NO883296L - Fremgangsmaate til aa bestemme tilstedevaerelsen av en genkode for syntese av beta-laktamase, og hybrid rekombinant plasmid og rent dna-fragment som koder for slik syntese. - Google Patents

Fremgangsmaate til aa bestemme tilstedevaerelsen av en genkode for syntese av beta-laktamase, og hybrid rekombinant plasmid og rent dna-fragment som koder for slik syntese.

Info

Publication number
NO883296L
NO883296L NO88883296A NO883296A NO883296L NO 883296 L NO883296 L NO 883296L NO 88883296 A NO88883296 A NO 88883296A NO 883296 A NO883296 A NO 883296A NO 883296 L NO883296 L NO 883296L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
lactamase
synthesis
plasmid
fragment
molecular weight
Prior art date
Application number
NO88883296A
Other languages
English (en)
Other versions
NO883296D0 (no
Inventor
Roger Levesque
Original Assignee
Univ Laval
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Laval filed Critical Univ Laval
Publication of NO883296D0 publication Critical patent/NO883296D0/no
Publication of NO883296L publication Critical patent/NO883296L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Den viktigste biokjemiske mekanisme for £-laktam-resistens i gram-negative bakterier er produksjon av S-laktamase. Denne type enzym spalter S-laktamringen i penicilliner og cefalosporiner til produkter som er uten anti-bakteriell virkning.
En lang rekke ft-laktamaser er kjent å kunne plasmidformidles i gram-negative bakterier. I virkeligheten er mer enn 27 biokjemisk forskjellige ft-laktamaser som er ansvarlige for resistens mot penicilliner, cefalosporiner og beslektede S-laktam-antibiotika, identifisert, tradisjonelt ved isoelektrisk fokusering. Nye 13-1 akt anras e type r har opptrådt i nye bakterieverter, og deres spredning blir lettet ved at de bæres av transposoner, dvs. DNA-elementer som kan settes tilfeldig inn i plasmider eller bakteriekromosomer uavhengig av vert-cellens rekombineringssystem. I virkeligheten er de fleste, om ikke alle, 13-laktamasegener deler av komplekse, overførbare multiresistentelementer.
Tradisjonelt er bakteriers resistens mot antibiotika blitt undersøkt ved dyrking av den undersøkte mikroorganisme i et medium inneholdende et antibiotikum. Selv om denne metode vanligvis gir ganske tilfredsstillende effektivitet, er den fortsatt dyr og tidkrevende.
Derfor vil en ny teknikk som gir raskere og mer økonomiske metoder for undersøkelse av bakteriers resistens mot antibiotika, være svært ønskelig.
Ifølge oppfinnelsen er det skaffet en fremgangsmåte til å bestemme tilstedeværelsen av et gen som koder for syntese av S-laktamase i mikroorganismer som man ønsker å undersøke. Metoden omfatter: a) å avsette og fiksere en prøve inneholdende DNA-fragmen ter som hovedsakelig er enkelttrådete og antas å kode
for syntese av fé-laktamase, på en inert bærer,
b) å bringe det nevnte fikserte enkelttrådete genmateriale i berøring med en merket probe som har en nukleotid
sekvens på minst ca. 12 baser som er i det minste
hovedsakelig komplimentær med en nukleotidsekvens av et strukturelt gen som koder for syntese av S-laktamase, idet berøringen utføres under hybridiseringsforhold
ved en på forhånd bestemt stringens, og
c) dupleksdannelse på bæreren detekteres ved hjelp av det nevnte merke.
Det er også skaffet en første serie av syntetiske DNA-prober som har henholdsvis 12, 15, 17 og 45 baser, og som inneholder de bevarte, anerkjente aminosyresekvenser med aktive seter som er felles for S-laktamasegenene til OXA-2 og TEM1, og en annen serie av DNA-prober som inneholder de bevarte, anerkjente aminosyresekvenser med aktive seter som er felles for S-laktamasegenene til OXA-1, PSE-1, ROB-1, OXA-3, OXA-4, ASF-2, PSE-4, CARB-3, CARB-4 og AER-1.
Fremstillingen og anvendelsen av DNA-probene ifølge oppfinnelsen vil forstås bedre med referanse til beskrivelsen nedenfor. Fig. 1 viser restriksjons-endonukleasekart av 14 rekombinante plasmider som inneholder S-laktamasegenet. Fig. 2 viser molekylær kloning og konstruksjon av de rekombinante plasmider pM0N21 og pMON22 ved bruk av R46-plasmidet og pACYC184 som kloningsbærer. Fig. 3 viser fysiske kart av de rekombinante plasmider som bærer DNA-fragmenter som brukes til S-laktamase (bla) genprober. Fig. 4 viser nukleotid- og aminosyrebasissekvensen til de syntetiske OXA-2- og TEM-l-oligodioksyribonukleotidprober. Fig. 5 viser molekylærkloningen og konstruksjonen av de rekombinante plasmider pMON34, pMON3 6 og pMON3 8 ved hjelp av pM0N31-plasmidet som inneholder SHV-l-S-laktamasegenet. Fig. 6 viser molekylærkloningen og konstruksjonen av de rekombinante plasmider pMON1025, pMON1026, pMON1027, pMON1028,PMON1036 og pMON1038 ved hjelp av pMK20::Tnl413-plasmidet som inneholder CARB-4-S-laktamasegenet og pACYC184 som kloningsbærer. Fig. 7 viser plasmidet pMON234 som inneholder PSE-2-S-laktamasegenet. Fig. 8 viser molekylærkloningen og konstruksjonen av de rekombinante plasmider pMON54, pMON5 5 og pMON5 6 ved hjelp av pMON53plasmidet som inneholder CARB-3-S-laktamasegenet. Fig. 9 viser molekylærkloningen og konstruksjonen av de rekombinante plasmider pMON42, pMON4 3 og pM0N44 ved hjelp av pM0N41-plasmidet som inneholder OXA-5 S-laktamasegenet ogPACYC184 som kloningsbærer. Fig. 10 viser molekylærkloningen og konstruksjonen av de rekombinante plasmider pMON7 03, pMON7 05 og pMON7 07 ved hjelp av pM0N700-plasmidet som inneholder PSE-4-S-laktamasegenet.
På disse tegninger er forkortelsene for restriksjons-endonuklease-spaltningsstedene: A, Aval; B, BamHi; Bg, Balli; C, Clal: E, EcoRi; H, Hindlll; HC, HineII; K, Kpnl, N, Nrul. P, Pstl: S, Sali: Sm, Smal: X, Xhol.
