JPH02107970A - バクテロイデス・ジンジバリス菌体の検出用試薬、そのためのキット及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の線毛抗原に
対する抗体を感作させたラテックス粒子からなるバクテ
ロイデス・ジンジバリス検出用試薬、そのためのキット
及びそれを用いる被検体中のバクテロイデス・ジンジバ
リス菌体の検出方法に関する。

バクテロイデス・ジンジバリス（以下、Ｂ、ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓと称する）は歯周病患者の口腔内、特に歯肉
縁下ポケットに高比率で生息し、成人性歯周炎の原因菌
として注目されている。歯周病には歯肉の炎症をともな
う歯肉炎と、さらに歯周ポケットの形成、歯根膜の破壊
、歯槽骨の吸収をともなう歯周炎とがある。さらに歯周
炎は、成人性歯周炎症と限局性若年性歯周炎とに分けら
れる。このうち成人性歯周炎は最も罹患率が高く、出血
、排膿を伴う歯牙の動揺、さらに重度の場合には歯牙の
喪失に至る疾患である。しかしながら、現在、歯周炎の
治療法はまだ完全に確立されていないのが現状であり、
できるだけ早期に成人性歯周炎を発見し、予防的処置を
施すことが最も重要であると考えられている。上記の成
人性歯周炎の病巣局所には、全細菌のうちの７〜８割が
ダラム陰性桿菌によって占められ、なかでも特にＢ　、
　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの顕著な増加が認められている
ことが報告されている。そこで、このＢ　、　ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓに注目し、成人性歯周炎の診断の補助的手
段として、本菌の存否ならびに多寡を知るために種々の
方法が提案されている。

例えば、成人性歯周炎患者のプラーク（歯垢）、歯肉溝
液及び唾液などを血液平板主で嫌気的条件下で培養する
ことにより黒色色素産生性Ｂ　ａｃｔｅｒ。

１ｄｅｓを検出し、さらに詳細な生化学的性状を調べる
ことによりＢ　、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓであることを確
認する方法が提案された。

一方、酵素免疫測定法を用いて、プラーク（歯垢）、歯
肉溝液、唾液及び血清中のＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓ菌体表層抗原に対する抗体価の有無ならびにその程度
を調べることにより、病態の悪化と抗体価の上昇が相関
することを指標として成人性歯周炎症を診断することが
試みられている。さらに蛍光顕微鏡を用いての検体を観
察することにより特定細菌の有無を判定することも試み
られている。しかしながら、これらのいずれの方法もか
なりの時間と煩雑な操作ならびに高価な特殊装置を必要
とするために広く普及することはきわめて離しく、迅速
かつ簡便な診断方法の開発が望まれている。

本発明者は、これらの従来方法の欠点を克服すべく鋭意
研究の結果、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの種々の病
原性因子の中で、特に成人性歯周炎患者において初期定
着に重要でありかつ同菌の表層菌体成分の中でも強い免
疫原性を示す線毛抗原に着目し、この線毛抗原に対する
抗血清又は、モノクローナル抗体を調製し、これらの単
独もしくは複数をラテックス粒子に吸着させて得た感作
ラテツクス粒子を用いれば、迅速かつ簡便にＢ　、　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓの存否ならびに多寡を判定すること
が、可能であることを見出した。特に、被験者の口腔か
らの検体ならびにＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体浮
遊液（陽性対照）を好ましくは特殊な処理剤で処理して
、菌体より線毛をその抗原性をそこなうことなく迅速か
つ多量に抽出し、さらに菌体自体も溶解することにより
、菌体とラテックス粒子相互の非特異的凝集が起こらず
、Ｂ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存否ならびに多寡を信
頼性高く検出出来ることを見い出し、本発明を完成する
に至った。

本発明は、かかる知見に基いて到達されたものであり、
Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛抗原に対する抗体
を感作させたラテックス粒子からなることを特徴とする
Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体の検出用試薬であり
、また前記ラテックス粒子の懸濁液及び処理剤よりなる
Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体を検出するためのキ
ットであり、さらに前記検出用試薬を被検体と接触させ
て凝集像の有無を判定することを特徴とする被検体中の
Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体の検出方法である。

