JPH0191799A - グラム陰性菌におけるβ−ラクタマーゼ産生を検定する為のＤＮＡプローブ - Google Patents

グラム陰性菌におけるβ−ラクタマーゼ産生を検定する為のＤＮＡプローブ

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JPH0191799A
JPH0191799A JP63177259A JP17725988A JPH0191799A JP H0191799 A JPH0191799 A JP H0191799A JP 63177259 A JP63177259 A JP 63177259A JP 17725988 A JP17725988 A JP 17725988A JP H0191799 A JPH0191799 A JP H0191799A
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JP63177259A
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Roger Levesque
ロジャー　レベスク
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Universite Laval
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｑ楽土の利用分野〉 本発明は微生物による特定の抗生物質に対する耐性に関
与するβ−ラクタマーゼ生成を検定する方法に関する。
く（色旦舅」ン ダラム陰性菌におけるβ−ラクタム耐性の最も重要な生
化学的メカニズムはβ−ラクタマーゼ生成である。この
タイプの酵素はペニシリン及びセファロスポリンのβ−
ラクタム環を切断し、抗菌活性を欠く物質を生成させる
。
様々なβ−ラクタマーゼがダラム陰性菌においてはプラ
スミドにより媒介されることが知られている。事実、ペ
ニシリン、セファロスポリン及びそれらに関連したβ−
ラクタム抗生物質への耐性に関与する２７を越える生化
学上区別されるβ−ラクタマーゼが、従来、等電点電気
泳動により同定されてきた。しかしながら、新型のβ−
ラクタマーゼが新しい細菌宿主に出現し、その播殖（転
移）はトランスボゾンに運ばれることにより促進される
。実際上、全てではないとしても殆どのβ−−ラクタマ
ーゼ伝子は複合的な多謝性（ｍｕｌｔｉ−ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｃｅ　）転移因子の一部である。
◇明が解決しようとする問題点 従来、抗生物質に対する１ｍ薗の耐性は対象微生物を抗
生物質含有培地中で培養することにより検定されていた
。そうした技術は通常充分実効性を有するものであるが
、ただそれは費用と時間を要する。
従って、細菌の抗生物質耐性を検定する為のより迅速且
つ経済的手段を持つ新しい技術が強く求められている。
ぐ照点を解決するための手段、　用 本発明は、対象微生物におけるβ−ラクタマーゼ合成を
コードする遺伝子の存在を検定する方法を提供し、当該
方法は、以下の事項より成る：ａ）実質的に一重鎖の状
態であってβ−−２クタマー４合成コードしていると思
われるＤＮＡ断片を含有する試料を不活性支持体上に沈
着して固着させ； ｂ）上記固着−本鎖遺伝物質を予め決定された緊縮度忙
よるハイブリッド形成条件下、β−ラクタマーゼ合成を
コードする構造遺伝子のヌクレオチド配列に少なくとも
実質的に相補的な少なくとも凡そ１２ａ基のヌクレオチ
ド配列を有する標識プローブに接触させ；且つ Ｃ）上記標識により上記支持体上の二重らせん形成を検
出する。
本発明はまた、β−ラクタマーゼ遺伝封子Ｘ／Ｌ　−２
及びＴＴｈ（１に共通な、保存された、基準的アミノ酸
活性部位を含有し、各々１２，１５，１７及び４５塩基
から成る第一系統の合成ＤＮＡプローブ、及びβ−ラク
タマーゼ遺伝封子伍−１、ｐ３８−１、ＲＯＢ−１、０
ＸＡ−３、■Ｃｋ　−４、ＡＳＦ　−２゜ＰＳＥ−４、
ＣＡＲ，Ｂ−３、ＣＡＲ，Ｂ−４及び庇−１に共通な、
保存された、基準的アミノ酸活性部位を含有する第二系
統のＤＮＡプＵ−プを提供する。
本発明のＤＮＡプローブの調製及びその有用性は以下の
説明を参照することによってより良（理解されるであろ
５゜ 本発明は、従って、微生物による特定の抗生物質に対す
る１、耐性に関与するβ−−ラクタマーゼ生成検定する
方法に関する。この方法は、特にその迅速性において従
来の技術に１募り、その平頭が簡明であり、標準化され
た試薬を使用し得、商業的なキットとして提供し得、そ
してより多くの試料を、迅速にスクリーニングし得るも
のである。
検定用試料の調製 本発明により開発された技術の使用が望まれる場合、β
−ラクタマーゼ合成をコードする遺伝子を持つ微生物を
含有すると思われる、臨床的に分離された試料を直接あ
るいは生育に適した条件下培養装用いる。対象微生物を
処理して一本鎖ゲツム核酸を得、その核伎を支持体に固
着させた後、その固着ＤＮＡをそれとは相補的コードを
持つ塩基配列、あるいは、β−ラクタマーゼをコードす
る遺伝子の非転写鎖、を有する慄識ポリヌクレオチドと
接触させる。
プローブの構築 主要な試薬は標識ＤＮＡプローブである。本発明のプ筒
−プは通常少なくとも１２塩基から凡そ１７００塩基ま
でを有する。このプローブの配列はβ−ラクタマーゼ生
成をコードする遺伝子に対し、少なくとも実質的に相補
的である。グローブが、それと共にハイブリッドを形成
する配列に対して完全な相補性を有する必要はなく、４
０％あるいはそれ以上の異なった対があっても良い。遺
伝子中の反応物（ｒｅａｇｅｎｔｓ　）の多様性、変異
、複数微生物に共通なプローブ、対立遺伝子等が原因で
、反応の特異性の幅を広げるクロスハイブリダイゼーシ
ョンを生じる可能性が在る。
本発明において用いられるプローブは、次の様な一般的
方法によつ【調製し得る。すなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１９１株を培養、精製し、そ
のプラスミドＤＮＡをクリアート・ライゼイト法（ｃｌ
ｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　）により分
離し、セシウム　り四リドーエチジウム　プロミド（ｃ
ｅｓｉｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅ−ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｂｒ
ｏｍｉｄｅ　）勾配超遠心分離によって精製する。