Genforkortelsene er: aadA, aminoglykosid-3<11>(9)-adenylyltrans-ferase; aadB, aminoglykosid-2<1->adenylyltransferase; a<p>hC. aminoglykosid-3<1->fosfotransferase; bla, S-laktamase; sul. sulfonamid; Ap, ampicillin; Cm, kloramfenikol, Km, kanamycin; Tc, tetracyclin, Spe, spectinomycin.
Andre forkortelser er: Ant, antimon; Asa, arsenat; Asi, arsenitt; IR, omvendt gjentagelse; IS, innskuddssekvens; MucAB, forsterket mutagenese; per, rekombinase; Rep, replikasjon,
Tra, konjugal overforing.
På fig. 1 er plasmidkartene vist linearisert ved EcoRI-setet i pACYC184-vektoren, som er representert ved en tykk linje.
Omtrentlig lokalisering av resistens-determinatene er også vist, og rekombinantmolekyler er tegnet i målestokk. Alle 14 rekombinante plasmider ble kartlagt med enzymene Aval, BamHI. BgJLII, EcoRI, Hindlll, PvuII, Sali og Sstl. bortsett fra at Aval- og PvuII-setene ikke ble lokalisert på pMON401.
På fig. 2 er koordinatene angitt i kilobaser. Orienteringer av omvendt gjentagelses- og innskuddsekvenser er angitt ved hjelp av piler. De prikker og piler som er avbildet i pM0N21 ogPMON22, representerer promotorposisjonen og transkripsjons-retningen for 0XA-2-bla-genet.
På fig. 3 er bare relevante endonukleaseseter angitt. De DNA-fragmenter som ble brukt som prober, er nummerert 1-4. De tykke linjer representerer vektordelen pACYC184, prikken indikerer den omtrentlige posisjon til primotoren, og pilene indikerer transkripsj onsretningen.
På fig. 4 er de syntetiserte prober avgrenset med tykke linjer. Parentesene indikerer de fire aminosyrer som er bevart ved eller nær de aktive seter for S-laktamase. Bevarte arginindeler i begge sekvenser er angitt med en stjerne. Posisjonene 59-73 av TEM-1 og 63-77 på OXA-2 svarer til posisjonene til amino-syrene i deres respektive strukturelle gener for S-laktamase.
Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte til å bestemme S-laktamaseproduksjon av mikroorganismer som gir resistens mot enkelte antibiotika. Denne fremgangsmåte representerer en forbedring i forhold til eksisterende teknikker, spesielt når det gjelder hastighet, den har en enkel protokoll og anvender reaksjonsbestanddeler som kan standardiseres og anskaffes som kommersielle sett, noe som tillater rask undersøkelse av et stort antall prøver.
Fremstilling av den prøve som skal undersøkes
Når det er ønskelig å benytte den teknikk som er utviklet ved oppfinnelsen, kan en klinisk isolert prøve som mistenkes for å inneholde mikroorganismer som har et gen som koder for S-laktamasesyntese, brukes direkte eller dyrkes under forhold egnet for vekst. De mikroorganismer som ønskes undersøkt, behandles slik at de gir enkeltrådet, genomisk nukleinsyre, og bindes deretter til en bærer. Det bundne DNA bringes deretter i berøring med et merket polynukleotid som har en basesekvens som er komplementær til den kodende eller antikodende tråd til et gen som koder for S-laktamase.
Konstruksjon av orobene
Den primære reagens er den merkede DNA-probe. Proben ved denne oppfinnelse har normalt minst 12 baser og kan ha opptil omtrent 1700 baser. Probens basesekvens er i det minste hovedsakelig komplementær med et gen som koder for produksjon av S-laktamase. Proben behøver ikke å ha perfekt komplementaritet til den sekvens som den hybridiserer til. Det kan være 40% eller mer av ikke-passende basepar. Tverrhybridisering som utvider spesifi-siteten av reaksjonen, kan være et resultat av variable reagenser i genet, mutasjon, en felles probe for en mangfoldig-het av mikroorganismer, alleler eller lignende.
De prober som brukes i sammenheng med oppfinnelsen, kan fremstilles ved den følgende generelle prosedyre: Escherichia coli-arten HB101 dyrkes og renses, og dens plasmid-DNA isoleres ved hjelp av "cleared lysate"-metoden og renses ved cesium-klorid/etidiumbromid-gradient-ultrasentrifugering.
Når det ønskede plasmid er isolert, blir det digerert med de passende restriksjons-endonukleaser og alternativt ligert medPACYC184 som på forhånd er behandlet med den passende endonuklease. I dette tilfelle blir de resulterende fragmenter behandlet med T4-ligase. Ligeringen blir overvåket med agarosegelelektroforese. De således oppnådde rekombinante plasmider transformeres inn i E.coli HB101 for videre vekst. De bakteriekloner som inneholder de rekombinante plasmider, blir deretter utvalgt etter sin resistens mot enkelte antibiotika såsom ampicillin eller kloramfenikol. Kloramfenikol-resistens blir vanligvis overført til bakterien av pACYC184-plasmidet. Bakterier som inneholder det rekombinante plasmid, blir imidlertid følsomme for tetracyklin, fordi et gitt restrik-sjonssete i pACYC184 er innenfor tetracyklingenet slik at fremmed-DNAen som innskytes i genet, ødelegger dette.
Fra disse forsøk blir de mindre rekombinante plasmider utvalgt for videre analyse. Så snart det ønskede plasmid er blitt isolert og renset i passende mengde, blir det digerert med passende restriksjons-endonukleaser og separert ved elektroforese. DNA-fragmenter blir drevet ut av gelen og elektrout-vasket i dialysemembraner. DNA blir deretter felt ut i kald etanol, sentrifugert og oppløst i 100 jjI sterilt TE. Renheten og kvaliteten av hver probe blir deretter analysert ved agarose- eller akrylamidgel-elektroforese.
Etter identifikasjon og karakterisering av de spesifikke DNA-sekvenser som er ansvarlige for S-laktamaseproduksjon, blir korresponderende DNA-prober syntetisert. Oligonukleotid-sekvensene blir først syntetisert ved fosfitt-triester-kjemi. De resulterende sekvenser blir deretter avsaltet, renset på polyakrylamidgeler, gjort synlige ved ultrafiolett skyggelegging og merket.
