JPH02103462A - 液体クロマト用分離剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分軒〕 本発明は液体クロマト用分離剤に関する。

本発明の分離剤を充填したカラムに各種アミノ酸、ペプ
チッド、タンパク質等の混合溶液を通液することにより
、アミノ酸やそのアミノ酸誘導体自身あるいはこれらよ
り構成されるベプチッドやタンパク質を含有する混合溶
液から混合物溶液中に含まれる各種のアミノ酸をそれぞ
れのアミノ酸の成分に、又各種ペプチッドをそれぞれの
ベプチッドの成分に、又各種タンパク質をそれぞれのタ
ンパク質成分に、成分ごとに分離精製することができる
。

（従来の技術） 従来、アミノ酸、ペプチッドおよびタンパク質物質を分
離する分離剤としては、活性炭、ベントナイト、アルミ
ナ、酸性白土、リン酸力ルシュウムゲル、ヒドロキシア
パタイト、セルローズ系天然ポリマー、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル等のニトリル含有モノビニルモ
ノマーの単独または共重合体等の公知技術が知られてい
る。

例えば、特公昭６０−３２４９７にはニトリル含有モノ
ビニル単量体のみ又は共重合体を用いた蛋白質吸着＠Ｉ
３質について、特公昭６０〜４５９３７には含シアノ単
量体の架橋構造物を用いた蛋白質吸着物質について、特
公昭６１−２８４４８にはニトロ基を含存する多孔質の
架橋した合成樹脂からなる吸着剤を用いたアミノ酸の分
離精製方法について開示されている。

（発明が解決しようとする問題点〕 従来技術には蛋白質を含んだ液の清澄化、微量の混入蛋
白質の除去、蛋白質の分離精製等の目的やアミノ酸の分
離精製の目的に実用化されているものがあるが、これら
の物質には蛋白質に対する非特異的吸着を起こしたり、
ρ１１等の溶液条件に制限があったり、移動相に用いる
溶媒に対して制限があったり、機械的強度が不十分な事
がある等の理由から、個りの吸着剤を液体クロマト分離
剤として用いるには応用範囲が狭く、又各種のアミノ酸
、ペプチッド、蛋白質に対して十分な分離能が得られず
、かならずしも満足し得るものではなかった。

〔問題点を解決するための手段］ 本発明者らはこれらの点を解決し、アミノ酸および／ま
たはアミノ酸誘導体自身あるいはこれらより構成される
ベプチッドやタンパク質の混合物を液体クロマト分離法
により分離する液体クロマト用分離剤について鋭意検討
した結果、本発明に到達した。

すなわち本発明は、多孔質ポリアミノ酸球状粒子よりな
る液体クロマト用分離剤である。

多孔質ポリアミノ酸球状粒子を分離剤に用いることによ
り、各種のアミノ酸が効率よく容易に分離出来る上に、
アミノ酸とペプチノドとタンパク質の混合溶液について
も効率よく容易に分離が出来る。すなわち、ポリアミノ
酸のもつ両親媒性、β構造を有する耐機械強度の増大、
多孔質化による比表面積の増大と細孔容積の増大と細孔
径の調節により、アミノ酸および／またはアミノ酸誘導
体自身あるいはこれらより構成されるペブチンドやタン
パク質を効率よく分離することができる。

本発明の多孔質ポリアミノ酸におけるポリアミノ酸とし
ては疎水性ポリアミノ酸であり、ポリアラニン、ポリロ
イシン、ポリイソロイシン、ポリノルマルロイシン等の
本来的に疎水性のポリアミノ酸のみならず、親水性ポリ
アミノ酸を疎水性化したもの（疎水性基を導入した親水
性アミノ酸ポリマー）も包含する。そのような変性ポリ
アミノ酸としては、ポリグルタミン酸、アスパラギン酸
等の酸性ポリアミノ酸を疎水性エステル化したもの、例
えば、それらのアミノ酸のアルキルエステル、ベンジル
エステル、シクロヘキサンメチルエステル等を挙げるこ
とができ、また、リジンのような塩基性アミノ酸を疎水
性カルボキシ化したもの、例えば、そのようなアミノ酸
のカルボヘンジキシ化物、カルボエトキシ化物を挙げる
ことができる。これらの変性ポリアミノ酸を用いる場合
、得られる変性ポリアミノ酸の球状粒子をそのまま使用
してもよいが、必要に応じて、疎水性基を脱離し親水性
ポリアミノ酸球状粒子にすることもできる０以上の様な
疎水性のα−アミノ酸の重合物があげられる。