分離した所望プラスミドは次いで適切な制限エンドヌク
レアーゼで消化させ、代わって、予め適切なエンドヌク
レアーゼで処理したｐＡＣＹＣ１８４と結合させる。こ
の場合に生じる断片はＴ４リガーゼで処理する。結合は
、アガロースゲル電気泳動で調べて確かめる。こうして
得た組換えプラスミドを更に生育させる為、Ｅ、　ｃｏ
ｉｌ　ＨＢ　１０１に導入して形質転換させる。次いで
、その組換えプラスミドを含む細菌のクローンをアンピ
シリンやクロラムフェニコールの様な特定の抗生物質に
対するそれらの耐性に従って選択する。クロラムフェニ
コール耐性は通常ｐＡＣＹ０１８４プ２スミドによって
細菌に伝達される。しかしながら組線えプラスミドを含
有する細菌は、テトラサイクリン忙対しては感受性とな
る。なぜならば、ｐＡＣ′ＹＣｌ３４のテトラサイクリ
ン遺伝子内の制限部位を選んだ為、この反応部位（ｒｅ
ａｇｅｎｔ　）に挿入された外来遺伝子がその遺伝子を
破壊するからである。
これらの実験から、より小さな組換えプラスミドを選択
し、更なる分析を行う。所望プラスミドを分離し精製し
た後、それを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化し、
電気泳動くより分離する。
ＤＮＡ断片をゲルから切り取って透析膜中で電気溶離す
る。次いでＤＮＡを冷エタノール中で沈ＩＩＲし、遠心
分離し１００μノの滅菌ＴＥ中に溶解させる。各プロー
ブの純度及び品質をアガロースまたはアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって分析する。
β−ラクタマーゼ産生に関与する特定のＤＮＡ配列を同
定し特徴を定めた後、対応するＤＮＡプローブを合成す
る。フォスファイトトリエステル法（ｐｈｏｓｐｈｉｔ
ｅ　ｔｒｉｅｓｔｅｒ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）を用い
、オリゴヌクレオチド配列を先ず最初に合成する。
次いで、得られた配列を脱塩し、ポリアクリルアミドゲ
ル上で精製し、紫外線染色（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔｓ
ｈａｄｏｗｉｎｇ　）により可視化して標識した。
大体においてポリヌクレオチドプローブは放射性ラベル
によって標識される。しかしながら、ある状況において
は、β−ラクタマーゼ合成をコードする一本＠ＤＮＡｋ
ハイブリダイズしたプローブに対し特異的に結合する抗
体を使用することもできる。この沿合、その抗体で標識
することによって検出が可能になる。
使用され得る放射性ラベルの５ちでも”Ｐ、　”Ｈ。
１４Ｃが例示され得る。しかし、十分なシグナルを与え
且つ十分な半減期を有するものであれば、あらゆる放射
性ラベルが使用され得る。他の標識としては標識された
抗体に対する特異的結合部材として用いられ得るリガン
ド、螢光剤、化学的発光剤、酵素、標識されたリガンド
に対して特異的に対を為す結合部材として使用され得る
抗体等が含まれる。イムノアッセイにおいては多様なラ
ベルが用いられているが、それは本発明のプローブに直
接使用され得る。ラベルの選択は、ハイブリダイゼーシ
ョンの速度及び遺伝子ＤＮＡへのプローブの結合に対す
る２ベルの効果によって決定される。ラベルは、ハイブ
リダイゼーションに有効な量のＤＮＡを充分に検出し得
る感受性を提供し得ることが必要である。
プローブにラベルを結合する方法は、そのラベルの性質
によって様々である。放射性ラベルに関しては、広範囲
の技術が使用され得る。よく用いられるのは、ａｌｐｈ
ａ　−”Ｐ　−ｄＮＴＰによるニックトランスレーショ
ンまたはアルカリフォスファターゼによる末端リン酸加
水分解（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅｈｙｄ
ｒｏｌｙｓｉｓ　）後ガｙ　マー　ｓ２Ｐ　−ＮＴＰ及
びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射性３２Ｐ
で標識する方法である。それらに代わる方法としては、
存在する一以上の元素を、例えば、水素を三重水素に置
き換える等、放射性同位体で置き換えてヌクレオチドを
合成することができる。こうして、プローブはハイブリ
ダイゼーションの目的に使用可能となる。
ハイブリダイゼーションの技術 プローブは、水に対して不溶の多孔質支持体上に一本鎖
核酸として固定された遺伝子にハイブリダイズする為に
用いられる。核酸の人手源によって、支持体へ核酸を固
着させる方法が異なることがある。
検定を行う微生物を含有する試料は、互いに独立した複
数の部分を形成する様にフィルター上に滴下または散布
する。フィルターは、ニトロセルロースの様な不活性な
多孔性固体支持体である。
臨床的分離物としては、尿、血漿、血清等のあらゆる排
泄物や体液（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ
　）が使用され得る。細胞が明瞭なコロニーを形成する
様にフィルターを栄養源忙接触させても良い。栄養物質
は細胞へ拡散して行っても良いが、細胞はフィルター上
でそれらの存在する場所から拡散してはならない。マイ
クロフィルターを使用すると、それは、細胞がそのフィ
ルターと栄養ゲルに接したフィルターとを通り抜けるの
を阻止するので便利である。
次に、細胞がそのＤＮＡを遊離させる様に処理する。細
胞数を増加させる為に栄養物質が供給されている場合は
、コロニー形成に充分な時間を経過させた後、フィルタ
ーをその栄養源から離し、細胞を溶菌する。溶菌条件は
、細胞あるいはコロニーが移動せず、それらのＤＮＡが
それらの位置する面に付着したまま残る様に設定する。
溶菌は、通常水性の希釈ブルカＩＪ　Ｋよる化学的溶菌
法を用いて行う。アルカリはＤＮＡの変性にも役立つ。
他に高温や、例えばアルコール、アミド、アミン、尿素
、フェノール及びスル７オキシドの様な有機試薬または
特定の無機イオンを変性因子として使用し得る。
変性後、フィルターは核緩衝溶ｇ、（ｎｕｃｌｅｕｓｂ
ｕｆｆｅｒ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）中で、−船釣に凡そ
ｐＨ５乃至８にて洗浄する。使用され得る多くの緩衝液
の中でトリスを例示する。１種またはそれ以上の洗浄剤
を使用し得、その際、溶菌及び変性に用いた方法と同様
の方法を使用すると便利である。
溶菌、変性及び洗浄を完了後、ＤＮＡスポットの付いた
フィルターを凡そ５０℃乃至７０℃の高温で乾燥させる
。こうしてＤＮＡは固定され、随時プローブを用いて検