かかる本発明によれば、成人性歯周炎患者の歯周病巣部
におけるＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの存否ならびに
多寡を極めて簡単な操作で迅速に検出可能であり、短時
間内に本疾患を診断し、また病態の程度を把握できる。

従来、ヒトのプラーク（歯垢）、歯肉溝液、唾液等の被
検体に処理剤を加え、検体中のＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉ
ｓの線毛抗原を菌体より、その抗原性をそこなうことな
く分離するとともに、菌体自体を溶解させることにより
、菌体とラテックス粒子の相互における非特異的凝集を
阻止しながらＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛抗原
をラテックス凝集反応により検出する方法は知られてお
らず、迅速かつ簡便な成人性歯周炎の診断は不可能であ
った。

ラテックスを用いたラテックス凝集反応を組み合せるこ
とにより、早期に成人性歯周炎の迅速且つ簡便な診断が
可能となった。

次に本発明をさらに詳細に説明する。

くラテックス粒子及びその調製〉 本発明の感作ラテツクス標品を製造するために用いるラ
テックス粒子は、通常、抗体を用いる検出用試薬として
使用されるラテックス粒子であればよく、その例として
は、例えばポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン
、アミノ基を有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリ
ビニルトルエン、スチレンブタジェン共重合体、カルボ
キシル化スチレンブタジェン共重合体、スチレン−ジビ
ニルベンゼン−共重合体、ビニルトルエン第三ブチルス
チレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリ
メタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリ
ル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニルア
クリレート、ポリビニル−ピロリドン、塩化ビニル−ア
クリレート共重合体等の合成高分子ラテックスの粒子で
あげられる。さらにこれらの高分子ラテックス粒子はそ
の表面を非イオン界面活性剤等で処理したものであって
も良い。これら高分子ラテックスのなかでもポリスチレ
ンラテックスが好ましい。ラテックス粒子の粒径は０，
０１〜１０．０μｍであり、好ましくは０．１〜１．０
μｍであるのが望ましい。さらにラテックスは凝集反応
板法に使用するので高比重のラテックス粒子であること
が望ましい。

く線毛抗原の調製〉 Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、例えばＣＡＭブイヨ
ン、Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ　−Ｉ　ｎｆｕｓｉｏｎブ
ロスなどにヘミン、メナジオンを添加した培地に接種し
て嫌気的条件で約３７°Ｃで培養すれば約２０時間また
はそれ以後に多数の菌体が得られる。これを集菌してピ
ペツティングなどにより物理的に線毛を剥離する。次に
、線毛を硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー処理すれば、精製されたＢ　
、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ線毛抗原が得られる。

このようにして得られる線毛を抗原として使用する。

く抗体の調製〉 上記の如くして得られたＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
線毛抗原を動物に免疫する。例えばこの線毛抗原をＦｒ
ｅｕｎｄの完全アジュバントと共にウサギ、ヤギなどの
動物の皮下又は筋肉内に注射して免疫し、上記動物の血
液からそれ自体公知の方法に従って旦ユｇｉｎｇｉｖａ
ｌｉｓ線毛抗原に対する抗血清を得ることができる。

一方上記線毛抗原でマウスを免疫し、この牌細胞を取り
出し、マウス骨髄腫細胞とポリエチレングリコール等を
用いて細胞融合させ、クローニングした後、Ｂ　、　ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓ線毛抗原に特異的に反応するモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマを選択する。

く感作ラテツクス粒子の調製〉 上記Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ線毛抗原に対する抗
血清又はモノクローナル抗体をラテックス粒子に感作さ
せるには、それ自体知られている方法に従い、物理的吸
着法又は化学的結合法が用いられる。

例えば、物理的吸着法では先ず精製されたＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ線毛に対する抗血清又はモノクロ
ーナル抗体をグリシン緩衝生理食塩水で１０〜１０００
　ｐ　ｇ／　ｍ（２，好ましくは１００〜５００　ｐ−
ｇ／ｍＱニ希釈する。

