JPH02468A - 乳酸桿菌に外来ｄｎａを導入する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ラクトバチルス属（Ｌａａｔｏｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　Ｊ４　）の細菌（乳酸桿菌）の細胞内に外来ＤＮ
Ａを導入する方法に関する。

更に具体的には本発明は、エレクトロポレーション法（
１！気穿孔法）を乳酸桿菌に適用し、釧菌の細胞内に外
来ＤＮＡを導入することにより形質転換された乳酸桿菌
を得る方法に関する。

〔従来の技術〕

これまでに微生物に外来性の遺伝子（ＤＮＡ　）を導入
してこの宿主微生物に外来性の遺伝子の遺伝情報を発現
させる多くの試みが行なわれている。そしてこの外来性
の遺伝子が導入された微生物すなわち形質転換体を得る
種々の方法の提案が既になされている。

しかしながら、外来性の遺伝子の導入については微生物
の種類によって、固有の条件と問題点があり、成る方法
が特定の微生物に適用可能であってもその方法がそのま
ま他の微生物に適用しえない場合も多い。

例えば、大腸菌に外来性の遺伝子を導入する方法として
ＣａＣｌ２を用いる方法、ポリオキシエチレンを用いる
方法などがあり、枯草菌や酵母ではプロトプラスト法等
が広く知られているところであるが、乳酸桿菌に関して
は上記したいずれの方法を採用してもその細胞内に外来
性のＤＮＡを導入することは困難であって、乳酸桿菌の
細胞内への外来性のＤＮＡの直接導入法の開発が望まれ
ていた。

乳酸桿菌はヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズなどの乳製
品製造、飼料の製造、醗酵法による乳酸の製造などの産
業分管において広く用いられている重要な菌であり、こ
の菌を所望の性質を発現するように人為的に改変して育
種することができれば産業上のメリットもきわめて大と
なり、従ってこの育種の手段としての遺伝子工学的手法
はかかる観点からしても非常に重要な手段となるはずで
ある。

しかしながら、上記したように乳酸桿菌に外来性のＤＮ
Ａを導入する直接的方法は確立されておらず、わずかに
コンシュゲージシン法［：Ａ、Ｗ。

Ｓｈｒａｇｏ　ａｔ、ａｌ、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒ
ｏｎ、　Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ、　。

５２、ｐｐ５７４−５７６（１９８６））およびプロト
プラストを調製したのちＤＮＡを導入する方法（特開昭
６０−５０６８６号公報）が現在までに知られているに
すぎない。このコンシュゲージシン法ではＤＮＡ供与菌
とＤＮＡ受容菌の二種の菌が必要でありまた複雑で、偶
然的な菌体量接合条件を必要とするのみならず所望の遺
伝子を選択的にＤＮＡ受容菌中に導入することがほとん
ど不可能である。従って、現段階において試行錯誤的な
実験の繰り返しが必要であって、結果についての再現性
にとぼしく信頼性のある方法とは云いがたい。またプロ
トプラスト法にあっては、乳酸桿菌のプロトプラスト形
成工程を経なければならず、プロトプラスト化が不充分
の場合は既導入効率が低いし、プロトプラスト化が進み
すぎると菌の生存率が低下するなどの問題がある他に１
プロトプラストの調製法、復元の方法に未解決の部分が
あるなどＤＮＡ導入方法として確立された方法ではない
。ところで、最近になって哺乳類細胞に外来性のＤＮＡ
を導入する方法としてエレクトロポレーション法が提案
された。