定、が可能となる。
別法として、試料としての細菌のプラスミドＤＮＡをフ
ィルター上にスポットする前に分離精製してもよい。次
の段階で試料中に含まれた核酸を一本鎖にし、調製され
た混合物をニトロセルロースフィルター上にスポットし
た後フィルターを高温で乾燥させる。それによりＤＮＡ
は固定され、プローブで随時判定し得る。
そこで、予め準備しておいたフィルターをプ四−ブを含
まないハイブリダイゼーション溶液で全体が湿るまでや
や高温に保ちながらインキュベートする。様々なハイブ
リダイゼーション溶液が用いられ得、それらは極性を有
する不活性有機溶媒約２０乃至６０％、好ましくは３０
％から成る。
フィルターを十分な時間やや温暖に保ちながらハイブリ
ダイゼーション溶液に接触させた後フィルターは第二の
ハイブリダイゼーション溶液中に入れる。フィルターを
第二のハイブリダイゼーション溶液中に保つ時間は５分
乃至３時間以上である。第二の溶液によって緊縮度が決
定される。すなわち交差二重らせん（ｃｒｏｓｓ　ｄｕ
ｐｌｅｘｅｓ　）や短い相補配列を溶解させる。フィル
ターを希釈塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム溶液の
様な適切な溶液で洗浄後、フィルターはラベルの性質に
応じ、二重らせんの存在について判定される。ラベルが
放射性である場合は、フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィ
ルムに露出させる。
適切なβ−ラクタムＤＮＡプローブの恰築に使用され得
るＤＮＡ配列の合成を可能にする為には、β−ラクタマ
ーゼ生成をコードするＤＮＡ配列を同定しその４９徴を
定めることが先ず必要である。
従って様々なタイプのβ−ラクタマーゼをコードするプ
ラスミドを先ず一組の制限エンドヌクレアーゼでスクリ
ーニングし、クローニングに最も適したＤＮＡ断片を生
産するものを決定する。クローニングベクターとしては
、ｐＢＧｓ　１３１　、Ｍ　１３、ｐＡｃＹｃ　１８４
の様なベクター及び−ｂ匹、２プラスミド融合へＩＩ　
−ｐＭＬＢ　１０３４及びｐＭｃ　１８７１が使用すれ
得るが、ｐＡＣＹｏ　１８４を用いるのが一般的である
。
所望ＤＮＡ配列の同定に到る第一段階においてプラスミ
ドＤＮＡは適切なエンドヌクレアーゼで消化し所望クロ
ーニングベクターに結合させる。プ；Ｆ　スｉ　）”　
ｐＡＣＹｏ　１Ｂ４をクローニングベクターとして用い
る場合には、エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ。
拒几工、旦匡ｄ　ＩＩＩ　、五区工、−旦ａｕ　３Ａ及
びＢＡ！ｇ。
ＩＩが最も適することが判っている。
例えば、プラスミドＤＮＡは□、Ｂａｍ　ＨＩ　、旦匡
ｄＩＩＩ　、　Ｓａｄ　ＩあるいはＢＪｇ　ＩＩで消化
し、予め同一または異なるエンドヌクレアーゼで処理し
、アルカリ性フォスファターゼで脱リン酸化したｐＡＣ
Ｙ０１８４と結合し、得られた混合物テＥ、　ｃｏ（ｉ
　ＨＢｌｏｌを形質転換してアンピシリン及びクロラム
フェニコールに対する耐性に関し選択を行うことができ
る。ＰＳＥ　−３をコードするプラスミドＲｍｓ　１４
９の場合、Ｆｆｃｏ　ＲＩとＳａｔ　Ｉの双方をクロー
ニングに弔い、アンピシリン忙対してのみ耐性を有する
形質転換体を選択する。にｍ−１β−ラクタマーゼ遼伝
封子場合は、旦５１リーＪ　５３−２０７７１１の染色
体ＤＮＡから５．１１３Ａ部分的消化物を調製し、１皿
ｆ（Ｉ処理されたｐＡＣＹｏ　１８４と結合する。■仏
−２β−ラクタマーゼ迫伝子をコードするプラスミドＲ
４６は、Ｂｌｇ　ＩＩを用いて消化し、得られた断片は
、予めＢａｍＨＩ処理したｐＡＣＹＣ１８４と結合する
。５ＨＹ−１β−ラクタマーゼ遺伝子をコードするプラ
スミドｐＭＯＮ　３１の場合、このプラスミドを先ずＡ
ｖａ　Ｉで消化し、得られた断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合する。
新しいプラスミドＤＮＡが分離、精製されたら、後の＆
１査に使用する為に、欠失プラスミド（ｄｅｌｅｔｅｄ
ｐｌａｓｍｉｄ　）を構築して、より小さなアンピシリ
ン組換え体を選択する。ｐＡＣＹＣ１８４のオリ、遺伝
子内のクローニング部位の位置から予期される様に全て
の組換え体はテトラサイクリン感受性であることが判明
した。ｐＡＣＹＣ１８４中の＆ｏＲＩ部位へのｐＭＯＮ
　２２Ｇの挿入はクロラムフェニコールに対しても感受
性である。いくつかのプラスミドは、アンピシリンに対
してのみならず、ストレプトマイシンあるいはスルフォ
ンアミドに対する耐性もコードしている。等電点電気泳
動によれば、これらのプラスミドはいずれも、アンピシ
リン耐性Ｒ４６親プラスミドと同一タイプのβ−ラクタ
マーゼを産生ずることが示された。
制限地図の作成及びβ−ラクタマーゼ 選択された組換えプラスミドのＤＮＡは以下のエンドヌ
クレアーゼで消化し得る一Ａｖａ　Ｉ　、　ＢａｍＨＩ
　、短ＩＩ　、以遠ＲＩ　、旦ｉｎ　ｄ　ＩＩＩ　、　
Ｐｖｕ　ＩＩ　。
旦す−■、Ｓｓｔエエ、及びジ狙３Ａ０なお仰外として
プラスミドｐＭＯＮ　２０は、酵素か！工、睡ＨＩ。
ＢｃｏＲＩ、旦ｉｎ　ｃ　ＩＩ　、　Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩ
Ｉ　、　Ｎｒｕ　Ｉ　、坦Ｉ及び５ａｌＩを用いて消化
する。制限部位の位置は、ｐＡｃＹｏ　１８４の様なり
ローニングベクターまたはＲ，４６の様な初期プラスミ
ドの対応する制限パターンと比較しながら一回、二回、
及び三回消化物（ｓｉｎｇｌｅ　、　ｄｏｕｂｌｅ　ａ
ｎｄ　ｔｒｉｐｌｅ　ｄｉｇｅｓｔｓ　）を用いて、断
片の大きさに応じ０．８乃至１．５％アガロースゲル上
で電気泳動を行うことＫよって決定する。β−ラクタマ
ーゼ構造遺伝子の更なる位置決定はサブクローニングま
たは遺伝子発現に不可欠な断片の削除によって行われる
。結果的に得られた地図は第１図、第２図及び第５乃至
１０図に示されるが、これらは以下の情報を提供した。
すなわち、第１図はほとんどのβ−ラクタマーゼ遺伝子
はジ皿ＨＩまたは旦国ｄ　ＩＩＩ断片上にり四−ニング
され、そうした断片の大部分は少なくとも１個のｙｎＩ
Ｉ部位とそうした部位２個を各々含有する０Ｘｋ−１及
び０η、−４β−ラクタマーゼ断片とを含有する。生化
学的に類似したＰＳＥ−１゜ＰＳＢ　−２、ＰＳＢ−４
、ＣＡＲ，Ｂ　−３及びＡＥＲ−１遺伝子を含有するＤ
ＮＡ断片もまた同様に配置されたＡｖａ　Ｉ及びＰｖｕ
　ＩＩ部位の頻度に関し、注目すべきものである。更に
は、第２図は、Ｒ４６プラスミドのスルフォンアミド遺