Vanligvis blir polynukleotidproben merket med en radioaktiv markør. I noen situasjoner kan det imidlertid være fordelaktig å benytte et antistoff som vil binde seg spesifikt til proben som er hybridisert til den enkeltråd-DNA som koder for S-laktamasesyntese. I dette tilfelle vil antistoffet bli merket for å muliggjøre deteksjon.
Av de typene radioaktiv merking som kan anvendes, kan nevnes ^<2>P, % og<14>C, men en hvilken som helst radioaktiv merking som kan gi et passende signal, og som har tilstrekkelig halverings- tid, kan brukes. Andre markører omfatter ligander som kan tjene som et bindingselement til et merket antistoff, fluorescerende midler, kjemoluminiserende midler, enzymer og antistoffer som kan tjene som et spesifikt bindingsparelement for en merket ligand og lignende. Et stort antall merker blir anvendt ved immunoanalyser, og disse kan lett brukes med probene ifølge oppfinnelsen. Valg av merke vil bli styrt av merkets virkning på hybridiseringshastigheten og probens binding til det genetiske DNA. Det vil være nødvendig at det merkede DNA gir tilstrekkelig følsomhet til å finne den mengde DNA som er tilgjengelig for hybridisering.
Den måte markøren er bundet til proben på, vil variere avhengig av markørens art. For en radioaktiv markør kan mange forskjellige teknikker anvendes. Vanligvis anvendes kuperings-translasjon med en alfa<32>P-dNTP eller terminal fosfathydrolyse med alkalisk fosfatase fulgt av merking med radioaktivt<32>P ved hjelp av gamma--* 2p-NTP og T4-polynukleotidkinase. Alternativt kan nukleotider syntetiseres når en eller flere av de grunn-stoffer som er tilstede, blir skiftet ut med en radioaktiv isotop, f.eks. hydrogen med tritium. Probene er nå klare for bruk til hybridiseringsformål.
H<y>bridiserin<g>steknikk
Proben brukes til hybridisering til et gen som er bundet til en ikke-vannoppløselig porøs bærer som den enkelttrådet nukleinsyre er bundet til. Metoden for binding av nukleinsyren til støttemediet kan variere avhengig av hvilken opprinnelse nukleinsyren har.
Prøven som inneholder de bakterier som skal undersøkes, kan avsettes flekkvis eller spres på et filter for å gi flere individuelle porsjoner. Filteret er en inert, porøs, fast bærer såsom nitrocellulose. Det kliniske isolat kan være et hvilket som helst sekret eller en fysiologisk væske som f.eks. urin, serum, plasma eller lignende. Filteret kan bringes i kontakt med et næringsstoff for å øke antall celler slik at de danner avgrensede kolonier. Næringsstoffene kan diffundere til cellene, men cellene kan ikke diffundere bort fra sin posisjon på filteret. Det er hensiktsmessig å anvende et mikrofilter som hindrer cellene i å passere gjennom filteret, og filteret plasseres på en næringsgel.
Cellene blir deretter behandlet for frigjøring av deres DNA. Dersom cellene fikk tilført næringsstoffer for å øke deres antall, blir filteret fjernet fra næringsstoffet og cellene lysert etter passe lang tid for kolonidannelse. Lyseringsfor-holdene er lagt opp slik at cellene eller koloniene ikke flytter seg og deres DNA forblir bundet på plass på den overflate som de ble plassert på. Kjemisk lysering kan anvendes, vanligvis med en fortynnet, vandig, alkalisk oppløs-ning. Den alkaliske oppløsning vil også tjene til å denaturere DNAen. Andre denatureringsmidler såsom forhøyet temperatur, organiske reagenser, f.eks. alkoholer, amider, aminer, ureaer, fenoler, sulfoksider, og enkelte uorganiske ioner kan anvendes.
Etter denaturering blir filteret vasket i en kjerne-bufferopp-løsning, generelt ved en pH-verdi på omtrent 6-8. Tris er et eksempel på en av de mange buffere som kan anvendes. Det kan benyttes en eller flere vaskinger, passende med den samme prosedyre som anvendt for lysering og denaturering.
Etter at lysering, denaturering og vasking er fullført, blir det DNA-flekkede filter tørket ved forhøyet temperatur, generelt på 50-70°C. DNAen er nå bundet i sin posisjon og kan undersøkes med proben når det passer.
Alternativt kan plasmid-DNA fra prøvebakteriene isoleres og renses før den påføres filteret flekkvis. I et etterfølgende steg blir nukleinsyrene i prøven gjort enkelttrådete, og etter at den fremstilte blanding er påført flekkvis på nitrocellu-losefilteret, blir det DNA-flekkede filter tørket ved forhøyet temperatur. DNAen er nå bundet i posisjon og kan undersøkes med proben når det passer.
Det på forhånd preparerte filter blir så inkubert ved en svakt
hevet temperatur i tilstrekkelig tid sammen med hybridiserings-oppløsningen uten prober, for grundig å fukte filteret. Det kan anvendes en rekke hybridiseringsoppløsninger som inneholder fra 20 til 60%, fortrinnsvis 30% av et ikke-polart organisk
oppløsningsmiddel.
Etter at filteret er bragt i berøring med hybridiserings-oppløsningen ved moderat temperatur i et lengre tidsrom, blir filteret så ført inn i en annen hybridiseringsoppløsning. Filteret blir holdt i den annen oppløsning i et tidsrom som kan variere fra 5 min til 3 h eller mer. Den annen oppløsning bestemmer stringensen, oppløselige tverr-duplekser og korte komplementære sekvenser. Etter at filteret er skyllet ved værelsetemperatur med en passende oppløsning såsom fortynnet natriumcitrat/natriumkloridoppløsning, kan filteret undersøkes for nærvær av duplekser i overenstemmelse med markørens art. I tilfelle markøren er radioaktiv, kan filteret tørkes og utsettes for røntgenfilm.
Utvelgelse av bakterielle plasmider som antas å bære et S- laktamasegen
For å muliggjøre syntesen av de DNA-sekvenser som kan anvendes til konstruksjon av passende S-laktam-DNA-prober, er det først nødvendig å identifisere og karakterisere de DNA-sekvenser som koder for S-laktamaseproduksjon. Derfor ble plasmider som koder for en lang rekke S-laktamasetyper, først sortert med et batteri av restriksjonsendonukleaser for fastleggelse av hvilke som produserte de mest passende DNA-fragmenter for kloning. Som kloningsvektor kan vektorer som f.eks. pBGS131, Ml3, pACYC184 og lacZ og plasmidfusjonsvektorer som f.eks. pMLB1034 ogPMC1871 anvendes, men pACYC184 foretrekkes vanligvis. I det første trinn som leder til identifikasjon av de ønskede DNA-sekvenser, ble plasmid-DNA digerert med de passende endonukleaser og ligert til den ønskede kloningsvektor. Endonukleasene BamHI, EcoRI. Hindlll, Sali, Sau3A og Blall viste seg å være optimale når plasmid-pACYC184 anvendes som
kloningsvektor.
