菌に１２ＲＶ３０８を
形質転換した。
４７の〜２．７ｋｂ Ｐｓｔｌ−ＢａｍＨＩおよび〜１
．０３ｋｂ Ｐｓｔｌ −ＢａｍＨＩ制限断片をブラス
ミ ドｐＰＲ１２ＡＲ１の〜２．９ｋｂ ＰｓｔＩ
−ＥｃｏＲＩ制限断片と結合させ、結合したＤＮＡを用
い、形質転換体の選択をアンピシリン耐性ではな（テト
ラサイクリン耐性に基づいて行う外は実質上、実施例２
および３記載の方法に従い、大腸菌に１２ＲＶ３０８を
形質転換した。
ＢＧＨ暗号領域には２個のＰｓｔｌ制限酵素認識部位が
存在するが添付の制限部位および機能地図には記載され
ていない。プラスミドρＬＩＩＯの制限部位および機能
地図を添付の第１２図に示す。
存在するが添付の制限部位および機能地図には記載され
ていない。プラスミドρＬＩＩＯの制限部位および機能
地図を添付の第１２図に示す。
実施例１０ 大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＬ１１０Ｃ
の構築 Ａ、大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＬ１１０Ａ＋７）構
築 プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡ約１μ９を、ｌＯＸ高塩バ
ッフｙ−（１，ＯＭ ＮａＣ＆、０．５０ＭＴｒｉｓ−
ＨＣＱ、ｐＨ７，５，０、１０Ｍ ＭｇＣＱ＊およびＩ
Ｏ＋Ｍジチオスレイトール）２μｇとＮｄｅｌ酵素３単
位とを含有する全量２０μｇ中で制限酵素Ｎｄｅｌによ
り、３７℃で１時間消化した。反応混合物をフェノール
／クロロホルム混合物（１：１、ｖ）抽出に付し、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させた。Ｎｄｅｌ消化プラスミド
ＰＬＩＩＯＤＮＡを１ｘクレノウバッファ−（４０ＩＩ
ＩＭＫＰＯ４、ｐ）（７，５，６，６ｍＭ ＭｇＣＱｔ
、１．０ｍＭ２−メルカプトエタノール、３３℃Ｍ ｄ
ＡＴＰ、３３℃ＭｄＣＴＰ、３３μＭ ｄＧＴＰおよ
び３３℃ＭＴＴＰ）５０μｐに溶かした。このＤＮＡに
、大腸ｍＤＮＡポリメラーゼ■の大きいフラグメント（
フレノウ）２ ｔｔ（Ｉｃ〜Ｉ Ｏ単位、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて混合し、得られた
反応混合物を１６℃で１時間インキュベートした。フェ
ノール／ＣＨＣｅ、抽出によって反応を止め、常法通り
、ＤＮＡを精製した。Ｎｄｅｌ消化し、フレノウ処理し
たＤＮＡを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、４℃に
おいて１６時間ライゲートさせた。得られたＤＮＡで大
腸菌に１２株ＲＶ３０８ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４
）を常法通り形質転換した。テトラサイクリン５μｖ／
友Ｑ、を含んだＴＹ−寒天培地上で形質転換体を選択
し、バーンボイム（Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ）をドーリ−（
Ｄｏｌｙ）の示した方法に従い、高速アルカリ抽出法で
耐性コロニーからプラスミドを単離した［ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）、７，１５１３−２３（１９７９）］。Ｎｄ
ｅ１部位を欠くプラスミド（ｐＬ １１０Ａ。
の構築 Ａ、大腸菌に１２ ＲＶ３０８／ｐＬ１１０Ａ＋７）構
築 プラスミドｐＬ１１０ＤＮＡ約１μ９を、ｌＯＸ高塩バ
ッフｙ−（１，ＯＭ ＮａＣ＆、０．５０ＭＴｒｉｓ−
ＨＣＱ、ｐＨ７，５，０、１０Ｍ ＭｇＣＱ＊およびＩ
Ｏ＋Ｍジチオスレイトール）２μｇとＮｄｅｌ酵素３単
位とを含有する全量２０μｇ中で制限酵素Ｎｄｅｌによ
り、３７℃で１時間消化した。反応混合物をフェノール
／クロロホルム混合物（１：１、ｖ）抽出に付し、ＤＮ
Ａをエタノールで沈澱させた。Ｎｄｅｌ消化プラスミド
ＰＬＩＩＯＤＮＡを１ｘクレノウバッファ−（４０ＩＩ
ＩＭＫＰＯ４、ｐ）（７，５，６，６ｍＭ ＭｇＣＱｔ
、１．０ｍＭ２−メルカプトエタノール、３３℃Ｍ ｄ
ＡＴＰ、３３℃ＭｄＣＴＰ、３３μＭ ｄＧＴＰおよ
び３３℃ＭＴＴＰ）５０μｐに溶かした。このＤＮＡに
、大腸ｍＤＮＡポリメラーゼ■の大きいフラグメント（
フレノウ）２ ｔｔ（Ｉｃ〜Ｉ Ｏ単位、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えて混合し、得られた
反応混合物を１６℃で１時間インキュベートした。フェ
ノール／ＣＨＣｅ、抽出によって反応を止め、常法通り
、ＤＮＡを精製した。Ｎｄｅｌ消化し、フレノウ処理し
たＤＮＡを、次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと、４℃に
おいて１６時間ライゲートさせた。得られたＤＮＡで大
腸菌に１２株ＲＶ３０８ （ＮＲＲＬ Ｂ−１５６２４
）を常法通り形質転換した。テトラサイクリン５μｖ／
友Ｑ、を含んだＴＹ−寒天培地上で形質転換体を選択
し、バーンボイム（Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ）をドーリ−（
Ｄｏｌｙ）の示した方法に従い、高速アルカリ抽出法で
耐性コロニーからプラスミドを単離した［ヌクレイツク
・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、）、７，１５１３−２３（１９７９）］。Ｎｄ
ｅ１部位を欠くプラスミド（ｐＬ １１０Ａ。
第１３図）を選択した。
Ｂ０部位特異的突然変異誘発によるファージＭ１３Ｔｃ
ｌｌＯＢの構築 部位特異的突然変異誘発による、テトラサイタリフ耐性
付与遺伝子中のＢａｍＨ１部位の除去は第１３図の右側
に図示されている。
ｌｌＯＢの構築 部位特異的突然変異誘発による、テトラサイタリフ耐性
付与遺伝子中のＢａｍＨ１部位の除去は第１３図の右側
に図示されている。
Ｂ（ｉ） ファージＭ１３Ｔｃ３の構築テトラサイタ
リン耐性付与遺伝子供給源としてプラスミドｐＬｌｌｏ
を用いた。ＴＥバッファー５０ｔｔＱ中、プラスミドｐ
Ｌ１１Ｏ約５０μｙを１ＱＸＨｉｎｄｌ［バッファー２
５μＱおよび水１７０μＱに加えた。制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌ［約５μｍ２（〜５０単位）をプラスミドｐＬ １
１０ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７℃で
２時間インキュベートした。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ％
ｐＨ７，４約１３μＱと制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ μＮ
（〜５０単位）をＨｉｎｄ■消化プラスミドｐＬ１１０
に加え、反応混合物を３７℃でさらに２時間インキュベ
ートした。反応混合物をＴＥ飽和フェノールで抽出して
反応を止め、クロロホルム抽出してフェノールを除去し
た。次いで、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｎＩ消化プラスミド
ｐＬＩＩＯを沈澱させ、遠心して収集し、１％アガロー
スゲルに適用して大きい〜１．４ｋｂ ＥｃｏＲ［−Ｈ
ｌｎｄＩ［［制限断片を精製、単離した。
リン耐性付与遺伝子供給源としてプラスミドｐＬｌｌｏ
を用いた。ＴＥバッファー５０ｔｔＱ中、プラスミドｐ
Ｌ１１Ｏ約５０μｙを１ＱＸＨｉｎｄｌ［バッファー２
５μＱおよび水１７０μＱに加えた。制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌｌ［約５μｍ２（〜５０単位）をプラスミドｐＬ １
１０ＤＮＡ溶液に加え、得られた反応混合物を３７℃で
２時間インキュベートした。２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ％
ｐＨ７，４約１３μＱと制限酵素ＥｃｏＲＩ ５ μＮ
（〜５０単位）をＨｉｎｄ■消化プラスミドｐＬ１１０
に加え、反応混合物を３７℃でさらに２時間インキュベ
ートした。反応混合物をＴＥ飽和フェノールで抽出して
反応を止め、クロロホルム抽出してフェノールを除去し
た。次いで、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｎＩ消化プラスミド