多孔質ポリアミノ酸球状粒子とは、上記の如きα−アミ
ノ酸の重合物を不活性溶媒、例えばパラフィン、トルエ
ン、キンレン、ｎ−ヘキサノール、ジエチルベンゼン、
デカヒドロナフタリン、ジオクチルフタレート、ドデカ
ン酸メチルなどと共存させ、有ａ溶媒に溶かした溶液を
水性媒体中に分散することにより平均径が３〜１００μ
ｍ、好ましくは３〜３０μｍ１さらに好ましくは３〜■
０μｍの細粒子にした後、これら不活性な溶媒を抽出等
により除去して得られる、細孔径がデキストラン分子量
にして６００より１００万である多孔質よりなるポリア
ミノ酸球状粒子である。

さらに多孔質ポリアミノ酸球状粒子がアルキルエステル
やベンジルエステル等の官能性の側鎖を有しているとき
は多官能性試薬、たとえばアルキルエステルやベンジル
エステル側鎖とエステル交喚反応するエチレングリコー
ル、プロピレングリコール等のグリコール類や該側鎖と
アミツリシス反応するメチレンジアミン、エチレンジア
ミン、プロピレンジアミン、ブチレンジアミン、ヘキサ
メチレンジアミン、ジエチレントリアミンやポリアミン
等を作用させて架橋反応を行うことができる。かかる架
橋反応をおこなった多孔質ポリアミノ酸球状粒子は、架
橋構造による耐機械強度向上とポリアミノ酸のβ構造に
もとすく本来の耐機械強度が一層高くなり、アミノ酸、
ペプチッドおよびタンパク質の高速液体クロマト分離に
一層良い効果を奏するので好ましい。

また本発明の多孔質ポリアミノ酸球状粒子は、疎水性の
置換基を導入させた構造を有する場合は各種のアミノ酸
および／またはアミノ酸誘導体や各種のベブチッドや各
種の蛋白質を効率よく分離することが出来好ましい。疎
水性の置換基としては、例えば炭素数１以上３０以下、
好ましくは炭素数１以上２０以下の直鎮あるいは分岐状
アルキル基と芳香族置換基であり、メチル基、エチル基
、ヘキシル基、オクチル基、ドデシル基、オクタデシル
基、フェニル基、ヘンシル基等を挙げることができる。

疎水性の置換基を導入させるにはエステル基を有するポ
リアミノ酸の球状粒子に、長鎖アルキル基を有する１価
アルコールまたはモノアミンとを有機溶媒中で反応させ
るか、またはアルキレンジアミン等の化学反応処理後、
有機溶媒中、各種酸クロライド化合物を反応させればよ
い、たとえばポリーγ−メチルーＬ−グルタメート（以
下ＰＭＬＧと言う）の場合は側鎖のメチルエステル部分
をアミツリシス反応によりｎ−オクタデシルアミンを反
応させ、長鎖アルキル基を導入させたり、エチレンジア
ミンによる化学反応処理後、Ｎアシル化反応によりステ
アロイルクロリドを反応させ長鎖アルキル基を導入させ
たり、上記と同様にしてベンジルクロライドを反応させ
ベンジル基を導入させることにより、疎水性の置換基を
導入できる。このような疎水性の置換基を導入したＰＭ
ＬＧは各種のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体や
各種のベプチッドや各種の蛋白質を効率よく分離するこ
とが出来る。

