JPH02107192A - 細菌に外来ｄｎａを導入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄ。

ｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）の細菌の細胞内に外来ＤＮＡを
導入する方法に関する。

更に具体的には本発明は、エレクトロボレーシコン法（
電気穿孔法）をビフィドバクテリウム属の細菌に適用し
、細菌の細胞内に外来Ｉ）　Ｎ　Ａを導入することによ
り形質転換されたヒフイドバクテリウム属の細菌を得る
方法に関する。

〔従来の技術］ これまでに微生物に外来性の遺伝子（ＤＮＡ）を導入し
て−の宿主微生物に外来性の遺伝子の遺伝情報を発現さ
せる多くの試みが行われている。

そしてこの外来性の遺伝子が導入された微生物すなわち
形質転換体を得る種々の方法の提案が既になされている
。

しかしながら、外来性の遺伝子の導入については微生物
の種類によって、固有の条件と問題点かあり、成る方法
が特定の微生物に適用可能であってもその方法がそのま
ま他の微生物に適用しえない場合も多い。

例えば、大腸菌に外来性の遺伝子を導入する方法として
ＣａＣＱ２を用いる方法などがあり枯草菌や酵母ではプ
ロトプラスト法等が広く知られているところであるが、
ビフィドバクテリウム属の細菌に関しては上記したいず
れの方法を採用してもその細胞内に外来性のＤＮＡを導
入することは困難であって、これらの細菌の細胞内への
外来性のＤＮＡの導入法の開発が望まれていた。

ビフィドバクテリウム属の細菌は動物の腸内菌叢の主要
なメンバーとして知られた細菌であって、その宿主との
かかわり合いにおいて宿主の健康に大きく影響を与える
細菌である。すなわち腸内菌叢中のビフィドバクテリウ
ム属の細菌のバランスが失われる場合、種々の症状が現
れ、このバランスが回復するとこの症状が消失するなど
、宿主の健康に大きくかかわるものである。かかる症状
の主たるものに、下痢、消化不良、などがある。

このようにビフィドバクテリウム属の細菌は宿主動物の
健康に影響を与えるきわめて重要な細菌で、この菌に所
望の性質が発現するように人為的な改変を加える手段の
開発が切望されてきたところであるが、いまだかかる手
段の開発には成功していない。

ところで、最近になって哺乳類細胞に外来性のＤＮＡを
導入する方法としてエレクトロポレーション法が提案さ
れた。

この方法は、一対の電極を有する容器に細胞の懸濁液と
導入すべきＤＮＡを入れ、高電圧パルス電流を流して細
胞膜を変化せしめ（例えば物理的な障害を与え）、この
変化した膜を通して外来性のＤＮＡを細胞内に導入しよ
うというものである。すなわち、このエレクトロポレー
ション法は細胞膜の局所的な一時破壊に基づく物質の透
過性の増大を利用しようとするもので、これまでにサイ
ズの大きい動物細胞および植物細胞への外来性のＤＮＡ
の導入のための技法として用いられている。微生物に対
するこのエレクトロポレーション法の適用の試みは酵母
および細菌（Ｂ、　ｃｅｒｕｓ）のプロトプラストにつ
いて既に行われている〔稲葉浩子外２名による総説「電
気穿孔法による哺乳類細胞への遺伝子導入」蛋白質核酸
酵素ｖｏ１．　３２．　　Ｎｏ、ｌ　（１９８７）　１
Ｏ＝２１頁参照〕ものの、ビフィドバクテリウム属の細
菌に対してはこの方法の適用可能性を報告した報文は知
られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記したところから、ビフィドバクテリウム属の細菌の
細胞内に外来性のＤＮＡを導入する方法が求められてい
るものの、細胞内に外来性のＤＮＡを導入する上記公知
の手法は適用することができなかった。

従ってこのビフィドバクテリウム属の細菌に対する新し
い細胞内への外来性のＤＮＡの導入手法の開発が求めら
れｔ；のである。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる現状に鑑みて本発明者らはビフィドバクテリウム
属の細菌について遺伝子操作上の問題点を克服してこれ
らの細菌の細胞内に外来性のＤＮＡを導入するための有
用な技術を確立すべく研究を重ねた。

その結果、エレクトロポレーション法をこれらの細菌に
適用することによって所望のＤＮＡを直接導入すること
に成功し本発明を完成させた。

すなわち、本発明者らはビフィドバクテリウム属から選
ばれる細菌を培養し、菌体を捕集し、この菌体と外来性
のＤＮＡとを含む懸濁液にパルス電流を通電することに
よって外来性のＤＮＡをビフィドバクテリウム属から選
ばれる細菌の細胞内に導入しうろことを見出したのであ
る。

