JPH0198499A - 増幅された遺伝子を使用する配列のアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特定の配列を検出するための遺伝子の増幅（ａ
ｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）に関する。更に特定的には
、本発明は固定化された又は固定化可能なオリゴヌクレ
オチドを使用して特定の核酸配列を検出する方法に関す
る。

核酸配列の大規模な製造は、特定のベクター中の特定の
配列をクローン化することにより通常行なわれる。クロ
ーン化されるべき配列は単離され、同定され、−末鎖又
は二本鎖ベクターに共有結合により結合せしめられ、次
いでクローン化される。

余分のＤＮＡを持ったベクターは宿主細胞から分離され
、そして必要に応じて、ＤＮＡのクローン化された断片
はＤＮＡの残余から制限され（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）
そして分離されなければならない。−末鎖ＤＮＡを希望
する場合には、それは−末鎖ベクターにおいてクローン
化されるか又は鎖分離が必要である。すべてのこれらの
技術は生化学的及び生物学的系の熟練した操作を伴う。

（１９８４）には、−本ＭＤＮＡ鋳型をセルロースに非
特異的に固定化させることによりＤＮＡハイブリダイゼ
ーショングローブを製造する方法が記載されている。こ
の方法は有用であるけれども、新たに合成された生成物
ＤＮＡの長さの分布が所望される程均−ではない。これ
は現在のところセルロースに対する鋳、型ＤＮＡの多数
の結合（ｍｕｌｔｉｐｉｅ　ａｔｔａｃｈｅｍｅｎｔ）
によるのかもしれない思われる。

２つのグローブを伴う均一な系がヨーロッパ特許出願第
８６１０１７２５．９号に記載されている。この方法は
、２つの重なり合わないグローブ（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌ
ａｐｐｉｎｇ　ｐｒｏｂｅ）を使用し、その１つは検出
のために標識されておりそして他の１つはハイブリッド
の分離のためのものである。アッセイは均一な溶液中で
行なわれ、そしてハイブリッドは、固体支持体との固定
化反応及び分離プローブにより後に分離される。

固定化されたポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用することによる精製されたポリ
ヌクレオチド配列の増幅はヨーロッパ特許出願第１８４
．０５６号及びアシュレイ（Ａｓｈ　１ａｙ）等、アナ
リティカル・バイオケミストリー、第１４０巻、９５−
１０３、（１９８４）、に記載されている。ヨーロッパ
特許第１８４．０５６号においては末端カップリングが
そしてアシュレイ等においては非特異的ランダムカップ
リング反応がポリヌクレオチドの固定化のために使用さ
れた。

増幅分析の後の溶液中の増幅は、固定化又は他の方法、
例えば標識された物質によるゲル電気泳動を必要とする
。

サイキ（Ｓａｉｈｉ）等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
）、第２３０巻、１３５０、（１９８５）は、オリゴヌ
クレオチドとのハイブリダイゼーションによる点突然変
異（ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）検出のためのヒト
ゲノム試料におけるβグロビン核酸配列の増幅の方法を
記載している。この生成物配列は溶液中で形成される。

ハイブリダイゼーションのために、ＤＮＡは増幅の後固
定化されなければならないか又は制限消化及び分離が配
列の分析のために行なわれなければならない。

本発明は、特定の配列の検出のための遺伝子の増幅に関
する。増幅された配列は、生成物が固定化された状態で
形成されるように固定化されたプライマー配列を使用す
ることによって製造される。