一方、ラテックス粒子をグリシン緩衝生理食塩水で５〜
１０　ｍｇ／　ｍＱに調製して、上記抗体溶液と等容量
で混和したのち、４〜４０℃において３０分〜２４時間
ゆるやかに撹拌しながら吸着させる。

また、化学的結合法では、先ず精製されたＢ。

ｇｉｎｇｉｖａｌ　ｉｓ線毛に対する抗血清又はモノク
ローナル抗体を蒸留水で１０〜１０００μｇ／　ｍＬ好
ましくは１００〜５００μｇ／ｍＱに希釈する。一方、
蒸留水で１０　ｍｇ／　ｍｆｆに調製したラテックス粒
子懸濁液を、例えば、０．Ｏ１〜Ｏ，１Ｍ　　ｌ−Ｅｔ
ｈｙｌ−３−　　（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐ
ｒｏｐｙｌ）　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｌｌｙｄｒｏ
ｃｈ　ｆｏｒ　ｉｄｅ水溶液とを等量ずつ混和し、室温
で２時間反応し、次いで遠心分離により、回収したラテ
ックス粒子を蒸留水で再懸濁した溶液ならびに、上記線
毛抗原溶液を等量ずつ混和し、４〜４０°Ｃにおいて３
０分〜２４時間ゆるやかに撹拌しながらラテックス表面
に抗体を結合させる。

物理的吸着法、化学的結合法ともラテックス粒子表層で
抗体の吸着あるいは結合していない部分をウシ血清アル
ブミン（以下ＢＳＡと略す。）でブロッキングしたのち
、遠心分離して得られる感作ラテツクス粒子を、０．１
−１．０％のＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸
濁し、必要あれば０．Ｏ１〜０．５％の窒化ソーダを加
えておくのが好ましい。

〈被検体およびその処理〉 本発明においては、歯周炎の感染が予想されるヒトの被
検体、すなわち、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを含ん
でいると推測されるヒトのプラーク（歯垢）、歯肉溝液
、唾液などの被検体を前記抗体を感作させたラテックス
粒子からなる検出試薬に接触させるが、その場合、上記
被検体をそのまま直接使用すると感作ラテツクス粒子と
、Ｂ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ以外の菌体との非特異的
反応が生じる可能性があり、そのため１３　、　ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓの判定が不確実になることがある。さら
に、初期の成人性歯周炎患者のプラク（歯垢）、歯肉溝
液、唾液等の被検体中にはＢ。

ｇ　ｉｎｇ　ｉｖａ　ｌ　ｉｓの菌数は少なく菌体のま
まで感作ラテツクスと反応させても、抗原量が少ないの
で凝集反応を感知し難いこともある。しかし被検体をＢ
。

ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛の抗原性が失われない条件
下で抽出、溶菌処理すると、ラテックス粒子に吸着する
線毛の実質的割合が増加し、初期の成人性歯周炎患者の
如きプラーク（歯垢）、歯肉溝液、唾液などの中に含ま
れている菌体が少量の場合であってもラテックス凝集反
応を特異的に起こさせることが出来る。

従って本発明において、被検体の抽出、溶菌処理を行う
ことは、線毛抗原の検出感度を増加するために極めて好
ましい態様である。

かかる被検体の処理は、Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
の線毛の抗原性が喪失しない処理剤で処理すればよく、
好ましくは１３　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛を実
質的に変性せず、且つＢ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに
対し抽出、溶菌作用を有するものが有利に使用される。

かかる処理に使用される処理剤としては、上記の如＜　
Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの線毛の抗原性が喪失し
ないものであればよいが、一般には各種界面活性剤、カ
オトロピックイオンなどが使用される。

界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン
性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤
、ステロイド系界面活性剤のいずれであってもよいが、
就中、非イオン性界面活性剤及びステロイド系界面活性
剤が好ましい。またカオトロピックイオンとしては、グ
アニジン塩酸塩、尿素及び５ＣＮ−１■−１ｃ　Ｑｏ　
ａ−１ＮＯ３−１Ｂｒ−１ＣＩ２−１ＣＨ３ＣＯＯ−な
どのイオンが使用される。これらカオトロピックイオン
としては、グアニジン塩酸塩及び尿素が好ましい。

