JPH02176552A - Ｄｎａ塩基配列決定の方法と設備 - Google Patents

Ｄｎａ塩基配列決定の方法と設備

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JPH02176552A
JPH02176552A JP1243267A JP24326789A JPH02176552A JP H02176552 A JPH02176552 A JP H02176552A JP 1243267 A JP1243267 A JP 1243267A JP 24326789 A JP24326789 A JP 24326789A JP H02176552 A JPH02176552 A JP H02176552A
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dna
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Bertrand De Cosnac
ベルトラン　デ　コスナツク
Bertrand Grimm
ベルトラン　グリム
Serge Haan
スルジユ　アーン
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、有機分子複合体、と〈（核酸、蛋白質、ペプ
チド、ポリマーのような生体分子複合体のモチーフを同
定する方法と設備に関するもので、遺伝子工学、生物学
、薬物学の分野において実験と基礎研究の段階ならびに
工業段階で実施される。
本発明の方法は、アミノ酸、ヌクレオチド、原子グルー
プのつながりからなる分子すべてに、とりわけＤＮＡ　
（デオΦシリボ核酸）およびＲＮＡ　（りざ核酸）のよ
うな核酸に一般的に適用される。
ＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチＶの配列または順序の
同定は、配列決定（ａ５ｑｕｅｎｑａｇｅ　）と呼ばれ
ている。
核酸の配列決定は、分子生物学と生物工学の分野で現実
的な重要性をもつようになった。とぐに、ＤＮＡの配列
決定によって特殊な遺伝子のなかの動物、植物およびウ
ィルスのデノムが分析できる。
生体分子の機能はその構造によって規定されるから、遺
伝子構造の決定はこの情報基礎単位に可能な操作にとっ
てきわめて重要である。
ヌクレオチドは塩基、糖、ホスフェートによって構成さ
れていることを指摘しておこう。
核酸では、塩基はプリンまたはピリミジンの型の複素環
構造をもつ窒素塩基であり、全部で４箇である。糖は、
ＲＮＡではリボース、ＤＮＡではデオキシリざ−スであ
り、ホスフェートは燐酸である。
一般的には、利用される核酸のヌクレオチドが３燐酸で
処理されているのは、この型の分子が多数の生化学反応
、とぐにＤＮＡの重合にかかわる反応において酵素の働
きに必要なエネルギーを供給するからである。
ＲＮＡとＤＮＡ　Ｋは３つの共通塩基がある。すなわち
、プリン化合物のアデニン（Ａ）　、！ニゲアニン（Ｇ
）およびピリミジン化合物のシトシン（Ｃ）である。
別のピリジン型塩基は、ＤＮＡではチミン（Ｔ）、ＲＮ
Ａではウラシル（Ｕ）である。
ＤＮＡでは、関係する４１ｇのヌクレオチドはデオキシ
グアニン３燐酸すなわちｄＡＴＰ　、デオキシグアニン
３燐酸すなわちｄＧＴＰ　、デオキシシトシン３燐酸す
なわちｄｃＴＰおよびデオキシチミン３燐酸す彦わちｄ
’ｌ”ｒＰである。以下、これらはｄＸ’Ｉ’Ｆ’で表
わされ、そのＸはＡ、（）、ＣまたはＴとする。
ＤＮＡは、すべての生命有様体の構成エレメントである
蛋白質の製造に必要な完全な遺伝情報をもっている。と
ぐに、３塩基の各つながりは、蛋白質組成に入るアミノ
酸のコーＶ（運搬ＲＮＡに仲介される）である。配列決
定の目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡのストランＹ　（ｂｒ
ｉｎ　）を構成する塩基の順序を知ることである。
ＤＮＡ配列決定法には必ず次の５段階が含まれている。
すなわち、（ａ）ｒツム断片化、（ｂ）ヌクレオチド鎖
を形成するための配列決定化学反応、（Ｃ）ヌクレオチ
ド鎖のラベル化、（ｄ）ラベル化された鎖の分離、卦よ
び（ｅ）検出である。
段ｖ４ａ デノム、すなわちＤＮＡのセクター集合は多数の塩基対
から構成されている（酵母では１３　Ｘ　１０６、人で
は３Ｘ１０９）。デノムは、その長さのために、直接に
は配列決定反応の対象とならない。
ＤＮＡは、約１０００〜３００００塩基の断片に分割さ
れ、それはさらにクローニングで増殖させられる。この
断片化は、例えば、「分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃ　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉａｔｒｖ　）　Ｊ　１６３　＊　１−
８（１９８７）のＭｏｏｒｅｓ　Ｊ、Ｃ，論文’　Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ　Ａｐｐｒｏ−ａｃｈｅｓ　ｔｏ　ＤＮＡ　
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　（ＤＮＡ配列決への新アプロー
チ）＠で明らかにされているように、ＤＮＡをいくつか
の配列のレベルで切断する制限酵素の利用または超音波
の利用によって行うことができる。
段階す この段階は、ＤＮＡの４種の塩基に特定の４化学反応系
（５ｅｒｉｅｓ　）を段階へて見られた鎖に実施するこ