ｐＬＩＩＯを沈澱させ、遠心して収集し、１％アガロー
スゲルに適用して大きい〜１．４ｋｂ ＥｃｏＲ［−Ｈ
ｌｎｄＩ［［制限断片を精製、単離した。
ファージＭ ｌ ３ ｍｐ ｌ Ｉ３ （Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂ １ｏｌａｂＳ）をＴＥバッファー５
０ｕＱに溶解し、次いで、上記のごとく、ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。Ｅ ｃｏＲＥ −Ｈ１
ｎｄｎｌ切断フア一ジＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを、〜７．
２５ｋｂ制限断片を精製、単離することを除いて、ｐＬ
ｌｌｏについて記載したと同様にして精製した。
ｎｇｌａｎｄ Ｂ １ｏｌａｂＳ）をＴＥバッファー５
０ｕＱに溶解し、次いで、上記のごとく、ＥｃｏＲＩお
よびＨｉｎｄＩ［Ｉで消化した。Ｅ ｃｏＲＥ −Ｈ１
ｎｄｎｌ切断フア一ジＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡを、〜７．
２５ｋｂ制限断片を精製、単離することを除いて、ｐＬ
ｌｌｏについて記載したと同様にして精製した。
プラスミドｐＬ１１０の〜１．４ｋｂ Ｈｉｎｄｌｎ−
ＥｃｏＲＩ断片約１１００ｎを、ファージＭ１３ｎ＋ｐ
１８の〜７．３ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
約４００ ｎｇ。
ＥｃｏＲＩ断片約１１００ｎを、ファージＭ１３ｎ＋ｐ
１８の〜７．３ｋｂ Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片
約４００ ｎｇ。
１０Ｘリガーゼバッファー２μｍ２（０，５Ｍ トリ
ス（ｐＨ７，４）、０ 、１ Ｍ ＭｇＣＩ２１．０．
１Ｍジチオトレイトール、１０ｎＭスペルミジン、１０
ｍＭＡＴＰおよびｌ ｍｙ／ａ（ｌ Ｂ Ｓ Ａ）、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼｌμＩ２（〜ｌ単位）および水１４μ
ｇと混合した。
ス（ｐＨ７，４）、０ 、１ Ｍ ＭｇＣＩ２１．０．
１Ｍジチオトレイトール、１０ｎＭスペルミジン、１０
ｍＭＡＴＰおよびｌ ｍｙ／ａ（ｌ Ｂ Ｓ Ａ）、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼｌμＩ２（〜ｌ単位）および水１４μ
ｇと混合した。
このライゲーション反応混合物を１５℃で１．５時間イ
ンキュベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望のファ
ージＭ１３Ｔｃ３ＤＮＡを構成していた。
ンキュベートした。ライゲートしたＤＮＡは所望のファ
ージＭ１３Ｔｃ３ＤＮＡを構成していた。
大腸菌Ｋ １２ ＪＭ１０９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉ。
ｄ Ｂｉ。
ｔａｂｓから入手可能）の代わりに大腸菌Ｋ１２ＪＭ１
０１を用いることができる）の−夜培養物１３１１２を
Ｌブロス５０Ｒａに接種し、得られた培養物を、通気下
、Ｏ，Ｄ、、、、〜０．３〜０．４の値になるまで３７
℃でインキュベートした。細胞をｌｏｍＭＮａＣσ２５
ｘＱに再懸濁し、水上で１０分間インキュベートしたの
ち、遠心して採集した。細胞を７５ｍＭ ＭｇＣＱｔ
１ 、２５３！ｅに再懸濁し、細胞各２００μｇをとり
、上で調製した、ライゲートしたＤＮＡ混合物ｇに加え
、水上で約４０分間インキュベートした。次いで、細胞
−ＤＮＡ混合物を４２℃で２分間インキュベートし、種
々の量（１゜ｌＯおよび１００μｇ）をとり、２％Ｘ−
Ｇａ１５０ａＱ％１００ｍＭ ＩＰＴＧ５０μｃ、お
よび対数増殖期の大腸菌に１２ ＪＭ１０９（２００
μのを・含有するｔｏｐ ａｇａｒ（４５℃で融解状態
に維持した０、５％ａｇａｒを含有するしブロス）：Ｍ
に加えた。
０１を用いることができる）の−夜培養物１３１１２を
Ｌブロス５０Ｒａに接種し、得られた培養物を、通気下
、Ｏ，Ｄ、、、、〜０．３〜０．４の値になるまで３７
℃でインキュベートした。細胞をｌｏｍＭＮａＣσ２５
ｘＱに再懸濁し、水上で１０分間インキュベートしたの
ち、遠心して採集した。細胞を７５ｍＭ ＭｇＣＱｔ
１ 、２５３！ｅに再懸濁し、細胞各２００μｇをとり
、上で調製した、ライゲートしたＤＮＡ混合物ｇに加え
、水上で約４０分間インキュベートした。次いで、細胞
−ＤＮＡ混合物を４２℃で２分間インキュベートし、種
々の量（１゜ｌＯおよび１００μｇ）をとり、２％Ｘ−
Ｇａ１５０ａＱ％１００ｍＭ ＩＰＴＧ５０μｃ、お
よび対数増殖期の大腸菌に１２ ＪＭ１０９（２００
μのを・含有するｔｏｐ ａｇａｒ（４５℃で融解状態
に維持した０、５％ａｇａｒを含有するしブロス）：Ｍ
に加えた。
細胞−ｔｏｐ ａｇａｒ混合物を４０ａ９／ｘ（ｌのＸ
−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−チオガラクトシッド）および０．１ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトジッド）を
含有するＬ −ａｇａｒプレートに接種し、３７℃で一
夜インキユベートした。
−Ｇａ１（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−チオガラクトシッド）および０．１ｍＭのＩＰ
ＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトジッド）を
含有するＬ −ａｇａｒプレートに接種し、３７℃で一
夜インキユベートした。
翌朝、青色に対して、幾つかの透明なプラークの各々を
選択し、Ｌブロス２ＲＱに接種し、得られた培養物を通
気下、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培
養物を遠心し、得られた上清２００μｅを、通気下、３
７℃で増殖している大腸菌に１２ ＪＭ１０９の培養
物（０，Ｄ、、、、＝０゜５）ｌＯＪ１１２に加えた。
選択し、Ｌブロス２ＲＱに接種し、得られた培養物を通
気下、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、培
養物を遠心し、得られた上清２００μｅを、通気下、３
７℃で増殖している大腸菌に１２ ＪＭ１０９の培養
物（０，Ｄ、、、、＝０゜５）ｌＯＪ１１２に加えた。
これらの培養物を３７℃でさらに３０分間インキュベー
トし、次いで、遠心して細胞をペレット化し、それらが
含有する複製型組換えファージを調製するために用いた
。実施例１記載の方法の規模を縮小し、細胞から二本鎖
の複製型ファージＤＮＡを単離した。そのフ７−ジＤＮ
Ａの制限酵素分析により、ファージＭ１３Ｔｃ３ＤＮＡ
を含有する形質転換体を単離した。
トし、次いで、遠心して細胞をペレット化し、それらが
含有する複製型組換えファージを調製するために用いた
。実施例１記載の方法の規模を縮小し、細胞から二本鎖
の複製型ファージＤＮＡを単離した。そのフ７−ジＤＮ
Ａの制限酵素分析により、ファージＭ１３Ｔｃ３ＤＮＡ
を含有する形質転換体を単離した。
Ｂ （ｉｉ ） −本鎖ファージＭ１３Ｔｃ３ＤＮＡ
の調製 大腸菌に１２ ＪＭＩ０９／Ｍｌ ３Ｔｃ３の一夜培
養物１．５１１Ｑを遠心し、ファージＭ１３Ｔｃ３含有
上清１００μρをＯ，Ｄ、ａｅａ・が約０．４〜０．５
の大腸菌に１２ ＪＭ１０９の培養物２５ｉ（２に接
種した。通気下、培養物を３７℃で６時間インキュベー
トし、培養物を遠心して得られた上清、約２０１１Ｑを
新しいチューブにいれた。２０％ポリエチレンングリコ
ール（ＰＦＧ６０００）２Ｒａと１４゜６％ＮａＣｌ２
を含有する溶液２ａＱを上清に加えた後、氷上で２０分
間インキュベートした。
の調製 大腸菌に１２ ＪＭＩ０９／Ｍｌ ３Ｔｃ３の一夜培
養物１．５１１Ｑを遠心し、ファージＭ１３Ｔｃ３含有
上清１００μρをＯ，Ｄ、ａｅａ・が約０．４〜０．５
の大腸菌に１２ ＪＭ１０９の培養物２５ｉ（２に接
種した。通気下、培養物を３７℃で６時間インキュベー
トし、培養物を遠心して得られた上清、約２０１１Ｑを
新しいチューブにいれた。２０％ポリエチレンングリコ
ール（ＰＦＧ６０００）２Ｒａと１４゜６％ＮａＣｌ２
を含有する溶液２ａＱを上清に加えた後、氷上で２０分