伝子上に新たにＰｓｔ−工部位が付加されていることを
示し、それは既に発表されたＲ　４６地図と相異すると
ころである。
０ＸＡ−２β−ラクタマーゼ構造遺伝子はＺ８ｋｂ旦ｓ
ｔ　Ｉ断片及び２．３　ｋｂ　Ａｖａ　Ｉ断片を削除す
ることＫよって更に位置決定される。これらの断片を削
除するとプラスミドｐＭＯＮ　２１及びｐＭＯＮ　２２
が得られる。Ｒ４６プラスミド中のβ−ラクタマーゼ耐
性をコードするＯＸＡ　−２構造遺伝子が最後の数個の
ヌクレオチドを除きほとんど完全に０．８５ｋｂＡｖａ
Ｉ−旦ｉｎ　ｃ　ＩＩ−旦ｉｎ　ｃ　ＩＩ断片内に見い
出されたことに留意すべきである。
第１．２図及び第５乃至１０図の制限地図から、第１図
及び第３乃至１０図に示すＴＥＭ−１、Ｏ）仏−１、Ｐ
ＳＥ−１、ＩｔＯＢ−１，０ｘｋ−２、■α−３゜０Ｘ
Ａ−４、ＡＳＦ’−２、ＰＳＥ−４、ＣＡＲＢ−３，Ｃ
ＡＲＢ−４及びＡＥＲ−１β−ラクタマーゼ遺伝子に対
する遺伝子ブ四−ブが得られる。プラスミドルＢａ３２
２によって担持されたＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ遺伝
子は、１９７８年にサトクリ７　（５ｕｔｃｌｉｆｆｅ
）がその配列を解読した。従ってその遺伝子に内在する
プローブは４２４　ｂｐ　ＢＧＪ　Ｉプラス用ユｃ　Ｉ
Ｉ断片として得られる。第二のプローブは、ｐＭＯＮ３
０１から得られる０ＸＡ−１ラクタマーゼ遺伝子に内在
する３１５　ｂｐ且旺ＩＩから成る。ｐＭＯＮ　３０１
は、第１図に示すｐＭＯＮ　３００の土ｄ　ＩＩＩ断片
の角皿ＨＩ−Ｈｉｎ　ｄ　ＩＩＩサブクローンであると
とに留意すべきである。このプローブの選択は、この断
片の削除によりβ−ラクタマーゼ遺伝子の発現が消失す
るというＶｉ察事実に基づく。更に、０ＸＡ−１遺伝子
のプロモーター位置と転写の方向はＰＭ０１８７１から
得た１五ＺカートリツヂをｐＭＯＮ　３０１の胚ｋＩＩ
部位に挿入することにより決定される。第三のプローブ
はｐＭＯＮ　８１０から得られるβ−ラクタマーゼ遺伝
封子ＳＥ−１の１．３　ｋｂ珈匹ＨＩプラスＢＧＩ　Ｉ
Ｉ断片を含む部分である。その選択は、ｐＭｃ１８７１
から得られる’Ｊａｃ　Ｚ　Ｂａｍ　ＨＩ断片をｐｋｉ
ＯＮ８１０のＢｇｌ　ＩＩ部位に挿入するとβ−ラクタ
マーゼ遺伝子の発現が失なわれるという事実に基づく。
ｐＭＯＮ　４０１から得られる２５０　ｂｐ生巨３Ａ断
片から成る第４のプローブはこの断片の削除によってβ
−ラクタマーゼ遺伝子の発現が消失するという観察事実
に基き調製される。０ＸＡ−２構逃遺伝子に内在するプ
ローブもまた調製され、それらは０．２８ｋｂ　Ｎｒｕ
　Ｉ−旦ｉｎ　ｃ　ＩＩ及び０．５１　ｋｂＨｉｎｃＩ
Ｉ−ＨｉｎｃＩＩＤＮＡ断片を含む。β−ラクメマ・−
ゼブロープの特異性を確実にする為、プラスミドｐＭＯ
Ｎ　２１から得られる０、８４　ｋｂシ辺ＲＩ−坦工断
片も使用し得る。なぜならばその断片は、構造遺伝子の
外側に接する配列を有することが知られているからであ
る。
既知の配列を有するβ−ラクタマーゼにおいては、活性
部位ペニシリン結合セリン残基は第４位置のフェニルア
ラニンと第３位置のりジンに、そのカルボキシル側で接
しており、そのことは、これらの保存されたフェニルア
ラニン及びリジン残基が触媒反応に重要であることを示
唆している。
また、ＴＹＭ及び■仄−２β−ラクタマーゼは同一の位
置１ｃ　ａｒｇ　−Ｘ−Ｘ−Ｘ　−ａｒｇをも有するこ
とに留意すべきである。従って０ＸＡ−２及びＴＥＭオ
リゴヌクレオチドプローブは、β−ラクタマーゼ活性部
立またはその付近の相同性の評価に役立ち得ることが推
測された。これらのヌクレオチド配列から、分子プロー
ブとして使用されるべき一連のオリゴヌクレオチドが合
成され、それらは第１゜３．４乃至１０図にも示されて
いる。
これらの図面中、制限エンドヌクレアーゼの切断部位に
関する省略記号は：　Ａ、　Ａｙａ　Ｉ　；　Ｂ、　Ｂ
ａｍＨＩ　；　Ｂｇ、　Ｂａ７　ＩＩ　；　Ｃ，Ｃ１ａ
　Ｉ　；　Ｅ、　Ｅｃｏ　ＲＩ　；　Ｈ。
旦ｉｎ　ｄ　ＩＩＩ　；　Ｈｅ、旦ｉｎ　ｃ　ＩＩ　；
　Ｋ、　Ｋｐｎ　Ｉ　；　Ｎ、　ＮｒｕＩ　；　Ｐ、　
Ｐｓｔ　Ｉ　；　Ｓ、　５ａｉｌ　Ｉ　；　Ｓｍ、珈ｔ
ａ　Ｉ　；　Ｘ、　Ｘｈ。
工である。
遺伝子の省略記号は：旦竺、アミノグリコシド３’（９
）−アデニリルトランスフエラーゼ；　ａａｄＢ、アミ
ノグリコシドτ−アデニリルトランスフエラーゼ；　ａ
ｐｈＣ，アミノグリコシド３′−７オスフオートランス
フエラーゼ；　ｂｌａ、β−ラクタマーゼ；５スルフォ
ンアミドｐ　Ａｐ−アンピシリン；　Ｃｍ、クロラムフ
ェニコール；脂、カナマイシン；　Ｔｃ、テトラサイク
リン；　Ｓｐｃ、スペクチノマイシンである。
その他の省略記号は：Ａｎｔ、アンチモン；　Ａｓａ。
ヒ酸塩；Ａｓ　ｔ　ｅ亜ヒ酸塩；　ＩＲ，、逆位反復；
　Ｉｓ、挿入配列；　ＭｕｃＡＢ、突然変異誘発の促進
；　ｐｅｒｅ　！Ｊコンビナーゼ；　Ｒｅｐ、複製；　
Ｔｒａ、接合転移である。
第１図中、プラスミド地図は太線で示すｐＡＣＹ０１８
４ベクターのＥｃｏＲＩ部位で切って直線状に表す。耐
性決定因子のおおよその位置も示し、組換え分子は一定
の割合で拡大して示す。唯−ｐＭＯＮ４０１にはＡｖａ
　Ｉ及びＰｖｕ　ＩＩ部位が存在しないことは例外とし
て、１４種の組換えプラスミドの全ては、Ａ阻Ｉ　、　
ＢａｍＨＩ　、里ＩＩ　、担Ｒ工、旦匡ｃｔ　ＩＩＩ　
、至ｒｕ　ＩＩ　、−シリ、■及びシ佳Ｉをその地図上
に有する。
第２図中、目盛の数字はキロベースで示しである。逆位
反復及び挿入配列の方向は矢印によつそ示す。ｐＭＯＮ
　２１及びｐＭ）Ｎ　２２に記した点と矢印は、プロモ
ーターの位置と０ＸＡ−２ｂｌａ遺伝子の転写方向を示
す。
第３図においては、関係のあるエンドヌクレアーゼ部位
のみを示した。プローブとして使用されるＤＮＡ断片は
１から４迄番号を付した。太線は、ベクターｐＡＣＹＣ
１８４０部分を示し、点はプロモーターのおおよその位
置を、矢印は転写の方向を示す。
第４図中、合成されたプローブは太線でその範囲が示さ
れている。括弧はβ−ラクタマーゼ活性部位あるいはそ
の付近に保存された４つのアミノ酸を示し、双方の配列
中の保存アルギニン残基は星印で示す。ＴＥＭ−１に関
する５９乃至７３位置及びＯＸＡ　−２に関する６３乃
至７７位置は、それう各々のβ−ラクタマーゼ構造逮伝
封子のアミノ酸の位置を示す。
Ｋ１表は、合成された、異なるβ−ラクタマーゼ遠伝封
子ローブを要約して示す。
衾施例〉 実施例１ ｕｐグ識０１２プローブＤＮＡのｇ１製り三色リーはト
リブチツク大豆肉汁培地（を昨ｔｉｃＢｏｙ　ｂｒｏｔ
