JPH0154360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な蛋白質（PP₉）、そしてその濃
縮および取得法ならびにその使用に関する。 PP₉はこれまで研究されているヒトの器管のほ
とんどすべての中に存在している。胎盤の他にこ
れは胎児の下記の器管すなわち心臓、肝臓、腎
臓、肺、胃および脳、そしてさらに成人の下記の
器管すなわち心臓、肺、胃、腎臓、子宮、肝臓、
脾臓、副腎、結腸および膀胱中に証明されてい
る。 ヒトの成熟した胎盤（600ｇ）から生理食塩溶
液を用いてこの蛋白質は平均約42mgの量で抽出さ
れる。多くの他のヒトの器管におけるPP₉の濃度
も同様の程度であろう。血清中にはPP₉は通常存
在しないかあるいは痕跡量（＜0.1mg／100ml）に
おいてのみ存在する。 本発明の目的は、 ａ 炭水化物含量5.57±1.35％（そのうちヘキソ
ース4.9±1.0％、ヘキソースアミン0.1±0.1％、
フコース0.07±0.05％、およびノイラミン酸0.5
±0.2％）、 ｂ 沈降係数 S^o _20,w3.2±0.2S、 ｃ 超遠心器で測定された分子量35100±3800、 ｄ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
クリルアミド（PAA）ゲル中で測定された分
子量40000±4000、 ｅ 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm）14.6±1.0、 ｆ β₁−グロブリンの範囲内にある電気泳動運動
性、 ｇ PH6.4〜6.7の範囲内にある等電点 を特徴とする、遍在性組織蛋白質PP₉にある。 この組織蛋白質の特徴的な指標を以下に詳説す
る。 沈降係数はベツクマン（Beckman）社の分析
用超遠心器〔スピンコ（Spinco） 装置Ｅ型〕
中でUVスキヤンナー技術を用いて二重セクター
セル中で毎分60000回転（rpm）で280nmにおい
て測定される。溶媒としては0.2モル／のNaCl
を包含する0.05モル濃度の燐酸塩緩衝液（PH6.8）
が用いられる。蛋白質濃度は約30D（光学濃度）
に調整される。沈降係数は20℃の水を基準にして
換算される。 超遠心器における分子量の測定には沈降平衡法
が用いられる。その際蛋白質の濃度は約1.0光学
濃度に調整される。測定は9000rpmで行われる。
記録は光電スキヤンナーを用いて280nmでUV光
学装置を用いて行われる。 SDS−PAAゲル中における分子量の測定には
0.1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を包含
する7.5％ポリアクリルアミド（PAA）を有する
ゲルが用いられる。比較物質としてヒトの胎盤ラ
クトゲン（HPL）およびヒト−アルブミンなら
びにその集合物が用いられる。 吸光率の測定にはその物質を0.10％で蒸留水中
に溶解させる。 電気泳動運動性の調査はPH8.6のジエチルバル
ビツール酸ナトリウム緩衝液を使用して酢酸セル
ロース箔（Sartorius社製品）上ベツクマン・イ
ンストルメンツ（Beckman Instrumente）社の
装置「ミクロゾーン（Microzone」 」R200を
用いて微調整にて行われる。 等電点の測定はLKB社のカラム（440ml）を用
いて行われる。いわゆるアムフオリン 混合物は
糖蛋白質の研究に際してPH5.0〜7.0を有してい
る。蛋白質PP₉は非常に不均質（ヘテロゲン）で
ある。等電点焦点化に際してそれはPH5.0〜6.8の
範囲内にあると考えられ、その際蛋白質の主要量
はPH6.4〜6.7にある。 炭水化物の測定はシユルツエ（Schultze）氏等
により「バイオヘミツシエ・ツアイトシユリフト
（Biochem.Z.）」第329巻第490頁（1958年）に記
載されている方法により行われる。 アミノ酸分析はムーア（Moore）氏等による
「アナリテイカル・ケミストリー（Anal.Chem.）」
第30巻第1185頁（1958）の記載によりベツクマン
社の液体クロマトグラフイー用マルチクロームＢ
を使用して行われる。 1/2シスチンはこの蛋白質を過蟻酸を用いて酸
化〔「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958）〕お
よび引続いてのクロマトグラフイー〔「J.Biol.