この方法は、一対のｉＫ極を有する容器に細胞の懸濁液
と導入すべきＤＮＡを入れ、懸濁液中に浮遊した細胞に
高電圧パルス電流を流して細胞膜を変化せしめ（例えば
物理的な傷害を与え）、この変化した膜を通して外来性
のＤＮＡを細胞内圧導入しようというものである。すな
わち、このエレクトロポレーション法は細胞膜の局所的
な一時破壊に基づく物質の透過性の増大を利用しようと
するもので、これまでにサイズの大きい動物細胞および
植物細胞への外来性のＤＮＡの導入のための技法として
用いられ、この技術はほぼ確立の域に達している。微生
物に対するこのエレクトロポレーション法の適用の試み
は酵母および細菌（Ｂ、　ｏｅｒｅｕｓ　）のプロトプ
ラストについて既に行なわれている〔稲葉浩子外２名に
よる総説「電気穿孔法による哺乳類細胞への遺伝子導入
」蛋白質核酸酵素ｖｏ１．３２．應１　（１９８７）１
０〜２１頁参照〕ものの、乳酸桿菌に対してはこの方法
の適用可能性を報告した報文は知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記したところから、乳酸桿菌の細胞内に外来性のＤＮ
Ａを直接導入する方法が求められてぃるものの、細胞内
に外来性のＤＮＡを導入する上記公知の手法は適用する
ことができなかった。

従ってこの乳酸枠＠に対する新らしい細胞内への外来性
のＤＮＡの導入手法の開発が求められたのである。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる現状に鑑みて本発明者らは乳酸桿菌について遺伝
子操作上の問題点を克服してこの細菌の細胞内に外来性
のＤＮＡを導入するための有用な技術を確立すべく研究
を重ねた。

その結果、エレクトロポレーション法を乳酸桿菌に適用
することによって所望のＤＮＡを直接導入することに成
功し本発明を完成させた。

すなわち、本発明者らは乳酸桿菌を培養し、菌体を捕集
し、これを緩衝液ＫＷＩＡ濁し、外来性のＤＮＡを添加
混合し、この懸濁液にパルス電流を通電することによっ
て外来性のＤＮＡを乳酸桿口の細胞内に直接導入しうる
ことを見出したのである。

従って本発明は、乳酸桿菌の浮遊細胞に外来性のＤＮＡ
の共存下にパルス電流を通電し、外来性のＤＮＡを乳酸
桿菌の細胞内に直接導入することを特徴とするものであ
る。

更に本発明は、上記の外来性のＤＮＡの共存下における
パルス電流の通電に際してポリエチレングリコールなど
を存在させることを特徴とするものである。

本発明によって形質転換しうる乳酸桿菌はラクトバチル
ス属に含まれる総ての種に属するものであって、代表例
としてラクトバチルス・カゼイ（Ｌａａｔｏｂａａｉｌ
ｌｕｓ　ｏａｇｅｉ　）、ラクト、ｚチルス・アシドフ
ィルス（Ｌａｏｔｏｂａｏｉｌｌｕｓ　ａａｉｄｏｐｈ
ｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｏｔ
ｏｂａｏｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｇ　）、ラクト
バチルス・うＰテイス（Ｌａｃｔｏｂａｏｉｌｌｕｓ　
１ａｃｔｉｓ　）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（
Ｌａｃｔｏｂａｏｉｌｌｕｇ　ｈｅｌｖｅｔｉａｕａ　
）、ラクトバチルス・サリパリウス（Ｌａａｔｏｂａｏ
ｉｌｌｕｓｇａｌｉマａｒｉｕｓ　）　、ラクトバチル
ス・プランタルム（Ｌａｏｔｏｂａａｉｌｌｕｓ＋　ｐ
ｌａｎｔａｒｕｍ　）、ラクトバチルス・ファーメンタ
ム（Ｌａｏｔｏｂａｏｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ
　）、ラクトバチルス・セロビオ−サス（Ｌａｏｔｏｂ
ａｏｉｌｌｕｓｃｅｌｌｏｂｉｏａｕｇ　）、ラクトバ
チルス・デルプルキ（Ｌａｃｔｏｂａｏｉｌｌｕｓ＋　
ｄｅｌｂｒｕｅｏｋｉｉ　）、ラクトバチルス・プヒネ
リ（Ｌａｃｔｏｂａｏｉｌｌｕａ　ｂｕｏｈｎｓｒｉ　
）　、ラクトバチルス・プレビス（Ｌａａｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕａ　ｂｒｅｖｉｇ　）などを挙げることができる
。