以下処理剤として適用可能な界面活性剤及びカオトロピ
ックイオンの具体的化合物の例を示すが本発明はこれら
に限定されるわけではない。

（１）陰イオン性界面活性剤ニ ドデシル硫酸ナトリウム、 テトラドデシル硫酸ナトリウム、 ドデシルスルホン酸ナトリウム、 テトラデシルスルホン酸ナトリウム、 ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ
−サルコシン酸ナトリウム、（２）陽イオン性界面活性
剤ニ ドデシルトリメチルアンモニウムクロリドテトラデシル
トリメチルアンモニウムクロリド、 セチルトリメチルアンモニウムプロミド、ドデシルピリ
ジニウムプロミド、 セチルピリジニウムクロリド、 テトラデシルアンモニウムプロミド、 （３）両性界面活性剤； バルミトイルリゾレシチン、 Ｎ−ドデシル−ベタイン、 ステアリル−Ｎ−ベタイン、 ドデシル−β−アラニン、 （４）非イオン性界面活性剤： ポリオキシエチレングリコール（７）デシルエーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）ドデシルエーテル
、 ポリオキシエチレングリコール（１０）　）リゾシルエ
ーテル、 ポリオキシエチレングリコール（１１）テトラデシルエ
ーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）セチルエーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）ステアリルエーテ
ル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）オレイルエーテル
、 ポリオキシエチレングリコール（１７）セチル−ステア
リンエーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）ｐ−ｔオクチルフ
ェニルエーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）ｐ−オクチルフェ
ニルエーテル、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）ｐ−ノニルフェニ
ルエーテル、 モノラウリン酸ソルビタン、 モノパルミチン酸ソルビタン、 モノステアリン酸ソルビタン、 モノオレイン酸ソルビタン、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）モノラウリン酸ソ
ルビタン、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）モノパルミチン酸
ソルビタン、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）モノステアリン酸
ソルビタン、 ポリオキシエチレングリコール（ｎ）モノオレイン酸ソ
ルビタン、 ラウリルジメチルアミンオキシド、 ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコシド、 オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ノナノイル−Ｎ
−メチルグルカミド、 デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、 ｎ−へブチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−才クチル
−β−Ｄ−チオグルコシド、（５）ステロイド系界面活
性剤； コール酸ナトリウム、 デオキシコール酸ナトリウム、 ケノデオキシコール酸ナトリウム、 タウロコール酸ナトリウム、 タウロデオキシコール酸ナトリウム、 ジギトニン、 ３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ］−１−プロパンサルフエイト、 ３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニ
オ］−２−ハイドロキシ−１−プロパンサル７エイト、 （６）カオトロピックイオン ＣＣＱ　ｓ　ＣＯＯＮ　ａ。

Ｎａ５ＣＮ。

Ｎ　ａ　ＣＱ　Ｏ４％ ＮａＩ　。

ＮａＢｒ。

ＮａＮ　Ｏｓ、 Ｎ　ａ　ＣＱ　％ 尿素、 グアニジン塩酸塩、 本発明の処理剤は、前述したように、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓの線毛の抗原性を喪失しないもの、好ましくは
線毛を実質的に変性せず且つ口腔内に存在する細菌に対
し溶菌作用を有するものであればよく、比較的簡単なテ
ストにより好適なものを選択することができる。

すなわち、処理剤の水溶液中に口腔内細菌を入れ、菌体
は一部又は全て溶解するが、その線毛はその抗原性が喪
失しない程度に存否するか、実質的に変性されないで存
在するこ七を調べることによって本発明の処理剤として
使用しうるか否かを選別することができる。

本発明において被検体の抽出、溶菌剤処理に使用される
処理剤は、−船釣に種々の緩衝液に溶解して使用され、
例えば界面活性剤の場合、０．５〜７重量％、好ましく
は１〜５重量％の濃度で使用されまたカオトロピックイ
オンの場合０．１〜１０Ｍ１好ましくは１〜８Ｍの濃度
で使用される。