プライマーとして作用する配列は、標識を含むことがで
き又は延長する配列において標識されてもよい。

更に特定的には、本発明は、試料例えば二本鎖Ｄ’ＮＡ
を含んで成る試料中の特定の標的核酸配列を増幅する方
法であって、 （ａ）（ｉ）２つの異なる固定化された又は固定化可能
なプライマー核酸を（ｉ）標的核酸配列を含有する試験
試料と／蔦イブリダイゼーション条件下に接触させるこ
とを含むプライミング工程と、（ｂ）工程（ａ）の得ら
れる生成物を、得られるハイブリダイゼーションされた
プライマー核酸を延長させる条件下に延長酵素（ｅｘｔ
ｅｎｄｅｒ　ｅｎｚｙｍｅ）及び少なくとも１種の核酸
残基と接触させることを含む延長工程と、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を変性して固定化された標的
核酸配列を生成させ、 （ｄ）先のサイクルの工程（ｃ）の生成物を（ａ）（ｉ
ｉ）の代わりに使用して工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
のサイクルを少なくとも一回繰り返す、ことを特徴とす
る方法に関する。

本発明は、試料例えば二本鎖ＤＮＡを含んで成る試料に
おける特定の標的核酸配列を検出する方法であって、 （ａ）（ｉ）２つの異なる固定化された又は固定化可能
なプライマー核酸を（ｉｌ）標的核酸配列を含有する可
能性のある試験試料とハイブリダイゼーション条件下に
接触させ、 （ｂ）工程（ａ）の得られる生成物を、得られるハイブ
リダイゼーションされたプライマー核酸を延長させる条
件下に延長酵素及び少なくとも１つの核酸残基と接触さ
せ、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を変性して固定化された標的
核酸配列を生成させ、 （ｄ）先のサイクルの工程（ｃ）の生成物を（ａ）（ｉ
ｉ）の代わりに使用して工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
のサイクルを少なくとも一回繰り返し、 （ｅ）増幅された配列が存在するかどうかを決定するこ
とを特徴とする方法にも関する。

更に本発明は、特定の標的核酸配列を増幅させるだめの
キットであって、（ａ）固定化された又は固定化可能な
プライマー核酸、（ｂ）延長酵素及び（ｃ）少なくとも
１種の核酸残基を含有する１個又はそれより多くの容器
を備えて成るキットに関する。

本発明は特定の標的核酸配列を検出するためのキットで
あって（ａ）固定化された又は固定化可能な核酸、（ｂ
）延長酵素、（ｃ）少なくとも１種の核酸残基及び（ｄ
）増幅された配列を検出するための特異的な標識された
ハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドを含
有する１個又はそれ−より多くの容器を含んで成るキッ
トも指向する。

多くの他の配列を含有する粗製混合物中の特定の配列の
増幅のために固定化されたオリゴヌクレオチドを使用す
ることがでさるという点で本発明は驚くべきことであり
そして予測されないものである。更に、プロセスの終わ
りに生成される所望のアナライトは固定化された形態に
ありそして不均一相アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕ
ｓ　ｐｈａｓｅ　ａｓｓａｙｓ）の準備ができている。

本発明は固定化された増幅された配列を製造する。

本発明は自動化されたシステムとして進めることができ
る。

添付図面は本発明に従う増幅を行うための工程を示す略
図である。

本発明は、１つの鎖に対して相補的な固体支持体に結合
している１つの核酸と試験試料核酸の他の鎖に対して相
補的な固体支持体に結合している他の核酸をハイブリダ
イゼーション条件下に接触させ、試験試料に対して相補
的な配列を生成するような酵素により前記核酸を延長さ
せ、生成物を変性しそして再アニーリング（ｒｅａｎｎ
ｓａｌｉｎｇ）　してさらに延長可能な構造体を生成さ
せそしてこのプロセスを繰り返して出発濃度より大きい
量の固体支持体に固定化された試験配列を生成させるこ
とによるアッセイのための試験核酸配列の増幅に関する
。次いで生成物は例えば下記の如くしてアッセイされる
： （１）特定のプローブとハイブリダイゼーションさせる
こと、 （２）延長反応の間に標識された核酸残基が導入される
ならば、このような残基の導入の程度が特定の配列の存
在を決定する、又は （３）延長後凝集反応（ｐｏｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
　ａｇｇｌｕｔｉｎａＬｉｏｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）に
よる。