従って本発明は、ビフィドバクテリウム属の細菌の浮遊
細胞と外来性のＤＮＡとを含む懸濁液にパルス電流を通
電し、外来性のＤＮＡをこれらの細菌の細胞内に導入す
ることを特徴とするものである。

更に本発明では、上記のビフィドバクテリウム属の細菌
と外来性のＤＮＡとを含む懸濁液へのパルス電流の通電
に際してポリエチレングリコールなどを存在させること
ができる。

本発明によって形質転換しうるビフィドバクテリウム属
の細菌は、ビフィドバクテリウム属に含まれるすべての
種に属するものであって、代表例としてビフィドバクテ
リウム・ビフィダムぐＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
　ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・イン７ア
ンテイス（Ｂｉｆ　ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａ
ｎｔｉｓ）　、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆ
ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバ
クテリウム・アドレセンテイス（Ｂｉｆ　ｉｄｏｂａｃ
Ｌｅｒｉｕｍａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ、ｉｓ）　、ビフィ
ドバクテリウム・デンテイウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｄｅｎｔｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム
・ロンガム（Ｂｉｆ　ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎ
ｇｕｍ）　、ヒフイトバクテリウム・シュードロンガム
（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｌｏ
ｎｇｕｍ）、ビフイト、＜クテリウム・サーモフィルム
（Ｂｉｆｉｄｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｍ）　、ビフィドバクテリウム・アステロイ
デス（Ｂ　ｉ　ｆ　１ｄｏｂａｃ　ｔｅｒ　ｉｕｍａｓ
ｔｅｒｏｉｄｅｓ）　、ビフィドバクテリウム−インデ
イカム（Ｂ百ｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｄｉｃｕ
ｍ）などを挙げることができる。

本発明の方法は、誘導期、増殖期および停止期のビフィ
ドバクテリウム属の細菌に対して適用可能であるが、対
数増殖期の前期の生育段階の菌体を使用することが好ま
しい。この対数増殖期とは、菌を培地に接種して培養し
た場合に、最初のほとんど増殖しない時期（ｌａｇ　ｐ
ｈａｓｅ）の次にやってくる菌が最も増殖する時期（ｌ
ｏｇｐ　ｈ　ａ　ｓ　ｅ　）で、培養時間に対する菌数
（または濁度）の対数の関係が直線関係になる時期を指
すものである。この期間以外の段階の細菌に対してパル
ス電流を通電した場合の外来性のＤＮＡの導入の効率は
低いものとなる。

この外来性のＤＮＡの導入に好適した期間である対数増
殖期の前期は、ビフィドバクテリウム属の細菌を適当な
培地で培養し、各培養時間に対する各培養菌の濁度の対
数をフロントしく増殖曲線）、一定の濁度の範囲内とな
った時期と定められる。例えば、ビフィドバクテリウム
・ロンガム　１０８Ａ株をブリックス（Ｂｒ　１ｇｇ５
）培地で培養した場合には一般にＡ６０Ｇ”約０．０５
〜約１．０濁度、好ましくはＡ、。。−約０．０５〜約
０．３０濁度となった時期に相応する。

このようにして培養して得た細菌を適当な手段、例えば
遠心分離によって捕集する。この場合細菌の菌体に損傷
を与えＩ；す、生存率が低下するような分離手段はさけ
なければならない。

このように捕集された細菌を水（好ましくは蒸留水）又
は緩衝液中に分散懸濁せしめる。

この細菌の懸濁に用いる緩衝液としては、既知の緩衝液
を用いることができ、一般にｐＨ５，５〜９の範囲のも
のを使用することができるが、例えばリン酸ナトリウム
緩衝液、トリス塩酸緩衝液またはこれらの緩衝液にシュ
ークロースを加えたものなどが挙げられる。

この細菌懸濁液中の細菌数は一般にはある程度多い方が
好ましいが、有用な形質転換体が得られる範囲で十分で
ある。

このビフィドバクテリウム属の細菌の懸濁液中に、菌の
細胞内に導入すべき外来ＤＮＡを添加混合する。この混
合はＤＮＡに細菌懸濁液を添加して行ってもよい。一般
的に混合量が大であればそれだけ細胞内への導入の確率
は増大する。