本発明の方法は、誘導期、増殖期および静止期の乳酸菌
に対して適用可能であるが、対数増殖期の前期の生育段
階の菌体を使用することが好ましい。この対数増殖期と
は、菌を培地に接種して培養した場合に１最初のほとん
ど増殖しない時期（ｌａｇ　ｐｈａｓｅ　）の次にやっ
てくる菌が最も増殖する時期（ｌｏｇ　ｐｈａｓｅ　）
で、培養時間に対する菌数（または濁度）の対数の関係
が直線関係になる時期を指すものである。この期間以外
の段階の細菌に対してパルス電流を通電した場合の外来
性のＤＮＡの導入の効率は低いものとなる。

この外来性のＤＮＡの導入に好適した期間である対数増
殖期の前期は、乳酸桿菌を適当な培地で培養し、各培養
時間に対する各培養菌の濁度の対数をプロットしく増殖
曲線）、一定の濁度の範囲内となった時期と定められる
。例えば、ラクトバチルス・カゼイＩＡＭ１０４５株を
ブリッグス（Ｂｒ１ｇｇｇ　）培地で培養した場合には
、Ａ６００＝約０．０５〜約０．３０濁度となった時期
に相応する。

このようにして培養して得た細菌を適当な手段、例えば
遠心分離によって捕集する。この場合細菌の菌体に損傷
を与えたり、生存率が低下するような分離手段はさけな
ければならない。

このように捕集された乳酸桿菌を緩衝液中に分散懸濁せ
しめる。

この乳酸桿菌の懸濁に用いる緩衝液としては、既知の緩
衝液を用いることができ、一般にｐＨ５，５〜９の範囲
のものを使用することができるが、例えばリン酸ナトリ
ウム緩衝液、トリス塩１！ｉ！緩衝液またはこれらのａ
衝液にシュークロースを加など えたもｂτ挙げられる。

この乳酸桿菌の＠濁液中の細菌数は一般にはある程度多
い方が好ましいが、有用な形質転換体が得られる範囲内
で十分である。

この１４Ｊ酸桿菌の懸濁液中に、菌の測胞内に導入すべ
き外来ＤＮＡを添加する。一般的に添装置が大であれば
それだけ細胞内への導入の確率は増大する。通常０．０
１μ９　／　ｃｕｖｅｔｔｅ以上あれば実施できる。

ここで添加されるＤＮＡは乳酸桿石の形質転換に用いう
るすべてのＤＮＡを含むものであって、例えば２〜３Ｋ
ｂＮ度の比較的低分子嘴のものから５０〜１００Ｋｂ又
はそれ以上の高分子像のものまでが含まれうる。そして
こうしたＤＮＡの具体例としては、例ればν諷β１（煮
１およびＡ２　）　；ｐＥＩＬ。

１００３および１）ＢＬ１０２７（特願昭６０−２９！
１６４１号記載の　　　　　　　　　　　プラユミド）
；ｐ０１９４などが挙げられる。

外来性のＤＮＡが添加された懸濁液は次いでエレクトロ
ポレーションに付される。

この方法では、一般的には、上記の懸濁液を一対の平板
電極を持った容器に導入し、０〜４０℃の濁度で高電圧
パルスをかけることによってエレクトロポレーション（
通気穿孔）が行なわれる。

このエレクトロポレーションのための装置は、多くのも
のが市販されており、例えばバイオラッド（Ｂｉｏ　Ｒ
ａｔ　）社製のシーンパルサー（ＧｏｎｅＰｕｌｓａｒ
；商品名）、烏津製作所製のＧＴｇｌ、ビーコン社製の
ビーコン２０００および米国Ｐｄ５Ｉｎｏ、ｉｌＪのザ
ラパー等がこの方法において利用可能である。