前述の如く、サイキ等は試験試料の増幅の方法を記載し
ている。サイキ等はプライマーとして２つの異なったオ
リゴヌクレオチドを使用している。

試験試料核酸はプライマー延長反応のための鋳型として
作用している。オリゴヌクレオチドは二本鎖試料ＤＮＡ
の２つの鎖の端部に対して相補的である。サイキ等にお
いては、１つのオリゴヌクレオチドは１つの鎖に対して
特異的でありそして他のオリゴヌクレオチドは相補的鋼
に対して特異的である。両オリゴヌクレオチドは分析さ
れるべき突然変異配列の領域をフランキングさせる（　
ｆ　１ａｎｋ）。オリゴヌクレオチドをアニーリング条
件下に試験試料核酸と混合すると、オリゴヌクレオチド
は、各オリゴヌクレオチドの３′　ヒドロキシルが延長
のために利用可能であるようにハイブリダイゼーション
するであろう。オリゴヌクレオチドが鋳型依存性プライ
マー延長酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素
等により延長されて後、オリゴヌクレオチドハイブリダ
イゼーション及び延長のプロセスが繰り返される。この
ような増幅の欠点は最終生成物分析が、困難な試料取り
扱い工程、例えば固定化を必要とするという点にある。

本発明は固定化された又は固定化可能な核酸プライマー
を使用する。本発明の最終の増幅された生成物は既に固
定化されているか又は特異的に固定化可能である。

図において、増幅の最初のサイクルのための鋳型として
作用する試験試料核酸を固定化された又は固定化可能な
ブライマー核酸とハイブリダイゼーション条件下に接触
させる。１つのプライマー配列は１つの鎖に対して特異
的でありそして他のプライマー配列は相補的な鎖に対し
て特異的である。プライマーは相互に相補的ではない。

プライマー鋳型ハイブリッドが形成されて後、それらは
酵素により延長せしめられる。増幅された配列は次いで
更なる増幅のために再循環される。

プライマー核酸は任意のハイブリダイゼーション可能な
りＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドである。

好ましい態様においては、ブライマー核酸はオリゴヌク
レオチドでありそしてそれらは試料ＤＮＡの３′末末端
列に対して相補的である。核酸は３ベース乃至１０キロ
ベース及びそれ以上のいずれの長さであってもよく、好
ましくは５塩基乃至１００塩基である。３′　ヒドロキ
シを持ったいかなる相補的な（試料に対して）核酸も鋳
型介在延長反応のためのプライマーとして作用すること
ができる。

２つのプライマーを使用することの目的は、両方の鎖を
増幅することである。プライマーは試料配列に対して相
補的（全体として）である必要はない。それらは、配列
特異的鋳型介在延長反応を開始するのに十分に相補的で
あるべきである。鋳型介在プライマー延長反応の忠実性
を維持するために、開始反応は完全にマツチした塩基対
領域から行うべきである。最小の配列は３塩基対を含む
ことができる。普通は５乃至７塩基対二本鎖領域は２５
℃及びそれ以下でプライマー延長反応を行うのに十分に
強い。５塩基対より少ない場合には、低温延長反応を行
った。

本発明は先行技術に記載の増幅方法にまさる改良である
。本発明は、増幅された配列が固定化された形態で生成
される試験試料核酸の増幅の方法を説明する。このよう
な方法に関連した主な利点は、生成物が特定的に固定化
可能であるか又は固定化された状態で形成されるという
ことである。

これは増幅されていない配列からの分離をより容易にす
る（時には試験配列の１０’−１０’倍）。

それは特定的に固定化可能であるか又は固定化された形
態にあるので、分析はより容易である。

核酸、特にオリゴヌクレオチドの固定化は、ア５ｃｈｏ
ｔ）、マルセル・デツカ−・インコーホレーテッド（Ｍ
ａｒｃｅｌ　Ｄｅｃｋｅｒ　Ｉｎｃ）、１５−２１頁に
記載されている。それに記載されている固定化反応の大
部分はスペーサー又はリンカ−残基を介して行うことが
できる。例えば、゛″セフアデツクス″はセルロース粒
子を直接使用する代わりに、ポリアミン又はタンパク質
が連結した“セファデックス″又はセルロースを使用す
ることが可能でありそしてオリゴヌクレオチドに対する
結合部位としてタンパク質又はポリアミン残基を使用す
ることが可能である。