F.eks. kan plasmid-DNA digereres med BamHI. Hindlll, Sali eller Blall og ligeres med pACYC184 som på forhånd er behandlet med enten den samme eller en annen endonuklease og defosforylert med basisk fosfatase. Den resulterende blanding transformeres inn i E. coli HB101 som selekterer for resistens mot ampicillin eller kloramfenikol. Med plasmid-Rmsl49 som koder for PSE-3, brukes EcoRI pluss Sali for kloning, og transformanter som er resistente bare mot ampicillin, utvelges. For AER-l-S-laktamasegenet blir delvis Sau3A-digerert DNA fremstilt fra kromosomalt DNA til E. coli J53-2 07711 og kombinert med BamHI-behandlet pACYC184. For plasmid-R46 som koder for OXA-2-ft-laktamasegenet, blir digerering utført ved hjelp av Bl<g>ll, og det resulterende fragment blir ligert med pACYC184 som på forhånd er behandlet med BamHI. I tilfelle av plasmid-pMON31 som koder for SHVl-S-laktamasegenet, blir plasmidet først digerert med Ava-1 og det resulterende fragment så ligert med T4-DNA-ligase.
Så snart ny plasmid-DNA er isolert og renset, blir de mindre ampicillinrekombinanter utvalgt for videre undersøkelse ved konstruksjon av slettede plasmider. Som antatt på grunnlag av posisjonen av kloningsstedet innenfor tet-<g>enet til pACYC184 viste alle rekombinantene seg å være tetracyklinfølsomme.PMON226 med et innskudd i EcoRI-setet til pACYC184 kunne også påvirkes av kloramfenikol. Noen plasmider kodet også for resistens mot streptomycin eller sulfonamid i tillegg til ampicillin. Hvert av disse plasmider viste seg å produsere den samme ft-laktamasetype som ampicillinresistent R46-opphavsplas-mid ved isoelektrisk fokusering.
Restriksionskartleqginq og lokalisering av det strukturelle f3- laktamasegen
DNAen til rekombinante plasmider utvalgt for videre under-søkelse kan digereres med følgende endonukleaser: Aval,BamHI. Bgill. EcoRI, Hindlll, PvuII. Sali. Sstl og Sau3A, med unntak av plasmid-pMON2 0 som kan digereres ved hjelp av enzymene Aval. BamHI, EcoRI, HincII, Hindlll, Nrul, PstI, og Sali. Posisjonen av restriksjonssetene bestemmes ved elektroforese på agarosegel på 0,8-1,5% avhengig av fragmentstørrelsen ved bruk av enkelt, dobbelt eller trippelt digerert DNA sammenlignet med det tilsvarende restriksjonsmønster til kloningsvektoren, som f.eks. kan være pACYC184, eller det opprinnelige plasmid som f.eks. R46. Videre lokalisering av de strukturelle ft-laktamasegener oppnås ved subkloning eller ved sletting av fragmenter som er nødvendige for genekspresjon. De resulterende kart, som er vist på fig. 1, 2 og 5-10, gir følgende informasjon: Fig. 1 viser at de fleste S-laktamasegener er klonet på BamHI- eller HindIII-fragmenter, og de fleste av disse fragmenter inneholder i det minste ett Bglll-sete med OXA-1- og OXA-4-S-laktamase-fragmenter som hvert inneholder to slike seter. DNA-fragmenter som inneholder gener for de biokjemiske lignende PSE-1, PSE-2, PSE-4, CARB-3, og AER-l-genene er også bemerkelsesverdige pga. frekvensen av på lignende måte fordelte Aval- og PvuII-seter. Videre kan det ses på fig. 2 at et ekstra Psil-sete er kartlagt på sulfonamidgenet til R46-plasmidet. Dette utgjør et avvik fra det publiserte R46-kart. Det strukturelle OXA-2-S-laktamasegen blir videre lokalisert ved sletting av et 2,8 kb Pst-fragment og et 2,3 kb Aval-fragment. Slettingen av disse fragmenter gir plasmidene pMON21 og pMON22. Det må bemerkes at det strukturelle OXA-2-gen som koder for ft-laktamaseresistens i R46-plasmidet, er funnet å være nesten fullstendig innenfor 0,85 kb Aval-HincII- HincII-fraomentet. bortsett fra de siste få nukleotider.
Valg av DNA- fragementene og oligonukleotidene som brukes som fi- laktamase- DNA- prober
Fra restriksjonskartene på fig. 1, 2 og 5-10 ble genprober Utviklet for TEM-1-, OXA-1-, PSE-1-, R0B-1-, OXA-2-, OXA-3-, OXA-4-, ASF-2-, PSE-4-, CARB-3-, CARB-4- og AER-1-S-laktamasegenene. Disse er vist på fig. 1 og 3-10. TEM-l-S-laktamasegenet som er båret av plasmid-pBR-322, ble sekvensert i 1978 av Sutcliffe. Således kan en probe internt for genet oppnås som et 424 bp BGlI-pluss HineII-fragment. Den annen probe består av et 315 bp Balll-DNA-fraoment fra pMON301 internt for OXA-1-laktamasegenet. Det skal bemerkes at pMON301 er en BamHI-Hindlll-subklon av Hindlll-fragmentet til pMON300 vist på fig.
1. Utvalg av denne probe er basert på den observasjon at slettingen av dette fragment eliminerer ekspresjon av £-laktamasegenet. Videre ble promotorposisjonen og transkrip-sjonsretningen til OXA-l-genet bestemt ved innsetting av
'lacZ-innsatsen fra PMC1871 i BGlII-setet til pMON301. Den tredje probe er et 1,3 kb BamHI og BGlII-fragment som inneholder deler av PSE-l-ft-laktamasegenet fra pMON810. Utvalg av dette er basert på oppdagelsen av at innskyting av ' lacZ-BamHl-fragmentet fra pMC1871 til Bglll-setet til pMON810 inaktiverer ft-laktamase<g>eneks<p>resjonen. En fjerde probe bestående av et 250 bp Sau.3A-fragment fra pMON401 er fremstilt på bakgrunn av at det er observert at sletting av dette fragment eliminerer S-laktamasegenekspresjonen. Prober innenfor det strukturelle OXA-2-gen er også fremstilt og omfatter et 0,28 kb NruI-HincII- og et 0,51 kg HineII-HineII-DNA-fragment. For å bekrefte S-laktamaseprobens spesifisitet ble et 0,84 kb Ec_o_RI-Ps_£I-fragment fra plasmid-pMON21 også innlemmet, da det er kjent at dette bærer omgivende sekvenser som er utenfor det strukturelle gen.