間インキュベートした。
上清を７０００ ｒｐａ＋で２５分間遠心し、得られた
一本鎖Ｍ１３Ｔｃ３ＤＮＡを含有するベレットをＴＥバ
ッファー５００μｇに再懸濁した。このＤＮＡ溶液をＴ
Ｅ−飽和フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出し
た。次いで、−本鎖ＤＮＡをＮａ０Ａｃとエタノールで
沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した後、水
６０μｅに溶解した。
一本鎖Ｍ１３Ｔｃ３ＤＮＡを含有するベレットをＴＥバ
ッファー５００μｇに再懸濁した。このＤＮＡ溶液をＴ
Ｅ−飽和フェノールで２回、クロロホルムで２回抽出し
た。次いで、−本鎖ＤＮＡをＮａ０Ａｃとエタノールで
沈澱させ、７０％エタノールで洗浄し、乾燥した後、水
６０μｅに溶解した。
Ｂ （ｉｉｉ ） 突然変異誘発
突然変異誘発ブライマーとして用いる一本鎖ＤＮＡ断片
を、自動ＤＮＡ合成装置により、合成した。突然変異誘
発ブライマーは、式： ％式％ で示される配列を有し、プラスミドｐＢ Ｒ３２２由来
のテトラサイクリン耐性付与遺伝子のＢａｍＨ１部位（
５°−ＧＧＡＴＣＣ−３′）の周辺領域の配列とホモロ
ーガスである。ただし、５”末端から２番目のＡ残基（
または３°末端から３番目のＡ残基）がプラスミドｐＢ
Ｒ３２２中ではＣである。この変化により、テトラサ
イクリン耐性付与遺伝子タンパク質のアミノ酸成分が変
わることはないが、Ｂａ５Ｈ１部位は消滅する。
を、自動ＤＮＡ合成装置により、合成した。突然変異誘
発ブライマーは、式： ％式％ で示される配列を有し、プラスミドｐＢ Ｒ３２２由来
のテトラサイクリン耐性付与遺伝子のＢａｍＨ１部位（
５°−ＧＧＡＴＣＣ−３′）の周辺領域の配列とホモロ
ーガスである。ただし、５”末端から２番目のＡ残基（
または３°末端から３番目のＡ残基）がプラスミドｐＢ
Ｒ３２２中ではＣである。この変化により、テトラサ
イクリン耐性付与遺伝子タンパク質のアミノ酸成分が変
わることはないが、Ｂａ５Ｈ１部位は消滅する。
突然変異誘発プライマーおよびＭ１３普遍的（ユニバー
サル）ブライマー［ベセスダリサーチラボラトリー（Ｂ
ＲＬ）Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ ６００９、Ｇａ１ｔｈｅｒｙ；
ｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０７６０］各々約１０ピコモルを
ＩＸキナーゼバッフｙ−（６０＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（２，ｐＨ７，８，１５５Ｍメルカプトエタノール、ｌ
Ｏｏ＋Ｍ ＭｇＣＱ、および０．４１ μＭ ＡＴＰ）
２０μＮ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１単位（Ｂ
ＲＬ）により、３７℃で３０分間処理した。キナーゼ
処理したＤＮＡを以下の突然変異誘発法に用いた。
サル）ブライマー［ベセスダリサーチラボラトリー（Ｂ
ＲＬ）Ｐ、Ｏ，ＢＯＸ ６００９、Ｇａ１ｔｈｅｒｙ；
ｂｕｒｇ、 ＭＤ ２０７６０］各々約１０ピコモルを
ＩＸキナーゼバッフｙ−（６０＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
（２，ｐＨ７，８，１５５Ｍメルカプトエタノール、ｌ
Ｏｏ＋Ｍ ＭｇＣＱ、および０．４１ μＭ ＡＴＰ）
２０μＮ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１単位（Ｂ
ＲＬ）により、３７℃で３０分間処理した。キナーゼ
処理したＤＮＡを以下の突然変異誘発法に用いた。
アニーリング反応は、−本鎖ファージＭ１３Ｔｃ３の３
００ｎｇ（１，２μＱ）、普遍ブライマー１ｐＭ（ピコ
モル、２μ４）、突然変異誘発プライマー１ｐＭ（２μ
（２）、１ＱＸ７−−ＩＪ７グバツ７ｙ−（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１，ｐＨ７，５、ｌａＭＥＤＴＡお
よび５００Ｉｌ１Ｍ ＮａＣ１２）２１１Ｑ−および水
１２゜８μｇを混合することにより行われた。反応混合
物を８０℃で２分間、５０℃で５分間インキ１ベートし
、次いで、室温まで冷却した。
００ｎｇ（１，２μＱ）、普遍ブライマー１ｐＭ（ピコ
モル、２μ４）、突然変異誘発プライマー１ｐＭ（２μ
（２）、１ＱＸ７−−ＩＪ７グバツ７ｙ−（１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１，ｐＨ７，５、ｌａＭＥＤＴＡお
よび５００Ｉｌ１Ｍ ＮａＣ１２）２１１Ｑ−および水
１２゜８μｇを混合することにより行われた。反応混合
物を８０℃で２分間、５０℃で５分間インキ１ベートし
、次いで、室温まで冷却した。
伸長反応は、ＩＯＸ伸長（６ｘｊ６ｎｓｉｏｎ）バッフ
ァー（５００＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、 ｐＨ８，１
ｍＭＥＤＴ Ａ、 １２０ｔＭ ＭｇＣｌ２ｔ）５１ｔ
Ｑ、 ２ｍＭ ｄＡＴ Ｐ５μＮ、各６ｒａＭのｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰを含んだ溶液ｌμｇ、クレノ
ウ酵素ｌμＱ（約２単位、ファルマシアＰ−Ｌバイオケ
ミカルス、８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ
ｅ、 Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ、 Ｎ Ｊ０８８５４）
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩμ＋２［１単位、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリ−（Ｂ ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ、 ＭＤ２０８７７）］および水１７μＣを
アニーリングしたＤＮＡに加えることにより行われた。
ァー（５００＋ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、 ｐＨ８，１
ｍＭＥＤＴ Ａ、 １２０ｔＭ ＭｇＣｌ２ｔ）５１ｔ
Ｑ、 ２ｍＭ ｄＡＴ Ｐ５μＮ、各６ｒａＭのｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰおよびｄＣＴＰを含んだ溶液ｌμｇ、クレノ
ウ酵素ｌμＱ（約２単位、ファルマシアＰ−Ｌバイオケ
ミカルス、８００ Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ Ａｖｅｎｕ
ｅ、 Ｐ ｉｓｃａｔａｗａｙ、 Ｎ Ｊ０８８５４）
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩμ＋２［１単位、ベセスダ・リ
サーチ・ラボラトリ−（Ｂ ｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ
ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ、 ＭＤ２０８７７）］および水１７μＣを
アニーリングしたＤＮＡに加えることにより行われた。
伸長反応混合物を室温で１時間、次いで、３７℃で２．
５時間、４℃で一夜インキユベートした。
５時間、４℃で一夜インキユベートした。
ＴＥ飽和フェノールで２回抽出して反応を止めた後、Ｃ
ＨＣＮ、で２回抽出した。エタノールおよびＮａ０Ａｃ
でＤＮＡを沈澱させた。遠心してＤＮＡを集め、水５０
μσ中に再懸濁し、このＤＮＡ溶液に１ＯＸＳ ｌバッ
ファ−６μｇを加えた。
ＨＣＮ、で２回抽出した。エタノールおよびＮａ０Ａｃ
でＤＮＡを沈澱させた。遠心してＤＮＡを集め、水５０
μσ中に再懸濁し、このＤＮＡ溶液に１ＯＸＳ ｌバッ
ファ−６μｇを加えた。
ＤＮＡ溶液を等しく３本の管に入れた。２本の管には、
Ｓ１ヌクレアーゼ（マイルスラボラトリーズ）約２００
単位を入れた。一方の３１反応混合物は、室温で５分間
、他は１０分間、イン牛ユベートした。反応混合物をＴ
Ｅ飽和フェノールで抽出（２回）することにより、反応
を止めた。フェノール抽出の後、クロロホルムで２回抽