例えば、臭化シアンで活性化された０セフアデツクス″
を先ず大過剰のポリアミン、例えばスペルミンと反応さ
せ、次いで酸化的反応によりオリゴヌクレオチドに結合
させる。ヨーロッパ特許第１６４．５８６号に記載の如
く、アミノ標識されたオリゴヌクレオチドは、種々のリ
ンカ−長さで製造することができる。アミノ標識された
オリゴヌクレオチドを製造するための他の方法も又当接
術に記載されている。

本発明のための固定化マトリックス（固体支持体）とし
ては、反応性の又は活性化されたセルロース、′セファ
デックス”、゛セファロース″、“セファクリル″（“
５ＥＰＨＡＣＲＹＬ”）、ポリスチレンラテックス、ポ
リアクリレート、ポリビニルアルコール又は活性化され
て化学反応を受けることができる他の合成マトリックス
又は天然に存在するマトリックスが挙げられる。

延長反応のための基質は１種又は１種より多くの核酸残
基、例えばヌクレオシドトリホスフェート（ＮＴＰ）で
ある。

プライマーに対するヌクレオシド残基の付加及び配列の
忠実性（ｆ　１ｄｅｌｉｔｙ）のために必要な延長反応
は特異的であるべきなので、ＤＮＡポリメラーゼ、ポリ
メラーゼのフレノウフラグメント（Ｋ　Ｉｅｎ。

ｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）又は逆転写酵素が好ましい。こ
れらの酵素は特異的プライマー延長反応を触媒する。

このような酵素がオリゴヌクレオチドに対してそれらが
固定化されているときに作用することができることは驚
くべきことである。

本発明は、分析のための固定化された配列を製造する。

このような配列の存在は延長のための基質として標識さ
れたヌクレオシド残基を使用することにより検出するこ
とができる。例えば、３２Ｐ標識ヌクレオシドトリホス
フエート又はフルオレセイン標識ヌクレオシドトリホス
フェートをＤＮＡポリメラーゼによる延長のための基質
として使用するならば、延長された生成物は標識される
であろう。このような標識を検出する（３２Ｐについて
は放射性及びフルオレセインについては蛍光）ことによ
り、試験配列核酸の存在を確かめることが可能である。

増幅された信号は特異的プローブとのハイブリダイゼー
ションにより検出することができる。

固定化された又は固定化可能なオリゴヌクレオチドグロ
ーブは、増幅されるべき配列の３′末端又は５′末端に
対して相補的な少なくとも１つの一本鎖塩基配列を含ん
で成るであろう。プローブは酵素による延長反応が行な
われる前の全配列に対して相補的である必要はない。プ
ローブの末端の相同性は３ヌクレオチドという短いもの
であることができそして２００ヌクレオチドという長い
ものであることができるが、しかしＩＯ乃至３０ヌクレ
オチド残基が好ましい。

オリゴヌクレオチドは一端で固体支持体に連結されてい
ることにより固定化することができそして延長は固体支
持体に対して反対方向に起こる。

試料は二本鎖ＤＮＡを含んで成ることができそして各オ
リゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡの鎖に対して相補的で
あることができる。

増幅された配列の存在の検出は下記の如くして行うこと
ができる： （１）核酸残基を例えば放射性部分、染料、蛍光性部分
又は酵素のような標識で標識し、次いで分析を行ってこ
のような標識の存在を決定すること、 （２）特定の標的核酸配列を検出するだめの前記方法の
工程（ｄ）の生成物を、試験されるべき配列とハイブリ
ダイゼーション可能な標識されたグローブ（このような
標識は上述の如きものであることができる）と共にハイ
ブリダイゼーション条件に付し、そして実際にハイブリ
ダイゼーションが起こったかどうかを決定すること、（
３）物理的性質の変化又は差の決定、例えば、電気泳動
、遠心分離、ゲルパーミェーションクロマトグラフィー
による分子量又は密度の差の検出又は顕微鏡を使用する
こと（寸法の差を検出するための視覚による決定）。