Chem.」第238巻第235頁（1963）〕の後にシステ
イン酸として測定される。トリプトフアン含量は
エーデルホフ（Edelhoch）氏の「バイオケミス
トリー（Biochemistry）」第６巻第1948頁
（1967）の記載により直接測光側定により測定さ
れる。 実施例により得られるPP₉のアミノ酸分析の結
果を表にまとめる。

【表】 PP₉には以下の性質が確認され、これらはこの
新規組織蛋白質の単離に使用される。 １ 硫酸アンモニウムを用いるとPP₉はPH7.0で30
〜60％飽和で水溶液から沈澱される。 ２ 水溶性のアクリジン塩基例えば２−エトキシ
−６，９−ジアミノアクリジン乳酸塩〔リバノ
ール（Rivanol） 〕を用いるとPP₉はPH７〜
９そして0.4〜0.8％ｗ／ｖの濃度で沈殿され、
これに反してリバノール濃度が0.04％に等しい
かそれ以下である場合はPH6.0で全然かもしく
はほとんど沈殿されない。 ３ エタノールを用いる沈殿に際してはPP₉は生
理食塩溶液中においてPH7.0でアルコール25％
の濃度まで大部分上澄み液中に残留する。 ４ 調製用電気泳動に際してPP₉はβ₁−グロブリ
ンの範囲内を移動する。 ５ ゲル過〔セフアデツクス（Sephadex） 〕
に際してはPP₉は分子量20000〜60000を有する
蛋白質の範囲内にあるように思われる。 ６ PP₉は例えばDEAE−セルロースあるいは
DEAE−セフアデツクスのような弱塩基性イオ
ン交換体に低い伝導率（約０〜2ms）で中性も
しくは弱アルカリ性PH値（PH約７〜９）におい
て吸着される。 ７ PP₉はその水溶液から免疫吸着により濃縮さ
れそして単離されうる。 本発明の目的はさらにPP₉を包含している溶液
を前掲の性質を用いて分別することを特徴とす
る、蛋白質の取得法にある。 硫酸アンモニウムと並んでもちろんまた他の調
製的生化学において慣用される中性塩もPP₉の沈
殿に使用されうる。アクリジン塩基と並んでま
た、蛋白質の分別について知られているようなキ
ノリン塩基の水溶性誘導体も本発明による方法の
範囲内で用いられうる。その分子量のようなその
電気泳動性挙動に相応して蛋白質の単離には、β₁
−グロブリンまたは分子量約40000を有する蛋白
質を他の蛋白質から分離するのに適しているその
他の処置も利用できる。これにはゲル過、ゲル
クロマトグラフイーあるいは限外過なる種々の
方法、あるいはまた弱塩基性イオン交換体に結合
されそしてそこから再び溶離されうるPP₉の性質
が用いられうる。 PP₉の濃縮あるいはこの蛋白質の他の蛋白質か
らの分離を起させる前掲処置の合目的々な組み合
せによりPP₉は単離されうる。 従つて本発明の目的はPP₉の濃縮のための個個
の段階および濃縮のための処置の組み合せにより
生ずるPP₉の精製法に見出される。 濃縮法は処置１〜７の少くとも一つあるいはそ
の化学的もしくは生化学的な調製上の等価物を用
いることを特徴とする。 本発明の目的はさらに、PP₉を包含している液
体を蛋白質の分離について知られている処置の一
つもしくはそれ以上に付しそしてその時々にPP₉
の指標を有する蛋白質が濃縮されて存在している
物質を取得することを特徴とする、PP₉の製法に
ある。 たとえば分離操作で得られるフラクシヨン中の
PP₉の証明および測定には示されている助変数と
並んで免疫化学的方法も用いられうる。それは
PP₉が抗原性質を有するからである。 この目的に役立てられうる抗血清は以下のよう
にして取得されうる。PP₉含有性胎盤蛋白質フラ
クシヨン〔ボーン氏の「Arch.Gynaekol.」第210
巻440頁（1971年）の記載による胎盤フラクシヨ
ンおよび〕を用いて家兎に免疫賦与すること
により多価抗血清が得られ、これを用いてPP₉が
証明されうる。この抗血清はPP₉を包含していな
い正常なヒトの血清およびかような胎盤フラクシ
ヨンを用いて吸収させることにより抗原PP₉に対
して広範囲に特異的となされうる。この特異的な
抗血清は一方ではPP₉の免疫学的証明に、他方で
はPP₉の濃縮および単離に使用されうる免疫吸着
剤の調製に用いられうる。 PP₉の免疫学的証明にはオウヒターロニー
（Ouchterlony）氏によるゲル拡散技術
〔SchultzeおよびHeremans両氏著「Molecular
Biology of Human Proteins」第１巻第134頁参
照〕が用いられうる。 本発明により取得されるPP₉を用いて既知方法