前述した処理剤による被検体の処理は通常４〜４０℃、
好ましくは２０〜３７°Ｃで１分〜２４時間、好ましく
は５分〜ｌＯ分間行うのが望ましい。

〈抗原の検出〉 前記したヒトの被検体或いは抽出、溶菌処理した被検体
は本発明のラテックス粒子と接触させることによって被
検体中の線毛抗原の有無又は量を調べるために使用され
る。その際抽出、溶菌処理した場合には、処理に使用し
た薬剤は除去しなくてもよく、また除去しなくてもよい
。

その際、ラテックス粒子は、リン酸緩衝液中に懸濁させ
て使用される。例えば０．１−１重量％のウシ血清アル
ブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水を用い、これにラテ
ックス粒子が０．５〜１．０重量％含む懸濁液となるよ
うに調整して使用される。

かくして得られた懸濁液と、被検体又は抽出、溶菌処理
した被検体の液とを混合することにより、ラテックス粒
子の凝集反応を調べる。懸濁液と被検体液との混合は、
混合させた液中のラテックス粒子の濃度が０．３〜１．
５重量％、好ましくは０゜５〜１．０重量％となるよう
に、懸濁液及び被検体液のそれぞれの濃度を予め調整し
ておくのが望ましい。混合された液中のラテックス粒子
の濃度が前記範囲よりも低くなると、ラテックス粒子の
凝集が検知し難くなる傾向になるので望ましくない。

凝集反応は上記混合液を凝集板上に滴下し例えば室温に
て約１−１０分間、好ましくは２〜５分間放置すればよ
い。凝集したラテックス粒子の有無又は程度を肉眼で観
察するか、或いは光学的方法によって測定することがで
きる。

次に本発明を調製例、試験例および実施例によってさら
に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるもので
はない。

調製例１ Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　３８１株からの線毛
抗原の調製。

Ｂ　、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　３８１株をＣＡＭブ
イヨン培地（日永製薬）で嫌気的条件下で大量培養後、
遠心分離により集菌した。その菌体を２０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，４）　＋Ｑ’、ｌ　５Ｍ　　ＮａＣ
＋２＋４０ｍＭ　　ＭｇＣ（１２に懸濁しピペッティン
グ後マグネティックスクーラーで撹拌して物理的に線毛
を剥離した。

遠心分離により菌体を除去し、その上清を４０％飽和硫
安沈澱し、得られた沈渣を２’ＯｍＭト！Ｊス塩酸緩衝
液（ｐＨ８，０）に溶解後、透析により脱塩した。

次にＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　（ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ーにより食塩の濃度勾配をかけ、０．１５Ｍ食塩で溶出
してくる両分を線毛抗原とした。

さらに、これを５ｅｐｈａｃｒｙｌ　　Ｓ　−５００（
ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたゲル濾過クロマトグラフ
ィーにかけ単一のピークであることを確認した。

調製例２ 線毛抗原に対する抗血清の調製。

調製例１の線毛抗原（１ｍｇ）をウサギ１匹当り１ｍＱ
のＦ　ｒｅｕｎｄの完全アジュバントにより油中水滴型
乳剤として皮下に３週問おきに合計２回注射して免疫し
、最終追加免疫から７日目に全採血し、常法通り抗血清
を分離した。

調製例３ 線毛抗原に対するモノクローナル抗体の調製。

調製例１の線毛抗［（１００μｇ）をマウス１匹当りＯ
、ｌ　ｍＱのＦ　ｒｅｕｎｄの完全アジュバントと共に
油中水滴型乳剤として、Ｂａ１ｂ／ｃマウス（予）、皮
下に３週問おきに合計２回注射して免疫し、追加免疫後
、３日目にＢａ１ｂ／ｃマウス、牌細胞を採取しＥ　ａ
ｇｌｅ’ｓ　　Ｍ　Ｅ　Ｍで３回洗浄した。