とである。これらの反応によってＤＡＨの４つの類ファ
ミリー（ｆａｍｉｌｉｅｓ　）がえられ、それらの１端
は普通は固定され、他端＃ｉ４つの反応系のそれぞれに
特定の塩基からなっている。
上述のＤＮＡの４鎖フアミリーを得るために通常２つの
方法が用いられている。マクサムトサルパートによって
発展させられた方法（Ｍａｘａｍ　Ａ、Ｍ。
＆　Ｇ１０）ｂｅｒｔ　Ｗ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、、　Ｕ、８．Ａ、。
Ｖｏｌ、７４＊４２．ＰＰ、５６０〜５６４ｏｆ１９７
７゜＠Ａ　ｎｅｗ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ　ＤＮＡ　（ＤＮＡ配列決定の新方法）１）
は鎖の化学的変質によるもので、サンが−によって始め
られた方法（８ａｕｇｅｔＦ、その他、Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、８．Ａ、。
７４　、　ＰＰ　−５４５３〜５４６７　ｏｆ　Ｄｅｃ
ｅｍｂｅｒｌ　９７７　ｅ　”　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉａａ−ｔｉ
ｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　（鎖終結の阻害剤による
ＤＮＡ配列決定）１）は酵素法で、ジデオキシ鎖の伸長
をおわらせる方法をとる。
サンが一法では、配列決定の４反応のそれぞれに、配列
決定すべき一本鎖ＤＮＡの多くのサンプルが用いられる
。すなわち、配列決定すべき１ｍ１ＮＡの１端の相補的
核酸であるプライマー　ｄＸＴＰ０４つのヌクレオチド
、配列決定すべきＤＮＡの相補的ストランドの製造（ヌ
クレオチＶから、そしてプライマーで始める）を可能に
する酵素、そして最後に、４つのジデオキシヌクレオチ
ドのうちでなだ１つ、ターミナル・ヌクレオチドと称さ
れ、ｄｄＸＴＰと書かれるものである。このｄｄＸＴＰ
はデオキシリボースの３位の炭素のＯＨ基を欠いている
。
プライマーは配列決定すべきＤＮＡに相補性によって結
合し、その後で酵素は相補的ストランドを、それが鎖伸
長を止めるｄｄＸＴＰを組込むまで合成する。ターミナ
ル・ヌクレオチドの組込みは合成中にいつでも起９うる
もので、このことは所与の塩基Ｘの特定の配列決定操作
の終りには、プライマーから約４００ヌクレオチドまで
の可能なすべての長さを含むＤＮＡファミリーが存在す
ることで示される。
４つのｄ、ｄＸＴＰに対して並列して実施される４反応
系によって４種のＤＮＡ鎖ファミリーの集合が導きださ
れるが、所与の塩基Ｘを代表する各ファミリーの鎖はそ
の後で電気泳動Ｃルのうえにおかれる。
マクサム・ザルバート法では、適切な寸法をもち、サン
が一法で見られるものに類似するＤＮＡ鎖は精製された
ＤＮＡの化学処理でつくられる。この作業によって、そ
１端で放射性ホスフェートによりラベル化された１本＠
またＦ１２本鎖のＤＮＡの配列決定ができる。
４つの配列決定反応系のそれぞれで、ＤＮＡは２つの化
学反応の作用をうける。第１の化学反応はその糖の塩基
を変性させ、引きだし、第２の反応はこうして露出させ
られ九糖を引きだすことによってＤＮＡを切断する。こ
うして固定部分に始まり既知の塩基に終る鎖がえられる
。反応条件は、典型的には１〜４００ヌクレオチドを含
むすべての長さの鎖をつくれるように調節される。
段階Ｃ 段階すで見られ鎖は、放射性ラベル（ｇＬｒｑ＋５ｕｒ
ｓ）によって事前に、または反応中にラベル化される。
用いられる放射性ラベルはβ−放射体である３２ｐまた
は３５Ｂ、）リチウム、１４Ｃである。
サンが一法にお込て、プライマー　ｄＸＴＰまたはｄｄ
ＸＴＰをラベル化することが可能である。
段階ｄ ラベル化されたＤＮＡ鎖は電動泳動により長さにしたが
って分離されるが、小さいほど速く、大きいほど遅く移
動する。−殻内にポリアクリルアミｒ−ビルである電気
泳＠ｐｙ’ルによってＮおよびＮ十１（Ｎは１〜約４０
０）の長さの分子が区別される。
電気泳動は、あとで乾燥されるデルの長さに応じて４〜
１２時間つづく。
段階θ それから、ビルはベータ放射に敏感なフィルムのうえに
）かれる。ＤＮＡ　＠内に組込まれた放射性ラベルは、
各電気泳動線（ｔｒａｃ６　）のオートラジオグラフィ
像を現わすのに利用される。オートラジオグラフィは、
放射への露出の１２時間以後に現像される。
４つの反応ファミリーに対応する４つのカラムのなかの
、オートラジオグラフィ像に現すれる帯域の位置比較に
よって出発ＩＭＪＡの塩基配列を決定できる。
オートラジオグラフィの読取り、検査および判定のあと
で、配列は次の分析と総合のためにコンピュータのメモ
リーに入れられる。
上述した２つのＤＮＡ配列決定法は広く用いられ、いず
れも多くの変糧をもっている。きわめて能力が高く、効
果があっても、これらの方法はとても不便で、きわめて
複雑な作業を要述する。それは現実においては雌しい大
仕事であって、データ・ソースと電気泳動移動比較が信
頼度の高いものとなるにはきわめてよく標準化されねば
ならない。
さらに、放射性鎖の電気泳動の読取＃）はオートラジオ
グラフィのあとでなされ、やはり完全な再現性がオート
ラジオグラムの現像においてもその読取りにおいても絶
対に必要とされている。
事実、放射性ビルの帯域のフィルム像は帯域自体よりも
大きくて、電気泳動の４つの異なるトラック（鎖の可動
性を不均一にすることがある）の帯域位置の比較は、オ
ートラジオグラム上で効果的ＩＣ＠察される解職を制限