により動物に免疫賦与することにより単一特異性
抗血清が調製される。 PP₉は抗原性質を有している。この蛋白質を用
いて動物に免疫賦与すると特異的な抗体が形成さ
れる。寒天含有ゲル中での電場における分離後の
家兎の特異的な抗血清とPP₉との免疫学的反応を
第1a図に示す。第1b図はこれとの比較のために
ヒト血清（HS）に対する家兎の抗血清とのその
免疫反応により可視的ならしめられた血清蛋白質
の分離を示す。 免疫学的方法を用いるPP₉の証明および測定は
診断上重要である。PP₉は明らかにほとんどすべ
てのヒトの器管に存在している組織蛋白質であ
る。組織崩壊を伴なつて現われる疾患に際して、
この蛋白質は高められた濃度で血液中に証明され
うる。それゆえその測定は全く一般的に疾患の認
知ならびに疾患経過の監視および治療の制御のた
めに使用されうる。 PP₉はこのようにPP₉を証明しそして測定する
のに用いられうる抗血清を調製するために使用さ
れうる。 本発明を以下の実施例により説明する。 実施例 １ Ａ 胎盤の抽出および抽出物のリバノールおよび
硫酸アンモニウムを用いる分別 冷凍されたヒトの胎盤1000Kgを切断混合器中で
粉砕しそして0.4％食塩溶液1000を用いて抽出
する。抽出液は組織残留物を遠心分離により分離
したのち、次に20％酢酸を用いてPH6.0に調整し
そして撹拌下に２−エトキシ−６，９−ジアミノ
アクリジン乳酸塩（リバノール）の３％溶液200
を加える。生ずる沈殿を遠心分離して除去しそ
して捨てる。上澄み液に１％ｗ／ｖベントナイト
Ａ（Erbsloh＆Co.製品）を加え、2N NaoHの添
加によりPH値を7.0に調整しそして過する。
液に撹拌下にゆつくりと30％ｗ／ｖ硫酸アンモニ
ウムを加える。その際胎盤蛋白質PP₉は他の蛋白
質と共に析出する。沈殿を過しそして湿つたペ
ースト約12Kgが得られ、これは以下にフラクシヨ
ンＡとして表示される。このペースト500ｇは平
均約640mgのPP₉を包含している。 Ｂ セフアデツクスＧ−150でのゲル過 フラクシヨンA500ｇを約400mlの水に溶解させ
そしてNaCl1.0モル／および0.1％のNaN₃を包
含している0.1MトリスーHCl緩衝液（PH8.0）（緩
衝溶液）に対して透析する。蛋白質含有溶液を
セフアデツクスＧ−150を充填したカラム（20×
100cm）に入れそしてゲル過する。溶離には緩
衝溶液を使用する。溶離液をオウヒターロニー
によるゲル拡散試験で特異的な抗PP₉−家兎血清
を用いて試験する。胎盤特異的な蛋白質PP₉を包
含しているフラクシヨンをすべて集めそして限外
過器〔アミコン（Amicon） UF2000〕上で
PM10膜を使用して約300mlまで濃縮する。この
溶液（フラクシヨンＢ）は合計で約600mgのPP₉
を包含している。 Ｃ 免疫吸着によるPP₉の濃縮 １ 免疫吸着剤の調製 家兎の抗PP₉−血清350mlを0.02M燐酸塩緩衝液
（PH7.0）に対して透析しそして免疫グロブリンを
分離するためにDEAE−セルロースでクロマトグ
ラフ処理する。次にこの免疫グロブリンフラクシ
ヨン（蛋白質2.78ｇ）をブロムシアン348ｇで活
性化されている球形の特別に精製されたアガロー
ス278ｇ〔Pharmacia社製品、「セフアロース
（Sepharose） 」4B〕と反応させそして担体に
かくして共有結合させる。 この方法はアキセン（Axen）氏等により
「Nature」第214巻第1302頁（1967）に記載され
ている。 この方法で調製される免疫吸着剤を用いて胎盤
蛋白質PP₉がその溶液、特にPP₉濃縮された胎盤
抽出液フラクシヨンから単離されうる。 ２ 免疫吸着の実施 免疫吸着剤を緩衝溶液（0.1MトリスHCl緩
衝液、PH8.0，1.0モル／のNaClおよび0.1％
NaN₃を有する）中に懸濁させ、次いでクロマト
グラフイーカラム（5.5×20cm）中に充填しそし
て緩衝溶液を用いて洗う。次いでPP₉含有溶液
（フラクシヨンＢ）60mlを徐々にカラムを通つて
移動させるとその際PP₉は免疫吸着的に結合され
る。このカラムを緩衝溶液を用いて充分に洗い
そして次に吸着されている蛋白質を3Mチオシア
ン酸カリウム溶液約600mlを用いて溶離する。
PP₉を含有している溶離液を緩衝溶液に対して
透析しそして限外過器中で約15mlまで濃縮す
る。１吸着当りの収量PP₉〜10mg。 カラム中の吸着剤をPP₉の溶離の直後に再び緩
衝溶液を用いて中和しそして充分に洗う。これ
