JPH02112752A - 使い捨て要素、分析機器及び液体試料中の生物細胞を測定する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物試料の電気化学的測定を行うための分析
機器に関し、特に、こうした分析機器に用いられる電極
に関するものである。

（従来の技術） 微生物活性の正確、迅速な測定が、汚染制御、食品、飲
料及び薬品工業での品質保証、及び体液やその他の医療
サンプルの臨床測定を含む多くの分野で必要とされる。

長い間バクテリアを計量するための標準法は、寒天平板
カウント法であった。この方法は多くの不利益、特に結
果を得るまでに時間がかかるという不利益を有する。最
も生長が早い場合でも、形成されたコロニーが可視とな
るのに１８時間は必要であり、次いでこれらのコロニー
をカウントする作業がある。

生物電気化学電池又は燃料電池を微生物試料の測定のた
めに採用することが提案されている。例えば、微生物の
呼吸感知に基づいて生菌数をアンペロメトリー測定する
ことが［アプライド　マイクロ　バイオロジカル　バイ
オテクノロジー（Ａｐｐｌ。

Ｍ＋ｃｒｏｂ＋ｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）　　（１
９８１）１２．９７Ｊに記載されている：バクテリアを
迅速に計量するのに微生物燃料電池を用いることは、’
（Ａｐｐｌ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＥｌ＋ｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ）　（１９８８）　２８．２６Ｊに記載がある：バ
クテリアを迅速に定量し、探知する単純なアンペロメト
リー電極システムの実験は「ジャーナルオブ　アプライ
ド　バクテリオロジ−（Ｊ　ＡｐｐｌＢａｃｔｅｒｉｏ
ｌ）　（１９８９）６６、４９Ｊに記載されている。

アンペロメトリー　バイオアッセイ　システムの他の面
については、他の例の中でも、欧州特許第１９０４７０
号、第２３８３２２号、イギリス国特許第２１８１４５
１号及び２１８１５５８号に記載がある。これらのシス
テムのうち幾つかは、測定が完了する前に電極で微生物
細胞を捕捉するフィルターを採用する。

（発明が解決しようとする課題） 本発明の課題は、繰り返して信頼できる結果を与えるよ
うな、微生物及び他の菌体の電気化学的測定用分析機器
の進歩を可能とすることである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、作用電極と参照電極とを用いて、液体試料中
の微生物又は他の菌体を生物電気化学的に測定するため
の分析機器を提供する。この作用電極、参照電極、及び
これらの電極の近傍に固体を保持するためのフィルター
は使い捨て要素として備えられる。この分析機器は、こ
の使い捨て要素を解除可能に収容するための収容手段を
有する。

これらの電極とフィルターとを使い捨て要素として備え
ているので、この分析機器のユーザーは電極を組み立て
、フィルターを調整する必要がない。−貫した品質を得
るために制御された条件下でシールドユニットとして注
意深く製造された使い捨て要素を使用することで、高度
の確実性と信頼性とが得られる。

これらの使い捨て要素自体も本発明の一部をなすもので
あるが、更に、本発明はこれらの使い捨て要素を用いて
微生物又は他の菌体を測定する方法を提供する。

この関連分析機器と接合された使い捨て要素は、試料中
のあらゆる菌体を捕捉する貫流用に適合するよう設計さ
れ、濃縮を行い、洗浄を可能とする。現在は、特に電極
とフィルターとが一般に水平方向へと拡がり、前記要素
を一般に垂直方向へと貫流する場合には、一般に平面状
の使い捨て要素が好ましく用いられる。

この使い捨て要素のフィルターは対向する電極間に挟ん
でよく、また他の構成では、フィルターを電極の上流と
してもよい。フィルター材料は三つの主要な基準に基づ
いて選択される：生物細胞を良好に保持できること（９
０％又はそれ以上）：与圧下で十分な流量があること二
及び阻害への抵抗が適当であること。この最後の二つの
基準は、導入できる特定試料の容積に影響し、従って人
手可能な濃度に影響する。

特に好適なフィルターはデプス　フィルターであり、と
りわけグラスファイバー　フィルター（例えば、ワット
マン（Ｗｈａｔｍａｎ）又はミリポール（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）　　によって製造されたもの）である。

膜フイルタ−、チャージ　モディファイド　フィルター
等の他のフィルターを採用してもよい。ビーズ上に固定
化された抗体又はレクチンのような捕捉基質を含む、他
の形のフィルターを採用してもよい。このフィルターは
、二つのハーフを互いに合わせてなるハウジング内に収
容してもよい。

これら二つのハーフは射出成形法で製造できる。

更に、フィルターを通る液体につき所望の流れと配分と
を助長するためにメツシュを採用できる。

前記作用電極は既知の材料に基づいていてよい。

金や白金のような貴金属を用いることもできるが、使い
捨て要素の製造用としてはより安価な材料を用いること
が一般には好ましい。適当な材料はグラファイト　フェ
ルト（例えば、ＲＶＧ　２０００ルカルボン（Ｌｅ　Ｃ
ａｒｂｏｎｅ）でありうる。しかし、グラファイト　フ
ェルトは高い電気抵抗を与える傾向があり、この発明の
好ましい態様では、印刷カーボン電極を使用することに
よって良好な結果が得られることを見出した。特に好ま
しい態様では、一つ又は二つ以上の電極をスクリーン印
刷する。