ｈ　）中で生育させ、Ｍ製し、そのプラスミドＤＮＡを
クリアート・ライゼイト法で分離し、セシウムク四リド
ーエチジウムプロミド勾配超遠心分離によって精製する
。精製されたＲ４６ＤＮＡプラスミドを、次いで、制限
エンドヌクレアーゼーシ罰−ＩＩで消化し、予めシュＨ
Ｉ処理したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４と結合させる。
結合は、０．８％アガロースゲル上電気泳動で確かめ、
組換え分子をルｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１に導入し、アン
ピシリン及びクロラムフエニフール耐性によって選択す
る。得られた１０．３　ｋｂ　ｐ′ＭＤＮ　２０　プラ
スミドを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼを用いて結合させ、７．５　ｋｂ　ｐ
ＭＯＮ　２１プラスミドを作成する。プ９スＱドｐＭＯ
Ｎ　２０またはｐＭＯＮ　２１２０１１ｇをｍ製後、ｐ
ＭＯＮ　２０プラスミドをＡｖａＩプラス且ｃ　ＩＩで
消化し、また、ｐＭＯＮ　２１をか１■プラス匡ｃ　Ｉ
Ｉで消化して、プローブＤＮＡ断片が得られ、それらは
電気泳動によって分１される。
これらのＤＮＡ断片は、種々の康変（０，７％乃至１．
５％）のアガロースまたは、５％ポリアクリルアミドゲ
ル及びトリスホウ酸緩衝液を用いて分離される。次いで
ＤＮＡ断片をゲルから切除し透析膜中で電気溶離（ｅｌ
ｅｃｔｒｏ　ｅｌｕｔｅｄ　）する。次にＤＮＡを冷エ
タノールで沈澱し、遠心分射し、１００ｐｉ無＠　Ｔ　
Ｅ　（１０ｍＭ　）リス、ｌ　ｍＭＥＤＴＡ、ｐｈ＆Ｏ
）中に溶解させる。得られた断片のうち所望のプローブ
は−ＴＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−というＪＦｌｊ造を有
していた。７オスフアイ））ジエステル法を用い、Ａｐ
ｐｌ　ｆｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ａｐｐａｒａｔｕ
ｓまたはＰｈａｒｍａｃｉａＧｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌ
ｅｒによって十分な量のこのヌクレオチドを合成した後
ＮＡＰ　ＩＱカラムを用いてそれを説塩し、７Ｍ尿素含
有１２％ポリアクリルアミド上で精製し、紫外線染色に
より可視化する。リン酸化オリゴヌクレオチドは３７℃
にて３０分間Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及びガンマ
−Ｂ２ｐ−ＡＴＰを用いて標識した。
実施ｆＰ＋　２ ”Ｐ　ＰＲＰａ　０１５　Ｄ　Ｎ　Ａプｏ　−２ｆ）　
ａｌＭｌ”Ｐ　ｑ識０１５　Ｄ　Ｎ　Ａプローブの調製
に用いる方法は実施例ＩＫ記した方法と同一である。１
５ヌクレオチド配列は第４図に示す。
実施例３ ！２Ｐ漂識０１８　Ｄ　Ｎ　Ａプローブの調渠社Ｐ標７
００１８　Ｄ　Ｎ　Ａプローブの調製に用いる方法は実
施例１に記した方法と同一である。１８ヌクレオチド配
列は第４図に示す。
実施例４ ＳａＰ像識０４５　Ｄ　Ｎ　Ａプローブの調製３２ｐ傾
７′１０４５　Ｄ　Ｎ　Ａプロ−ブの調製に用いる方法
は、実施例ＩＫ記した方法と同一である。４５ヌクレオ
チド配列は第４図から明らかである。
実施例５ Ｐ　４！識Ｔ　１５　Ｄ　Ｎ　Ａ　フｃｔ　−２ノ調ｆ
ｉ５２ｐａ識Ｔ１５ＤＮＡグローブの調製に用いる方法
は、実施例１に記した方法と同一である。１５ヌクレオ
チド配列は、ｍ４図に示す。
実施例６ Ｅ、　ｃｏｌｉ、細胞は、トリブチツク大豆肉汁培地中
で生育させ、そのプラスミドＤＮＡをクリアードライゼ
イト法によって分離し、ポリエチレングリコールで濃縮
し、セシウムクロリド−エチジウムプロミド勾配超遠心
分離によって精製する。精製ｐＢＲ３２２プ２スミド１
００μｇをエンドヌクレアーゼ乃区Ｉ及び旦ｉｎ　ｃ　
ＩＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を電気泳動により調
製する。これらのＤＮＡ断片は、種々の濃度（０，７乃
至１．５％）のアガロースまたは５％ポリアクリルアミ
ドゲル及びトリスホウ酸緩衝液を用いて分離される。次
いでＤＮＡ断片をゲルから切除し透析膜中で電気溶離す
る。次にＤＮＡを冷エタノールで沈澱し、遠心分離しＺ
ｏｏ　ｔｔｌの無菌ＴＥ（１０ｍＭ）リス、　１　ｍＭ
ＢＤＴＡ　、　　ｐＨ８，０）中＆Ｃ溶解する。得られ
た断片のうち、所望のプローブを第３図に示す。フォス
７フイトトリエステル法により、Ａｐｐｌ　ｉｄ　Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍＡｐｐａｒａｔｕｓ　ｔたはＰｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを用い、この
オリゴヌクレオチドを十分な量合成したら、ＮＡＰ　１
０カラムで脱塩し、７Ｍ尿素含有１２％ポリアクリルア
ミドゲルで精製し、紫外線染色により可視化する。リン
酸化オリゴヌクレオチドを３７℃にて３０分間、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ及びガンマ−３２Ｐ　−ＡＴＰ
を用いて標識する。
実施例７ ｓ２Ｐ　ｇ　識０ＸＡ−１フｏ　−フＤ　Ｎ　Ａ　ノＩ
！整Ｅ、　ｃｏｌｉ細胞はトリブチツク大豆肉汁培地中
で生育させ、精製し、そのプラスミドＤＮＡをクリアー
ドライゼイト法によって分離し、ポリエチレングリフー
ルで濃縮し、セシウムクロリド−エチジウムプロミド勾
配超遠心分離によって精製する。
精製された９ＭＫ　２０　：　Ｔｎ　２６０３　Ｄ　Ｎ
　Ａプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩｊ
消化し、予め同一のエンドヌクレアーゼで処理しアルカ
リ性フォスファターゼで脱リン酸化したプラスミドｐＡ
Ｃ’ＹＣ１８４と結合させる。結合は８％アガロースゲ
ル上電気泳動で確かめ、組換え分子なＥ、　ｃｏｌｉＨ
Ｂ　１０１　Ｋ導入しアンピシリン及びクロラムフェニ
コール耐性により選択する。得られた６、　９　ｋｂｐ
ＭＯＮ　３００プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＨ
ｉｎ　ｄ　ＩＩＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼで結
合してプラスミドｐＭＯＮ　３０１を作製する。プラス
ミドｐｈＤＮ　３０１１００μｇを精製後、このプラス