出し、次いで、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールによって反
応混合物からＤＮＡを析出させた。ＤＮＡの未処理試料
を負対照とした。Ｓ１処理試料は、以後の工程を通して
別々に離しておいたが、同様の結果を得た。
Ｓ１ヌクレアーゼ（マイルスラボラトリーズ）約２００
単位を入れた。一方の３１反応混合物は、室温で５分間
、他は１０分間、イン牛ユベートした。反応混合物をＴ
Ｅ飽和フェノールで抽出（２回）することにより、反応
を止めた。フェノール抽出の後、クロロホルムで２回抽
出し、次いで、Ｎａ０Ａｃおよびエタノールによって反
応混合物からＤＮＡを析出させた。ＤＮＡの未処理試料
を負対照とした。Ｓ１処理試料は、以後の工程を通して
別々に離しておいたが、同様の結果を得た。
ＤＮＡペレットを水２０μｅに再懸濁し、得られた溶液
１０μρを用いて大腸！ｌＫ１２ ＪＭＩＯ９（大腸
菌に１２ ＪＭＩＯＩを用いてもよい）を、Ｉ ＰＴ
ＧまたはＸ−Ｇａ１をプレートに加えないことを除き、
ファージＭ１３Ｔｃ３の構築工程と同様にして形質転換
した。
１０μρを用いて大腸！ｌＫ１２ ＪＭＩＯ９（大腸
菌に１２ ＪＭＩＯＩを用いてもよい）を、Ｉ ＰＴ
ＧまたはＸ−Ｇａ１をプレートに加えないことを除き、
ファージＭ１３Ｔｃ３の構築工程と同様にして形質転換
した。
約４８プラークから得た二本鎖複製型ＤＮＡを前記の如
くにして単離し、ＢａｍＨ［制限部位の存在に関してス
クリーニングした。ＢａｌＨｌ部位を含有しない単離体
を、上記のごとく、−本鎖ＤＮＡを調製してさらにスク
リーニングした。ジデオキシ配列決定法（Ａｎｄｒｅｗ
Ｊ 、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ、 １９８０、 Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｇｍｏｌｏｇｙ ６５ ： ５６０−５８
０）を用いて一本鎖ＤＮＡの配列を決定した。所望の単
離体をＭ１３ＴｃｌｌＯＢと命名した（第１３図）。
くにして単離し、ＢａｍＨ［制限部位の存在に関してス
クリーニングした。ＢａｌＨｌ部位を含有しない単離体
を、上記のごとく、−本鎖ＤＮＡを調製してさらにスク
リーニングした。ジデオキシ配列決定法（Ａｎｄｒｅｗ
Ｊ 、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ、 １９８０、 Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｇｍｏｌｏｇｙ ６５ ： ５６０−５８
０）を用いて一本鎖ＤＮＡの配列を決定した。所望の単
離体をＭ１３ＴｃｌｌＯＢと命名した（第１３図）。
Ｃ，プラスミドｐＬ１１０ｃの構築
７ｙ−シｐＬ １１０Ｂ ＤＮＡｃ７）［製型約５０μ
９をＮｈｅｌ制限酵素約５０単位を含んだ１ＸＮｈｅ■
バッフ７−（５０１１鎖、ＮａＣＱ、、６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ２、ｐＨ７，５，６ｍＭ ＭｇＣ（Ｉｔおよ
び５ｍＭβ−メルカプトエタノール）２５０μＱ中で、
３７°Ｃにおいて２時間消化した。次いで、Ｎｈｅｌ消
化ファージＭｌ ３Ｔｃ１１０Ｂ ＤＮＡに５Ｍ Ｎ
ａＣｌ２５ｕＱ、さらに、５ａｌＩ制限酵素５μ＆（〜
５０５０単を加えた。３７℃で２時間消化を継続した。
９をＮｈｅｌ制限酵素約５０単位を含んだ１ＸＮｈｅ■
バッフ７−（５０１１鎖、ＮａＣＱ、、６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ２、ｐＨ７，５，６ｍＭ ＭｇＣ（Ｉｔおよ
び５ｍＭβ−メルカプトエタノール）２５０μＱ中で、
３７°Ｃにおいて２時間消化した。次いで、Ｎｈｅｌ消
化ファージＭｌ ３Ｔｃ１１０Ｂ ＤＮＡに５Ｍ Ｎ
ａＣｌ２５ｕＱ、さらに、５ａｌＩ制限酵素５μ＆（〜
５０５０単を加えた。３７℃で２時間消化を継続した。
テトラサイクリン耐性付与遺伝子の突然変異した領域を
含んだ所望の〜４２２ｂｐ ＮｈｅＩ−３ａｌｔ断片を
実施例ｔｔの方法に従い、アクリルアミドゲルから単離
した。
含んだ所望の〜４２２ｂｐ ＮｈｅＩ−３ａｌｔ断片を
実施例ｔｔの方法に従い、アクリルアミドゲルから単離
した。
プラスミドｐＬ１１０ＡがファージＭ１３Ｔｃ１１０Ｂ
に置き換えられている外は、同一条件下でプラスミドｐ
Ｌ １１０Ａ ＤＮＡをＮｈｅｌおよびＳａｌ■で消化
した。プラスミドｐＬ１１０Ａの〜６゜Ｏｋｂ Ｎｈｅ
ｌ −５ａｌ Ｉ制限断片をアガロースから精製した。
に置き換えられている外は、同一条件下でプラスミドｐ
Ｌ １１０Ａ ＤＮＡをＮｈｅｌおよびＳａｌ■で消化
した。プラスミドｐＬ１１０Ａの〜６゜Ｏｋｂ Ｎｈｅ
ｌ −５ａｌ Ｉ制限断片をアガロースから精製した。
ｐＬ １１０Ａ（〜６．０ｋｂ）およびＭ１３Ｔｃｌｌ
ＯＢ（〜４２２ｂｐ）各々のＮｈｅｒ−５ａ目断片各１
１００ｎを常法通りライゲートし、所望のプラスミドｐ
Ｌ１１０ｃを構築した。プラスミドｐＬｌ１０Ｃの制限
部位および機能地図を第１３図に示す。
ＯＢ（〜４２２ｂｐ）各々のＮｈｅｒ−５ａ目断片各１
１００ｎを常法通りライゲートし、所望のプラスミドｐ
Ｌ１１０ｃを構築した。プラスミドｐＬｌ１０Ｃの制限
部位および機能地図を第１３図に示す。
所望のプラスミドｐＬ１１０ｃは、大腸菌に、ｌＯμ９
／ １１２のテトラサイタリンに対する耐性を付与する
が、テトラサイクリン耐性付与遺伝子内にあるＢａｍ８
１部位を喪失している。
／ １１２のテトラサイタリンに対する耐性を付与する
が、テトラサイクリン耐性付与遺伝子内にあるＢａｍ８
１部位を喪失している。
実施例１１ オリゴヌクレオチドリンカーの調製
リンカ−配列：
を、まず、アプライド・バイオシステムズ・インコーホ
レイテッド社製（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅＩ
Ｉｌｓ Ｉｎｃ、）３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、次に、標準キナー
ゼバッフｙ−（５０ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ（ｐＨ７，
５）、１０ｓＭ ＭｇＣ（ｈ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｌ
ＯｍＭ ＤＤＴジチオトレイトール）中で７４−ＤＮＡ
キナーゼにより合成−本鎖オリゴヌクレオチドを各々＋
ナーゼ処理し、等モル量の合成オリゴヌクレオチドを再
アニーリングすることによって調製した。
レイテッド社製（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅＩ
Ｉｌｓ Ｉｎｃ、）３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーで
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、次に、標準キナー
ゼバッフｙ−（５０ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ（ｐＨ７，
５）、１０ｓＭ ＭｇＣ（ｈ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｌ
ＯｍＭ ＤＤＴジチオトレイトール）中で７４−ＤＮＡ
キナーゼにより合成−本鎖オリゴヌクレオチドを各々＋
ナーゼ処理し、等モル量の合成オリゴヌクレオチドを再
アニーリングすることによって調製した。
再アニーリングは、２つの相補性合成オリゴヌクレオチ
ドをポリプロピレン遠心管（１！Ｍりあるいはエッペン
ドルフ管（１，５ｍの中で８０℃、５分間加熱し、次い
で、サンプルをゆっ（す４℃まで冷却することにより実
施した。
ドをポリプロピレン遠心管（１！Ｍりあるいはエッペン
ドルフ管（１，５ｍの中で８０℃、５分間加熱し、次い
で、サンプルをゆっ（す４℃まで冷却することにより実
施した。
実施例１２ 発現プラスミドｐＨ８２４６およびＥ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨ３２４６の構築 Ａ、 ｐＬ １１ ＱＣＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片（５
７７０ｂｐ）の調製 プラスミドｐＬ １１０ＣＤＮＡ（１００μｇ）約５０
ｕＱを、ｔＯＸ中塩中限フｙ−（５０＠Ｍ ＮａＣＱ、