前記参照電極は典型的には銀及び塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣ
＋）　、又は水銀及び塩化水銀（飽和カロメル電極、５
ＣＥ）からなる。こうした系で、水媒体中での絶対電極
電位は知られている。特に電流が小さい　（１０−６Ａ
又はそれ以下）場合には、外部回路を完結させるのに参
照電極のみを用いるのが好ましい。特に好ましいものは
印刷銀／塩化銀参照電極である。

電流の通過に従って参照電極の電位が変動するので、電
流の大部分が通過するカウンター電極を設けることがで
きる。カウンター電極に適した材料としては白金、金又
は銀が含まれる。カウンター電極を用いた場合には、参
照電極は参照電位を確認するのに十分な表面積を有すれ
ば充分である。

スクリーン印刷電極は多くの利点を示す。電極の動作と
配置とを最適化するための余地が多く、作用電極と参照
電極とを極めて接近させることができる。その抵抗はグ
ラファイトフェルトの抵抗よりも低く、電極と接触させ
るのが極めて易しい。

バクテリアに対する印刷電極の応答はグラファイトフェ
ルトで得られる応答と同じオーダーであるが、若干低い
。しかし、この結果はより良好でかつ制御性の良いバッ
クグラウンド電流によって補償される。

参照電極及び／又は作用電極及び／又はカウンター電極
は、繊維（例えばグラスファイバー）基質又はプラスチ
ック（例えばポリ塩化ビニル：ＰＶＣ）基質のような不
活性基質上へと印刷又は他の方法でコーティングするこ
とで形成するのが適当である。電極の透過性は利点とな
るものであるが、液体が電極表面に沿って通過するもの
とすると、電極は固体であってもよい。電極がフィルタ
ー機能を営まない場合には、一つ又はそれ以上の液体通
過孔を持つ固体電極を用いたり、又は電極のすべての部
分を通して液体を自由に通過させるネットワーク又は基
質を用いたりすることも同様に可能である。

一つの例では、参照電極は、この参照電極と対向して配
置された基質参照電極と共に、フィルター上を覆うカー
ボンフェルトである。これら全体はハウジング内に配置
され、試料は入口を通して供給される。これはフィルタ
ーを通して拡散し、双方の電極の表面領域を効率的に使
用することを可能とする。実際には、存在する空気をパ
ージするために一般に緩衝液を双方向に通過させ、この
後試料をまた各方向に導入する。次いで、必要とされる
ように、緩衝液での洗浄と媒体として作用する化合物の
導入とを行うことが有用である。

他の例では、試料が導入される電極は単一の開口を好ま
しくはその中心部に有し、−力対向する電極は、好まし
くは一個より多い開口、例えば８個の開口を通して、電
極縁部で流体を抜けさせる。

他の例では、カーボン印刷インキの作用電極を銀／塩化
銀インキで印刷した参照電極とインターディジテートさ
せる。例えば、星形電極をその他の電極とインターディ
ジテートさせる。参照電極と作用電極とを極めて接近さ
せることで、作用電極表面で電位を良好に制御すること
が可能となる。

カウンター電極は銀インキで印刷したディスクよりなる
。これらの電極は０．５＋ａｍ厚のＰＶＣ上へと適当に
印刷され、ディスク状にカットされる。これらのディス
クにパンチして設けた開口を液体が流れる。作用／参照
電極ディスクに中心開口を設け、他方のディスクに８個
の縁部開口を設けるのが適当である。次いで、このディ
スクをグラスファイバー　フィルター　ディスクの両側
でフィルター電極ホルダーに組み合わせ、使い捨て要素
とする。

更に他の例では、使い捨て要素が、好ましくは有機ベー
スカーボンインキでスクリーン印刷された、作用電極を
なす二つの共心電極と、好ましくは銀−塩化銀インキで
スクリーン印刷された、外側の参照電極とを備えたＰＶ
Ｃ又は他のプラスチック製の基体からなる。この共心的
デザインは電流分布及び電位制御のための多数の配置に
好ましい。三つの電極は、第三のカウンター電極が他の
二つの電極の平面内に又はこれら二つの電極と対向し存
在する所で、直面するようデザインできる。

一般に、電極を適当な導電性接触体によって読み出しデ
バイスと接続してもよい。この接触体の例は金、銅及び
白金接触体を含み、スプリング負荷されてもよく他にバ
イアスされてもよい。