本発明の分離剤を用いて分離できるアミノ酸として好適
なものとしては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、セリン、トレオニン、プロリン、メ
チオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシン、ト
リプトファン、オキシプロリン、アスパラギン酸、グル
タミン酸、アルギニン、ヒスチヂン、リジニ／、オルニ
チン等ヲ挙げることができる。またアミノ酸誘導体とし
ては、上記アミノ酸のカルボキシル基、アミノ基、ヒド
ロキシル基等を利用してこれらに導入可能な各種の置換
基を導入したものであり、γ−メチルグルタメート、γ
−ヘンシルグルタメート、βメチルアスパルテート、β
−ベンジルアスパルテート、ε−カルボエトキシリジン
、ε−カルボベンゾキシリジン、δ−カルボエトキシオ
ルニチン、ε−カルボベンゾキシオルニチン、０−アセ
チルチロシン、０−ベンジルセリン等をその例として挙
げることが出来る。アミノ酸および／またはアミノ酸誘
導体自身より構成されるベブチッドやタンパク質として
は線状ジペプチッド、トリペプチ・ンド、テトラベラブ
チ・ンド、ボリペブチンド、環状ベプチνド等の分子量
にして１万以下のもの及びその末端化学修飾物の分子量
にして１万以上のタンパク質及びその化学修飾品のこと
をさす。タンパク質としては単純タンパク質である加水
分解でα−アミノ酸だけを生ずるもの、例えばアルブミ
ン、グロブリン、プロラミン、グルテリン、ヒストン、
プロタミン、硬タンパク質や複合タンパク質に属する単
純タンパク質と他の有機原子団との結合物、例えば核タ
ンパク質、糖タンパク質、色素タンパク質、リンタンパ
ク質や誘導タンパク質、すなわち天然タンパク質の軽い
処理で誘導生成された非天然タンパク質、たとえばゼラ
チン、プロテオース、ペプトンなどである。

〔作用〕

従来技術の分離剤は親水性の溶媒と疎水性の溶媒の両方
の溶媒を用いたアミノ酸、ペブチンドおよびタンパク質
の液体クロマト分離、あるいはｐｌ＋領域の広範囲、例
えばｐＨ−３より１１等の条件にてアミノ酸、ペプチッ
ドおよびタンパク質の液体クロマト分離にはかならずし
も満足すべき液体クロマト用分離剤ではなかった。

本発明の分離剤はポリアミノ酸本来の持つ両親媒性と耐
薬品性及びβ構造の形成のため、耐機械安定性の理由で
同類のアミノ酸、ペブチッドおよびタンパク質の液体ク
ロマト分離には非常に良好な分離剤になる。これらの詳
細な機構については明瞭ではないが、化学構造が類似の
分離剤を液体クロマト充填剤に用いるためだと推定させ
る。

〔発明の効果〕

本発明のアミノ酸、ペブチッドおよび／またはタンパク
質の液体クロマト分離剤によれば、従来技術ではかなら
ずしも満足ではなかった耐薬品性、広範囲ｐＨ６Ｕ域の
使用、耐機械安定性、アミノ酸、ペプチッドおよび／ま
たはタンパク質の液体クロマト分離効率の点で高い性能
を発揮する。

この液体クロマト分離効率を更によく発揮させるために
は、多孔質ポリアミノ酸球状粒子の細孔径のコントロー
ル、粒子径の最適化、アミノ酸やペプチッドやタンパク
質との吸着性、耐機械安定性が重要であり、また多孔質
ポリアミノ酸球状粒子の架橋処理、置換基導入等により
一層高い液体クロマト分離性を発揮することが認められ
た。

〔実施例〕

以下に実施例で本発明の詳細な説明するが、これらの実
施例は本発明を限定するものと解されるべきではない。

実施例１ 重合度約２０００のＰＭＬＧ　１５ｇを不活性溶媒であ
るジオクチルフタレート１５ｄを含む１，２−ジクロロ
エタン６００ｇに溶解し、Ｐ？ｌＬＧ　２．５５重量％
溶液とした。水中に鹸化度８８％、重合度１２００のポ
リビニルアルコールを２重量％溶解した粘度４５ｃ、ｐ
、の水性媒体７部に上記ＰＭＬＩ液１部を徐々に加えな
からＮ２雰囲気下、高速撹拌機にて撹拌した。