本発明を下記の非限定的実施例により更に説明する。

実施例１ ヒトβグロビン遺伝子の配列を本発明のモデル系として
使用する。いかなる公知の配列でも固定化されたプライ
マーの正しい選択により増幅することができる。

配列ＷＰ又はそれより短いもの 及び配列ＣＰ又はそれより短いもの は公知のオリゴヌクレオチド合成方法により合成される
。次いでオリゴヌクレオチドは、モレキュラー療クロー
ニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、マニ
アチス（ＭａｎｉａＬｉｓ）等、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１２５、（１
９８２）に記載の如き酵素的方法により５′末端でリン
酸化される。

これらのオリゴヌクレオチド及び標的グロビン配列に対
するそれらの関係はサイキ等、サイエンス、第２３０巻
、１３５０、（１９８５）により公表された。次いでリ
ン酸化されたオリゴヌクレ（Ｈ，５ｃｈｏｔＬ）、マル
セル・デツカ−・発行者（Ｍａｒｃｅｌ　ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒ）、１５、（１９８４）に記載の方法に従ってビ
ーズに固定化させる。

固定化されたＷＰ及びＣＰを含有する水性懸濁液中の２
００μａのビーズを、１０ｍＭトリスｐＨ７，５，５０
ｍＭＮａＣ＋、１０ｍＭＭｇＣ１□、１．５ｍＭデオキ
シヌクレオシドトリホスフェート（４種類すべて）を含
有する溶液（１ｍＱ）に加えた。それらを３７°Ｃｆ、
ｍｔｏ分間加熱しそしてＥ、ｃｏ　Ｉ　１ＤＮＡポリメ
ラーゼのフレノウフラグメント２０単位（ＰＬバイオケ
ミカル）を加える。反応を５分間進行させる。次いで溶
液をマイクロ７ユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で遠心
分離しそして放射性基質としてデオキシヌクレオシドト
リホスフェートの１つを使用してバックグラウンド反応
をシンチレーションカウンターにおいてビーズの放射能
を計数することによって評価する。

１０μＱの水性熱変性（１００°Ｃ）水冷試料ＤＮＡ（
ヒト）を加えた（０．１μｇ）後反応を繰り返す。全混
合物を沸騰水浴中で加熱しモして３７°Ｃに急速に冷却
することにより上記のサイクルを繰り返す。総てのサイ
クルについて、新たな酵素のアリコート（２単位）を加
える。

最終生成物をマイクロ７ユージ中での遠心分離により固
定化された増幅された配列として集める。

固定化された生成物核酸を次いで３つの異なった方法、
即ち： （１）標識された１９マーとのハイブリダイゼーション
、 （２）２つの酵素による消化［サイエンス、第２３０巻
、１３５０、（１９８５）］、（３）制限消化を伴うか
又は伴わない直接の検出、 によりアッセイする。

デオキシＮＴＰの１つを、例えば、３２Ｐで標識するな
らば、制限消化の前及び後の放射能の直接の計数が配列
についての情報を与えるであろう。

ビーズに固定化された増幅された生成物を、沸騰水浴で
加熱し次いで水中で急冷することにより変性する。前述
の如く、次いでビーズを３２Ｐで標識されたオリゴヌク
レオチドとハイブリダイゼーションさせる。

分子ハイブリダイゼーションのために下記の混合物を調
製する： ４５０μＱ　　２０Ｘ　　ＮＥＴ！衝液７５０μ０　２
０％デキストランサルフェート１５０μα　脱イオン化
水 ７５ｐＱ　　１００ｘ　　デンハートの溶液（Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ’　ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ） ７５μＱ　　１０％　ＮＰ−４０洗剤（シグマ）。