このフィルター電極アセンブリーは一回使用の使い捨て
要素であるのが好ましい。この使い捨て要素の一回使用
を確認するために、可融性電気伝導リンクを備え、融解
させて使い捨て要素の一回使用を確認してよい。二つの
接触パッドに亘る銀−塩化銀インキの微細トラックを補
助電極印刷に組み入れることができる。各測定を行う前
に、使い捨て要素が新しく取り付けられ、未だ使用され
ておらず、融解リンクが未だ手をつけられていないこと
を機器によって確かめることができる。次いで機器が大
きな電圧をかけてリンクを焼き切るように調整できる。

可融性リンクの使用は広範な応用を有する。例えば、使
い捨て要素の範囲としては、特徴的な抵抗の可融性リン
クを有する範囲内で異なる用途、各タイプのものを提供
できる。次いで、分析機器が異なる抵抗タイプ同士を識
別し、この情報を利用して機器内に配置された使い捨て
要素のタイプを必要に応じて映ホするか又は他の方法で
示すように調整できる。

更に一般的には、可融性リンクをフィルターを持たない
使い捨て要素でも採用できる。作用電極と参照電極とを
有する使い捨て要素は、例えば、欧州特許第１２７９５
８号と「バイオセンサーの基礎と応用（Ｂｉｏｓｅｎｓ
ｏｒ　Ｆｏｎｄａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ）：ターナー、カルベ及びウィルソン編
（ｅｄｓ　Ｔｕｒｎｅｒ。

Ｋａｒｕｂｅ　ａｎｄ　Ｗｉｌｓｏｎ）、ＯＵＰ　、　
１９８７Ｊに記載されている。

この発明の他の例においては、電気化学的測定用の分析
機器に使用する使い捨て要素を提供する。

この使い捨て要素は作用電極、参照電極、及びこの使い
捨て要素の一体使用を確認するために融解される可融性
電気伝導リンクを有する。

フィルターを有しないこの使い捨て要素は、欧州特許第
１２７９５８号（公開１９８４年１２月１２日）の開示
に従って製造するのが好ましい。例えば、この作用電極
は媒体及び／又は酵素を組み込んでいてよい。こうした
使い捨て要素は欧州特許第１２７９５８号に示されるよ
うに、一般に平面状要素として設計されてよく、印刷電
極が好ましい。

しかし、フィルターを有しない使い捨て要素は媒介測定
（ｍｅｄｉａｔｅｄ　ａｓｓａｙ）及び類似の測定を超
える有用性を有し、電気化学一般においてこれら使い捨
て要素を使用することが本発明の示すところである。こ
の分析機器のユーザーは前もって電極を組み立てる必要
がなく、−貫した品質を得るために制御された条件下で
シールドユニットとして注意深く製造された使い捨て要
素を用いることで、高度の確実性と信頼性とが得られる
。

フィルターを有するか又は有しない上記使い捨て要素は
、シールされたパケット、例えばプラスチックでコーテ
ィングしたアルミニウムで製造され、使用の時点で開放
できるパケット内にパッケージ化することが有利である この使い捨て要素が収容手段内にただ一つの方法で収容
されうるように、分析機器を使い捨て要素と関連して°
形成するのが好ましい。この収容手段は一般にドアによ
って上方からアクセスする水平方向の凹部からなってい
るのが好ましいが、他の構成も可能であり、水平方向へ
とアクセスする水平スロット、引き出し、垂直方向にア
クセスする垂直スロット等を含む。

好ましいことに、分析機器に使い捨て要素を結合するこ
とで、自動的に流体流路の整列と電気的接続とを行う結
果となる。この分析機器は、典型的にはそれ自体たンプ
と、緩衝液の供給部と他の構成要素とを有する。試料供
給と電気的測定とを自動化するために、マイクロプロセ
ッサで制御するのが好ましい。−貫した結果を保証し、
応答性を最大化するため、分析機器はフィルター上に保
持された微生物をインキュベートするための適当なヒー
ターを含んでいる。気泡を検出し、これによって間違っ
た結果を得るのを避けるために、気泡セン、サーを含め
てもよい。好適なセンサーは流路に二つの電極を有して
いる。

本発明に従った一つの方法においては、人工の媒体化合
物を採用した呼吸測定（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙａｓｓ
ａｙ）を実施する。呼吸測定が機能する正確な機構は明
らかではない。バタテリアの呼吸過程は基体の酸化的分
解をもたらし、結果的に電子の抽出をもたらす。これら
の電子は、菌体の膜内に位置し、チトクローム類のよう
なタンパク質やキノン類のような小さな親油性分子を含
む酸化還元剤間を通過する。好気性呼吸では、これらの
電子が結局酸素の還元にあずかる。好気性呼吸では、硝
酸塩、フマル酸塩、又は他の化合物が末端酸化剤として
機能する。呼吸バクテリアの存在下に還元される能力の
ある人工媒体が、膜内の一つ又はこれ以上の酸化還元剤
から電子を抽出することによって還元され始めるものと
推定される。

呼吸測定のために、この発明の使い捨て要素は分析機器
内に一時収容する。試料はフィルターと接触するように
供給し、例えば試料を使い捨て要素を通して流し、これ
によってフィルター上に微生物を捕捉する。次いで、媒
体化合物の溶液を電極及びフィルターと接触するように
供給し、かくしてフィルター上に捕捉された菌体と接触
させる。