I S-laktamaser med kjent amminosyresekvens er det aktive sete, som er penicillinbindende serin, omgitt av et fenylalanin i den fjerde posisjon og en lysin i den tredje posisjon på karboksyl-siden. Dette antyder at disse bevarte fenylalanin- og lysin-rester er viktige for katalyse. I tillegg ble det bemerket at tem- og OXA-2-S-laktamaser også inneholder en arg-X-X-X-arg-sekvens i den samme posisjon. Det ble derfor antatt at OXA-2-og TEM-oligonukleotidprobene kunne være nyttige til estimering av homologitet ved eller nær 6-laktamase-aktive seter. Fra disse nukleotidsekvenser ble en serie av oligonukleotider som skulle anvendes som molekylærprober, syntetisert, og disse er vist på fig. 1, 3 og 4-10. Tabell 1 oppsummerer de forskjellige S-laktamaseprober som ble syntetisert.
TABELL 1. OPPSUMMERING AV S-LAKTAMASE-GENPROBER
Plasmid S-laktamase DNA-fragment Tverr-Oligonukleotid hybridisering
pBR322 TEM-1 0.42 kb Bgll-HincII TEM-1 TEM-2 TLE-1
0.3 kb HincII-Pstl TEM-1 TEM-2 TLE-1 15-mer TEM-1 TEM-2
pMON301 OXA-1 0.31 kb BG1II-BG1II OXA-1 OXA-4
0.2 kb Bglll-Aval OXA-1 OXA-4
pMON21 OXA-2 0.28 kb NruI-HincII OXA-2
0.51 kb HincII-HincII OXA-2 (OXA-3)
12-mer OXA-2 (OXA-3)
15-mer 18-mer 45-mer OXA-2
pMON38 SHV-1 0.78 kb PvuII-PvuII SHV-1 SHV-2
17-mer SHV-1 SHV-2
pMON810 PSE-1 1.3 kb BamHI-BGlII PSE-1 PSE-4
CARB-3 (CARB-4)
pMON234 PSE-2 1.2 kb Aval-Aval PSE-2 (CARB-4)
pMON707 PSE-4 1.7 Kb Hindlll-Bglll PSE-4 CARB-3
(PSE-2) (OXA-3)
0.7 kb BGIII-Aval PSE-4 CARB-3
0.7 kb BGlI-BSTell PSE-4 (CARB-3)
(PSE-1)
pMONl028 CARB-4 0.2 kb Hindlll-Bglll CARB-4 (PSE-4)
0.3 kb BglH-Hindlll CARB-4 (PSE-4)
0.63 kb Hindlll-Hindlll CARB-4 (PSE-4)
(PSE-1)
17-mer CARB-4
pMON510 AER-1 0.41 kb Aval-Aval AER-1
0.34 kb Aval-Aval PSE-4 (OXA-1)
(OXA-4)
pMON401 ROB-1 0.25 kb Sau3A-Sau3A ROB-1
pNU81 ampC 0.436 kb Sall-Xhol CEP-1
( Krcmosanal)
Tverrhybridiseringer i parentes indikerer svak homologitet
De følgende eksempler tjener til å illustrere oppfinnelsen, ikke til å begrense den.
Eksempel 1
Fremstilling av -^^ P- merket 012- probe- DNA
E.Coli-celler ble dyrket i et tryptisk soyavekstmedium og renset, og dets plasmid-DNA ble isolert ved hjelp av klarnet lysatmetoden og renset med cesiumkloridetidiumbromid-gradient-ultrasentrifugering. Renset R46-DNA-plasmid ble så digerert med restriksjons-endonukleasen BlgJI og ligert med plasmidet pACYC184, som tidligere var blitt behandlet med BamHI.
Ligering ble overvåket ved elektroforese på agarosegeler på 0,8% og rekombinante molekyler transformert inn i E.Coli HB101 som selekterer for resistens mot ampicillin og kloramfenikol. Det resulterende 10,3 kb pMON20-plasmid ble så digerert med restriksjonsendonukleasen Pstl og ligert med T4-DNA-ligase for å danne et 7,5 kb pMON21-plasmid. Etter at 20 mikrogram av plasmid pMON20 eller pMON21 var blitt renset, fikk man DNA-probefragmenter fra digerering av pMON20-plasmidet med Aval pluss HineII og fra digerering av pM0N21 med Aval pluss HineII og separering ved elektroforese. Disse DNA-fragmenter ble separert i forskjellige konsentrasjoner av agarose (fra 0,7-1,5%) eller-på 5%'s polyakrylamidgeler og trisboratbuffer. DNA-fragmenter ble så felt ut fra gelen og elektroeluert i dialysemembraner. DNAen ble utfelt med kald etanol, sentrifugert og oppløst i 100 mikroliter sterilt TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0). Blant oppnådde fragmenter hadde den ønskede probe følgende struktur: -TCGACATTCAAG-. Så snart tilstrekkelige mengder av denne oligonukleotid var blitt syntetisert på et "Applied Biosystem Apparatus" eller med en "Pharmacia Gene Assembler" ved hjelp av fosfitt-triesterkjemi, ble DNA-sekvensen avsaltet ved hjelp av NAPlO-søyler, renset på 12%'s polyakrylamidgel inneholdende 7M urea og gjort synlig ved ultrafiolett skyggelegging. Den fosforylerte oligonukleotid ble merket med T4 polynukleotid-kinase og gamma-<32>P-ATP ved 37°C i
30 min.
Eksempel 2
Fremstilling av ^ 2P- merkede 015 DNA- prober
Prosedyren for fremstilling av ^<2>P-merkede 015-DNA-prober var den samme som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen til de 15 nukleotider er angitt på fig. 4.
Eksempel 3
Fremstilling av ^^ P-^- merkede 018- DNA- prober
Prosedyren for fremstilling av -*2P-merkede 018-DNA-prober og var den samme som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen til de 18 nukleotider er vist på fig. 4.
Eksempel 4
Fremstilling av 32P- merkede 045- DNA- prober
Prosedyren for fremstilling av ^<2>P-merkede 045-DNA-prober var den samme som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen til de 45 nukleotider kan ses på fig. 4.