この方法において、エレクトロポレーションを例えばポ
リエチレングリコールなどの共存下に行なうことで更に
形質転換効率を増加させることができる。

ポリエチレングリコールとしては、例えばポリエチレン
グリコール２０００．４０００．６０００など および２００　ｏ’ｙｉ；’使用することができる。ま
た、ポリエチレングリコール濃度が高い程、一般に高い
形質転換効率を示す。一般には約５０％（通？１懸濁液
中のポリエチレングリコール血清％）までの濃度で好ま
しい効率が得られるが、さらに高い濃度でも実施可能で
ある。

また、本発明の方法では、通電される懸濁液中にｙｇｃ
ｔ２、ＣａＣｌ２、ＭｎＣ４２等の無機物質が存在して
いてもよいが、存在量は少ない方が好ましい。

このようにエレクトロポレーションに付した乳酸桿菌を
次いで公知のＡ別過程に付して、得られた形質転換体を
選別する。形質転換体は、例えば各種の抗生物質に対す
る耐性、特別な糖の資化能およびアミノ酸の要求性など
により選別される。これらの能力を有する遺伝子は、本
発明で使用するＤＮＡ中に予め入れられである。

次に実施例によってこの発明を更に具体的に説明するこ
とにする。なお、これらの実施例は本発明を説明するた
めのものとして開示するものであって、この記載によっ
て本発明が限定されるものと解されるべきではない。

実施例　１ 以下の培地組成を有するプリッグス（Ｂｒ１ｇｇ５）培
地を常法により調製した。

培地組成ニ ドマドジュース抽出物”　　　　　　　　４０〇−グル
コース　　　　　２０９ スターチ　　　　　　０．５９ 酵母エキス〔デイフコ（Ｄｉｒｃｏ　）社製〕　　　　
６クポリはプトン〔大工栄養（株）＠〕　　　　　１ｓ
ｙグルタミン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　２９
ＣＨ３ＣＯＯＮＪＬ　−３Ｈ２Ｏ１０９ＫＨ２ＰＯ４４
９ ＮａＣｔ５９ 蒸　留　水　　全体が１０００ｔＩＬｔになるまで添加
ｐＨ＝　６．８ 来トマトジュース抽出物は、市販トマトジュース〔デル
モンテ（Ｄｅｌ　Ｍｏｎｔｅ　）社製〕に等量の蒸留水
を加え、約６０°Ｃで１時間加熱し、更に１００℃で５
分間加熱した後、冷却して、水不溶物を戸別して調製し
た。

上記培地は、使用時にシスティン２００ｑおよびアスフ
ルピン酸ナトリウム３．４９を蒸留水１〇−に溶解した
溶液を添加して用いる。

得られた培地中で６７℃で終夜静置培養したラクトバチ
ルス・カゼイ（Ｌ、カゼイ）ＩＡＭ１０４５株の種培養
液０．２−を上記培地１０−に接種し、３７℃で＃置培
養した。培養液２〇−から対数増殖期の前期（Ａ６ｏｏ
＝０．２５　）の菌体を捕集しく遠心分離：　５０００
ｒ、ｐ、ｍ、１０分）、これを室温の緩衝液Ｉ（７ｍｕ
リン酸ナトナトリウム緩衝液Ｈ７，０）、１ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２および０．４　Ｍシュークロース〕で洗浄した後
、同じ緩衝液Ｉ　　Ｏ，２５ｄを加え、菌体を懸濁せし
めた。得られた懸濁液０．１−１４０％ポリエチレング
リコール６００゜水溶液０．３ゴおよびエリスロマイシ
ン耐性遺伝子を有するプラスミドＩ）ＡＭβ１罵１４μ
りを混合し、１０分間＃装した後、バイオランド（Ｂｉ
。