次いで、この作用電極を有効電位に保持する。もし溶液
中の化学種が作用電極で還元又は酸化されうるような電
位であれば、電流が外部回路を通して流れる。電極を流
れるこの電流はモニターできる。標準化された条件下で
得られた結果と比較することにより、定量的測定が可能
となる。

本発明の採用によって測定できる微生物又は他の菌体に
は、ダラム陽性菌、ダラム陰性菌、菌類、藻類、シアノ
バクテリア、酵母、単細胞生物及び他の微生物類を含む
。測定可能な菌体の特定例としては、シュードモナス　
フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｓ）　、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、リステリア　モノチ
トゲネス化１ｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ
ｓ）及び大腸菌（ｅｓｈｅｒｉｓｈｉａ　Ｃｏ１１）を
含む。

この発明では、フェロセン、フェロセンｌ導にのような
媒体を採用できる。採用可能な他の媒体としては、キノ
ン類、フェナジンメトスルフ７−ト及び特にｐ−ベンゾ
キノンを含む。この媒体は有効濃度の溶液として供給す
るのが好ましい。

使い捨て要素中にフィルターを使用すると、試料から微
生物を濃縮することができ、試料の洗浄も可能となる。

例えば、オレンジジュース中に存在する還元剤（例えば
アスコルビン酸）は呼吸測定を阻害しうるが、しかしこ
うした還元剤は容易に流し出すことができ、微生物のみ
についての測定が可能となる。

本発明の分析８機器は、電気化学的活性部分を遊離する
人工基質を加えることによってエンザイムアッセイに使
用でき、酵素標識抗体を用いて免疫測定に使用できる。

エンザイムアッセイのために、使い捨て要素を分析機器
内に一時収容する。試料をフィルターと接触するように
供給する。次いで酵素基質の溶液を電極及びフィルター
と接触するように供給する。

この基質は微生物の酵素のための基質である。この酵素
は、基質がこの基質の電気活性と異なる電気活性を有す
る生成物へと転化するのを触媒するものである。この作
用電極を有効電位で保持し、これらの電極に流れる電流
を検出する。

こうしたエンザイムアッセイを用い微生物の特定の種又
は集団を酵素活性に基づいて同定し、特徴づけ、又は定
量することができる。例えば、アラニンアミノペプチダ
ーゼ活性を所有することは、非常に多くの場合にダラム
染色性と相関がある。

こうした酵素としては更にアミノペプチダーゼ類、特に
、ピロリドニル　アミノペプチダーゼ（ｐｙｒｒｏｌｉ
ｄｏｎｙｌ　ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）　　（ピ
ログルタミル　アミノペプチダーゼ（ｐｙｒｏｇｌｕｔ
ａｍｙｌａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ））　Ｅ、　Ｃ
，３，４，１９，３，を含む。最初にシュードモナス　
フルオレセンスから発見されたこの酵素は、バクテリア
の間に共通にではないが広範な分布を有することが発見
された。この酵素の分布に関する最も包括的な研究「Ｊ
　Ｇｅｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９７０）　　６１．
９）によれば、２３５４種の腸内細菌類（Ｂｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を調べたところ、これらの
うち４５１種が酵素活性を示すことが見出されている。

エンザイムアッセイにおいて、前記酵素存在下の反応で
、遊離溶液中では電気化学的に活性であって基質結合時
には活性でないリポータ−グループを遊離する基質を採
用することが好ましい。例えば、ピロリドニル　アミノ
ペプチダーゼに適した基質はＮ、Ｎ−ジメチル−Ｎ′　
−ピロリドニルフェニレンジアミンである。酵素加水分
解で遊離する部分であるジメチルフェニレンジアミンは
、ＳＣＥに対して＋１９０ｍＶで酸化ピークを示し、未
反応の基質はＳＣＥに対して＋４００ｍＶの領域でのみ
酸化を行う。従って、測定のためにＳＣＥに対してほぼ
＋２５０ｍＶの電位を選択することで、これら二つの物
質を区別できる。

呼吸測定でバクテリアを検出し、また特定のバクテリア
性酵素活性を測定することで、バイオマス全体と特定の
集団との定量がそれぞれ可能となる。本発明の他の例は
免疫測定フォーマットに存する。

この目的のため、本発明は、分析機器と、作用電極、参
照電極及びフィルターを有する使い捨て要素とに基づい
て、液体試料中の微生物を免疫学的に測定する方法を提
供する。この使い捨て要素は分析機器内に一時固定され
る。フィルターと接触するように試料を供給し、次いで
酵素標識抗体の溶液を供給する。この抗体（モノクロー
ナル又はポリクローナル）は測定すべき微生物と免疫反
応するものである。この標識抗体はフィルターで捕捉さ
れた微生物の固定化微生物抗原へと結合する。過剰の非
結合試薬は洗浄工程によって除去でき、フィルターと結
合した酵素標識は定量できる。