１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ＆（ｐＨ７，９）、１０
ｍＭＭｇＣｆｆｔ）約１０μｉ２．水３０Ａ（１，Ｘｂ
ａｒＣ２０μ／ｌｔＱ＞５ｔｔ（ｌおよびＢａｍＨＩ（
２５μ／μｌり制限酵素５μｇと混合した。得られた混
合物を３７℃で２時間インキュベートした。５７７０ｂ
ｐ制限断片を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動法
（ＳＥＡプラークアガロースゲル、ＦＭＣバイオプロダ
クツ）で精製し、エタノールで沈澱させた。ベレットを
、ＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＳ １ｍＭ ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，０）４０μｅで再懸濁し、後の使用に備えて
０℃で保存した。
ｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８／ｐＨ３２４６の構築 Ａ、 ｐＬ １１ ＱＣＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ断片（５
７７０ｂｐ）の調製 プラスミドｐＬ １１０ＣＤＮＡ（１００μｇ）約５０
ｕＱを、ｔＯＸ中塩中限フｙ−（５０＠Ｍ ＮａＣＱ、
１０ｎ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣ＆（ｐＨ７，９）、１０
ｍＭＭｇＣｆｆｔ）約１０μｉ２．水３０Ａ（１，Ｘｂ
ａｒＣ２０μ／ｌｔＱ＞５ｔｔ（ｌおよびＢａｍＨＩ（
２５μ／μｌり制限酵素５μｇと混合した。得られた混
合物を３７℃で２時間インキュベートした。５７７０ｂ
ｐ制限断片を０．７％低融点アガロースゲル電気泳動法
（ＳＥＡプラークアガロースゲル、ＦＭＣバイオプロダ
クツ）で精製し、エタノールで沈澱させた。ベレットを
、ＴＥ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＳ １ｍＭ ＥＤＴＡ
、ｐＨ８，０）４０μｅで再懸濁し、後の使用に備えて
０℃で保存した。
Ｂ、プラスミドｐＨ３１９０のＥ ｃｏＲ１／ Ｂ ａ
ｍＨ■消化 プラスミドｐＨ３１９０は、寄託された菌株（ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４１０ＸＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３
０８／ｐＨ３１９０）から得ることができ、実質上、実
施例２Ａの記載に従って分離した。プラスミドｐＨＳ１
９０約４３μｅを１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー（ｌ Ｏ
ＯａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２． ｐＨ７，５，５０ＩＩ
ＩＭＮａＣＱ、 １０ｍＭ ＭｇＣｅｔ） １０ ｕＱ
、水４０ｕＱ。
ｍＨ■消化 プラスミドｐＨ３１９０は、寄託された菌株（ＮＲＲＬ
Ｂ−１８４１０ＸＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３
０８／ｐＨ３１９０）から得ることができ、実質上、実
施例２Ａの記載に従って分離した。プラスミドｐＨＳ１
９０約４３μｅを１０ＸＥｃｏＲＩバツフアー（ｌ Ｏ
ＯａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２． ｐＨ７，５，５０ＩＩ
ＩＭＮａＣＱ、 １０ｍＭ ＭｇＣｅｔ） １０ ｕＱ
、水４０ｕＱ。
ＥｃｏＲＩ制限酵素（２０μ／、ｌり３．５μ１２、お
よびＢａｍＨＩ制限酵素（２５単位／μ（２）３．５μ
Ｑを加えて消化した。得られた混合物を３７℃で２時間
インキュベートした。制限断片を４％ＮｕＳｉｅｖｅゲ
ルで精製し、６６０ｂｐ断片を分離し、エタノールで沈
澱させた。この断片はＩＧＦＩＩ遺伝子を含有していた
。
よびＢａｍＨＩ制限酵素（２５単位／μ（２）３．５μ
Ｑを加えて消化した。得られた混合物を３７℃で２時間
インキュベートした。制限断片を４％ＮｕＳｉｅｖｅゲ
ルで精製し、６６０ｂｐ断片を分離し、エタノールで沈
澱させた。この断片はＩＧＦＩＩ遺伝子を含有していた
。
Ｃ，プラスミドｐＨＳ１９０の６６０ｂｐ断片のＴａｑ
■消化 Ｂ、で得られた約６６０ｂｐ ＩＧＦＩ［ＥｃｏＲＩ／
Ｂ ａｍＨＩ断片をＴａｑｌ制限酵素で消化した。次
いで、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片約４０μｅ％ １０
ＸＴａｑｌバツフアー５ｕＱ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ ＭｇＣＱ、、５０ｍ
ＭＮａＣｌ２）、およびＴａｑｌ（１０μ／μＱ）制限
酵素４μｅを混合し、６５°Ｃで２時間インキュベート
した。
■消化 Ｂ、で得られた約６６０ｂｐ ＩＧＦＩ［ＥｃｏＲＩ／
Ｂ ａｍＨＩ断片をＴａｑｌ制限酵素で消化した。次
いで、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片約４０μｅ％ １０
ＸＴａｑｌバツフアー５ｕＱ （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ ＭｇＣＱ、、５０ｍ
ＭＮａＣｌ２）、およびＴａｑｌ（１０μ／μＱ）制限
酵素４μｅを混合し、６５°Ｃで２時間インキュベート
した。
制限断片を４％ＮｕＳｉｅｖｅゲルで精製し、２０１ｂ
ｐ断片を分離し、ＴＥバッファー中で再懸濁した。
ｐ断片を分離し、ＴＥバッファー中で再懸濁した。
Ｄ、結合
実施例１で得られたオリゴヌクレオチドリンカー約１０
ピコモル、Ｃ４で得られたＴａｑ［／Ｂａ信Ｈ１消化ｐ
Ｈ３１９０断片０．０２μ？、およびＡ。
ピコモル、Ｃ４で得られたＴａｑ［／Ｂａ信Ｈ１消化ｐ
Ｈ３１９０断片０．０２μ？、およびＡ。
で得られたＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ消化ｐＬ１１０ｃ断片
０．４μ９を標準ライゲーションバッファー（５Ｑｎ＋
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｌ。
０．４μ９を標準ライゲーションバッファー（５Ｑｎ＋
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＱ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣ
Ｌ。
１Ｑｎ＋Ｍ ＤＤＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ
ＡＴ Ｐ）２０ ａ（ｌと混合し、Ｔ４−ＤＮＡ’Ｊガ
ーゼ（ＢＲＬ）ｌ単位を加え、１２°Ｃで１６時間、反
応させた。得られたプラスミドをプラスミドＰＨ３２４
６と名付けた。ライゲーション混合物約７．５μｅを、
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、モレキュラーク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）［
コールド・スプリング・バーバー−ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）（１９８２）］記述の標準的手法に従って、凍
結コンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８細
胞（ＮＲＲＬ Ｉ ５６２４）２００μｇを形質転換す
るために使用した。形質転換体を５μ９／ｘ（ｌテトラ
サイクリンを含んだＴＹテトラサイクリンプレート上、
３２℃で増殖させた。
ＡＴ Ｐ）２０ ａ（ｌと混合し、Ｔ４−ＤＮＡ’Ｊガ
ーゼ（ＢＲＬ）ｌ単位を加え、１２°Ｃで１６時間、反
応させた。得られたプラスミドをプラスミドＰＨ３２４
６と名付けた。ライゲーション混合物約７．５μｅを、
マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、モレキュラーク
ローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）［