通常０．０１μ９　／　ｃ　ｕ　ｔ、・ｅ　ｔ　ｔ　ｅ
以上あれば実施できる。

ここで混合されるＤＮＡはビフィドバクテリウム属の細
菌の形質転換に用いうるすべてのＤＮＡを含むものであ
って、例えば２〜３Ｋｂ程度の比較的低分子量のものか
ら５０〜１００Ｋｂ又はそれ以上の高分子量のものまで
が含まれうる。そしてこうしたＤＮＡの具体例としては
、例えばｐＡＭβ１（Ｎｏ、　ｌおよびＮｏ−２）；　
ｐｃ１９４などが挙げられる。

外来性のＤＮＡと混和した懸濁液は次いでエレクトロポ
レーションに付される。

この方法では、一般的には、上記の懸濁液を一対の電極
を持った容器に導入し、０〜４０°Ｃの温度で高電圧パ
ルスをかけることによってエレクトロポレーション（電
気穿孔）が行われる。

コノエレクトロポレーションのための装置は、多くのも
のが市販されており、例えば／くイオラツド（Ｂｉｏ　
Ｒａｄ）社製のシーンパルサー（ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ
　；商品名）、島津製作所製のＧＴＥ−１、ビーコン社
製のビーコン２０００、ホファーサイエンスインスツル
ーメント（Ｈｏｆｆｅｒ　　ＳｃｉｅｎｃｅＩｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔ）社製のブロージエネーター　および米国Ｐ
ｄｓ　　Ｌｎｃ、製のザラバー等がこの方法において利
用可能である。

この方法において、エレクトロポレーションを例えばポ
リエチレングリコールなどの共存下に行うことで更に形
質転換効率を増加させることができる。

ポリエチレングリコールとしては、例えばポリエチレン
グリコール２０００．４０００．６０００および２００
００などを使用することができる。また、ポリエチレン
グリコール濃度が高い程、一般に高い形質転換効率を示
す。一般には約３０％（通電懸濁液中のポリエチレング
リコール重量％）までの濃度で好ましい効率が得られる
が、さらに高い濃度でも実施可能である。

また、本発明の方法では、通電される懸濁液中にＭｇＣ
ｌ２２、ＣａＣｌ２２、ＭｎＣｌ２２等の無機物質が存
在していてもよいが、存在量は少ない方が好ましい。

このようにエレクトロポレーションに付したビフィドバ
クテリウム属の細菌を次いで公知の選別過程に付して得
られた形質転換体を選別する。形質転換体は、例えば各
種の抗生物質に対する耐性、特別な糖の資化能およびア
ミノ酸の要求性などにより選別される。これらの能力を
有する遺伝子は、本発明で使用するＤＮＡ中に予め入れ
られである。

次に実施例によってこの発明を更に具体的に説明するこ
とにする。なお、これらの実施例は本発明を説明するた
めのものとして開示するものであって、この記載によっ
て本発明が限定されるものと解されるべきではない。

なお、以下の実施例におけるエリスロマイシン耐性：］
ａニミニ−ｍＲコロニー、！：略記する）からのプラス
ミドの抽出ならびに確認は次の手順に従った。

プラスミドの抽出 エリスロマイシンをｌμｇ／ｍＱ含有する以下の実施例
１記載のブリッグス培地５ｍαにＥｍ”コロニーを一白
金耳植付け、３７°Ｃで終夜静置培養し、種培養液を得
た。エリスロマイシンを３μｇ／ｍＱ含有するブリッグ
ス培地１００ｍ４に、この種培養液を１ｍＱ植付け、３
７°Ｃで終夜静置培養した。次いで、得られた培養液１
００ｍＱを、エリスロマイシンを３μｇ　／　ｍ　Ｑ含
有するブリッグス培地９００ｍαに植付け、３７°Ｃで
４時間静置培養した。菌体を捕集しく遠心分離：　６０
００ｒｐｍ、　５分、４°Ｃ）、これをＴＥＳ　（３０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＱ、＋　５０ｍＭ　ＮａＣＱ＋　５
　ｍＭ　ＥＤＴＡＢｐＨ８，０）　５０ｍＱに懸濁し、
再度遠心分離して菌体を捕集した。この菌体を２５％シ
ュークロース水溶液（２５％シュークロース／　５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ２−１　ｍＭＥＤＴＡ　；　ｐＨ８
，０）　８　ｍＱに懸濁し、これにリゾチーム溶液（リ
ゾチームｌｏｍｇ／　０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−（、Ｑｌ
　ｍＯ，；ｐＨ８，０）　２　ｍＱを添加し、３７°Ｃ
で１時間保温した。