この目的のため、酵素標識抗体の酵素の基質溶液を電極
及びフィルターと接触するように供給する。

この標識酵素は基質がこの基質の電気活性と異なる電気
活性を持つ生成物へと転化するのを触媒するものである
。作用電極を有効電位で保持することにより、これらの
電極での電流のフローをモニターできる。作用電極での
生成物の酸化（又は還元）によって製造される電流の大
きさを、フィルター上に載った微生物へと関連させるこ
とができる。

この方法は同じ種の中で異なる菌株を区別することを可
能とし、また同じ世代で異なる種や異なる血清型を区別
することを可能とする。例えば、マウスアンチ大腸菌（
Ｅ−Ｃｏｌｉ）モノクローナル抗体とアンチマウスアル
カリホスファターゼとの複合体を用いて好ましくは非特
異的な結合反応を減らすために前もってフィルターをブ
ロックして、大腸菌を検出することが可能である。アル
カリホスファターゼで標識したマウスアンチ大腸菌モノ
クローナル抗体はもう一つの好適な試薬を提供する。

一般に、この発明の方法では、測定感度の観点からバッ
クグラウンド電流を最小化するのが好ましい。真の零応
答は、応答レベルを超えて小さい信号を識別するために
、厳密に定める。一つの方法は、手順の最初にブランク
測定を行う実験用プロトコールを用い、この後に試料を
導入し、反応を行い、反応結果の測定であるところの第
二の電流値測定を行うことである。次いで、これら二つ
の測定値間の差を試料に対する機器の応答とする。

（実施例） 添付図面を参照しながら本発明を更に詳細に説明する。

例　　１ 使い捨て要素 第１図は、この発明の使い捨て要素の一例の分解図であ
る。図の下から見ると、要素は、中央開口１１、印刷作
用電極１２、参照電極１３、可融性リンク（ｆｕｓｉｂ
ｌｅ　１ｉｎｋ）１４及び電気接点１５をそなえる基板
１０；接着層１６；ろ膜１７；支持メツシュ１８；不透
性センタースポット（ｃｅｎｔｒｅ　５ｐｏｔ）１９　
　；接着リング２０；カウンター電極２２をそなえるダ
イヤフラム２１；接着層２３；及び中央開口２５を有す
る上カバー２４よりなる。共軸開口２６が基板上の電気
接点１５まで貫通して延び、開口２７がカウンター電極
まで貫通して延びる。使い捨て要素を通して試料を圧送
する場合、ダイヤフラム２１はろ膜１７から曲がって離
れ液体がろ膜を横切って十分流れるようにする。

圧送が終ると、ダイヤフラムは力がゆるんでろ膜が電極
と密接して保持される。

例２ 使い捨て要素 第２　（ａ）、　２　（ｂ）及び２（Ｃ）図は、コノ発
明ノ要素の使い捨て要素に対する現在の好ましい構成を
示す図面である。ＰｖＣの基板３０は、電極支持体の役
を果たす。有機ベースカーボンインキでスクリーン印刷
した作用電極３１と、銀／塩化銀インキでスクリーン印
刷した外側参照電極３２とよりなり、可融性結合４０を
そなえる、二つの同心電極がある。

基板は、一つの液体進入用中央開口３３を有する。

上側シート３４はガラス繊維のフィルターディスク３５
を適所に保持するようにつくられる。このシートは、要
素を組立てた場合、フィルターディスクの縁部のまわり
がわずかに押しつぶされフィルターの縁部のまわりで流
体が漏れないようにする２段の凹部が形成される。流体
の出口は、円形の８個の開口３６である。これにより凹
部の第２段の内側の、フィルターの全範囲がろ過に用い
られることが保証される。最大限に可能な流量を更に保
証するためにデインプル（ｄｉｍｐｌｅ）３７をそなえ
るデインプル組織を８個の出口開口内の上側シート上に
形成する。これは、加圧下にある場合、使い捨て要素の
後壁からフィルターを離しておくようにする。上側シー
ト中の３個の開口３８が電極とヒユーズ接点３９とを露
出させる。ＰｖＣを使い捨て要素の両ハーフに使用する
が、ポリカーボネートのような他のプラスチックを用い
ることができる。現在、ＰｖＣの上側シートは熱成形さ
れるが、この成分は、同様にポリスチレン中射出成形す
るか、他の方法でつくることができる。ＰｖＣの２枚の
シートをフィルターディスクとともに組み立てた後、２
個のハーフを移行接着剤（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｄｈｅ
ｓｉｖｅ）で、又は薄い（〈５μｍ）両面テープを用い
て、又は液体接着剤を印刷、噴霧若しくはロール塗りし
て互いに接着する。使い捨て品は、次いでその最終形状
、本質的に角形で隅を丸くし、左側に第４図に示すハウ
ジングに正確に挿入するための切欠きを有する形状に打
ち抜く。