ミドをＢｇｌ　ＩＩで消化し電気泳動で分離してプロー
ブＤＮＡ断片を得る。これらのＤＮＡ断片は種々の濃度
（０，７％乃至１．５％）のアガロースまたは５％ポリ
アクリルアミドゲル及びトリスホウ酸緩衝液を用いて分
離される。次いでＤＮＡ断片をゲルから切除し透析膜中
で電気溶離する。次ＫＤＮＡを冷エタノールで沈澱し、
遠心分離し無ｉＪＴＥ（１０ｍＭ　）リス、　１　ｍＭ
　ｌ１ＤＴＡ　、　ｐｈ　ａ　Ｏ）　Ｚｏｏμ！中に溶
解する。得られた断片のうち所望プ胃−ブは第３図に示
す構造を有する。フォスファイトトリエステル法により
、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ａｐｐａｒ
ａｔｕｓまたはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓ
ｅｍｂｌｅｒを用いて、十分な量のこのオリゴヌクレオ
チドを合成した後、ＮＡＰ　１０カラムを用いてそれを
脱塩し、７Ｍ尿素含有１２％ポリアクリルアミドゲルで
精製し、紫外線染色により可視化する。リン醸化したオ
リゴヌクレオチドは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ及
びガンマ−”Ｐ　−ＡＴＰを用い、３７℃にて３０分間
標識する。
実施例８ ３２Ｐ標識ＰｓＢ−１プローブＤＮＡの詞−１見吐細胞
はトリブチツク大豆肉汁培地中で生育させ、精製し、そ
のプラスミドＤＮＡをクリアードライゼイト法により分
離し、ポリエチレングリコールで濃縮し、セシウムクロ
リド−エチジウムプロミド勾配超遠心分離によって精製
する。
ＭＨされたｐＭＫ２０　：：　Ｔｎ　Ｉ　４０３　Ｄ　
Ｎ　Ａプ；ｙ　スミトを制限エンドヌクレアーゼ−Ｂａ
ｍＨＩで消化し、予めアルカリ性フォスファターゼで処
理したプラスミドｐＡｃＹ０１８４と結合させる。結合
は０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動によって確
かめる。
組換え分子はｌ立えリエＨＢ　１０１に導入しアンピシ
リン及びクロラムフェニコール耐性によって選択する。
精製されたｐＭＯＮ　８１０またはｐへ４ＤＮ８１１プ
ラスミド１００μｇは１．馬匹ＩＩプラスＢｇｌ　ＩＩ
またはＢｇｌ　ＩＩプラスＡｖａ　Ｉで消化し、得られ
た断片を電気泳動により分離する。これらのＤＮＡ断片
は種々の濃度（０，７％乃至１．５％）の７ガロースま
たは５％ポリアクリルアミドゲル及びトリスホウｒＲ緩
衝液を用いて分離される。次いでＤＮＡ断片をゲルから
切り取り透析膜中で電気溶隔する。次に３Ｍ酢酸ナトリ
ウムｐｈ　４．５１／１０容を添加後ＤＮＡを冷エタノ
ールで沈澱する。遠心後、ＤＮＡペレットをＴ　Ｅ　（
１０ｍＭ　）す／１．　、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　。
ｐＨ８，０）　５００μノ中に懸濁する。蛋白質はクロ
ルフォルムで抽出し、ＤＮＡは沈澱さぜ、無菌ＴＥ１０
０μノに溶解させる。得られた断片のうち、所望プロー
ブは第３図に示す構造を有する。フォスファイトトリエ
ステル法により、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅ
ｍ　ＡｐｐａｒａｔｕｓまたはＰｈａｒ＋ｎａｃｉａ　
Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを用い十分な量のオリゴ
ヌクレオチドを合成した後、それをＮＡＰＩＯカラムを
用い脱塩し、７Ｍ尿素含有１２％ポリアクリルアミドゲ
ルで精製し、紫外線染色により可視化する。次にリンα
化したオリゴヌクレオチドを３２℃にて３０分間、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼ及びガンマ−”Ｐ　−ＡＴＰ
で標ムする。
実施例９ ｐｓｚ　４ｇｅＲＯＢＩ　フローフＤＮＡノｉｌ製Ｅ、
　ｃｏｌｉ細胞はトリブチツク大豆肉汁培地中で生育さ
せ、そのプラスミドＩ）　Ｎ　Ａをクリアードライゼイ
ト法により分離し、ポリエチレングリコールにより濃縮
し、セシウムク四すドーエチジウムプロミド勾配超遠心
分濫により精製する。、精製したＲＯＢ　１６１　Ｄ　
Ｎ　Ａプラスミドは、制限エンドヌクレアーゼＳａｕ　
３Ａで消化し、予め−ＨＩ処理したプラスミドｐＡＣＹ
Ｃ１８４と結合させる。結合は、０．８％アガロースゲ
ルを用いた電気永動により砧かめる。組換え分子は′Ｌ
ｃｏｌｉ　ＨＢ　ＩＱｌに導入し、アンピシリン及びク
ロラムフェニコール耐性により瓜択する。得られた６、
　４　ｋｂ　ｐＢ＝［ｌｒＪ　４０１プラスミドは制限
エンドヌクレアーセＳａｕ　３Ａで消化し、それによっ
て得られたＤＮＡ断片を電気泳ｍ　Ｋより分離する。こ
れらのＤＮＡ断片は種々のｌａ！（０，６％乃至１．５
％）のアガロ・−スまたは５％ポリアクリルアミドゲル
及びトリスホウ酸緩衝液を用いて分離される。次いでＤ
ＮＡ断片をゲルから切り取り、透析膜中で電気溶離する
。次にＤＮＡを、ｌ／１０容３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４
，５を添加後冷エタノールで沈澱させる。遠心後、ＤＮ
ＡベレットをＴＥ（１０ｍＭ　）リス、　１　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　、　ｐＨ８，０）　５００μノ中に懸濁し、蛋
白質は、クロロフォルムで抽出し、ＤＮＡは沈澱させ、
無菌Ｔ　Ｂ　１００μノ中に溶解する。得られた断片の
うち所望のプローブは第３図に例示した構造を有する。
フォスファイトトリエステル法によりＡｐｐｌｉｅｄ　
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　Ａｐｐａｒａ−ｔｕｓ　”！たは
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを
用いてこのオリゴヌクレオチドを十分量合成した後、瓦
ヒ１０カラムを用いてそれを脱塩し、７　Ｍ　ｋ　１．
　ｉ有１２％ポリアクリルアミドによって精製し、紫外
線染色により可視化する。次いで、リン酸化したオリゴ
ヌクレオチドを３７℃にて３０分間、Ｔ４ポリヌクＶオ
チドキナーゼ及びガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰを用い、標識
する。
実施例１０ ハイブリダイゼーション技術 プローブとして使用される各ＤＮＡ断片１μｇを標識し
た後、各断片なり１−Ｄｏｔ装置を用いてニトロセルロ