Ｒ＆（１）社製のシーンパルサー（Ｇｏｎｅ　Ｐｕｌｍ
ａｒ　）を用い５ｋｖ／１−１Ｒ％１μＦの条件下室温
で通電した。通電後１０分間静置し、１５０００ｒ、ｐ
、ｍ、で２分間遠心分離して菌体を捕集した。

捕集した菌体を上記培地１１ｎｔに懸濁し３７℃で２時
間保温した。次いで、この懸濁液０．３−を、エリスロ
マイシン含有Ｂｒ１ｇｇ５寒天培地に塗布し、嫌気条件
下３７℃で１週間培養したところ、エリスロマイシン耐
性コロニーが１６１コロニー得られた。

得られたエリスロマイシン耐性コロニーからプラスミド
を抽出して、そのプラスミドサイズおよび制限酵素の切
断パターンを上記１）ＡＭβ１ム１の場合と比較したと
ころ、同じであった。これはり、カゼイエ、騙１０４５
株Ｋ　１）ＡＭβＩＡ１が導入されていたことを示す。

また、１）ＡＭβ１屋１を加えないで、上記工程を繰返
したが、エリスロマイシン耐性コロニーは得られなかっ
た。

なお、上記実施例および以下の実施例におけるエリスロ
マイシンＭ性コロニー（ｒｔｆｆｉ／Ｒコロニーと略記
する）からのプラスミドの抽出ならびに確認は次の手順
に従った。

プラスミドの抽出 エリスロマイシンを１μ９　／ｍｅ含有するＢｒ１ｇｇ
５培地５　ｍｌにＥｍ　　コロニーを一白金耳植付け、
３７℃で終夜静置培養し、種培養液を得た。エリスロマ
イシンを３μり／−含有するＢｒ１ｇｇｇ培地１００ｄ
Ｋ、この種培養液を１−植付け、３７℃で終夜静置培養
した。次いで、得られた培養液１００ｍを、エリスロマ
イシンを３μ９／−含有するＢｒｉｇｇｓ培地９０（ｌ
ｄに植付け、６７℃で４時間静置培養した。菌体を捕集
しく遠心分離：　６０００　ｒ、ｐ、！Ｉ１．。

５分、４℃）、これをＴＥ８　（５０ｍＭ　ＴｒｉＢ−
ＣＬ＋５０ｍＭＮａ１ｊ＋５ｍＭ　ｇＤＴＡ；　ｐＨ８
，０）５０−に懸濁し、再度遠心分離して菌体を捕集し
た。この菌体な２５％シュークロース水溶液（２５％シ
ュークａ　−／Ｃ１５ｎｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＣＬ−１ｍ
Ｍ　ＲＤＴＡ　；ｐＨｓ、ｏ）ａ−に懸濁し、これにリ
ゾチーム水浴液（リゾチーム１０ＷＩｇ１０．２５Ｍ　
Ｔｒｉｍ　−ＣＬ　　１　ｔｄ　；　ｐＨ８，０）２−
を添加し、３７℃で１時間保温した。

その後０℃に冷却し、０．２５Ｍ　ＢＤＴＡ　（ｐＨ８
，０）を３．２−添加し、次いで１０％ＳＤＢ　（ラウ
リル硫酸ナトリウム）をｉ２ＩＩ１ｇ添加し、０℃で１
０分間静置した。これに５　Ｍ　Ｎ＆（１’Ｌを５．６
−添加し、ゆるやかに攪拌した後０℃で１時間静置し、
遠心分離（２４０００ｒ、ｐ、ｍ、、３０分、４℃）に
より上清部を得た。この上清部に等量のフェノール−Ｃ
ＩＡＡ　ａ液（ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−Ｃｔ＋１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐＨ８，０）飽和フェノール−容量
とクロロホルム：インアミルアルコール（２４：　１　
）混液１容量との混液〕を加えて振盪後、９０００　ｒ
、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離し、上清を得た。この操
作を更に２回繰返した。得られた上清に同量のＣＩＡＡ
を加え、振盪後、９０００　ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠
心分離して、上清を得た。この上清Ｋ［ｌ＃にの３　Ｍ
　ＣＨ３ＣＯＯＮａ水溶液および２．２倍世のエタノー
ルを加え、−８０℃で１時間静置した後、９０００　ｒ
、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離した。得られた沈殿を７
０％エタノールで洗浄し、乾燥し、セシウムクロライド
超遠心分離しく　９９０００ｒ、ｐ、ｙｓ、　、１６時
間）、プラスミドバンドを捕集した。これをセファデッ
クスＧ−２５カラムにより脱塩し、フェノールで３回抽
出した後、エーテルで洗浄し、次いでエタノールで沈殿
せしめ、沈殿を７０％エタノールで洗浄した。乾燥後、
得られたシラスミドを蒸留水に溶解して、以下の試験に
供した。