第３図に示す使い捨て要素の別の例では、使い捨て要素
は、図に一部分解した形で示すように電極を載せた連続
ボトムリボン４５、連続フィルターリボン４７、及び連
続打ち込みアッパーリボン４８を有する連続テープとし
て提供することができる。

このようなテープは、繰り返し測定の位置に順番に要素
を連続的に供給する自動段階型供給を有する分析装置に
おいて特に有用である。

例　　３ 分析装置 第４図は、一般にこの発明に従う分析装置５０を示す図
である。ハウジング５１内には、一般に使い捨て要素５
３を受は入れる水平凹部５２と流体取り扱い、温度制御
及び電子ハードウェア用機構（図示せず）がある。装置
は、ハウジングのふた５４を閉めて掛は金をした場合、
凹部に置いた使い捨て要素に自動的に電気と流体が結合
されるように設計されている。

測定系は、サーモスタットを備えた加熱器、ポンプをそ
なえた流体取り扱い系、切り替え弁、気泡センサ、過渡
電流を測定するポテンシオスタット、シングルカードコ
ンピュータ（ｓｉｎｇｌｅ　ｃａｒｄｃｏｎｐｕｔｅｒ
）　、関連インタフェース及びマイクロディスク駆動装
置をそなえる。装置は、次の機能を行う： ｉ）フィルターセルを予め定めた温度に維持する。

ｉｉ）試料と試薬の測定した量をセルを経て圧送する。

ｉｉｉ　）電位を加え、生じた総合電流応答を測定する
。

ｉｖ）微生物濃度を計算する。

■）バッチ番号、試料データのような利用者からのデー
タを入力し、測定結果を出力する。

ｖｉ）結果とデータを記憶し出力を印刷する。

ｖｊ）すべての段階で、試薬の終わり、前に使用したセ
ル又は流体阻害のような誤りをチエツクし、誤った取り
扱いを防止する連動を与える。

第２図の使い捨て要素をそなえた第４図の分析装置は、
例えば、呼吸測定（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ａｓｓａ
ｙ）において用いることができ、これに対して次のプロ
トコールが適当である： Ａ、単純プロトコール １、試料導入 ２、緩衝液／電解液による洗浄 ３、媒体／緩衝液／電解液の導入 ４、特定期間、特定温度で保温する。

５、電位を加え電流を測定する。

Ｂ、低い値の較正を伴うプロトコール １．系を媒体／緩衝液／電解液でフラッシングする。特
定温度を待つ。

２、電位を加え、電流を測定する。ゼロ値として記録す
る。

３、緩衝液／電解液で洗浄。

４、上記（Ａ１）から続ける。

例　　４ 免疫測定 第５図に示すように試料を第２図の使い捨て要素を通し
て送り、バクテリア６１をフィルター６０上に捕捉する
。試料中の可溶性成分を洗浄剤により除去し、次いで抗
体−酵素複合体６２の溶液で処理する。使用抗体は、特
定の属、種（又は血清型）の微生物と特異的に結合する
ように設計され検出を要求するように酵素リポータ−グ
ループと共有結合で結合さ゛れている。過剰の非結合試
薬を除去する単純な洗浄段階の後、ここでフィルターと
十分関係させた酵素標識を適当な基質６３で定量化する
。（アルカリ性リン酸塩のような）酵素は、基質を既知
の方法で電気活性生成物に転化し、この濃度を電極表面
６４で酸化／還元により測定する。

その場合、得られた電流は、フィルターに捕集されたバ
クテリアの数に直接比例する。従って、免疫測定方式は
、特定のバクテリアの同定（抗原抗体相互作用による）
を可能にするだけでなく関係する種の直接計数をも可能
にする。

例５ 呼吸測定（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ａｓｓａｙ）第２
図の使い捨て要素を第４図の／’％９ジングに挿入した
後、１０　ｍβのリン酸塩／塩化物ｙ衝液（リン酸ナト
リウム１００ｍＭ　、塩化ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ
６，８，１０ｍＭのグルコース含有）を上向き方向に圧
送した。次いで、試料を導入し、次いで緩衝液を通し媒
質成分をフィルターから洗い去った。

次いで、アセンブリーを１．２５ｍ！、１のｐ−ベンゾ
キノンを含有する緩衝溶液で溢れさせた。次いで、全体
を３７℃に代表的には１０分間保温し、次いで銀／塩化
銀に対し＋４００ｍＶの電位を作用電極に加え電流を記
録した。