フラスコ内にＮ、ガスを吹込ながら４５〜５０゛Ｃの温
度にて１２時間激しく撹拌した後、生成した球状粒子を
濾過し、水洗し、メタノールにてソンクスレー抽出を行
い、さらに水洗を十分に行った後、水に懸濁させて標準
篩２００メソシユと４００メノンユで粒子サイズ別に分
別した。主生成物の粒子径は３７〜７４μｍで、９０％
以上が１０〜７４８ｍであった。

この３７〜７４μｍの球状粒子の細孔径及び空孔率を推
定するため水系で通常のゲルクロマトグラフ１桑作を行
った。

すなわち、球状粒子を内径４．６１１１ｍ、長さ１５０
ｍｍのカラムに充填し、デキストラン（分子ｉｔ　９，
０００〜２０００．０００　）およびマルトースの同族
体、重水を標準試料とし、溶出時間と試料との関係をカ
ラム間隙容積まで外挿し、そのときの分子量を排除限界
分子ｉｔ（最大孔径と見なすことが出来る）とした、ま
た空孔率は重水の溶出位置から算出した。この結果、得
られたＰＭＬＧの多孔質球状粒子は、デキストラン分子
量において５０，０００に相当する孔径を有し、また７
０％の空孔率を有していた。

この３７〜７４μｍ径の多孔質ＰＭＬＧ球状粒子を、内
径４．６１！Ｉ１１．長さ１５０ｍ−のカラムに充填し
た液体クロマトカラム、ＭＴＣ−Ｃｏｌｕｍｍ　に−５
０を用いて高速ｆｉ体クロマトグラフィーを行い、セリ
ン、フェニルアラニン、トリプトファンよりなるアミノ
酸混合物、及びＢ、Ｓ、Ａ、（Ｂｏｖｉｎｅ　５ｅｒｕ
−＾１ｂｕｍｉｎ）、トリプトファン、チトクロムＣ、
リゾチームよりなる蛋白質混合物の液体クロマト分離を
行った。その結果は第１図および第２図に示す様に、ア
ミノ酸混合物および蛋白質の混合物のいずれの場合にお
いても高い分離効率に示すことが判明した。アミノ酸に
ついてはほぼ同じ等電点５．７±０．２のものを高い分
離効率にて液体クロマト分離出来、また蛋白質に関して
は分子量に関係なく等電点の低い順序に液体クロマト分
離される結果を得た。

尚、第１．２図の液体クロマトの条件は以下のとおりで
ある。

第１図 カラム；　ＭＴＣ−Ｃｏｌｕｍｎ　Ｇ−５０，４，６Ｉ
φｄ５０ｍｍＬ　。

粒径３７−７４μｍ 装置　：日本分光　ＬＣ−８００システム検出　；Ｒ■ 移動相；蒸留水（ｐｌ＋＝５．６　＞ 流速　；　０．５ｍｌ／ｓｉｎ 温度　；室温 試料　ｉ１０μｉ　　アミノ酸混合物 １、セリン　　　　　　（１’ｌ・５．７）２、フェニ
ルアラニン（ＰＩ・５．５）３、トリプトファン　　（
ＰＩ・５．９）第２図 カラム；　ＭＴＣ−Ｃｏｌｕｍｎ　Ｇ−５０，４，６１
ｍｍ１５０ｍｅＬ、粒径３７−７４μｍ 装置　；日本分光　ＬＣ−８００システム検出　；　Ｌ
ＩＶ”−２８０ｎｍ 移動相；リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ・６．８）　１０
ｍＭ→３５０ｍＭ　（２０分間）リニアグラジェント流
速　；　１．Ｏｍｌ／ｓｉｎ 温度　；室温 試料　：１０ｕｌ　　　タンパク譬混合物１、Ｂ、Ｓ、
Ａ　（６，０ｍｇ＃り　　（ＰＩ＝４．７）（ＭＷ・６
６．０００）２、トリプトファンン（０，０４２ｍｇ／
　Ｒ）　　（ＰＩ・５．９）（ＭＷ・２０４） ３、チトクローム（１，２ｍｇ／　ｅ　）　　（ＰＩ＝
ｌＯ，６）（？Ｉｌｔ、１２０００） ４、リゾチーム　（１，６Ｂ／　Ｅ　）　　　（ＰＩ・
１１．１）（ｈ匈・１４．４００） 実施例２ 分散高速）立件速度を１．２倍にした以外は実施例１と
全く同様にして多孔質Ｐ？ｌＬＧ球状粒子を得た。