その後０°Ｃに冷却し、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ
８，０）を３．２ｍα添加し、次いで１０％５ＯＳ（ラ
ウリル硫酸ナトリウム）を３．２ｍα添加し、０°Ｃで
１０分間静置した。これに５ＭＮａＣαを５．６ｍｆ２
添加し、ゆるやかに撹拌した後Ｏ″Ｃで１時間静置し、
遠心分離（２４０００ｒｐｍ、　３０分、４°Ｃ）によ
り上溝部を得ｔ；。

この上溝部に等量の７エノールーＣＩＡＡ混液ＣＴＥ（
１０ｍＭ　Ｔｒ：５−ＣＱ＋−１ｍ１ｉｌ　ＥＤＴＡ　
ＨｐＨ８，０）飽和フェノール１容８とクロロホルム：
イソアミルアルコール（２４：１）混液１容量との混液
〕を加えて振盪後、９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離
し、上溝を得た。

この操作を更に２回繰り返した。得られた上清に同量の
ＣＩＡＡを加え、振盪後、９０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離して、上溝を得た。この上清に１７１０倍量の３
　Ｍ　ＣＨｓＣＯＯＮａ水溶液および２．２倍量のエタ
ノールを加え、−８０°Ｃで１時間静置した後、９００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られた沈澱を７０
％エタノールで洗浄し、乾燥し、セシウムクロライド超
遠心分離しく　９９０００ｒｐｍＳ１６時間）、プラス
ミドバンドを捕集した。これをセファデックスＧ−２５
カラムにより脱塩し、フェノールで３回抽出した後、エ
ーテルで洗浄し、次いでエタノールで沈澱せしめ、沈澱
を７０％エタノールで洗浄した。乾燥後、得られたプラ
スミドを蒸留水に溶解して、以下の試験に供した。

プラスミドの確認 １、　プラスミドサイズ二上記のようにして得られたＥ
ｍ”コロニーから抽出したプラスミドおよびｐＡＭβｌ
Ｎｏ、ｌプラスミドをアガロースゲル電気泳動にかけて
移動度を観側し、同一の移動度を示す場合にそれぞれの
サイズが等しいものと評価する。

２、制限酵素の切断パターン：上記のようにして得られ
たＥｍ”コロニーから抽出したプラスミドおよびｐＡＭ
βＩＮｏ、１プラスミドを、制限酵素（ＥｃｏＲＩ　、
　ＰｖｕＩ［、Ｈｉｎｄｎｌ、Ｋｐｎ　Ｉ等）で切断し
、アガロースゲル電気泳動を行って、切断断片を比較し
、両者の切断断片数および断片サイズが同一であった場
合、二つのプラスミドは同一であると判断する。

実施例　ｌ 以下の培地組成を有するブリッグス培地を常法により調
製した。

培地組成ニ ドマドジュース抽出物＊４００ｍＱ ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｇス
ターチ　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５ｇ酵
母エキス〔デイフコ（Ｄｉｒｃｏ）社製）　　　　　　
ｈポリペプトン〔犬五栄養（株）製〕１５ｇグルタミン
酸ナトリウム　　　　　　　　　　　２９ＣＨｘＣＯＯ
Ｎａ・３Ｈｚ０　　　　　　　　　　　　　　　１０ｇ
ＸＩ（２ＰＯ４ｈ ＮａＣＱ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
５ｇ蒸　留　水　　　　　　全体が１０００ｍρになる
まで添加ｐＨ−６，８ ＊　トマトジュース抽出物は、市販トマトジュース〔デ
ルモンテ（Ｄｅｌ　Ｍｏｎｔ）社製〕に等量の蒸留水を
加え、約６０℃で１時間加熱し、更に１００°Ｃで５分
間加熱した後、冷却して、水不溶物を炉別して調製した
。