次表は、適当な媒質中種々の希釈度での４種の異なる微
生物で得られた応答（ｔ＝３０秒、バックグラウンド補
正後のμＡ）を示す。

表　　１ 微生物 ｃｆｕ／ｍｌ 応答 （ＮＣＦＢ　１７７１） Ｘ１０５ ０．５ ｒｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ （ＮＣＴＣ１００３８） 大腸菌 （［Ｅｓｃｈｅｒ＋ｓｃｈ＋ａ ｃｏｌｉ） （ＮＭ　５２２） 霊菌 （Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ） （ＡＴＣ［：　１４７５６） Ｘ１０３ １．３　　Ｘｌ０６ １．３　　ｘｔｏ６ １．３　　ＸＩＯ’ ７．７　　Ｘｌ０８ ７．７　　Ｘｌ０６ ７．７　　ＸＩＯ’ １．０ ■０．０ １．６ ０．６ ２３．６ ４．５ １．０ 例６ バクテリアの選別 バクテリアの若干の種についてベンゾキノン呼吸測定の
応答を試験し、種々のバクテリアの相対的応答を測定し
た。反応は、１０（ｂｎＭの塩化す）　ＩＪウムを含有
する１１００ｒｎ　リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，
８中で行った。グルコースは１０ｍＭ含まれ、ｐ−ベン
ゾキノンは１．２５ｍＭ存在した。（ｐ−ベンゾキノン
は、ＢＤＨから得られ、４０〜６０°石油エーテルから
再結晶された。）バクテリアを、栄養培地（Ｇｉｂｃｏ
　ＢＲＬ）中か酵母菌グルコースブイヨン（栄ｉ培地＋
ｏ、　３　％ｗ／Ｖ酵母菌抽出物＋０．５％（ｗ／Ｖ）
グルコース、ｐＨ６，８）中かのいずれかで成長させた
が測定前に洗浄し、１００＋ｔ＋Ｍ　　リン酸ナトリウ
ムｐＨ６、８：　１００ｄ塩化ナトリウム；１０ｍＭグ
ルＪ−ス中に再懸濁した。バクテリアを媒体溶液と共に
セルに直接添加し、所定時間、既知温度で保温するか、
保温をセルから離して行い溶液を測定のためにセルに移
すかのいずれかであった。電流は、細胞数に対して規格
化され（標準平板計数によって算定〉、大腸菌ＮＭ　５
２２の応答を１００として相対的に表された。結果を次
表に示す。

表２ バチルス・バディウス　ＡＴＣＣ１４５７４（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ） バチルス・セレウス　　ＮＣＦＢ　１７７１バチルス・
スファエリカスＡＴＣＣ１４５７７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｈａｅｒｉｃｕｓ）枯草菌　ＮＣＦＢ　　１７６９ （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）大腸菌　ＮＭ
　５２２ シュードモナス・フルオレセンス ＡＴＣＣ２５２８９ ネズミチフス菌　ＡＴＣＣ１３３１１ 応答 バチルス・セレウス及び枯草菌のデータが表に含まれる
が、これらの生物に対する平板菌数の結果は、驚くほど
小さい（したがって、大きい規格化応答）。データ内に
ばらつきがあるが、測定は、試験したバクテリアの全種
を検出し、ダラム染色特性の種との関係はなかった。

例７ 酵素活性を哺乳動物のピロリドニルアミノペプチターゼ
及ヒシュードモナス・フルオレセンスＡＴＣＣ２５２８
９中に天然に存在する酵素の両方を用いて測定した。５
０　ｍ　Ｍのトリス−ｔｌｃＬ　ｐＨ８，３，２５℃、
１００ｍＭ　ＨＣｌ、１　ｍＭ基質を用いる哺乳動物酵
素の検定用検量線を第６（ａ）図に示す。

前記緩衝液中基質２ｍＭを用いるシュードモナス・フル
オレセンスに対する検量線を第６（ｂ）図に示す。バク
テリア細胞数との良好な線形応答が観察された。シュー
ドモナス・フルオレセンスの場合、酵素活性は、培地中
に分泌されるより細胞内に局在することを確かめた。

別の例 この発明をフィルターを有する使い捨て要素によって説
明したが、この発明は、参照電極、作用電極及び可融性
リンクをそなえる使い捨て要素も包含する。このような
電極は、例えば、欧州特許１２７９５８号明細書に従っ
て使い捨て要素をつくるが更に可融性リンクをそなえさ
せるように基板にスクリーン印刷することにより製造す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の使い捨て要素の分解斜視図、第２（ａ
）図、第２（ｂ）図及び第２（Ｃ）図ハソレぞれ本発明
による他の使い捨て要素の平面図、断面図及び印刷基板
、 第３図は本発明による多重使い捨て要素を与える連続テ
ープ、 第４図は本発明による分析機器の開口配置を示す斜視図
、 第５図は本発明の免疫測定法の各段階を示す図、第６（
ａ）図及び第６（ｂ）図は例７のピロリドニルアミノペ
プチダーゼ系を測定したグラフである。 ｌＯ・・・基板　　　　　　１１・・・中央開口１２・
・・作用電極　　　　１３・・・参照電極１４・・・可
融性リンク　　１５・・・電気接点１６・・・接着層　
　　　　１７・・・ろ膜１８・・・支持メツシュ １９・・・不透質センタースポット ２０・・・接着リング　　　２１・・・ダイヤフラム２
２・・・カウンター電極　２３・・・接着層２４・・・
上カバー　　　　２５・・・中央開口２６・・・共軸開
口　　　　２７・・・開口３０・・・基板　　　　　　
３１・・・作用電極３２・・・参照電極　　　　３３・
・・中央開口３５・・・フィルターディスク ３６・・・開口　　　　　　３７・・・デインプル３８
・・・開口　　　　　　３９・・・ヒユーズ接点４０・
・・可融性リンク　　５１・・・ハウジング５３・・・
使い捨て要素　　５４・・・蓋Ｆ［Ｇ、１ セルｆ１月１反