し、これによって２ルから読める配列の長さを減少させ
ている。典型的には、２００〜４００の塩基が１セツト
の痕跡から読める。
さらに、ある線から他の線に突然現われる不規則性は現
在の画渫技術（例えば走査デンシトメータ）によるオー
トラジオグラム自動読取りを困難だしている。現在は、
コンぎユータより人間の目の／！９が不規則性をよく判
別できるからである。
それ故、オートラジオグラムの「手作、業」分析に注意
を集中する必要から時間がかかり、誤りが訃かされてい
る。
さらに、放射性ラベルの利用によって大変な不便さが操
作に（複雑な作業者保護システムと設備の定期的除染）
、分析中の生成物の貯蔵（、そして分析終了後の廃棄物
の貯蔵にたらされている。
最後に、実施中の作業を管理するために、電気泳動のあ
いだビルのなかの帯域を観察するのが不可能であるのに
、所定の時点で１気泳動を必ず停止させねばならず、配
列読取りをするまえにオートラジオグラムの現像をせね
ばならない。
それゆえ、すでに多くの方法が、電気泳動のあいだに移
動するＤＮＡ鎖のリアルタイム検出を目的としてき九。
そのいくつかの方法では例えば、３２Ｐでラベル化され
た鎖からのβ−放射の検出に、また他の方法はレーデ・
ビームによる螢光放射の検出に注意がはられれている。
最初の方法では、電気泳動中の放射性帯域のオンライン
（またはリアルタイム）検出は、実行すべき作業の数を
いくらか減少させることによってその方法全体をある糧
度単純化できる。しかし、３２ｐの短い半減期を、した
がって放射性ラベル化反応体の不安定性を考慮しなけれ
ばならない。そのうえ、サンが−またはマクサム・ギル
バートのより伝統的な方法におけると同様に、放射性生
成物の除去と取扱いてついての問題が残っている。
さらに、ディテクタの前を鎖が通過する時間がきわめて
減少するので、これは放射収集効率を低下させることに
なって、感度と解像度の問題が提起されることになる。
レーデ・ビームにより出される螢光放射の検出は、７ン
ソルジ（Ａｎｓｏｒｇｅ　）によって提案された（ＤＥ
−Ａ−３６１Ｂ　　６０５：ＴｈよびＪｏｕｒｎａ１ｏ
ｆ　Ｂｉｏｃｈａｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　＠１３（１９８６）、ｐｐ
、３１５〜３２３の論文“Ａｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔ
ｉｆ　　ａｕｔｏｍａｔｅｄ　　ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏ
ｒ　　ＤＮＡ５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ　（ＤｔＪＡ配列決定の非放射性自動化法）＠を
参照せよ）。この方法は、サンが一法の枠内でプライマ
ーのラベル化に発螢光団の入を用いている。
この場合には、前述のように、４つの配列決定反応系に
よって、電気泳動２ルの４並列トラックにおかれる４つ
のＤＮＡ鎖ファミリーかえられるが、デルはその巾（ｌ
ａｒｇｅｕｒ　）に応じてレーデ・ぎ−ムにより完全に
貫通される。デル内で、ラベル化されたＤＮＡ　ｇ［は
電気泳動中に、レーデ・ビーム内を通過する際に配列の
順に次々と励起される。
所与の反応ファミ’Ｊ−に関係する各電気泳動トラック
のために、螢光は適切な光学系によって集められ、フィ
ルターされたあとで光倍増管型のディテクタに導かれる
。
この技術によって与えられる利点は、４つの電気泳動ト
ラックでの連続検出を可能にする固定ディテクタによっ
て検出装置内には可動部分がまったく除かれていること
である。
しかし、発螢光団のみ利用することは１配列の検討のた
めに電気泳動デルに対する４つの並列トラックの必然的
利用と々す、これてよってその後の感度増大と単純化の
可能性が制限される。これは３２ｐでラベル化されたＤ
ＮＡ　ｔｌのリアルタイム検出についても同様である。
リアルタイム検出のこれらシステムではオた、あるトラ
ックと他のトラックでの電気泳動可動性の比較について
大きな信頼度が必要とされる。ところで、実際上は多く
の困難が経験されてむ９、とくにデル内での熱勾配の形
成と不純物の存在はデル内で鎖の局部ひずみを生じさせ
、これにより目的とする配列への塩基の帰属決定が直接
に妨げられてしまう。
他のリアルタイム検出方法では、各鎖ファミリーを個別
に同定するために多くの発螢光団の利用が提案されてい
る。この型の方法には、その構想において、配列決定反
応からえられるＤＮＡ鎖が同一の電気泳動トラックで分
離される可能性を与えるという利点がある。この方法の
システムでは４種の発螢光団からなる系列が用いられる
ので、これまで強調してきた種々の問題は解決されるよ
うに思われる。しかし、そのどのシステムに特定の作業
も問題を部分的にしか解決できていない。
第１のシステムは、サンが−の配列決定反応の枠内で、
スミス（Ｓｍ１ｔｈ　Ｌ、Ｍ、　）らによって提案され
た（ＰＲ−Ａ−２５５８２５２を参照せよ）。
この技術では、配列決定反応は、ブライマーに結合され
九異なる螢光ラベルをそれぞれが含む分離された４つの
管のなかで実施されねばなら彦い。
スミスらによって記述された検出装置は、各発螢光団か
らの特定の波長を選択するために狭帯域干渉フィルタ系
列を利用する。
比較的に単純々この技法に基づいているシステムには、
要するにいくつかの欠陥がある。とくに、きわめて異な
る電荷とサイズの螢光分子が大きな問題である。
この状況は、異ってラベル化された種々の鎖の電気泳動
可動性の違いに基く、電気泳動中の乱れ（ｐｅｒｔｕｒ