方、Ｂ　ａｌｂ／　ｃマウス由来のミエローマ細胞（Ｓ
Ｐ２１０）をＥ　ａｇｌｅ’ｓ　　Ｍ　Ｅ　Ｍで３回洗
浄する。

ミエローマ細胞と牌細胞をＥａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ中
で１：ｌＯに混合し、１．２００ｒｐｍｌ　０分遠心後
、上溝を除去しペレットを良くほぐして、０．５ｍ（２
のポリエチレングリコール４０００（１ｍＱ）＋Ｅａｇ
ｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ　（ｌ　ｍ＋２’）　＋ＤＭＳ　Ｏ
（０−’３５ｍ（１’）の混合溶液を３７°Ｃ下でペレ
ットに静かに滴下しながら、１分間混合した。次にＥ　
ａｇｌｅ’ｓ　　Ｍ　Ｅ　Ｍ１０ｍ４を少しずつ加え、
１．２０Ｏｒｐｍ　　１０分遠心し、上溝を除去した。

ペレットにｌＯ％ウシ胎児血清を含むＲＰＭ１１６４０
を加え５ＸＩＯ５細胞／ｍＱぐらいに浮遊させ９６穴マ
イクロタイタープレートに１００μａずつ分注した。そ
の後、ＨＡＴ培地、ＨＴ培地によりハイブリドーマを選
択し１５日目頃に調製例１の線毛抗原をコーティングし
た９６穴マイクロタイタープレートを用いて、ＥＬＩＳ
Ａ法によりＢ、　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　３８１株の
線毛抗原に対する抗体産生ハイブリドーマをスクリーニ
ングした。

スクリーニングしたハイブリドーマは限界希釈法により
クローニングした。限界希釈法はｌＯ％ウシ胎児血清を
含むＲＰＭＩ−１６４０培地にハイブリドーマ５細胞／
　ｍＱ　％　Ｅ３　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス胸腺細胞
５Ｘ１０’細胞／ｍ１２を加え、９６穴マイクロタイタ
ープレートに０．２ｍＱずつ分注し、調製例１の線毛抗
原に反応するモノクローナル抗体を分泌するｌコロニー
のＷ　ｅ　１１を選び出した。この操作を２回繰り返し
クローニングを完了した。

モノクローナル抗体の調製はハイブリドーマを無血清培
地にて培養し培養液から抗体を採取することにより行っ
た。

次に、得られたモノクローナル抗体を硫安塩析、ＤＥＡ
Ｅイオン交換クロマトグラフィー、ならびにゲル口過ク
ロマトグラフィー後、濃縮して、０ｕｃｈｔｅｒ　１ｏ
ｎｙ法により抗体のサブクラスを調べた。なお、ウサギ
抗マウスＩｇＧ＋、ＩｇＧ　ｚ＊ｓ　　Ｉ　ｇ　Ｇ　ｚ
ｂ、ＩｇＧ３、Ｉ　ｇＭハＬ　Ｉ　ＴＴＯＮ　　ＢＩＯ
ＮＥＴＩＣ３社製の標品を使用した。

その結果Ｎｏ、−１はＩ　ｇＭＸＮｏ、−２はＩｇＧ＋
、Ｎ　ｏ　、−３はＩ　ｇＧ、であった（第１表参照）
。

第１表　　モノクローナル抗体のサブクラス試験例１（
得られたウサギ抗血清およびモノクローナル抗体と口腔
内常在菌との反応） 前記調製例１の線毛抗原に対するウサギ抗血清及びモノ
クローナル抗体Ｎｏ、１．２．３と下記口腔Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ２１種株と抗原抗体反応ヲラテックス凝集
反応により調べた。