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、電気化学測定用分析機器に用いる使い捨て要素であ
   って、作用電極、参照電極、及びこれらの電極の近傍に
   固体を保持するためのフィルターを有する使い捨て要素
   。 ２、一回使用のための使い捨て要素である、請求項１記
   載の使い捨て要素。 ３、前記使い捨て要素の一回使用を確認するために融解
   されうる可融性電気伝導リンクを有する、請求項２記載
   の使い捨て要素。 ４、前記フィルターが公称孔径のデプスフィルター（ｄ
   ｅｐｔｈ　ｆｉｌｔｅｒ）である、請求項１、２又は３
   記載の使い捨て要素。 ５、前記使い捨て要素が更にカウンター電極を有する請
   求項１、２、３又は４記載の使い捨て要素。 ６、前記の電極のうち少なくとも一つが印刷されている
   、請求項１、２、３、４又は５記載の使い捨て要素。 ７、前記作用電極と前記参照電極とが同一表面上に印刷
   されている、請求項６記載の使い捨て要素。 ８、作用電極と参照電極とを用いて電気化学測定を行う
   ための分析機器において、前記作用電極、前記参照電極
   、及びこれらの電極の近傍に固体を保持するためのフィ
   ルターが使い捨て要素として備えられ、かつこの分析機
   器が前記使い捨て要素を解除可能に収容する収容手段を
   有することを特徴とする分析機器。 ９、前記使い捨て要素が請求項２〜７のいずれか一つの
   項に記載の使い捨て要素である、請求項８記載の分析機
   器。 １０、前記使い捨て要素が前記収容手段内に収容される
   進路が一つしかない、請求項８又は９記載の分析機器。 １１、前記分析機器が気泡検出器を含む、請求項８、９
   又は１０記載の分析機器。 １２、前記分析機器が、被測定微生物と免疫反応する酵
   素標識抗体の供給と、前記酵素によって触媒されて基質
   の電気活性と異なる電気活性を有する生成物へと転化す
   る、前記酵素標識抗体の酵素に対する基質の供給とを有
   する、請求項８、９、１０又は１１記載の分析機器。 １３、生物細胞のアンペロメトリー測定用の分析機器を
   備え、作用電極、参照電極、及びこれらの電極の近傍に
   生物細胞を保持するためのフィルターを有する使い捨て
   要素を備え；前記分析機器へと前記使い捨て要素を解除
   可能に収容し；液体試料を前記フィルターと接触するよ
   うに供給し；媒体化合物の溶液を前記電極及び前記フィ
   ルターと接触するように供給し；前記作用電極を有効電
   位で保持し；かつ前記電極での電流のフローをモニター
   することを含む、前記液体試料中の生物細胞を測定する
   方法。 １４、生物細胞のアンペロメトリー測定用の分析機器を
   備え；作用電極、参照電極、及びこれらの電極の近傍に
   生物細胞を保持するためのフィルターを有する使い捨て
   要素を備え；前記分析機器へと前記使い捨て要素を解除
   可能に収容し；液体試料を前記フィルターと接触するよ
   うに供給し；被測定微生物と免疫反応する酵素標識抗体
   の溶液を前記電極及び前記フィルターと接触するように
   供給し；及び前記酵素標識抗体の酵素に対する基質の基
   質溶液を前記電極及び前記フィルターと接触するように
   供給し；前記基質がこの基質の電気活性と異なる電気活
   性を有する生成物へと転化するのを前記酵素に触媒させ
   ；前記作用電極を有効電位で保持し；かつ前記電極での
   電流のフローをモニターすることを含む、前記液体試料
   中の生物細胞を測定する方法。 １５、生物細胞のアンペロメトリー測定用分析機器を備
   え；作用電極、参照電極、及びこれらの電極の近傍に生
   物細胞を保持するためのフィルターを有する使い捨て要
   素を備え；前記分析機器へと前記使い捨て要素を解除可
   能に収容し；液体試料を前記フィルターと接触するよう
   に供給し；前記生物細胞の酵素に対する基質である酵素
   基質の溶液を前記電極及び前記フィルターと接触するよ
   うに供給し；前記基質がこの基質の電気活性と異なる電
   気活性を有する生成物へと転化するのを前記酵素に触媒
   させ；前記作用電極を有効電位で保持し；かつ前記電極
   で電流のフローをモニターすることを含む、前記液体試
   料中の生物細胞を測定する方法。 １６、電気化学測定用分析機器に使用する使い捨て要素
   であって、作用電極、参照電極、及び前記使い捨て要素
   の一回使用を確認するために融解されうる可融性電気伝
   導リンクからなる使い捨て要素。