ｂａｔｉｏｎｓ　）の存在によって示される。実際に、
データの処理・修正の大規模かつかなり複雑表ン７トウ
エアをともなう改良にもかかわらず、この現象は電気泳
動中の鎖のいくつかの重なりを、さらには逆位（１ｎｖ
ｅｒｓｉｏｎｓ　）すらもたらして１配列によるいくつ
かの塩基の同定を妨げ、またはゆがめている。
さらに、この技術はラベル化された特定の４種のプライ
マーの利用を必ず要求している。このことによって、他
のベクター（ｖｅｃｔｅｕｒｓ　）が用いられている場
合には、４つの新しい螢光プライマーを合成、精製する
長くて複雑な工程を組む必要性がでてくる。
プＣ！パー（Ｐｒｏｂｅｒ　Ｊ、Ｍ、　）らによって提
案された第２のシステム（Ｅ　Ｐ　−Ａ　−０２５２６
８３を参照）は、や＃ｉｏサンが一反応法の枠内で、４
つのｄｄＸＴＰと結ばれた４つの発螢光団の利用に基づ
いている。ｄｄＴＸＰの異なるラベル化はいくつかの利
点をも念らす。とくに、配列決定の４反応を同一の管で
行えること、そこにはラベル化されていない１つのプラ
イマーが利用できること、反応生成物を同一の電気泳動
カラムのなかで分離できることがあげられる。
しかし、ｄｄＸＴＰにかなり複雑できわめてかさのある
分子である外的ラベル、すなわち発螢光団を結合する（
　ｇｒｅｆｆｏｒ　）ことにより、電気泳動中のいくつ
かの鎖の可動性に予測できない偏移（ｄ４ｃａ−１ａｇ
ｅｓ　）がもたらされ、とくに相補性酵素の選択がひど
く制限される。それで、プライマーとして通常の酵素、
例えばポリメラーゼＤＮＡ　＋２）　ＫｌθｎＯ！断片
を利用する可能性が排除されている。利用される発螢光
団は一般的にフルオレセインの誘導体である。
したがって、本発明は、上述された不便さの大部分をも
たないＤＮＡ配列決定法を目的としている。
同種の問題が他のすべての核酸、とくにＭＡでの配列決
定にはみられるから、本発明はまた、他のすべての分子
複合体（蛋白質またはペプチド）に適用される。
本発明はある核酸の塩基の配列を決定する方法を目的と
し、その方法は下記の段階を本質的に含むことを特徴と
する： Ａ）核酸断片の製造、 Ｂ）それぞれが１端に特定の塩基をもつ、異なったサイ
ズの鎖ファミリーを形成するための塩基の特定の化学反
応、 Ｃ）安定した同位体または小分子による、前記鎖ファミ
リーの特定のラベル化シよび６鎖の各ヌクレオチドのラ
ベル化、 Ｄ）原子化・イオン化手段中へのラベル化された鎖の１
つずつの導入、 Ｅ）前記手段によるラベル化された６鎖の原子化とイオ
ン化、 Ｆ）質量分析による、形成されたイオンのリアルタイム
での選択・検出、そして Ｇ）検出された各イオンでラベル化されたヌクレオチド
を計数して６鎖の長さを測定するため、そして各鎖ファ
ミＩＪ−の特定のラベル化を同定するための質量分析か
ら出される信号の処理。
リアルタイム機能は、本発明では、イオンが形成される
につれて検出されるという事実に関連している。
ラベル化された鎖のイオン化、そして質量分析計による
これら鎖の検出により、ラベル化された鎖の検出、シ念
がって核酸の塩基の同定はいちしるしく容易になってい
る。
本発明による方法はＴ）ＮＡ配列決定に全くうまく適用
される。
この配列決定法は連続して機能し、従来法によるラジオ
グラフィ段階も電気泳動段階も含んでい々い。さら【、
ラベル化されたヌクレオチドの鎖は、従来法のようにま
とめてではなく、１つずつ検査、分析される。
本発明によれば、６鎖のヌクレオチｙすべてのラベル化
が行われる。各ヌクレオチドのラベルの検出は鎖の長さ
についての情報を与え、特定のうベル化の検出は鎖ファ
ミリーについての情報を与える。
最後に、イオン化と質量分析は種々のヌクレオチドに内
的または外的に結びつけられるラベルの利用を可能にし
ているので、きわめて普及している、種々の化学的配列
決定法、とくにサンが一法とその変種にこの方法を適用
できることになる。
有利なことには、各鎖系列の特定のラベル化および／ま
たは６鎖のすべてのヌクレオチドのラベル化は安定した
同位体ま念は小分子により行われる。
小分子については、例えばＴｅ　ｔｒａｈｅｄｒｏｎ論
文（ｖｏｌ、２６．／１６４０．ＰＰ、４９１５〜４９
１８゜Ｃ１９８５）　、　Ｐｅ１ｎＣ，Ｄ、、　Ｃｅｃ
ｈ　Ｄ、　）にのべられている技術を用いて、ＣＦ２．
５ｉ（ＣＨ３）３のよう低１つは有する化学化合物を含
まなければならない。
本発明による方法は、安定し−た、すなわち非放射性の
、したがって作業者に危険のない同位体または小分子を
３つ、４つまたはそれ以上利用するために、同定方法へ
の人間の関与をｂちしるしく容易にしている。
本発明はまた、下記のものを本質的に含む、核酸の塩基
を決定するための設備を目的としている：−各塩基ファ
ミリーが特定的にラベル化され６鎖のヌクレオチげがラ
ベル化されており、かつこれらのラベル化が安定した同
位体または小分子でなされている、異なる長さの塩基鎖
ファミリーのソース、 −ラベル化された６鎖の原子化手段、 一原子化手段中にラベル化された鎖を１つずつ導入する
手段、 一個別化され原子化された鎖のイオン化手段、−形成さ
れたイオンを選択・検出する之めに多くのディテクタを
備えた質量分析計、ならびに−検出され之各イオンによ
るラベル化されたヌクレオチドの計数により６鎖の長さ
を測定し、各鎖ファミリーの特定のラベル化を同定する
ためて、ディテクタから与えられる信号を処理する手段
。
すでに上述し念ように、本発明ＶｉＩＭＪＡや’ＲＮＡ
以外にすべての分子複合体に適用される。それゆえ、本
発明は、下記の段階を本質的に含む、有機分子複合体ま