（ａ）　　ヒドロ腔内に存在い成人性歯周炎を発症させ
るＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌ　ｉｓに属する下記株； Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　３８１株、Ｂ、ｇｉｎｇ
ｉｖａｌｉｓ　　ＲＢ２４Ｍ　　２株、Ｂ、ｇｉｎｇｉ
ｖａｌｉｓ　　６／２６株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　　ＡＴＣＣ３３２７７株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　　ＷＳ２株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　ＨＷ２４
Ｄ−１株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　ＲＢ２２Ｄ−
１株、Ｂ−ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　ＢＨ１８／ＩＱ株
、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　１９Ａ４株、Ｂ、ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓ　　ＨＧ３７９株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖ
ａｌｉｓ　　ＨＧ４０５株、Ｂ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ
　　０Ｍ２３１４株及びＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　
０Ｍ２４０９株（ｂ）　　ヒドロ腔内に存在するが成人
性歯周炎を発症させない下記株； Ｂ、ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ　　ＨＧ３７０株、Ｂ、
ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ　　ＨＧ４１３株、Ｂ、ｅｎ
ｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ　　ＨＧ５９１株、Ｂ、ａｓａｃ
ｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ　　ＮＣＴＣ９３３７−７６
株、Ｂ、ｍｅ　ｌ　ａｍｉｎｏｇｅｍｉｃｕｓ　　ＨＧ
４６５株、Ｂ、　ｍｅ　ｌ　ａｍ　ｉ　ｎｏｇｅｍｉｃ
ｕｓ　　ＨＧ５５７株、Ｂ、ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ　
　ＡＴＣＣ２５６１１株、Ｂ、　ｂｕｃｃａｅ　　０Ｍ
２３３０株 ラテックス凝集反応は、下記の方法により行った。

上記２１種の菌株を、それぞれ純粋培養し、その菌体懸
濁液４μＱを採取し、４μａの６Ｍ、グアニジン塩酸塩
溶液と和し、５分間、室温で静置した。これに調製例２
および３で得られたＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ３８１線
毛抗原に対するウサギ抗血清およびモノクローナル抗体
Ｎｏ、−１、Ｎｏ、−２およびＮ　ｏ、−３でそれぞれ
感作したラテックス粒子懸濁液を４０μＱ加え、凝集反
応板上で３分間、混和した後、下記の基準に従い凝集の
程度を判定した。

凝集の判定基準； ｍ：凝集を認めない。

±：辺縁部にわずかに凝集塊を認める。

＋：全全体わたり小さな凝集塊を認める。

十十二全体にわたり大きく凝集塊を認める。

＋十十二凝集塊のみとなり、白濁が消失する。

（−１士は凝集陰性、＋、＋＋、＋＋＋は凝集陽性。） 第２表に示されるようにウサギ抗血清およびモノクロ ナル抗体Ｎｏ。

３は全てのＢ。

ｂｕｃｃａｅとは全く反応せずＢ、ｇｉｎｇｉｖａｘｉ
ｓとの間に高い特異性を認めた。

実施例１ 抗体感作ラテックス粒子の調製 日本合成ゴム（株）のラテックス粒子Ｇ２８０１をグリ
シン緩衝生理食塩水で０．５％となるように懸濁し、そ
れに等量の調製例３で得られたモノクローナル抗体Ｎｏ
、１の０　、１　ｍｇ／　ｍ（ｌ溶液を混合し、３７°
Ｃで９０分間反応させた後、０．１％ウシ血清アルブミ
ン・リン酸緩衝生理食塩水（ＢＳＡ−ＰＢＳ）でブロッ
キングし、最終的にＢＳＡ−ＰＢＳで０．５％に懸濁し
て抗体感作ラテックス粒子溶液を調製した。

実施例２ プラーク（歯垢）中のＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ線毛抗
原の検出及び旦、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌体の同定 健常者（６名）及び成人性歯周炎患者（６名）の臼歯部
のプラーク（歯垢）をスケーラ−を用１．％て採取し、
４μＱの６Ｍ、グアニジン塩酸塩溶液と和し、５分間、
室温で静置した。これに実施例１で得られたＢ、ｇｉｎ
ｇｉｖａｌｉｓ線毛抗１４二対するモノクローナル抗体
Ｎｏ、１で感作したラテックス粒子懸濁液を４０μＱ加
え凝集反応板上で３分間、混和した後、試験例１のラテ
ックス凝集の判定基準に従い、凝集の程度を判定した。