この混合物に、エヌ・ダッタグプタ、デー・ラビン、ジ
ー・ミショウド及びピー・エム・エム・ラエ、°高い特
異的活性オリゴヌクレオチドプロ・−ブの発生のための
簡単な方法″、バイオテクニクス、第５巻、第１号、３
８−４３、（１９８７）［Ｎ、　ＤａＬｔａｇｕｐｔａ
、　Ｄ、　Ｒａｂｉｎ、　Ｇ、　Ｍｉｃｈａｕｄ　ａｎ
ｄ　ＰＭ、　Ｍ、　Ｒａｅ、　”　Ａ　Ｓｉｍｐｌｅ　
１Ｊｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆ　
Ｈｉｇｈ　５ｏｅｃｉｆｉｃ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌａｏｔｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　”、　Ｂ
ｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　Ｖｏｌ、　５．　Ｎｏ、
　１＋　３８−４３＋（１９８７）］に記載の如くして
調製されたオリゴヌクレオチドプローブのｌ／１０量を
加える。最終１９マ一プローブ濃度は約１ナノモルであ
る。これより多くのプローブの添加は増加しｔ；バック
グラウンドをもたらすことが見出だされた。１つの又は
少数の反応のための標識されたグローブを製造するため
に、上記の標識化プロトコルを、比例してより少ないプ
ライマー、鋳型、ｄＧＴＰ及びｄＡＴＰを使用して、ス
ケールダウンさせることができる。０．１倍の反応は１
０μＱで行うことができ、０．２倍の反応は２０μａで
行うことができる等。容量が許されるならば、【α３２
ｐ］−ａ　−Ａ　Ｔ　Ｐは乾固するまで蒸発させる必要
はない。

約０．５ｍＱの増幅された配列を含有するビーズを、一
端が開いているプラスチックバッグ（例えば、“ジ−ル
ーア−ミール”　　［”５ＥＡＬ−Ａ−ＮＥＡＬ”、“
シールアンドセーブ″（“５ＥＡＬ　ＡＮＤ　５ＡＶＥ
”）　、等］に入れる。放射源ハイブリダイゼーション
混合物をパスチュールピペット（Ｐａｓｔｅｕｒ　ｐｉ
ｐｅｔ）又は２１ケージの針を持った注射器で加えそし
てバッグの残りの端部をシールする。ハイブリダイゼー
ションを５０’Ｏで１時間行う。

ハイブリダイゼーションの後、ビーズを試験管内での遠
心分離により分離しそして穏やかに振とうしながら１５
分間ａｘ　　ｓｓｃで洗浄する。

ストリンジエンシー洗浄（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｗａ
ｓｈｉｎｇ）のために、１．４ｍ１２の６Ｘ　　ＳＳＣ
を含有する予め加温された１、５ｍαの培養管にビーズ
を移す。この管を５７℃の循環水浴中に１０分間置く。

液体を迅速に遠心分離し、更に１．５ｍｆｆのらＸ５Ｓ
Ｃを加え、次いでこの管を上記水浴に更に１０分間入れ
、液体を再び遠心分離しそして次いで上澄液を捨てる。

管内の放射能をシンチレーションカウンターで計数する
。ビーズに関連した放射能はハイブリダイゼーションの
目安であり、従って最初の試料中の試験遺伝子の存在の
指示である。

実施例３：　２つの酵素による消化 サイキ等によりサイエンス、第２３０巻、１３５０、（
１９８５むにおいて記載された如く、増幅された生成物
は、ハイブリダイゼーション、次いで制限消化及びゲル
電気泳動又は薄層クロマトグラフィーによりアッセイす
ることができる。

実施例４：　直接の検出 増幅／延長反応のための基質として標識を含むヌクレオ
シドトリホスフェートを使用することにより増幅された
生成物を直接にアッセイすることができる。例えば、３
２Ｐ標識又はフルオレセイン標識又はビオチン標識ヌク
レオシドトリホスフェートを基質として使用するならば
、延長された核酸への標識の導入は特定のプロセスの直
接の指示であり、従って特定の試験配列の存在の指示で
ある。増幅の後、増幅された核酸はビーズ中にありそし
てビーズ上の標識の存在は試験配列の指示である。フル
オレセイン、ビオチン又は！ｆｆ１ｐのアッセイは当業
界では周知されている。他の良く知られｔ；標識もこの
目的に使用することができる。