たはその断片のモチーフを同定する方法をも目的として
いるニ ー前記モチーフの特定のラベル化、 一原子化・イオン化手段へのラベル化されたモチーフの
１つずつの導入、 一前記手段による、ラベル化された各モチーフの原子化
とイオン化、 一質量分析計による、形成されたイオンのリアルタイム
検出、および −ラベル化されたモチーフの計数により蛋白質の長さを
測定し、モチーフの特定のラベル化を同定するために、
質量分析からえられる信号の処理。
本発明の他の特性と利点は、付属する図に限定されない
が、以下の図示から明らかにされる：−本発明による自
動化されたＤＮＡ配列決定の段階の全系統を表わす第１
図、 一本発明によるＤＮＡ配列決定のための自動化設備の全
系統を表わす第２図、 一本発明によるＤＮＡ配列決定によってえられるデータ
の型を表わす第３図。
上述したように、本発明はすべての核酸（例えばＲＮＡ
　）　、さらにはすべての有機分子複合体（蛋白質、ペ
プチｒ）に適用されるのだが、以下の説明ではＤＮＡの
配列決定が扱われている。
本方法の第１段階（第１図参照）は、引用された従来法
によりＤＮＡ　ｒツムの断片化を行う（段階ａ）。この
断片化段階は第１図で番号２をつけられている。
見られた鎖はサンが一法による配列決定反応（段階ｂ）
Ｋかけられるが、必要な場合圧は各鎖ファミリーの検出
に十分な信号強度を与えるためにそのスケール（６ｃｈ
ｅｌｌｅ　）　Ｆｉ増大されつる。放射ラベル化された
ヌクレオチドはこれらの配列決定反応では全く必要とさ
れない。配列決定反応は第１図上ではブロック４の記号
をつけられている。
本発明によれば、配列決定すべきＤＮＡ断片の相補的ヌ
クレオチド鎖の合成中にサンが一法によって組込まれる
ヌクレオチドすべてはラベル化されているか、または質
量分析で同定できる特性をもっている。さらに、配列決
定反応からえられる各鎖ファミリーの特定のラベル化が
行われることになっている。
ブロック６の記号をつけられているヌクレオチド鎖配列
決定は、６鎖の各ヌクレオチドならびにこれら鎖のター
ミナル塩基として働く鎖端を特定的にラベル化する之め
に、安定した同位体または同位体結合物（この結合物の
同位体は安定した小分子の成分とな９うる）を利用して
実現されうる。
鎖ファミリーの特定のラベル化は、プライマーに対して
（文献ＦＲ−Ａ−２５５８２６２）、ま九はジデオキシ
ヌクレオチドに対して（文献Ｅｐ−Ａ−ｏ　　２５２　
６８３）実施できるが、安定した同位体または小分子が
利用されている。
二重ラベル化システムによって、配列決定反応から出る
ＤＮＡの６鎖は二重情報をもっている。すなわち、１）
ラベル数、したがって６鎖を構成するヌクレオチドの数
の検出により与えられる鎖のサイズについての情報（こ
れまでは電気泳動によってなされていた〔段階ｄ：］）
、２）ファミリーの特定の安定したラベルの検出により
えられる、鎖の１端に存在するヌクレオチド１すなわち
塩基の型についての情報（これまで発螢光団ま念は放射
性同位体によってなされていた〔段階ｃ〕）である。
本発明によるＤＮＡ鎖の同位体ラベル化は、ヌクレオチ
Ｖを構成する６化学化合物の１つ、すなわち塩基、糖ま
たは３燐酸グループに対して、場合によっては第１の燐
に結合した酸素原子が硫黄原子で置換されているアルフ
ァチオ燐酸化したグループに対して行われる。
鎖のラベル化は、ヌクレオチＶの３化合物構造に含まれ
ている炭素、水素、窒素、酸素、または硫黄に対して内
的に行うことができる。本発明による、安定した自然同
位体の利用では、種々のヌクレオチド化合物構造に入れ
られうる、一般に使用されている放射性同位体（３２ｐ
　、　３５Ｓ、　１４ｃ。
３Ｈ）よりも広い選択ができる。
相対的な自然リツチネスを付記した安定同位体のリスト
が第１表である。
第１表：ヌクレオチド化合物の内的ラベル化のための安
定自然同位体 同位体　　　相対的リツチネス優） Ｄ　　　　　　　　　Ｏ，０１５ １３ｃ　　　　　　　　１．１０ １５ＮＯ１３７ １７００，０３８ １”ｏ　　　　　　　　Ｏ，２０ ３２ｓ　　　　　　　９５．０２ ”ｓ　　　　　　　　Ｏ，７５ ３４ｓ　　　　　　　　４．２１ ”８　　　　　　　０．０２ 化学的な観点からは、安定同位体ま念は放射性同位体を
組込むための反応は同一である。
安定同位体による生体分子ラベル化の種々の方法があり
、広く普及している（　ｐｅｔｒｅａｎｕ　Ｅ、。
Ｃｏｈｅｎ　Ｊ、Ｓ、およびＳａｍｕｅｌ　Ｄ、の論文
”　Ｔｈｅ　ｐｒｅｐａ−ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｕｒｉｎ
ｓ、　ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ、　ｎｕｃ１６ｏｔｉｄ
ｅｓ　ａｎｄｒｅｌａｔｅｄ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　１
ａｂｅｌｌｅｄ　ｗｉｔｈ　１７０　ａｎｄ　ｏｔｈｅ
ｒｓｔａｂｌｅ　１ｓｏｔｏｐｅｓ　（１７０その他の
安定同位体でラベル化されたプリン、ピリミジン、ヌク
レオチドおよび関連化合物の製造）′、第２回ラベル化
化合物製造・貯蔵国際会議記録、ｐｐ、　４８９〜４９
７を参照）。ラベル化された種々の分子、とくにヌクレ
オチ「は合成法または酵素法によって製造される。とく
に、安定同位体でラベル化された多数のヌクレオチド化
合物が市場で入手でき、本発明により生物学と薬物学で
種々に適用できる（例えば、論文”　Ｄｅｈａｌｏｇｅ
ｎａｔｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｆａｓｔａ
ｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｅｓ−ｓｐｅｃ
ｔｒｏｍｅｔｒｙ　（高速原子衝撃質量分析でのデハロ
ジエネーション反応）°、ＡｎａＬ　　Ｃｈｅｍ、、１
　９Ｂ４．５６．１　９７５−　７７を参照）。
自然同位体によりラベル化されたヌクレオチドの例が付
Ｆｆ４Ｉと■に示されている。
これらの例は、本発明に利用しうるラベル化手段を図示
するためだけのものである。
付Ｗａｒと■に示したデータのように、ラベル化け、各
ヌクレオチドのラベル化のためにはデオキシ６燐酸の形
態（付属■）およびそれに類似のアルファチ第３燐酸（
付属■）に対し実施されうるし、ファミ’）−の特定の
ラベル化のためにはジデオキシ３燐酸の形態（付属Ｉ）
およびそれて類似のアルファチ第３燐酸（付属ＩＩ）に
対して実施されつる。
サンが一法反応からえられる鎖のサイｔについての情報
のために内的に利用できる他のラベル化されたヌクレオ
チドとして、１または３−　”ＮｄＡＷ。
ｃｆ　−１８０ｄＣＴＰ　、　４−１８０ｄＴＴＰ　、
　２−１３ＣｄＡＴＰｉ　　ｆｃ　は　ｄＣ’ＴＰ　　
、　　８−　１３　ＣｄＡＴＰ　　、　　５’−”Ｃｄ
ＡＴＰ　　。
α−３ｄＡＴＰ　、α−３ｄＣ）ＴＰ　、α−８ｄＣ’
ｌ’Ｐ　、α−８ｄＴＴＰ（それらでＳは同位体３２，
３４．３３または：６６　）＊　ｍｅｔｙｌ”　ｃｄｒ
Ｔｐをあげることができる。
本発明によれば、６鎖のヌクレオチｖ５　これら鎖のジ
デオキシヌクレオチＶまたはプライマーの外的ラベル化
を行うことも可能である。この型のラベル化は、これら
の分子に自然には存在してぃない原子（単原子または多
原子の形態）をヌクレオチＶに結合できるという利点を
もっている。これらのラベルは、アルカリ、アルカリ土
類またはハロビンの元軍または小分子複合体から構成さ
れている。
配列決定文７ＫＬ−いて、本発明による外的ラベル化で
は、従来法での相対的に複雑な特定のアームによっての
み結びつきうる発色団ま之は発螢光団のような大分子の
付加とちがって、ヌクレオチドの物理的化学的性質をそ
こなう危険がより少い。
したがって、本発明による元素ま念は小分子複合体は、
各ヌクレオチドの塩基または糖のなかで見られる等個結
合を用いて、ヌクレオチドに直接に結合できる（例えば
最後に引用したＡｎａｌ、　Ｃｈｅｍ。
論文を参照）。
本発ＦＩＡによる外的ラベル化の例は付属■に示されて
ｈる。これらは外的にラベル化されたＲＮＡとＤＮＡの
ヌクレオチＶ塩基の完全なセットになっている。とぐに
、Ｘは弗素、塩素、臭素または沃素を表わしている。
本発明［利用できるハロ２ンによってラベル化されたヌ
クレオチドとして、Ｑ　−ｂｒｏｍｏ　ｄＧＴＰ　。
５−　ｂｒｏｍｏ　ｄｃＴＰ　、　３’　−ｂｒｏｍｏ
　、　ｃｈｌｏｒｏまたは工ｏｄｏ　ｄＴＴＰ　、　５
−　ｂｒｏｍｏ　、　１ｏｄｏまたＪｄ　ｆｌｕｏｒ。
ｄＴＴＰ　、　３’　−Ｆｄ（）ＴＰをあげることがで
きる。
種々の外的ラベルとな−りうる多（の安定同位体（例え
ばハロｒン元素）の存在を考えれば、同位体によるヌク
レオチドのラベル化の可能性は大いに増大している。
ハロＣン元素の種々の安定同位体がその相対的自然リツ
チネスとともに第２表に示されている。
第２表：外的ラベル化のためのハロＣン元素の安定自然
同位体 同位体　　　相対的リッチネス（壬） １９Ｆ　　　　　　　　１００ ”’Ｃ１７５，７７ ３７Ｃ１２４，２３ ７９Ｂｒ　　　　　　　　５０．６９ ｓＩＢｒ　　　　　　　　４９−３１ １２’Ｆｘ　　　　　　　１００ 本発明によれば、配列決定反応からえられる６鎖のヌク
レオチド（サイズ情報）、これら鎖のジデオキシヌクレ
オチドおよびプライマー（ファミリー情報）のマルチプ
ル・ラベル化ヲ行うことができて、そのラベル化は内的
および／または外的である。
初めに、所与のヌクレオチドに対して多くの同型のラベ
ル同位体を組込む可能性を指摘できる。
この型のラベル化されたヌクレオチドとして、例えば１
．３−１５ＮｄＡＴＰ　、　１．３−１５ＮｄＣＴＰ　
、　２．８−ｄｉｃｈｌｏｒｏまたはｄｉｂｒｏｍｏま
たはｄｉｆｌｕｏｒｏ　ｄＡＴＰ　。
５．５−　ｄｉｂｒｏｍｏ　ｄｃＴＰをあげることがで
きるので、ヌクレオチド鎖の検出・同定の際の感度をそ
れだけ増加できる。
第２に、多くの異なるラベルが同一のヌクレオチドにそ
の特性の明確化の念めに組込める。そのうえ、多くのラ
ベルの同時検出によって可能なラベル組合せがいちじる
しく増加する。
次の例は、３つの型の安定同位体ラベルで４つの異なる
ヌクレオチドを同定できることを示している。
Ｌ３Ｃ単独　　　Ａ型ヌクレオチド １３ｃ　　　　　＋ｌフＯＧ １３ｃ　　＋　１５Ｎ　　　　Ｃ １５Ｎ　　　　　＋ｌフＯ’ｒ こうして、安定同位体によるヌクレオチドの内的および
外的のラベル化は組合わされて、多数で多様な現実的可
能性を与えてくれる。
この配列決定法は、可能性においてより制限をうけざる
をえない、従来法の放射性同位体による配列決定または
発螢光団による配列決定よりも順応性があり、進んだ面
に富んでいる。そのうえ、従来法の操作と利用に際して
の不便さの大部分が避けられているのみならず完全に排
除されている。
さて、ラベル化されたＤＮＡ鎖は、イオン・ソースへの
個別導入に適切なサンプル・ソース８のなかにおかれる
。この段階は、多くとも１箇のラベル化された分子しか
含まない微小滴を形成することにより実現される。
次に、この微小滴は、原子化とイオン化を目的とするイ