プラスミドの確認 ｔ　プラスミドサイズ二上記のようにして得られた加８
コロニーから抽出したプラスミドおよびＥＸＡＭβ１ム
１プラスミドをアガロースゲル電気泳動Ｋかけて移動度
を観測し、同一の移動度を示す場合にそれぞれのサイズ
が等しいものと評価する。

２、　制限酵素の切断パターン：上記のようにして得ら
れたＥ♂コロニーから抽出したプラスミドおよび１）Ａ
Ｍβ１ム１プラスミドを、制限酵素（ｇｃｏＲＩ、ｐｖ
ｕ　、［、阻ｎｄｉＩＩ、　Ｋｐｍ　１等）で切断し、
アガロースゲル電気泳動を行って、切断断片を比較し、
両者の切断断片数および断片サイズが同一であった場合
、二つのプラスミドは同一であると判断する。

なお上記した実施例１の操作を対数増殖期の前期（Ａ６
ｏｏ　＝０．２　）の菌体について、緩衝液ＩＩ（７ｍ
Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐ）４８．０）、１ｍＭ、ＭｇＣ
ｌ２および０．４Ｍシュークロース〕を用いた以外は同
様に行なって、４０個のエリスロマイシン耐性コロニー
が得られた。

実施例　２ シーンパルサーの連成条件を１．２５　ｋＶ　１０ｎ、
２４　ＰＦに変えた以外は、実施例１の方法を繰返した
。

６８コロニーのエリスロマイシン耐性コロニーが得られ
た。

このコロニーからプラスミドを抽出し、これをＩ）ＡＭ
β１ノ短１と比較したところ、プラスミドのサイズおよ
び制限酵素の切断パターンが一致した。Ｌ、カゼイＩＡ
ＭＩＱ４５株にｐＡＭβ１煮１が導入されていた。

またＰＡＭｐＩＡｌを添加しないで、上記工程を繰返し
たが、エリスロマイシン耐性コロニーは得られなかった
。

実施例　６ 実施例１における菌体の捕集時期を種々変えて、すなわ
ち菌の増殖中の増殖時期の異なる時期の菌体な用いて実
施例１の方法を繰返した。

その結果を以下に示す。

Ａ４００　：　６００ｎｍの吸光度（０，Ｄ、）を示す
。

実施例１と同様にして、得られたコロニーからプラスミ
ドを抽出し、ｐＡＭβ１４１であることを確認した。

実施例　４ 実施例１における捕集菌体の代りにＡ６ｏｏ＝０．２の
菌体を用い、またｐＡＭβ１Ａ１の代りにｐＡＭβ１扁
１のＤＮＡが一部欠失したシラスミドＩ）ＡＭβ１墓２
をＤＮＡ　ｌで１μり添加し、実施例１記載の方法を繰
返した。

寒天プレート当たり５個のエリスロマイシン耐性コロニ
ーが得られた。

上記エリスロマイシン耐性コロニーからそれぞれプラス
ミドを抽出し、それぞれをｐＡＭβＩＡ２と比較したと
ころ、いずれもプラスミドのサイズおよび制限酵素の切
断パターンが一致し、１）ＡＭβ１罵２が導入されてい
たことがわかる。