Eksempel 5
Fremstilling av 3- 2P- merkede T15- DNA- probe
Prosedyren for fremstilling av ^<2>P-merkedeTl5-DNA-prober var den samme som beskrevet i eksempel 1. Sekvensen til de 15 nukleotider er vist på fig. 4.
Eksempel 6
Fremstilling av -* 2P- merket TEM- 1- DNA- probe
E.Coli celler ble dyrket i tryptisk soyavekstmedium og renset, og deres plasmid-DNA ble isolert ved hjelp av "klarnet lysat"-metoden, konsentrert med polyetenglykol og renset med cesium-kloridetidiumbromid-gradientultrasentrifugering. 100 mikrogram renset pBR322-plasmid ble så digerert med endonukleasene B<g>ll og HincII, og de resulterende DNA-fragmenter ble fremstilt ved elektroforese. Disse DNA-fragmenter ble separert i forskjellige konsentrasjoner av agarose (fra 0,7% til 1,5%), eller på 5%'s polyakrylamidgeler qg trisborat-buffer. DNAfragmentene ble så fjernet fra gelen og elektroeluert i dialysemembraner. DNA ble så felt ut med kald etanol, sentrifugert og oppløst i 100 mikroliter sterilt TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0). Blant de oppnådde fragmenter er den ønskede probe vist på fig. 3. Da tilstrekkelige mengder av denne oligonukleotid var blitt syntetisert på et "Applied Biosystem Apparatus" eller med en "Pharmacia Gene Assembler" ved hjelp av fosfitt-triesterkjemi, ble DNA-sekvensen avsaltet ved hjelp av NAPlO-søyler, renset på 12%'s polyakrylamidgel inneholdende 7M urea og gjort synlig ved ultrafiolett skyggelegging. Fosforylert oligonukleotid ble deretter merket med T4-polynukleotidkinase og gamma--*2P-ATP ved 37°C i 30 min.
Eksempel 7
Fremstilling av 32P- merket OXA- l- probe DNA
E.Coli celler ble dyrket i tryptisk soyavekstmedium og renset, og deres plasmid-DNA ble isolert ved hjelp av "klarnet lysat"-metoden, konsentrert med polyetenglykol og renset ved cesium-klorid-etidiumbrom-gradientultrasentrifugering. Renset pMK20::Tn2603 DNA-plasmid ble digerert med restriksjonsendonuklease BamHI og ligert med plasmid-pACYC184 som tidligere var behandlet med den samme endonuklease og defosforylert med alkalisk fosfatase. Ligeringen ble overvåket ved elektroforese på 8%'s agarosegeler, og rekombinante molekyler ble transformert inn i E.Coli HB101 som selekterer for resistens mot ampicillin og kloramfenikol. Det resulterende 6,9 kb pMON300 plasmid ble så digerert med restriksjonsendonuklease Hindlll og ligert ved hjelp av T4-DNA-ligase for å gi pMON3 01 -plasmidet. Etter rensing av 100 mikrogram av pMON301-plasmid ble probe-DNA-fragmenter oppnådd fra digerering av dette plasmid med Balli og separert ved elektroforese. Disse DNA-fragmenter ble separert i forskjellige konsentrasjoner av agarose (fra 0,7% til 1,5%) eller på 5%'s polyakrylamidgeler og trisboratbuffer. DNA-fragmentene ble så fjernet fra gelen og elektroeluert i dialysemembraner. DNAen ble deretter felt ut med kald etanol, sentrifugert.og oppløst i 100 mikroliter sterilt TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0). Blant de resulterende fragmenter hadde den ønskede probe en struktur som vist på fig. 3. Så snart tilstrekkelige mengder av dette oligonukleotid var blitt syntetisert på et "Applied Biosystem Apparatus" eller med en "Pharmacia Gene Assembler" ved hjelp av fosfitt-triesterkjemi, ble sekvensen avsaltet ved hjelp av NAPlO-søyler, renset på
12%'s polyakrylamidgel inneholdende 7M urea og synliggjort ved ultrafiolett skyggelegging. Det fosforylerte oligonukleotid ble så merket med T4-polyonukleotidkinase og gamma-<32>p<->ATP ved 37°C i 30 min.
Eksempel 8
Fremstilling av 32P- merket PSE- l- probe- DNA
E.Coli-celler ble dyrket i tryptisk soyavekstmedium og renset, og deres plasmid-DNA ble isolert ved hjelp av "klarnet lysat"-metoden, konsentrert med polyetenglykol og renset med cesium-klorid-etidiumbromid-gradientultrasentrifugering. Renset PMK20::Tnl 40 3 DNA-plasmid ble så digerert med restriksjonsendonuklease BamHI og ligert med plasmid-pACYC184 som tidligere var blitt behandlet med alkalisk fosfatase. Ligeringen ble overvåket ved elektroforese på 0,8%'s agarosegeler, og rekombinante molekyler ble transformert inn i E.Coli-HBlOl som selekterer for resistens mot ampicillin og kloramfenikol. 100 mikrogram renset pMON810- eller pM0N811-plasmid ble digerert med Bamll pluss B<g>lll eller B<g>lli pluss Aval, og de resulterende fragmenter ble separert ved elektroforese. Disse DNA-fragmenter ble separert i forskjellige konsentrasjoner av agarose (fra 0,7% til 1,5%) eller på 5%'s polyakrylamidgeler og tris-boratbuffer. DNA-fragmentene ble så fjernet fra gelen og elektroeluert i dialysemembraner. DNA ble deretter felt ut med kald etanol etter tilsetting av 1/10 av volumet av 3M natriumacetat, pH-verdi 4,5. Etter sentrifugering ble DNA-pelletten resuspendert i 500 mikroliter TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0), proteinene ekstrahert med kloroform og DNA felt ut og oppløst i 10 mikroliter sterilt TE. Blant de resulterende fragmenter hadde den ønskede probe den struktur som er vist på fig. 3. Sekvenseringen ble utført etter at tilstrekkelige mengder oligonukleotid var blitt syntetisert på et "Applied Biosystem Apparatus" eller med en "Pharmacia Gene Assembler" ved hjelp av fosfitt-triesterkjemi. Sekvensen ble avsaltet ved hjelp av NAPlO-søyler, renset på 12%'s polyakrylamidgel inneholdende 7M urea og synliggjort ved ultrafiolett skyggelegging. Det fosforylerte oligonukleotid ble så merket med T4-polynukleotidkinase og gamma-^<2>p-ATP ved 32°C i 30 min.