コールド・スプリング・バーバー−ラボラトリ−（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ）（１９８２）］記述の標準的手法に従って、凍
結コンピテントＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＲＶ３０８細
胞（ＮＲＲＬ Ｉ ５６２４）２００μｇを形質転換す
るために使用した。形質転換体を５μ９／ｘ（ｌテトラ
サイクリンを含んだＴＹテトラサイクリンプレート上、
３２℃で増殖させた。
コロニーをプレートから取り、得られた培養物を３２°
Ｃで１２〜１６時間増殖させた。１２〜１６時間培養物
を１：５０で接種し、３２°Ｃで振盪しながら、ＯＤが
約０．３になるまで培養し、増殖させた。いったん正し
いＯＤに達したら、温度を４２℃にし、細胞を２〜３時
間インキュベートした。温度を４２°Ｃに上げると、λ
ｐｔ、プロモーターが誘導され、所望のＭｅｔ −Ａ
ｒｇ −Ｔ ｒＰ −Ｉ Ｇ Ｆｎ誘導体の高レベルの
発現がもたらされる。
Ｃで１２〜１６時間増殖させた。１２〜１６時間培養物
を１：５０で接種し、３２°Ｃで振盪しながら、ＯＤが
約０．３になるまで培養し、増殖させた。いったん正し
いＯＤに達したら、温度を４２℃にし、細胞を２〜３時
間インキュベートした。温度を４２°Ｃに上げると、λ
ｐｔ、プロモーターが誘導され、所望のＭｅｔ −Ａ
ｒｇ −Ｔ ｒＰ −Ｉ Ｇ Ｆｎ誘導体の高レベルの
発現がもたらされる。
式： Ｍｅｔ−Ｘ−ｔｒｐ −Ｉ Ｇ Ｆ ＩＩのＩＧ
ＦＩＩ誘導体をコードする付加プラスミドを、リンカ−
配列：を、リンカ−配列： ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＧＡＡＴ
ＡＧＣ（Ｒは以下の第１表に定義されている）で置き換
えること以外は、実質上、実施例１１および１２の記載
に従って構築することができる。
ＦＩＩ誘導体をコードする付加プラスミドを、リンカ−
配列：を、リンカ−配列： ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＣＧＡＡＴ
ＡＧＣ（Ｒは以下の第１表に定義されている）で置き換
えること以外は、実質上、実施例１１および１２の記載
に従って構築することができる。
得られたプラスミドおよび関連のＩＧＦＩ［タンパク誘
導体を完全に提示する。
導体を完全に提示する。
（以下余白）
第 １ 表（続き）
実質上、実施例１２の記載に従って構築することのでき
る形質転換体の他の例を、第２表に示す。
る形質転換体の他の例を、第２表に示す。
第２表
実施例１８
Ｅ、ｃｏｌｉ Ｒ”／ｐＲ’
（ココニ、Ｒ”ｈ＜ＲＶ３０Ｂ、ＭＭ２９４、Ｃ６００
、ＪＭＩＯ１、およびＷ３１１０、Ｒ３が独立してプラ
スミドｐＨ３２７４、ｐＨＳ ２７３、ｐＨ３２４７、
ｐＨＳ２４９、ｐＨ３２７８、ｐＨＳ２７２、ｐＨ３２
７６、ｐＨＳ ２７０、ｐＨ３２８１、ｐＨ３２７５、
ｐＨＳ ２９７、ｐＨＳ ２８３、ｐ）ＩＳ２８２、ｐ
Ｈ３２７１、およびｐＨ３２８０である）で示される形
質転換体の構築。形質転換を実質上、実施例１２の記載
に従って実行する。
、ＪＭＩＯ１、およびＷ３１１０、Ｒ３が独立してプラ
スミドｐＨ３２７４、ｐＨＳ ２７３、ｐＨ３２４７、
ｐＨＳ２４９、ｐＨ３２７８、ｐＨＳ２７２、ｐＨ３２
７６、ｐＨＳ ２７０、ｐＨ３２８１、ｐＨ３２７５、
ｐＨＳ ２９７、ｐＨＳ ２８３、ｐ）ＩＳ２８２、ｐ
Ｈ３２７１、およびｐＨ３２８０である）で示される形
質転換体の構築。形質転換を実質上、実施例１２の記載
に従って実行する。
一般式：ｍｅｔ−Ｘ−Ｘ’−ＩＧＦ ＩＩで示されるＩ
ＧＦＩ［誘導体をコードする他のプラスミドをリンカ−
配列： ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧ
ＧＣＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＧＣＡＡ
ＣＣＣＧＡＡＴＡＧＣを、リンカ−配列： ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＡＡＴＡＧＣ（２
および２°は以下の第３表に定義されている）で置き換
えること以外は、実質上、実施例１１および１２の記載
に従って構築することができる。
ＧＦＩ［誘導体をコードする他のプラスミドをリンカ−
配列： ＣＴＡＧＡＧＧＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＴＧＣＧＴＴＧＧ
ＧＣＴＴＡＴＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＧＣＡＡ
ＣＣＣＧＡＡＴＡＧＣを、リンカ−配列： ＴＣＣＣＡＴＡＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＡＡＴＡＧＣ（２
および２°は以下の第３表に定義されている）で置き換
えること以外は、実質上、実施例１１および１２の記載
に従って構築することができる。
得られたプラスミドおよび関連のＩＧＦｎプロティン誘
導体を完全に提示する。
導体を完全に提示する。
（以下余白）
第３表
第 ３ 表（続き）
実質上、実施例１２の記載に従って構築することのでき
る形質転換体の他の例を、第４表に示す。
る形質転換体の他の例を、第４表に示す。
第４表
実施例３２ Ｅ、ｃｏｌｉ Ｒ’／ ｐＲ’の構築Ｒ
４がＲＶ３０８、ＭＭ２９４、Ｃ６００、ＪＭｌｏ鎖、
およびＷ３１１０、Ｒ５が独立してブラスミ ドｐＨＳ
２５０、ｐＨ３２５Ｌ ｐＨＳ２９０、ｐＨ３２９１
、ｐＨＳ２９２、ｐＨ３２９３、ｐＨＳ２５３、ｐＨ３
２９４、ｐＨＳ ２９５、ｐＨ３２９６、ｐＨＳ２９７
、ｐＨ３２９８、およびｐＨ８２９９であるＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｒ’／ｐＲ’の構築。
４がＲＶ３０８、ＭＭ２９４、Ｃ６００、ＪＭｌｏ鎖、
およびＷ３１１０、Ｒ５が独立してブラスミ ドｐＨＳ
２５０、ｐＨ３２５Ｌ ｐＨＳ２９０、ｐＨ３２９１
、ｐＨＳ２９２、ｐＨ３２９３、ｐＨＳ２５３、ｐＨ３
２９４、ｐＨＳ ２９５、ｐＨ３２９６、ｐＨＳ２９７
、ｐＨ３２９８、およびｐＨ８２９９であるＥ、ｃｏｌ
ｉ Ｒ’／ｐＲ’の構築。
実施例３３ 天然配列ＩＧＦＩＩ産生のためのｍｅｔ−
ｘ−ｔｒｐ −Ｉ Ｇ Ｆ Ｕの開裂開裂反応 Ｍｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ −Ｉ ＣＦ −ＩＩを含有する凍
結乾燥顆粒を、ＩＧＦ！Ｉを遊離するための、トリプト
ファン酸化的開裂反応の出発物質として使用した。
ｘ−ｔｒｐ −Ｉ Ｇ Ｆ Ｕの開裂開裂反応 Ｍｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ −Ｉ ＣＦ −ＩＩを含有する凍
結乾燥顆粒を、ＩＧＦ！Ｉを遊離するための、トリプト
ファン酸化的開裂反応の出発物質として使用した。
乾燥顆粒１ｏｆｔｙを丸底フラスコ中、９０％ギ酸９．
６１（２で溶解した。室温にて２時間、かき混ぜり後、
ＤＭＳＯおよび濃縮ＨＣｌ２各々１００μａを加え、３
０分間かき混ぜた。さらに、ＤＭＳＯおよび濃縮ＨＣｌ
２各々ｌＯＯμＱを加え、もう３０分間かき混ぜた。次
に、反応混合物を回転蒸発により乾燥した。乾燥物質を
ミリロウオーター５０ｘｉ２で懸濁し、凍結乾燥した。
６１（２で溶解した。室温にて２時間、かき混ぜり後、
ＤＭＳＯおよび濃縮ＨＣｌ２各々１００μａを加え、３
０分間かき混ぜた。さらに、ＤＭＳＯおよび濃縮ＨＣｌ
２各々ｌＯＯμＱを加え、もう３０分間かき混ぜた。次
に、反応混合物を回転蒸発により乾燥した。乾燥物質を
ミリロウオーター５０ｘｉ２で懸濁し、凍結乾燥した。
次に、乾燥開裂物質を逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣおよびモノ
Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーにて分析するため、
存在するＩＧＦＩＩをＳ−ス°ルフォネート型に変換す
る目的で７．５Ｍ尿素、Ｏ，ＩＭ Ｎａ、ＳＯ３および
０．０１ＭＮａ、Ｓｏ、を含んだＱ、５ＭＴｒｉｓ塩基
（ｐＨ８゜２）中にとった。Ｍｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ −Ｉ
ＧＦ−Ｕ含有顆粒を用いる他のトリプトファン酸化的物
質酸化的反応は、文献［シェシュター（Ｓ ｃｈｅｃｈ