オン・ソースに１滴ずつつぎつぎと導入される。この段
階は第１図で記号１０をつけられ、段階りとＥに対応す
る。
そこで、ラベル化された６鎖に対して形成されるイオン
は、１２に示されているように、質量分析により選択、
検出され、質量分析から出る信号は、１４に示されてい
るように、出発ＤＮＡを再構成する目的で処理される（
段階Ｇ）。
本発明により、自動化ＤＮＡ配列決定を可能てする設備
は第２図に図式化されて込る。
２ツム断片化、配列決定化学反応および配列決定は時間
的に分畦または独立して行われるので、第２図には表わ
されていない。
図示された設備は、本発明により安定同位体でラベル化
されたＩ）ＮＡ鎖のソース１８を備え、このソースは高
圧下にあって、緩衝溶液で約１０−４１０−４Ｏ／　ｔ
にうすめられたラベル化されたＤＮＡ鎖のサンプル２２
を入れる容器２０を含んでいる。
サンプル２２中に入れられている約１０ミクロンの直径
の毛細管２４はラベル化されたＤＮＡ鎖を１つずつイオ
ン・ソース２６に導入する。圧電気結晶２８は、管２４
の流れから直径数マイクロメータの微小滴に均質分別し
、噴霧する。
それから微小１ＩＩｈ、高周波ジエナレータ３４に接続
されている電磁コイル３３のついたプラズマ・ソース３
２に１つずつ導入される。７０００〜８０００°Ｋに達
するプラズマ最高温・戸−ン３２ａで、ＤＮＡ分子は原
子化され、イオン化される。
プラズマ・トーチが本発明によるイオン化の望ましいソ
ースであるのは、それによって分子の完全な原子化が可
能であり、単純元素の分析のあとで見られる質量スペク
トルが最大限に単純化されるからである。
その後、形成されたイオンは、−次および二次ポンプ３
９によって、デイ７エレンシアル真空がつくられる磁気
セクター型でありうる質量分析計３８の入口光学系３６
に入る。イオン光学系３６のレベルでの圧力は１０−４
　トール（１０−２Ｐａ　）程度、質量分析計の磁極片
４０のレベルでの圧力は１０−６　）−ル（１０−’　
Ｐａ　）程度である。
質量分析計３８の第１の役割は、すでに利用された同位
体トレーサによって見られた特定の質量の存在を、その
イオン光学系３６と磁極片４０によって選択、同定する
ことである。質量分析計３８は選択モードで動作できる
が、その目的Ｖｉ最大限の感度をうるために、同位体ラ
ベルの存在によって特徴づけられる質量だけを走査する
ことである。
質量分析による検出で、断片ソース１８から出た直後の
ラベル化されたＤＮＡ鎖の検出、特定ラベルによる対応
するファミリーの同定、そしてヌクレオチ「計数による
サイズの測定を同時に行うことができる。
ついで、質量分析計でイオン化され、選択された分子は
、質量分析計３８の出口におかれていて、個々のイオン
の衝繋に敏感な電子増倍器型ディテクタ４２の系列によ
って検出される。それゆえ、選択されたイオンは個別に
検出されて、これにより配列決定設備全体が最大限に感
度を発揮できる。
その後、各ディテクタ４２によってえられた計数信号は
ＰＣ型マイクロコンピュータ４６に入るが、ここでは設
備の種々のユニツ）（１８、２６。
３８沖操作、データの処理と表示がほとんど自動的に同
時コントロールされる。
ラベル化された６鎖について、質量分析によるその同定
である事象は、１）鎖ファミリーを特徴づけるラベル、
２）鎖の各ヌクレオチドに結合された他のラベルの数を
同時検出できることによって特徴づけられる。この数は
、鎖を構成するヌクレオチドの数に、したがってその長
さに直接に関係している（例えば、ヌクレオチドの数だ
けのラベル）。
しばらくたつと、多数の鎖が１つずつ検出ユニット内を
通過してしまう。そこで、第３図に示されたような図式
をうるための統計が作成される。
第３図の図式は仮定のＤＮＡのＴ（）ＡＣＴＧＣ’ＡＣ
ＧＴＡに対応するものである。
そこにはあるファミリー（例えばジデオキシでの）の安
定した特定のラベルの存在に関連づけられる事象の数は
縦座標に記されている。アデニンでおわる鎖には同位体
１（ファミリーＡ）、グアニンでおわる鎖には同位体２
（ファミリーＧ）、シトシンでおわる鎖には同位体３（
ファミリーＣ）およびチミンでおわる鎖には同位体４（
ファミリーＴ）がある。縦座標の単位は任意にとられて
いる。
ヌクレオチドと結合していて、事象の際に同時に検出さ
れる安定ラベルの数が横座標に記されている。この数は
、検出システム中で検出される鎖を構成するヌクレオチ
ドの数（ｎ、ｎ＋１．ｎ＋２・・・・・・このｎ　ｔｉ
１〜約１〜０）に直接関連（比例すら）している。
それゆえ、４つの型のファミＩ７−について作成された
図式は出発ＤＮＡの配列の全体を決定するのに必要な情
報を与えている。
以下には、仮定のＤＮＡである’ｒＧＡＣＴＧＣＡＡＣ
Ｃ）ＴＡの種々の鎖の配列決定の３例が図示されている
。
サンが一法による配列決定反応中に、存在するすべての
自由スクレオチＶ（デオキシおよびジデオキシ）はラベ
ル化されている。合成されたアームにそれらが組込まれ
ると、次の式の鎖ができるニラベル ラベル化された ラベル化された デオキシヌクレオチド（Ｘ） 、、１ Ｑ）　−−１ 上述した本発明の詳細な説明によって、ＲＮＡまたはそ
の他の型の有機分子複合体が本発明による方法および設
備によって分析されることは明瞭である。
例えば蛋白質の各アミノ酸、より特定的にはそれらのう
ちのいくつかをラベル化することにより、本発明によっ
て、ラベル原子を計数すること、それから特定的にラベ
ル化されていた蛋白質のアミノ酸の数、ならびにアミノ
酸の数を推定することができる。アミノ酸のすべての型
に対して本操作をモディファイすることによって、蛋白