ースフィルター上にスポットスル。
次いで、焼かれたフィルターを４乃至８時間４２℃にて
、５ＸＳＳＣ１０ｍ、２０％または５０％ホルムアミド
、５Ｘデｙ　バー）　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　）溶液
。
５０　ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）及び１　ｍｙ／
−超音波処理サケ精液のＤＮＡ中で予備的に７１イブリ
ダイズする。
予備的にハイブリダイズした溶液を除去し、同一試薬プ
ラス変性プローブＤＮＡ　（１０’　ｃｐｍ　）１０−
を加える。
高度な緊縮性を得る為には５０％フォルムアミドで１８
時間４２℃にてインキュベート後６５℃で洗浄し、低い
緊縮性を得る為には２０％フォルムアミドで３０℃にて
インキュベート後２０℃で洗浄するという条件が選択さ
れる。最終的洗浄の後湿ったままのフィルターをＷｈａ
ｔｍａｎ　３　ｔｘｓペー７＜−上に乗せプラスチック
ジップで覆い、Ｋｏｄａｋ　Ｘｏｍａｔ　ＡＲ−２フイ
ルムを用い一７０℃にてオートラジオグラフィーを行う
露出時間は数時間から数日間造機々である。ポジティブ
及びネガティブの対照を各ハイブリダイゼーションに入
れておいた。
【図面の簡単な説明】
第１図は、β−ラクタマーゼ遺伝子を含有する１４種の
組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼ地図を示す
。 第２図は、クローニングベクターとしてＲ４６プラスミ
ド及びｐＡＣＹＣ１８４を用いた、組換えプラスミドｐ
ＭＯＮ　２０　、　ｐＭＯＮ　２１　、及びｐＭＯＮ　
２２の分子クローニング及び構築を示す。 第３図は、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ　）遺伝子ブ四−
プとし【用いられるＤＮＡ断片を担持する組換えプラス
ミドの物理的地図を示す。 第４図は、■（Ａ−２及びＴＥＭ−１合成オリゴデオキ
シリボヌクレオチドプローブのヌクレオチド及びアミノ
酸塩基配列を示す。 第５図は、５ＨＹ−１β−ラクタマーゼ遺伝子を含有ス
るｐＭＯＮ　３１プラスミドを用いた、組換えプラスミ
ドｐＭＯＮ　３４　、　ｐＭＯＮ　３６及びｐＭＯＮ　
３８の分子クローニング及び構築を示す。 第６図は、ＣＡＲＤ−４β−ラクタマーゼ遺伝子を含有
するｐＭＫ２０　：　：　Ｔｎｌ　４１３プラスミド及
びｐＡＣＹＣ１８４をクローニングビークルとして用い
た、−組換えプラスミドｐＭＯＮ　１０２５　、　ｐＭ
ＯＮ　１０２６　、　ｐＮｉＯＮ１０２７　、　ｐＭＯ
Ｎ　１０２８　、　ｐＭＯＮ　１０３６及びｐ？ｖｊＯ
Ｎ　１０３８の分子クローニング及び構築を示す。 第７図は、ＰＳＥ−２β−ラクタマーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドｐＭＯＮ　２３４を示す。 第８図は、ＣＡＲＤ　−３β−ラクタマーゼ造伝子を含
有するｐＭＯＮ　５３プラスミドを用いた、組換えプラ
スミドｐｈ４ＤＮ　５４　、　ｐＭＯＮ　５５及びｐＭ
ＯＮ　５６の分子クローニング及び′ａ箒を示す。 第９図は、■θ、−５β−ラクタマーゼ遺伝子を含有す
ルｐＭＯＮ　４１プ５　ス９．　）”　及ヒｐＡＣＹＣ
１８４ヲクローニングビークルとして用いた、組換えプ
ラスミドｐＭＯＮ　４２　、　ｐＭ）Ｎ　４３及びｐＭ
ＯＮ　４４の分子クローニング及び構築を示す。 第１０図は、ＰＳＥ−４β−ラクタマーゼ辿伝封子含有
するｐＭＯＮ　７ＱＱプラスミドを用いた、組換えプラ
スミドｐｈｆＯＮ　７０３　、　ｐＬＩＯＮ　７０５及
びｐＭＯＮ７０７の分子クローニング及び＃を築を示す
。 代理人　三　宅　正　夫　他１名 ＦＩＧＵＩ Ｅ　　３ 田 ト 菅−一 フ　　ｒつ Φ　　１ ”Ｊ　　　Ｏ ・ｒ′上ト 　　Ｑ 〉　　Ｈ ＰＰ コ ＰｖｕｌＩ　　　Ａｖａｌ ＦＩＧＵＲＥ　５ 　Ｐ の　　　　　　　工 、手続補正書（廊） 昭和６３年１０月乏６日

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）対象微生物におけるβ−ラクタマーゼ合成をコー
    ドする遺伝子の存在を検定する方法であつて以下の事項
    より成る方法： ａ）実質的に一本鎖の状態であつてβ−ラクタマーゼ合
    成をコードしていると思われるＤＮＡ断片を含有する試
    料を不活性支持体上に沈着して固着させ、 ｂ）上記の固着した一本鎖遺伝物質を、予め決定された
    緊縮度でのハイブリッド形成条件下、β−ラクタマーゼ
    合成をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列に少な
    くとも実質的に相補的である少なくとも凡そ１２塩基の
    ヌクレオチド配列を有する標識プローブに接触させ、且
    つ ｃ）上記標識によつて上記支持体上で二重らせん形成を
    検出する。
  2. （２）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ細菌宿主種に
    おける複製が可能であつてβ−ラクタマーゼ合成をコー
    ドする発現され得る異種ＤＮＡを含有する、ハイブリッ
    ド組換えプラスミド。
  3. （３）分子量が０．４２ｋｂであつて、β−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第３図に示すｐＢＲ３２２プラスミ
    ドを￥Ｂｇｌ￥ I −￥Ｈｉｎ￥ｃII処理することによ
    り得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  4. （４）分子量が０．３ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ合
    成をコードし、第３図に示すｐＢＲ３２２プラスミドを
    ￥Ｈｉｎ￥ｃII−￥Ｐｓｔ￥ I 処理することにより得
    られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  5. （５）分子量が０．３１ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第３図に示すｐＭＯＮ３０１プラスミ
    ドを￥Ｂａｌ￥II−￥Ｂｇｌ￥II処理することにより得
    られる実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  6. （６）分子量が０．２ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ合