ｔｅｒ Ｙ 、 ）、パトコーニック（Ｐａｔｃｈｏｒ
ｎｉｋ Ａ、）およびパースティン（Ｂ ｕｒｓｔｅｉ
ｎ Ｙ 、 ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）、１５．５０７１−５０７５（１９７６）
コ記載の方法を以下のように改良して行った。
Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーにて分析するため、
存在するＩＧＦＩＩをＳ−ス°ルフォネート型に変換す
る目的で７．５Ｍ尿素、Ｏ，ＩＭ Ｎａ、ＳＯ３および
０．０１ＭＮａ、Ｓｏ、を含んだＱ、５ＭＴｒｉｓ塩基
（ｐＨ８゜２）中にとった。Ｍｅｔ−Ｘ−Ｔｒｐ −Ｉ
ＧＦ−Ｕ含有顆粒を用いる他のトリプトファン酸化的物
質酸化的反応は、文献［シェシュター（Ｓ ｃｈｅｃｈ
ｔｅｒ Ｙ 、 ）、パトコーニック（Ｐａｔｃｈｏｒ
ｎｉｋ Ａ、）およびパースティン（Ｂ ｕｒｓｔｅｉ
ｎ Ｙ 、 ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ）、１５．５０７１−５０７５（１９７６）
コ記載の方法を以下のように改良して行った。
尿素をＴｒｐ残基への接近を増加するよう反応物質に含
有させた。つまり、乾燥顆粒５００ｘｙを５０％酢酸５
０ｘＱ／ ３．７５Ｍ尿素に溶解し、室温にて３時間か
き混ぜた。ＤＭＦ（Ｎ−ジメチルホルムアミド）中、Ｎ
Ｃ３（Ｎ−クロローサクシニミド）の１００ｍＭ溶液を
２、Ｏｌづつ３回、全反応時間１時間のうち２０分間お
きに加える。メチオニン（２００ｍＭ溶液９ ｍ（２）
を加え、反応を終了させた。
有させた。つまり、乾燥顆粒５００ｘｙを５０％酢酸５
０ｘＱ／ ３．７５Ｍ尿素に溶解し、室温にて３時間か
き混ぜた。ＤＭＦ（Ｎ−ジメチルホルムアミド）中、Ｎ
Ｃ３（Ｎ−クロローサクシニミド）の１００ｍＭ溶液を
２、Ｏｌづつ３回、全反応時間１時間のうち２０分間お
きに加える。メチオニン（２００ｍＭ溶液９ ｍ（２）
を加え、反応を終了させた。
サンプルを回転蒸発させ、上記に記載した様に分析した
。
。
開裂産物の分析
上記に記載したトリプトファン酸化的開裂反応によって
生じたＩＧＦＩＩ（ＳＳＯ，）、を、ＲＰＨＰＬＣおよ
びモノＳ陽イオン交換クロマトグラフィーにて分析した
。ＲＰ ＨＰＬＣシステムは、４５°Ｃにてゾルパック
ス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８１５０Ａ２重に末端−キャップ
した２５ｃｍｘＪｙｘカラム［デュボン（Ｄ ｕｐｏｎ
ｔ）、ウィルミ゛ントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔ。
生じたＩＧＦＩＩ（ＳＳＯ，）、を、ＲＰＨＰＬＣおよ
びモノＳ陽イオン交換クロマトグラフィーにて分析した
。ＲＰ ＨＰＬＣシステムは、４５°Ｃにてゾルパック
ス（Ｚｏｒｂａｘ）Ｃ８１５０Ａ２重に末端−キャップ
した２５ｃｍｘＪｙｘカラム［デュボン（Ｄ ｕｐｏｎ
ｔ）、ウィルミ゛ントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔ。
ｎ）、ＤＥ］を使用した。Ａ溶媒は、５０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓＨ３ＰＯ４（ＰＨ７−８）、およびＢ溶媒は５Ｏ
ｍＭＴｒｉｓ−ＨａＰＯａ（ｐＨ７，８）、５０％ＣＨ
，ＣＮとした。Ａ勾配を１好／分で３０分間をかけて２
５％Ｂから６５％Ｂまでとした。モノＳ分析カラムを、
ファルマシアのＬＣＣ５００ＦＰＬＣ上で操作した。Ａ
バッファーは、２０ｍＭクエン酸、７Ｍ尿素、ｐＨ３，
５、およびＢバッファーは、２０ＩＩＩＭクエン酸、７
Ｍ尿素、ｐＨ３，５１，０ＭＮａＣＮとした。勾配をｌ
ＩＩＱ１分で３０分間をかけて０％から４０％ Ｂま
でとした。
ｒｉｓＨ３ＰＯ４（ＰＨ７−８）、およびＢ溶媒は５Ｏ
ｍＭＴｒｉｓ−ＨａＰＯａ（ｐＨ７，８）、５０％ＣＨ
，ＣＮとした。Ａ勾配を１好／分で３０分間をかけて２
５％Ｂから６５％Ｂまでとした。モノＳ分析カラムを、
ファルマシアのＬＣＣ５００ＦＰＬＣ上で操作した。Ａ
バッファーは、２０ｍＭクエン酸、７Ｍ尿素、ｐＨ３，
５、およびＢバッファーは、２０ＩＩＩＭクエン酸、７
Ｍ尿素、ｐＨ３，５１，０ＭＮａＣＮとした。勾配をｌ
ＩＩＱ１分で３０分間をかけて０％から４０％ Ｂま
でとした。
ミーンズ（Ｍｅａｎｓ Ｇ、 Ｅ、）およびフィーニー
（Ｆｅｅｎｅｙ Ｒ，Ｅ、）、「プロティンの化学修飾
（ＣｈｅＩ＋１ｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ、２１８〜２１９頁（ホー
ルデンーデイ、インコーポレイテッド出版、１９７１年
）記載の方法で準備したＩＧＦＨのＳ−力ルボキシメチ
ル誘導体のアミノ酸分析を、システィン酸形成量を測定
するためにベックマン・６３００・ハイ・パフォーマン
ス令アミノ酸・アナライザー（高性能アミノ酸分析装置
）にて行った。
（Ｆｅｅｎｅｙ Ｒ，Ｅ、）、「プロティンの化学修飾
（ＣｈｅＩ＋１ｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）Ｊ、２１８〜２１９頁（ホー
ルデンーデイ、インコーポレイテッド出版、１９７１年
）記載の方法で準備したＩＧＦＨのＳ−力ルボキシメチ
ル誘導体のアミノ酸分析を、システィン酸形成量を測定
するためにベックマン・６３００・ハイ・パフォーマン
ス令アミノ酸・アナライザー（高性能アミノ酸分析装置
）にて行った。
第１図はプラスミドｐＫＣ２８３の制限（酵素切断部位
の）地図、 第２図はプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限地図、 第３図はプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限地図、 第４図はプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限地図、 第５図はプラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの制限地図、 第６図はプラスミドｐＬ３２の制限地図、第７図はプラ
スミドＩ）ＮＭ７８９の制限地図、第８図はプラスミド
ｐ１２０の構築プロトコールの模式図、 第９図はプラスミドｐＬ４７の制限地図、第１Ｏ図はプ
ラスミドｐＰＲ１２の制限地図、第１１図はプラスミド
ｐＰＲ１２ＡＲ１の制限地図、 第１２図はプラスミドｐＬ１１０のそれぞれ制限地図、 第１３図はプラスミド１）ＬＩＩＯＣの構築プロトコー
ルの模式図、 第１４図はプラスミドｐＨ８２４６の制限地図の模式図
を表す。 ＦＩＧ、１ ＫＣ２８３ 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理人弁理士青山 葆（外２名） ＦＩＧ、２ （〜６．１ ｋｂ） ＦＩＧ、４ （〜５．９ ｋｂ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ （〜４゜Ｏｋｂ） ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、８ （〜１．０ｋｂ） ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、９ ＯｅＩ ＦＩＧ、ｌｏ ＦｊＧ、Ｉ２ ＦＩＧ、１ｌ ＦＩＧ、Ｉ４ ＨＳ２４６ （〜６．Ｏｋｂ） 手続補正書 く方式〉 平成 ２年 ２、月２０日 平成 １年 特許願 第２５８９４１号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係
の）地図、 第２図はプラスミドｐＫＣ２８３ＰＸの制限地図、 第３図はプラスミドｐＫＣ２８３−Ｌの制限地図、 第４図はプラスミドｐＫＣ２８３−ＬＢの制限地図、 第５図はプラスミドｐＫＣ２８３ＰＲＳの制限地図、 第６図はプラスミドｐＬ３２の制限地図、第７図はプラ
スミドＩ）ＮＭ７８９の制限地図、第８図はプラスミド
ｐ１２０の構築プロトコールの模式図、 第９図はプラスミドｐＬ４７の制限地図、第１Ｏ図はプ
ラスミドｐＰＲ１２の制限地図、第１１図はプラスミド
ｐＰＲ１２ＡＲ１の制限地図、 第１２図はプラスミドｐＬ１１０のそれぞれ制限地図、 第１３図はプラスミド１）ＬＩＩＯＣの構築プロトコー
ルの模式図、 第１４図はプラスミドｐＨ８２４６の制限地図の模式図