Eksempel 9
Fremstilling av ^ P- merket ROB- l- probe- DNA
E.Coli-celler ble dyrket i tryptisk soyavekstmedium og renset, og deres plasmid-DNA ble isolert ved hjelp av "klarnet lysat"-metoden, konsentrert med polyetenglykol og renset med cesium-klorid-etidiumbromid-gradientultrasentrifugering. Renset ROB161-DNA-plasmid ble så digerert med restriksjonsendonuklease Sau3A og ligert med plasmid-pACYC184 som tidligere var blitt behandlet med BamHI. Ligeringen ble overvåket ved elektroforese på 0,8%'s agarosegeler, og de rekombinante molekyler ble transformert inn i E.Coli-HBlOl som selekterer for resistens mot ampicillin og kloramfenikol. 100 mikrogram av det resulterende 6,4 kb pMON401-plasmid ble digerert med restriksjonsendonuklease Sau3A. og DNA-fragmentene oppnådd fra denne digerering ble separert ved elektroforese. Disse DNA-fragmenter ble separert i forskjellige konsentrasjoner av agarose (fra 0,6% til 1,5%) eller på 5%'s polyakrylamidgel og trisborat-buffer. NDA-fragmentene ble så fjernet fra gelen og elektroeluert i dialysemembraner. DNAen ble deretter felt ut med kald etanol etter tilsetting av 1/10 av volumet av 3M natriumacetat, pH-verdi 4,5. Etter sentrifugering ble DNA-pelletten resuspendert i 500 mikroliter TE (10 mM tris, 1 mM EDTA, pH-verdi 8,0). Proteiner ble ekstrahert med kloroform og DNA felt ut og oppløst i 100 mikroliter sterilt TE. Av de oppnådde fragmenter hadde den ønskede probe den struktur som er eksemplifisert på fig. 3. Sekvensering ble utført da en tilstrekkelig mengde av dette oligonukleotid var blitt syntetisert på et "Applied Biosystem Apparatus" eller med en "Pharmacia Gene Assembler" ved hjelp av fosfitt-triesterkjemi. Sekvensen ble avsaltet ved hjelp av NAPlO-søyler, renset på 12%'s polyakrylamidgel inneholdende 7M urea og synliggjort ved ultrafiolett-skyggelegging. Det fosforylerte olygonukleotid ble så merket med T4 polynukleotid-kinase og gamma--*2P-ATP ved 37°C i 30 min.
Eksempel 10
Hybridiseringsteknikker
Etter merking av ett mikrogram av hvert DNA-fragment som skulle brukes som probe, ble hvert fragment avsatt flekkvis på nitrocellulosefiltre ved hjelp av "Bi-Dot"-apparatet. De bakte filtre ble så forhybridisert i 4-8 timer ved 42°C i 10 ml av 5 X SSC, 20%'s eller 50%'s formamid, 5 X Denhardfs oppløsning, 50 mM fosfatbuffer (pH-verdi 6,5) og 1 mg/ml lydbehandlet laksesperma-DNA.
Den hybridiserte oppløsning ble så fjernet, og 10 ml av de samme reagensene pluss denaturert probe-DNA (10<5>cpm) ble tilsatt.
De betingelser som ble valgt for å gi en høy grad av stringens, var inkubering i 42°C i 18 timer med 50%'s formamid fulgt av vasking i 65°C. Betingelsene for en lav grad av stringens var inkubering ved 30°C med 20%'s formamid fulgt av vasking ved 20°C. Etter endelig vasking ble filtrene montert fuktige på 3mm Whatman-papir, dekket med plastfilm og audiografert ved -7 0°C ved hjelp av Kodak-X-omat-AR-2-film. Eksponeringen varte fra noen få timer til flere dager. Positive og negative sammen-ligningsprøver ble innlemmet ved hver hybridisering.

Claims (21)

1. Fremgangsmåte til å bestemme tilstedeværelsen av et gen som koder for syntese av S-laktamase i mikroorganismer som man ønsker å undersøke, karakterisert ved at: a) en prøve inneholdende DNA-fragmenter som hovedsakelig er enkelttrådete og antas å kode for syntese av S-laktamase, avsettes og fikseres på en inert bærer, b) det nevnte fikserte enkelttrådete genmateriale bringes i berøring med en merket probe som har en nukleotid sekvens på minst ca. 12 baser som er i det minste hovedsakelig komplimentær med en nukleotidsekvens av et strukturelt gen som koder for syntese av S-laktamase, idet berøringen utføres under hybridiseringsforhold ved en på forhånd bestemt stringens, og c) dupleksdannelse på bæreren detekteres ved hjelp av det nevnte merke.
2. Hybrid rekombinant plasmid som kan replikeres i en Escherichia Goli-bakterievertsart, karakterisert ved 'at plasmidet inneholder uttrykkbare heterologe DNA-er som koder for syntese av S-laktamase.
3. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,42 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Bgll-HincII-digerering av pBR322-plasmidet på fig. 3.
4. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,3 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved HincII-Pstl-digerering av pBR322-plasmidet på fig.
3.
5. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,31 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Bglll- Bglll-digerering av pMON3 01-plasmidet på fig. 3.
6. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,2 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Bglll- Aval-digerering av pMON3 01-plasmidet på fig. 3.
7. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,28 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved NruI- HincII-digerering av pMON21-plasmidet på fig.
2-
8. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,51 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved HincII-HincII-digerering av pMON21-plasmidet på fig. 2.
9. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,7 8 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved PvuII- PvuII-digererina av pMON3 8-plasmidet på fig.
5.
10. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 1,3 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved BamHI-Bglll-digerering av pMON810-plasmidet på fig.
3.
11. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 1,7 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Hindlll- Bglll-digerering av pMON707-plasmidet på fig. 10.
12. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,7 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved B <g> JLl-Aval-digerering av pMON7 07-plasmidet på fig.
10 .
13. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,7 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Bgll- Bstell-digerering av pMON7 07-plasmidet på fig.
10 .
14. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,41 kb og koder for syntesen av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Aval- Aval-digerering av pM0N510-plasmidet på fig. 1.
15. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,34 kg og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Aval- Aval-digerering av pMON510-plasmidet på fig.
1.
16. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,25 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Sau3A-Sau3A-di <g> ererin <q> av pMON401-plasmidet på fig. 1.
17. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 4,67 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Aval- Aval-digerering av pMON234-plasmidet på fig.