水に懸濁させて目の開きが１０μｍと３０μ−のナイロ
ン網目（筒井理化学機械■製）を用いて粒子サイズ別に
分別した。主生成物の粒子径は２０〜３０μｍで９０％
以上が１０〜３０μＩであった。

この２０〜３０μ輌の球状粒子の細孔径及び空孔率は実
施例１と同様に評価した結果、デキストラン分子量にお
いて３０，０００に相当する孔径を有し、また６０％の
空孔率を有していた。

この２０〜３０μｍの多孔［ＰＭＬＧ球状粒子１０ｇを
デカリン３００ｄとエチレンジアミン３０ｍ１の混合ン
容液中に懸濁させ、還流温度で２４時間撹拌した。生成
物を分離後、水、エタノール及びエーテルで洗浄し、乾
燥してエチレンジアミンによって置換及び架橋されたＩ
ＩＩＬＧ多孔質球状粒子をえた。このＰＭＬＧの架＋′
３球状粒子の元素分析値よりＰ　Ｍ　Ｌ　Ｇの９モル％
がアミノエチル基含有、７モル％が架橋反応、８４モル
％が未反応状態のＰＭＬＧてあった。すなわち、このも
ののアミノ基含有量は１．０重量％（アミノ５１度は０
．６２ｎ−ｍｏｌ／ｇ）である。

得られた多孔質架橋Ｐ　Ｍ　Ｌ　Ｇ球状粒子担体３ｇ（
アミド基１．８６ｍ−ｍｏｌ含有）をテトラヒドロフラ
ン＋００−とステアロイルクロリド５ｄの混合液中に懸
濁させて、還流温度で２４時間撹拌した。生成物を分離
後、ＴＩＩＦ、エタノール及び水の順序で十分に洗浄を
行い、多孔質架橋ＰＭＬＧ球状粒子に長鎖を含有させた
＋Ｒ造よりなる２０〜３０μｍの粒子を得た０元素分析
値よりＰＭＬＧの約５モル％がＣＩｌ＋よりなる長鎖ア
ルキル基を含有する置換基が導入された構造からなって
いることが分かった。

この２０〜３０μｍの粒子を内径４．６１、長さ１５０
ｍｍ０カラムに充填した液体クロマトカラム、ＭＴＣＣ
ｏｌｕｍｎ　ＧＥＳ−１２を用いて高速液体クロマトグ
ラフィーヲ行い、Ｄ、１．−フェニルグリシン、Ｌ−チ
ロシン、γ−ベンジルーし一アスパラギン＃ｒ−ベンジ
ルーし一グルタミン酸、Ｌ−トリプトファンよりなる各
種フェニル基含有アミン基混合物の液体クロマト分離を
行った。

その結果は第３図に示す様に疎水性の異なる各種アミノ
酸および／またはアミノ酸誘導体を高い分離効率にて分
離されることが判明した。

第３図の液体クロマトの条件は以下のとおりである。

カラム；　ＭＴＣ−Ｃｏｌｕｍｎ　ＧＥＳ−１２，４，
６■φ祠５０ｍｆｆ１Ｌ粒径２０−３０μ麹 装置　；日本分光　ＬＣ−８００システムｉ　ＵＶ＝　
２７０ｎｍ 移動相；　　１（１ｗＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐｌ
ｌ・６，９）３５０ｍＭ　（２０分間）リニアグラジェ
ント；　１．ＯＩｎｆｆ１／ｍｉｎ ；室温 ：ｌＯμ！　　各種フェニル基含有アミン基混合物 １、Ｄ、Ｌ−フェニルグリシン ２、Ｌ−チロシン ３．１−ベンジル−し−アスパラギン酸４．７−ヘンシ
ル−し−グルタミン酸 ５、Ｌ−１−リブトファン 検出 温度 流速 試料 実施例３ ポリベンジル−し−グルタメート（ＰＢＬＧ）１５ｇを
不活性溶媒であるデカリン（多孔化用添加剤）３０ｄを
含む１．２−ジクロロエタン６００　ｇに溶解し、分散
高速撹拌速度を１．２倍にした以外は実施例１と全く同
様にして多孔６ｐｎＬｃ球状粒子を得た。