を表す。 ＦＩＧ、１ ＫＣ２８３ 特許出願人 イーライ・リリー・アンド・カンパニー代
理人弁理士青山 葆（外２名） ＦＩＧ、２ （〜６．１ ｋｂ） ＦＩＧ、４ （〜５．９ ｋｂ） ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ （〜４゜Ｏｋｂ） ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、８ （〜１．０ｋｂ） ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、９ ＯｅＩ ＦＩＧ、ｌｏ ＦｊＧ、Ｉ２ ＦＩＧ、１ｌ ＦＩＧ、Ｉ４ ＨＳ２４６ （〜６．Ｏｋｂ） 手続補正書 く方式〉 平成 ２年 ２、月２０日 平成 １年 特許願 第２５８９４１号 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式：メチオニン−ｘ−ｘ’−タンパク質（式中、ｘ
およびｘ’はフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシ
ン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、スレオニ
ン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、ア
スパラギン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、
システイン、トリプトファン、アルギニン、およびグリ
シンからなる群から選択されるアミノ酸を表す） をコードしているＤＮＡ配列。 ２、タンパク質がＩＧＦII、ソマトスタチン、インシュ
リンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、ＩＧＦ I またはＧＲＦ
である請求項１記載のＤＮＡ配列。 ３、タンパク質がＩＧＦIIである請求項２記載のＤＮＡ
配列。 ４、ｘがアルギニンでｘ’がトリプトファンである請求
項１記載のＤＮＡ配列。 ５、ｘがセリンでｘ’がヒスチジンである請求項１記載
のＤＮＡ配列。 ６、ｘがリジンでｘ’がアラニンである請求項１記載の
ＤＮＡ配列。 ７、ｘがイソロイシンでｘ’がグルタミン酸である請求
項１記載のＤＮＡ配列。 ８、ｘがメチオニンでｘ’がグルタミンである請求項１
記載のＤＮＡ配列。 ９、ｘがイソロイシンでｘ’がトリプトファンである請
求項１記載のＤＮＡ配列。 １０、ｘがアスパラギンでｘ’がロイシンである請求項
１記載のＤＮＡ配列。 １１、ｘがアルギニンでｘ’がセリンである請求項１記
載のＤＮＡ配列。 １２、ｘがヒスチジンでｘ’がアラニンである請求項１
記載のＤＮＡ配列。 １３、ｘがアラニンでｘ’がリジンである請求項１記載
のＤＮＡ配列。 １４、ｘがチロシンでｘ’がアスパラギンである請求項
１記載のＤＮＡ配列。 １５、ｘがアルギニンでｘ’がアスパラギンである請求
項１記載のＤＮＡ配列。 １６、ｘがロイシンでｘ’がバリンである請求項１記載
のＤＮＡ配列。 １７、ｘがプロリンでｘ’がスレオニンである請求項１
記載のＤＮＡ配列。 １８、ｘがスレオニンでｘ’がアルギニンである請求項
１記載のＤＮＡ配列。 １９、組換えタンパク質の製造方法であって、ａ）式：
メチオニン−ｘ−ｘ’−タンパク質（式中、ｘおよびｘ
’はフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチ
オニン、バリン、セリン、プロリン、スレオニン、アラ
ニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギ
ン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイ
ン、トリプトファン、アルギニン、およびグリシンから
なる群から選択されるアミノ酸を表す） をコードしているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発
現ベクターで宿主細胞を形質転換し、ｂ）遺伝子発現に
適した条件下で形質転換細胞を培養することからなる方
法。 ２０、タンパク質がＩＧＦII、ソマトスタチン、インシ
ュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、ＩＧＦ I またはＧＲ
Ｆである請求項１９記載の方法。 ２１、式：メチオニン−ｘ−ｘ’−タンパク質（式中、
ｘおよびｘ’はフェニルアラニン、ロイシン、イソロイ
シン、メチオニン、バリン、セリン、プロリン、スレオ
ニン、アラニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、
アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸
、システイン、トリプトファン、アルギニン、およびグ
リシンからなる群から選択されるアミノ酸を表す） をコードしているＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮＡ発
現ベクター。 ２２、プラスミドである請求項２１記載のベクター。 ２３、プラスミドｐＨＳ２４６である請求項２２記載の
ベクター。 ２４、請求項２１、２２または２３記載のベクターを含
有する宿主細胞。 ２５、大腸菌である請求項２４記載の宿主細胞。 ２６、大腸菌に１２ＲＶ３０８である請求項２５記載の
宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US25221988A | 1988-09-30 | 1988-09-30 | |
| US252219 | 1988-09-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02219579A true JPH02219579A (ja) | 1990-09-03 |
Family
ID=22955101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1256941A Pending JPH02219579A (ja) | 1988-09-30 | 1989-09-29 | 低分子量組換えタンパク質を発現させるためのｄｎａ配列 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0361956A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02219579A (ja) |
| DK (1) | DK470689A (ja) |
| IL (1) | IL91771A0 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| IL97885A0 (en) * | 1990-04-24 | 1992-06-21 | Lilly Co Eli | Growth hormone releasing factor analogs |
| WO1993003152A1 (en) * | 1991-07-29 | 1993-02-18 | British Bio-Technology Limited | Igf-ii analogues |
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03503596A (ja) * | 1987-06-24 | 1991-08-15 | ノボ・ノルディスク エー／エス | 蛋白質若しくはポリペプチドの調製方法、該ポリペプチドをコードするｄｎａ配列、該ｄｎａ配列およびポリペプチドを有する微生物および該ポリペプチドの薬学的製剤としての利用 |
-
1989
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- 1989-09-25 IL IL91771A patent/IL91771A0/xx unknown
- 1989-09-29 JP JP1256941A patent/JPH02219579A/ja active Pending
- 1989-09-29 EP EP19890309969 patent/EP0361956A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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