    成をコードし、第３図に示すｐＭＯＮ３０１プラスミド
    を￥Ｂｇｌ￥II−￥Ａｖａ￥ I 処理することにより得
    られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  7. （７）分子量が０．２８ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第２図に示すｐＭＯＮ２１プラスミド
    を￥Ｎｒｕ￥ I −￥Ｈｉｎ￥ｃII処理することにより
    得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  8. （８）分子量が０．５１ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第２図に示すｐＭＯＮ２１プラスミド
    を￥Ｈｉｎ￥ｃII−￥Ｈｉｎ￥ｃII処理することにより
    得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  9. （９）分子量が０．７８ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第５図に示すｐＭＯＮ３８プラスミド
    を￥Ｐｖｕ￥II−￥ＰｖｕII処理することにより得られ
    る、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  10. （１０）分子量が１．３ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第３図に示すｐＭＯＮ８１０プラスミ
    ドを￥Ｂａｍ￥ＨＩ−￥Ｂｇｌ￥II処理することにより
    得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  11. （１１）分子量が１．７ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第１０図に示すｐＭＯＮ７０７プラス
    ミドを￥Ｈｉｎ￥ｄIII−￥Ｂｇｌ￥II処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  12. （１２）分子量が０．７ｋｂであつて、β−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第１０図に示すｐＭＯＮ７０７プラ
    スミドを￥Ｂｇｌ￥ I −￥Ａｖａ￥ I 処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  13. （１３）分子量が０．７ｋｂであつてβ−ラクタマーゼ
    合成をコードし、第１０図に示すｐＭＯＮ７０７プラス
    ミドを￥Ｂｇｌ￥ I −￥Ｂｓｔ￥ｅII処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  14. （１４）分子量が０．４１ｋｂであつてβ−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第１図に示すｐＭＯＮ５１０プラス
    ミドを￥Ａｖａ￥ I −￥Ａｖａ￥ I 処理することによ
    り得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  15. （１５）分子量が０．３４ｋｂであつて、β−ラクタマ
    ーゼ合成をコードし、第１図に示すｐＭＯＮ５１０プラ
    スミドを￥Ａｖａ￥ I −￥Ａｖａ￥ I 処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  16. （１６）分子量が０．２５ｋｂであつてβ−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第１図に示すｐＭＯＮ４０１プラス
    ミドを￥Ｓａｕ￥３Ａ−￥Ｓａｕ￥３Ａ処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  17. （１７）分子量が４．６７ｋｂであつて、β−ラクタマ
    ーゼ合成をコードし、第７図に示すｐＭＯＮ２３４プラ
    スミドを￥Ａｖａ￥ I −￥Ａｖａ￥ I 処理することに
    より得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  18. （１８）分子量が０．２ｋｂであつて、β−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第６図に示すｐＭＯＮ１０２８プラ
    スミドを￥Ｈｉｎ￥ｄIII−￥Ｂｇｌ￥II処理すること
    により得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  19. （１９）分子量が０．３ｋｂであつて、β−ラクタマー
    ゼ合成をコードし、第６図に示すｐＭＯＮ１０２８プラ
    スミドを￥Ｂｇｌ￥ I −￥Ｈｉｎ￥ｄIII処理すること
    により得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  20. （２０）分子量が０．６３ｋｂであつて、β−ラクタマ
    ーゼ合成をコードし、第６図に示すｐＭＯＮ１０２８を
    ￥Ｈｉｎ￥ｄIII−￥Ｈｉｎ￥ｄIII処理することにより
    得られる、実質的に純粋なＤＮＡ断片。
  21. （２１）−ＴＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−、−ＣＧＡＴＣ
    ＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣ−、−ＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＧＣ
    ＴＡＣＴＣＧ−、及び−ＣＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＣＧ
    ＣＴＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＡＴＣＧＡＣＡＴＴＣＡＡＧ
    ＡＴＡＣＣＴ−から選択されるオリゴヌクレオチド配列
    を有する実質的に純粋な一本鎖ＤＮＡ断片。
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