ビオチンの物理的性質の差も検出のために使用すること
ができる。電気泳動移動度、遠心分離フィールドにおけ
る密度及びクロマトグラフィー特性も検出の目的に使用
することができる。

本発明を特定の例により説明したがこれらは本発明を限
定するものではないこと及び本発明の精神及び範囲内で
種々の修正及び変更がなされうろことは認識されるであ
ろう。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、本発明に従って増幅を行うだめの工程を示
す略図である。 手続補正書彷式） 昭和６３年１０月２７日 増幅された遺伝子を使用する配列のアッセイ３、補正を
する者 事件との関係　　　　特許出願人 名称　モレキュラー・ダイアグノスティックス・インコ
ーホレーテッド ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　昭和６３年９月２７日（発送口）
６、補正の対象 明細書の図面の簡単な説明の欄及び図面（１）　　明細
書第２７頁第９行に「添付図面」とあるを、「第１図」
と訂正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）（ｉ）２つの異なる固定化された又は固定化
   可能なプライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含有す
   る試験試料とハイブリダイゼーション条件下に接触させ
   ることと、 （ｂ）工程（ａ）の得られる生成物を得られるハイブリ
   ダイゼーションされたプライマー核酸を延長させる条件
   下に延長酵素及び少なくとも１種の核酸残基と接触させ
   ることと、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を変性して固定化された標的
   核酸配列を生成させることと、 （ｄ）先のサイクルの工程（ｃ）の生成物を（ａ）（ｉ
   ｉ）の代わりに使用して工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
   のサイクルを少なくとも一回繰り返すことを特徴とする
   、試料中の特定の標的核酸配列を増幅させる方法。 ２、プライマー核酸がオリゴヌクレオチドである特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３、プライマー核酸がその一端で固体支持体に連結され
   ていることにより固定化されておりそして延長は支持体
   と反対の方向に起こる特許請求の範囲第１項又は第２項
   記載の方法。 ４、試料が二本鎖ＤＮＡを含んで成りそして各核酸が前
   記ＤＮＡの鎖に対して相補的である特許請求の範囲第１
   項乃至３項のいずれかに記載の方法。 ５、（ａ）固定化された又は固定化可能なプライマー核
   酸、（ｂ）延長酵素及び（ｃ）少なくとも１種の核酸残
   基を含有する１個又はそれより多くの容器を備えて成る
   ことを特徴とする、特許請求の範囲第１項乃至４項のい
   ずれかに記載の方法を行うためのキット。 ６、（ａ）（ｉ）２つの異なる固定化された又は固定化
   可能なプライマー核酸を（ｉｉ）標的核酸配列を含有す
   る可能性のある試験試料とハイブリダイゼーション条件
   下に接触させ、 （ｂ）工程（ａ）の得られる生成物を、得られるハイブ
   リダイゼーションされたプライマー核酸を延長させる条
   件下に延長酵素及び少なくとも１種の核酸残基と接触さ
   せ、 （ｃ）工程（ｂ）の生成物を変性して固定化された標的
   核酸配列を生成させ、 （ｄ）先のサイクルの工程（ｃ）の生成物を（ａ）（ｉ
   ｉ）の代わりに使用して工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）
   のサイクルを少なくとも一回繰り返し、 （ｅ）増幅された配列が存在するかどうかを決定するこ
   とを特徴とする、試料中の特定の標的核酸配列を検出す
   る方法。 ７、プライマー核酸がオリゴヌクレオチドである特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 ８、プライマー核酸がその一端で固体支持体に連結され
   ていることによって固定化されておりそして延長が前記
   支持体と反対の方向に起こる特許請求の範囲第６項又は
   ７項に記載の方法。