上記培地は、使用時にシスティン２００ｍｇおよびアス
コルビン酸ナトリウム３．４ｇを蒸留水’１０ｍＱに溶
解した溶液を添加して用いる。

得られた培地中ごビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ
ｉｆｉｄｏｂａ−ｃｔｓｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）１０
８Ａ株を一晩３７°Ｃで静置培養して得た培養液０．２
ｍＱを新鮮な上記の培地ＬＯｍＯ，に接種し、これを３
７°Ｃで静置培養し、培地の濁度がＡ、。、＝０．２と
なったところでこれを４℃で３０００ｒｐｍ　１０分間
の遠心分離に付して集菌した。得られた菌体からなる沈
澱に氷冷した緩衝液（０、４Ｍのスクロースを含む８ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０）を加え懸濁して
、洗浄し、これを４℃で３００Ｏｒｐｍ　１０分間の遠
心分離に付して集菌した。この洗浄、集菌の処理を更に
２回行ったのちに、培養液の１／１００量の緩衝液に懸
濁して菌体懸濁液とした。

別にプラスミドとしてエリスロマイシン耐性遺伝子を有
するｐＡＭβｌＮｏ、ｌを用い、この溶液と蒸留水とを
合わせて５０μａとしたものと、４０％ポリエチレング
リコール６０００水溶液２５０μαとを混合し、氷冷し
ておいた。これに先の菌体懸濁液１００μαを加え、良
く混合してシーンパルサー付属のキュベツトに移し、１
０分間氷冷したのち５　ｋＶ／　ｃｍ、　　ｌμＦの電
気パルスをかけた。電気パルスをかけた後再び１０分間
氷冷し、試験管に移し、４°Ｃで１５０００ｒｐｍ、　
２分間の遠心分離ニ付シて集菌した。沈澱に培地１　ｍ
Ｑを加えて懸濁し、３７°Ｃで３時間保温後、プレート
当たり０．４ｍＱの割合で撒布し、３７°Ｃの温度で嫌
気条件下に培養した。

同様の電気パルス処理をグラスミドを加えなかったもの
について行った。但しプレート当たり０．４ｍＱの割合
で懸濁液を撒布したものを３７℃の温度で嫌気条件下に
培養してネガティブコントロールとした。

３日および７日後のエリスロマイシン耐性コロニーの形
成数をプレート当たりのコロニー数で表すと法衣の通り
である。

この表から、電気パルス処理をＤＮＡの共存下で行った
菌は著しくエリスロマイシン耐性を獲得していることが
分かる。

得うれたエリスロマイシン耐性コロニ （ｐＡＩＪβｌ　　Ｎｏ、ｌを添加した場合）からプラ
スミドを抽出して、そのプラスミドサイズおよび制限酵
素の切断パターンを上記ｐＡ）Ｊβｌ　　Ｎｏ、ｌの場
合と比較したところ同じであっｌ；。これはＢ。

ロンガム１０８Ａ株にｐＡＭβｌ　Ｎｏ、ｌが導入され
ていたことを示す。

実施例　２ ポリエチレングリコール２０００を用いたことを除いて
実施例■を繰り返した。３日および６日後のエリスロマ
イシン耐性コロニーの形成数を以下に表示する。

限酵素の切断パターンを上記ｐＡＭβＩ　　Ｎｏ、Ｌの
場合と比較したところ同じであった。これはＢ。

ロンガム１０８Ａ株にｐＡＭβｌ　Ｎｏ、ｌが導入され
ていたことを示す。

実施例　３ 添加するプラスミドの量、印加する電気パルス、および
ポリエチレングリコールの種類を変えて実施例１を繰り
返した。操作条件および６日後のエリスロマイシン耐性
コロニーの形成数を以下に表示する。

得うレＩ；エリスロマイシン耐性コロニー（ｐＡＭβｌ
　　Ｎｏ、ｌを添加した場合）からブラスミ得られたエ
リスロマイシン耐性コロニ ドを抽出して、そのプラスミドサイズおよび制（ｐＡＭ
βｌ　　Ｎｏ、ｌを添加した場合）からプラスミドを抽
出して、そのプラスミドザイズおよび制限酵素の切断パ
ターンを上記ｐＡＭβＩ　　Ｎｏ、ｌの場合と比較した
ところ同じであった。これはＢ。

ロンガム１０８Ａ株にｐＡＭβｌ　Ｎｏ、ｌが導入され
ていたことを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ビフイドバクテリウム属の細菌と外来性のＤＮＡと
   を含む懸濁液にパルス電流を通電することを特徴とする
   ビフイドバクテリウム属の細菌の細胞内に外来性のＤＮ
   Ａを導入する方法。 ２）ビフイドバクテリウム属の細菌が対数増殖期の前期
   の生育段階のものである、請求項１に記載の方法。 ３）懸濁液がポリエチレングリコールを含むものである
   ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。