実施例　５ 実施例１の培地中で！１７℃で終夜静置培養したラクト
バチルス・カゼイエん１０４５株の種培養液０．２−を
上記培地１０−に接種し、３７℃で＃置培養した。培養
液８０ゴからＡ６ｏｏ＝０．２の菌体を捕集しく遠心分
離：　３０００ｒ、ｐｏｍ、、１０分、４℃）、これを
４℃の緩衝液１：８１！１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，５）および０．４　Ｍシュークロース〕１０ｄで洗浄
した後、同じ緩衝液０．７５ｓｊを加え、菌体を懸濁せ
しめた。得られた懸濁液０．１ｍｌ、エリスロマイシン
耐性ｉＩｌ伝子を有するプラスミドシ諷β１罵１２μ９
および４０％ポリエチレングリコール（ｐｗａ−６０Ｑ
ａ　）水溶液０．３ｄを混合し、０℃で１０分間＃装し
た後、バイオランド社製のシーンパルサーを用い、５ｋ
”／／α、１μＦの条件下、０℃で通電した。通電後０
℃で１０分間静置し、遠心分離（１５０００ｒ、ｐ、ｍ
、、２分、４℃）して、菌体を捕集した。

捕集した菌体な上記培地１−に懸濁し、′５７℃で６時
間培養した。次いで、この懸濁液α５ｔｘｔをエリスロ
マイシン含有Ｂｒ１ｇｇｇ寒天培地に塗布し、嫌気条件
下３７℃で１週間培養したところエリスロマイシン耐性
コロニーが４９００コロニー得られた。

実施例１と同様にして、このコロニーからプラスミドを
抽出し、ｐＡＭβＩＡ１であることを確認した。またプ
ラスミドを加えない場合は、エリスロマイシン耐性コロ
ニーは得られなかった。

実施例　６ 実施例５におけるポリエチレングリコール（ｐｇｏ６０
００）の漏度を０．５．１０．１５．２０．２５％（連
成懸濁液中のＰＥＧ　ｉ　ｉ％）に変化させて、実施例
５の方法を繰返した。得られた結果を以下に示す。

実施例１と同様にして、得られたコロニーからプラスミ
ドを抽出し、ｐＡＭ　／３１　Ａ　１であることを確認
した。また、プラスミドを加えない場合は、耐性コロニ
ーは得られなかった。

実施例　７ 実施例５におけるプラスミドｐＡＭβ１厘１２μりの代
りに０．４μりを用いまたポリエチレングリコール（ｐ
ｇＧ）として以下の種類のものを用いて、実施例５の方
法を繰返した。得られた結果を以下に示す。

ＰＥ０２０００　　　　　　　　４８０ＰＥＧ４０００
　　　　　　　　　　７２ＰＥ０６０００　　　　　　
　　　　６８ＰＥＧ２００００　　　　　　　　１０９
次いで、実施例１と同様にして、得られたコロニーから
プラスミドを抽出し、ｐＡＭｐＩＡｌであることを確認
した。また、プラスミドを加えない場合は、耐性コロニ
ーは得られなかった。

実施例　８ 実施例５で用いたし、カゼイＩＡＭ１０４５株の代りＫ
Ｌ、アシドフィルスＳ８・２７株（ＦＥＢＭ８５５１　
）（ＰＥＣ）　６０００使用）およびり、カゼイＪＣＭ
ＩＣ１５３株（ＰＥ（）　２０００使用）を用い、また
通電条件として５　：ｉｃｖ／ｍ、１μＦを用いて、実
施例５の方法を繰返した。

Ｌ、アシドフィルスＳＳ・２７株の場合、３個のエリス
ロマイシン耐性コロニーが得られ、またり、カゼイＪＣ
Ｍ１０５３株の場合、２７個のエリスロマイシン耐性コ
ロニーが得うレタ。