7 .
18. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,2 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Hindlll- Bglll-digerering av pMON1028-plasmidet på fig. 6.
19. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,3 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved B <g> ll-Hindlll-digerering av pMON1028-plasmidet på fig. 6.
20. Hovedsakelig rent DNA-fragment som har en molekylvekt på 0,63 kb og koder for syntese av S-laktamase, idet fragmentet er oppnådd ved Hindlll-Hindlll-digerering av pMON1028-plasmidet på fig. 6.
21. Hovedsakelig rent, enkelttrådet DNA-fragment med en oligonukleotid-sekvens valgt fra -TCGACATTCAAG-, -CGATCGAAGAAACGC-, -TCGAAGAAACGCTACTCG- og -CGATCGAAGAAACGC-TACTCGCCTGCATCGACATTCAAGATACCT-.
NO88883296A 1987-07-24 1988-07-25 Fremgangsmaate til aa bestemme tilstedevaerelsen av en genkode for syntese av beta-laktamase, og hybrid rekombinant plasmid og rent dna-fragment som koder for slik syntese. NO883296L (no)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7739387A 1987-07-24 1987-07-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO883296D0 NO883296D0 (no) 1988-07-25
NO883296L true NO883296L (no) 1989-01-25

Family

ID=22137795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO88883296A NO883296L (no) 1987-07-24 1988-07-25 Fremgangsmaate til aa bestemme tilstedevaerelsen av en genkode for syntese av beta-laktamase, og hybrid rekombinant plasmid og rent dna-fragment som koder for slik syntese.

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0300923A3 (no)
JP (1) JPH0191799A (no)
KR (1) KR890002405A (no)
AU (1) AU1913288A (no)
DK (1) DK408488A (no)
FI (1) FI883476A (no)
NO (1) NO883296L (no)
PT (1) PT88051A (no)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69032778T2 (de) * 1989-07-18 1999-07-29 Shimadzu Corp., Kyoto Verfahren zur Untersuchung von durch Mikroorganismen verursachten Lebensmittelvergiftungen und Reagens dafür
GB8924989D0 (en) * 1989-11-06 1989-12-28 Scotgen Ltd Method and device for the detection of antibiotic resistance
EP0467049A1 (en) * 1990-07-16 1992-01-22 American Cyanamid Company DNA sequences and amino acid sequences of class b beta-lactamase enzymes from bacteroides fragilis
US6001564A (en) * 1994-09-12 1999-12-14 Infectio Diagnostic, Inc. Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories
WO2016028712A1 (en) 2014-08-18 2016-02-25 The Texas A&M University System Beta lactamase as biomarker for the specific detection of tuberculosis-complex bacteria

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1177378B (it) * 1984-12-11 1987-08-26 Anic Spa Vettore plasmidico psm112 ad espressione in bacillus subtilis

Also Published As

Publication number Publication date
FI883476A (fi) 1989-01-25
AU1913288A (en) 1989-01-27
PT88051A (pt) 1989-06-30
KR890002405A (ko) 1989-04-10
EP0300923A3 (en) 1990-03-14
DK408488A (da) 1989-01-25
EP0300923A2 (en) 1989-01-25
DK408488D0 (da) 1988-07-21
FI883476A0 (fi) 1988-07-22
JPH0191799A (ja) 1989-04-11
NO883296D0 (no) 1988-07-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hellinga et al. Nucleotide sequence and high‐level expression of the major Escherichia coli phosphofructokinase
Farman et al. The Magnaporthe grisea DNA fingerprinting probe MGR586 contains the 3′ end of an inverted repeat transposon
McKenzie et al. The nucleotide sequence of pUB110: some salient features in relation to replication and its regulation
Tiemeier et al. Purification and cloning of a mouse ribosomal gene fragment in coliphage lambda
Rolfes et al. Escherichia coli gene purR encoding a repressor protein for purine nucleotide synthesis. Cloning, nucleotide sequence, and interaction with the purF operator.
CA1258623A (en) Probe containing a modified nucleic acid, recognizable by specific antibodies and use of this probe and these specific antibodies to detect and characterize a homologous dna sequence
US5474896A (en) Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
Kollek et al. Isolation and characterization of the minimal fragment required for autonomous replication (“Basic replicon”) of a copy mutant (pKN 102) of the antibiotic resistance factor R1
Zhu et al. A Large-Insert (130 kbp) Bacterial Artificial Chromosome Library of the Rice Blast FungusMagnaporthe grisea: Genome Analysis, Contig Assembly, and Gene Cloning
Meulien et al. Excision of the 40kb segment of the TOL plasmid from Pseudomonas putida mt-2 involves direct repeats
Lovett et al. Nucleotide sequence of the Escherichia coli recJ chromosomal region and construction of recJ-overexpression plasmids
Willson et al. Characterization of a multiple antibiotic resistance plasmid from Haemophilus ducreyi
Kobayashi et al. Evidence of a ter specific binding protein essential for the termination reaction of DNA replication in Escherichia coli.
Nagao et al. Multigene family of actin-related sequences isolated from a soybean genomic library
Vovis et al. Endonuclease R-EcoRII restriction of bacteriophage f1 DNA in vitro: ordering of genes V and VII, location of an RNA promotor for gene VIII
Jones et al. In vivo 5'terminus and length of the mRNA for the proton-translocating ATPase (unc) operon of Escherichia coli
Bohannon et al. Regulation of Bacillus subtilis glutamate synthase genes by the nitrogen source
Feiss et al. Essential interaction between lambdoid phage 21 terminase and the Escherichia coli integrative host factor
Hawkins et al. Cloning and characterization of the three enzyme structural genes QUTB, QUTC and QUTE from the quinic acid utilization gene cluster in Aspergillus nidulans
NO883296L (no) Fremgangsmaate til aa bestemme tilstedevaerelsen av en genkode for syntese av beta-laktamase, og hybrid rekombinant plasmid og rent dna-fragment som koder for slik syntese.
Li et al. Specific binding of Synechococcus sp. strain PCC 7942 proteins to the enhancer element of psbAII required for high-light-induced expression
Porter et al. The single-stranded-DNA-binding protein encoded by the Escherichia coli F factor can complement a deletion of the chromosomal ssb gene
Johnson et al. Construction and characterization of multicopy plasmids containing the entire F transfer region
Boissinot et al. Development of natural and synthetic DNA probes for OXA-2 and TEM-1 beta-lactamases
Little Isolation of recombinant plasmids and phage carrying the lexA gene of Escherichia coli Kl 2