一方、健常者（６名）及び成人性歯周炎患者（６名）の
プラーク（歯垢）中のＢ、ｇｉｌｇｉｖａｌｉｓの同定
は、下記のようにして行った。

即ち、輸送培地（ＲＴＦ：Ｒｅｄｕｃｅｄ　　Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒ　　Ｆｌｕｉｄ）にプラーク（歯垢）を懸濁し
、ウサギ脱繊血及びヘミン、メナジオンを含むＣＤＣ培
地（Ｃｏｎｔｒｏｌ　　Ｄｅｓｅａｓｅ　　Ｃｅｎｔｅ
ｒ開発）に播種し、嫌気条件下で数日間培養する。生育
のみられたコロニーのうち、黒色化したコロニーを選び
これを分離し、純培養後、ＲａＰ　　ＩＤ　　ＡＮＡ　
　Ｓｙｓｔｅｍ（ＭｃＤＯＮＮＥＬＬ　　ＤＯＵＧＬＡ
Ｓ社製）により同定試験を行なった。さらに、Ｂ、ｇｉ
ｎｇｉｖａｌｉｓと同定されたものの培養上清をガスク
ロマトグラフィーにかけ、フェニル酢酸の産生を調べる
ことによりＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓであることを再確
認した。

第３表に示されるように健常者（６名）のプラーク（歯
垢）ではラテックス標品の凝集は認めず、全て陰性の結
果を示した。又、プラーク（歯垢）中に存在する細菌の
同定試験ではＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを認めなかった
。一方、成人性歯周炎患者（６名）のプラーク（歯垢）
ではラテックス標品の凝集を認め、全て陽性の結果を示
した。一方、プラーク（歯垢）中に存在する細菌の同定
試験では１エｌｉｓ線毛抗原の検出） １一 実施例３ 成人性歯周炎患者および健常者のプラーク（歯垢）と各
種処理剤を作用させた場合のラテックス凝集反応 この実施例３は、処理剤の種類を種々変えて、それがラ
テックス凝集反応に及ぼす影響を調べるために行ったも
のである。

即ち、実施例２の成人性歯周炎患者Ｎｏ、１１および健
常者Ｎｏ、ｌの臼歯部のプラーク（歯垢）をスケーラ−
を用いて採取し、下記第４表に示した濃度の処理剤４μ
ａと和し、５分間、室温で静置した。

これに実施例１で得られたＢ、ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ線
毛抗原に対するモノクローナル抗体Ｎｏ。

１で感作したラテックス粒子懸濁液を４０μＱ加え、凝
集反応板上で３分間、混和した後、試験例１のラテック
ス凝集の判定基準に従い、凝集の程度を判定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
   ｄｅｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）の線毛抗原に対する抗
   体を感作させたラテックス粒子からなることを特徴とす
   るバクテロイデス・ジンジバリス菌体の検出用試薬。 ２、該抗体が抗血清又はモノクロナール抗体である特許
   請求の範囲第１項記載の試薬。 ３、バクテロイデス・ジンジバリスの線毛抗原に対する
   抗体を感作させたラテックス粒子の懸濁液及び処理剤よ
   りなるバクテロイデス・ジンジバリス菌体を検出するた
   めのキット。 ４、該処理剤が、バクテロイデス・ジンジバリスの線毛
   を実質的に変性させることなく抽出、溶菌作用を有する
   特許請求の範囲第３項記載のキット。 ５、該処理剤が、バクテロイデス・ジンジバリスの線毛
   の抗原性を実質的に喪失させない処理剤である特許請求
   の範囲第３項記載のキット。 ６、特許請求の範囲第１項記載の検出用試薬を被検体と
   接触させて凝集像の有無を判定することを特徴とする被
   検体中のバクテロイデス・ジンジバリス菌体の検出方法
   。 ７、該被検体がプラーク（歯垢）、歯肉溝液または唾液
   である特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、該被検体を予めバクテロイデス・ジンジバリスの線
   毛の抗原性を実質的に喪失させない処理剤を作用させる
   特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９、該処理を界面活性剤及びカオトロピックイオンから
   選ばれる処理剤を用いて行なう特許請求の範囲第６項記
   載の方法。