次いで、実施例１と同様にして、得られたコロニーから
プラスミドを抽出し、１）ＡＭβＩＡ１であることを確
認した。また、プラスミドを加えない場合は耐性コロニ
ーは得られなかった０実施例　９ 実施例５で用いたＬ６カゼイＩＡＭ１０４５株の代りに
、Ｌ、アシドフィルス８Ｂ・２７株およびり。

アシドフィルスＡＴＣＣ４３５６株を使用し、またプラ
スミドｐＡＭβ１ノに１の代りにプラスミドｐＣｉ９４
を使用し、またエリスロマイシン含有Ｂｒ１ｇｇ８寒天
培地の代りにクロラムフエニフール５μり／−含有Ｂｒ
ｉｇｇｆｌ寒天培地を使用して、５ｋＶ／ｃｍ、１μＦ
の通電条件下、実施例５の方法を繰返した。

Ｌ、アシドフィルスＳＳ・２７株の場合、４＠のクロラ
ムフェニコール耐性コロニーカ？Ｉ　Ｉ−）れ、またＬ
１アシドフィルスＡＴＣＣ４３５６株の場合、１２個の
クロラムフエニフール耐性コロニーが得られた。

次いで、実施例１と同様にして、得られたコロニーから
プラスミドを抽出し、ｐｃ１９４であることを確認した
。

実施例　１０ 実施例５の培地中で３７℃で終夜＃置培養したラクトバ
チルス・カゼイＩＡＭ１０４５株の種培養液から菌体を
捕集しく遠心分離：　３０００ｒ、ｐ、ｍ、、１０分、
４　’Ｃ）　、これを４℃の緩衝液［１３ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，５）および０．４　Ｍシュークロー
スフ１０−で洗浄した後、同じ緩衝液０．７５ｄを冊え
、菌体をＷＩＡ濁せしめた。得られた懸濁液０、１　ｍ
ｌ　、エリスロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド
シ調β１Ａ１２μりおよび４０％ポリエチレ〉グリコー
ル（ＰＥ（）　−６０００）水溶液０．３−を混合し、
０゛Ｃで１０分間静置した後、バイオランド社製のシー
ンパルサーを用い、５　ｋＶ／ｃｍ、１μＦの条件下、
０℃で通電した。通電後、０℃で１０分間静置し、遠心
分離（１５０００ｒ、ｐ、ｍ、、２分、４℃）して、菌
体を捕集した。

捕集した菌体な上記培地１ｄＫ懸濁し、３７℃で３時間
培養した。次いで、この懸濁液０．５−をエリスロマイ
シン含有Ｂｒ１ｇｇ１１寒天培地に塗布し、嫌気条件下
３７℃で１週間培養したところエリスロマイシン耐性コ
ロニーが６コロニー得られた。

実施例１と同様にして、このコロニーからプラスミドを
抽出し、ｐＡＭｐＩＡｌであることを確認した。またプ
ラスミドを加えない場合は、エリスロマイシン耐性コロ
ニーは得られなかった。

実施例　１１ 実施例５における菌体の捕集時期を種々変えて、実施例
５の方法を繰返した。その結果な以下に示す。

Ａ６ｏｏ　＝６００　ｎｍの吸光度（０、Ｄ　、　）　
上代へ実施例１ と同様にして、得られたコロニーか らプラスミ ドを抽出し、Ｉ）ＡＭｐＩ　Ａ　１であることを＠詔し
た。

％、ｆ’Ｆ出願人 外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）乳酸桿菌を緩衝液に懸濁し、これに外来性のＤＮＡ
   を添加混合し、この懸濁液にパルス電流を通電すること
   を特徴とする乳酸桿菌の細胞内に外来性のＤＮＡを導入
   する方法。２）乳酸桿菌が対数増殖期の前期の生育段階
   のものである、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３）懸濁液にポリエチレングリコールを加え、ポリエチ
   レングリコールの共存下にパルス電流を通電することを
   更に特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
   の方法。