質のアミノ酸での組成を決定できる。
同様にして、断片のヌクレオチドの数にひとしいラベル
数を計測することによって、ＤＮＡおよびＲ？ＪＡの制
限断片の長さを決定できる。
付 属 α−１フ０ （ｄ）ｄＡＴＰ ４−１８０　（ｄ）ｄＴＴＰ Ｂ−１３（Ｈ （ａ）ｄＧＴＰ −ＸＩＳＮ （ｃｌ）　ｄｃ’ｒＰ Ｒ−ＯＨ４ｄＸＴＰ Ｒ−Ｈ４１０）ｄＸＴＰ 付 属 ■ 付 属 ■ アデニン ウ ラシル ａｌｐｈａ　−ｔｈｉｏ（ｄ）　ｄＮＴＰＢ−３２８、
３５６、３４８、３６Ｂ Ｒ−０）１４　（ＩＸ’Ｉ’Ｐ Ｒ冨 Ｈ４ｄ（ｉＸＴＰ グアニン シ ドシン
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明による自動化されたＤＮＡ配列決定の
段階の全系統を表わす。 第２図は、本発明によるＤＮＡ配列決定のための自動化
設備の全系統を表わす。 第３図は、本発明によるＤＮＡ配列決定によって見られ
るデータの型を表わす。

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）下記の段階を本質的に含むことを特徴とする、核
    酸の塩基配列の決定法： Ａ）核酸断片の製造（２）、 Ｂ）各ファミリーが１端に特定の塩基を有する、種々の
    サイズの鎖のファミリーを形成するための塩基の特定の
    化学反応（４）、 Ｃ）安定した同位体または小分子による前記の鎖ファミ
    リーの特定のラベル化および各鎖の各ヌクレオチドのラ
    ベル化（６）、 Ｄ）原子化とイオン化の手段（２６，２８，３０，３２
    ）へのラベル化された鎖の１つずつの導入（２４）、 Ｅ）前記手段による、ラベル化された各鎖の原子化およ
    びイオン化、 Ｆ）質量分析法による、形成されたイオンの、リアルタ
    イムでの選択および検出（１２）、ならびにＧ）検出さ
    れた各イオンによりラベル化されたヌクレオチドの計数
    して各鎖の長さを測定し、かつ各鎖ファミリーの特定の
    ラベル化を同定することを目的とする、質量分析から出
    る信号の処理（１４）。
  2. （２）ラベル化をＤ，＾１＾３Ｃ，＾１＾５Ｎ，＾１＾
    ７Ｏ，＾１＾８Ｏ，＾３＾２Ｓ，＾３＾３Ｓ，＾３＾４
    Ｓおよび＾３＾６Ｓから選ばれる少くとも１つの同位体
    を用いて内的に行うことを特徴とする、前記第１項記載
    の方法。
  3. （３）ラベル化が＾１＾９Ｆ，＾３＾５Ｃｌ，＾３＾７
    Ｃｌ，＾７＾９Ｂｒ，＾８＾１Ｂｒおよび＾１＾２＾７
    Ｉから選ばれる少くとも１つの同位体を用いて外的に行
    うことを特徴とする、前記第１項記載の方法。
  4. （４）核酸がＤＮＡであることを特徴とする、前記第１
    項記載の方法。
  5. （５）段階Ｂ）が前記核酸の断片からの相補的ヌクレオ
    チド鎖の合成（プライマーにはじまり、前述の鎖がジデ
    オキシヌクレオチドを組込むまで）であることを特徴と
    する前記第１項記載の方法。
  6. （６）ラベル化がジデオキシヌクレオチドの塩基、糖、
    ３燐酸（ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびプライマー
    から選ばれる１エレメントに対して行われることを特徴
    とする、前記第５項記載の方法。
  7. （７）各鎖の合成中に組込まれる各ヌクレオチドがラベ
    ル化されていることを特徴とする、前記第５項記載の方
    法。
  8. （８）下記のものを本質的に含む、核酸の塩基を同定す
    るための設備： −各塩基ファミリーは特定的にラベル化されており、各
    鎖のヌクレオチドもラベル化されている（いずれのラベ
    ル化も安定した同位体または小分子によつてなされる）
    、種々の長さの塩基の鎖ファミリー・ソース（１８）、 −ラベル化された鎖を１つずつ原子化手段に導入するた
    めの手段（２２，２４）、 −ラベル化された各鎖を原子化する手段（２６，２８，
    ３０）、 −個別化され、原子化された鎖をイオン化する手段（３
    ２）、 −形成されたイオンを選択、検出するための多くのディ
    テクタ（４２）をそなえた質量分析計（３８）、および −検出された各イオンによる、ラベル化されたヌクレオ
    チドの計数によつて各鎖の長さを測定し、各鎖ファミリ
    ーの特定のラベル化を同定することを目的とする、ディ
    テクタ（４２）からえられる信号を処理する手段（４６
    ）。
  9. （９）イオン化の手段がプラズマ・トーチ（３２）をも
    つことを特徴とする、前記第８項記載の設備。
  10. （１０）下記の段階を本質的に含む、有機分子複合体ま
    たはその分子の断片のモチーフ（ｍｏｔｉｆ）同定する
    方法： −安定した同位体または小分子による、前記モチーフの
    特定のラベル化（６）、 −原子化とイオン化の手段（２６，２８，３０，３２）
    にラベル化されたモチーフを１つずつ導入すること、 −前記手段による、ラベル化された各モチーフの原子化
    およびイオン化（１０）、 −質量分析による、形成されたイオンのリアルタイム検
    出（１２）、および −ラベル化されたモチーフの計数により蛋白質の長さを
    測定し、それらの特定のラベル化を同定することを目的
    とする、質量分析から出る信号の処理（１４）。
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