水に懸濁させて、目開きが１ＯｕＩＩと３０μ曙のナイ
ロン網目を用いて粒子サイズ別に分別し、平均粒径が２
０μ鋼の多孔質球状粒子を得た。

この約２０μ傷の球状粒子の細孔径及び空孔率は実施例
１と同様に評価した結果、デキストラン分子量において
、１００，０００に相当する孔径を有し、また７５％の
空孔率を有していた。

この２０μ端径の多孔質ＰＢＬＧＦＪｉ状粒子を、内種
粒子６　ｍ、長さ１５０ｒｍのカラムに充填した液体ク
ロマトカラム、ＭＴＣ−Ｃｏｌｕａ＋ｍ　ＢＧ−２Ｄを
用いて高速液体クロマトグラフィーを行い、実施例１と
同じ、Ｂ。

Ｓ、＾、（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｕｒｍ　Ａｌｂｃ＋ｎ１
ｎ）、トリプトファン、チトクロムＣ、リゾチームより
なる蛋白質混合物の液体クロマト分離を実施例１と全く
同じ条件で行った。

その結果は、第２図とほぼ同様の保持時間と、留出順序
であったがピークはより一層シャープに分離された。

実施例４ ポリＬ−ロイシン（ＰＬＬｅｕ）　１５　ｇとジエチル
ベンゼン（多孔化用添加剤）３０ｇをクロロホルム６０
０ｄに溶解した以外は実施例１と全く同じ条件で多孔質
ＰＬＬｅｕ球状粒子を得た。

水に懸濁させて、Ｉ単筒２００メツシュと４００メソシ
ユで粒子サイズ別に分別した。主成分の粒子径は３７〜
７４μ鋼よりなる多孔質球状粒子（最大孔径：デキスト
ランの分子１１００．０００に相当、空孔率７０％）を
８０％収率で得た。この３７〜７４μｌ径の多孔質ＰＬ
Ｌｅｕ球状粒子を、内径４．６閣、長さ１５０旭のカラ
ムに充填した液体クロマトカラム、ＭＴＣＣｏｌｕｍＩ
ＩＬ−２０を用いて高速液体クロマトグラフィーを行い
、実施例１と同じ、Ｂ、Ｓ、Ａ、（Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅ
ｒｕＩｌｌＡｌｂｕｍｉｎ　）、トリプトファン、チト
クロムＣ、リゾチームよりなる蛋白質混合物の液体クロ
マト分離を実施例１と全く同し条件で行った。

その結果は第２図とほぼ同様の保持時間と留出順序であ
った。しかし、ピークは実施例１より若干ブロードであ
ったが十分に分離はなされた。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は本発明の分離剤を用いて液体クロマトにて
各種のアミノ酸等を分離したクロマトグラフィーのチャ
ートを表した図である。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 第３図 保 持 時 間 （ｍｉｎ） 第１図 保 持 時 間 （ｍｉｎ） 第２図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）多孔質ポリアミノ酸球状粒子よりなる液体クロマ
   ト用分離剤。
2. （２）アミノ酸および／またはアミノ酸誘導体自身ある
   いはこれらより構成されるペプチッドやタンパク質を含
   有する混合溶液の分離に使用する請求項１記載の液体ク
   ロマト用分離剤。
3. （３）多孔質ポリアミノ酸球状粒子は多官能性試薬を作
   用させて架橋させた多孔質ポリアミノ酸球状粒子である
   請求項１または２記載の液体クロマト用分離剤。
4. （４）多孔質ポリアミノ酸球状粒子は疎水性の置換基を
   導入させた構造からなる粒子である請求項１、２または
   ３記載の液体クロマト分離剤。