は次にPP₉の（免疫）吸着的結合に新たに用いら
れうる。 Ｄ PP₉の高度精製 免疫吸着により取得される蛋白質はしばしば非
特異的に結合している血清蛋白質および他の胎盤
組織蛋白質により汚染されている。血清附随蛋白
質の主要量の分離は例えばセフアデツクスＧ−
150でのゲル過により達成できる。次いで残り
の附随蛋白質は逆あるいは負の免疫吸着により、
すなわちなお汚染物として存在している蛋白質に
対する担体結合された抗体を用いて除去される。 従つてわずかな量にてなお存在している蛋白質
SP₁〔「Blut」第32巻第103頁（1976年）〕、PP₇
〔「Arch.Gynaekol.」第222巻第５頁（1977年）〕
およびHPG−２〔「Blut」第25巻第305頁（1977
年）〕は相当する免疫吸着剤により除去される。
しかしこのすでに知られている蛋白質の他にPP₉
粗フラクシヨン中にはまだ２〜３の他のこれまで
知られていない胎盤の組織蛋白が証明される。附
随蛋白質に対する抗体を調製するにはPP₉粗フラ
クシヨンを0.5Mグリシン−HCl緩衝液（PH2.5）
に対して12時間透析しそして次に再び中和する。
この条件下でPP₉は変性されそしてその免疫化学
的反応性を失なう。これに反して汚染物は安定で
抗原として残留して得られる。それで動物に免疫
賦与するとこの蛋白質に対する抗体が得られ、こ
れは担体に結合したのちPP₉粗フラクシヨンから
の未知胎盤蛋白質の免疫吸着的除去に用いられう
る。 免疫吸着剤により処理された前記粗PP₉を濃度
が0.01モル／ｌとなるようにPH7.0のトリスー緩
衝液に溶かし、DEAE−セフアデツクスに吸着さ
せる。所望の蛋白質を、濃度が０％から２％へと
増大する食塩水溶液で溶離すると主フラクシヨン
として等電点6.4〜6.7のPP₉が得られる。

【図面の簡単な説明】

添付図面において、第１ａ図は寒天含有ゲル中
での電場における分離後の家兎の特異的な抗血清
とPP₉との免疫学的反応を示す図であり、第１ｂ
図はこれとの比較のためにヒト血清（HS）に対
する家兎の抗血清とのその免疫反応により可視的
ならしめられた血清蛋白質の分離を示す図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質、すなわち ａ 炭水化物含量5.57±1.35％（そのうちヘキソ
   ース4.9±1.0％、ヘキソースアミン0.1±0.1％、
   フコース0.07±0.05％、およびノイラミン酸0.5
   ±0.2％）、 ｂ 沈降係数 S^o _20,w 3.2±0.2S、 Ｃ 超遠心器で測定された分子量 35100±3800、 ｄ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
   クリルアミドゲル中で測定された分子量40000
   ±4000、 ｅ 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm）14.6±1.0、 ｆ β₁−グロブリンの範囲内にある電気泳動運動
   性、および ｇ PH6.4〜6.7の範囲内にある等電点を有するこ
   とを特徴とする、蛋白質PP₉。 ２ 下記の理化学的性質、すなわち ａ 炭水化物含量5.57±1.35％（そのうちヘキソ
   ース4.9±1.0％、ヘキソースアミン0.1±0.1％、
   フコース0.07±0.05％、およびノイラミン酸0.5
   ±0.2％）、 ｂ 沈降係数 S^o _20,w 3.2±0.2S、 ｃ 超遠心器で測定された分子量 35100±3800、 ｄ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
   クリルアミドゲル中で測定された分子量40000
   ±4000、 ｅ 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm） 14.6±1.0、 ｆ β₁−グロブリンの範囲内にある電気泳動運動
   性、および ｇ PH6.4〜6.7の範囲内にある等電点を有する蛋
   白質PP₉の製造方法において、この蛋白質を包
   含している溶液を以下の処置、すなわち PH５〜８そして30〜60％飽和度での硫酸アン
   モニウムによる沈澱、 PH４〜９そして濃度0.2〜0.8％（ｗ／ｖ）で
   の水溶性アクリジン塩基による沈澱、 20000〜60000の分子量範囲内の蛋白質を取得
   するためのゲル過、 弱塩基性イオン交換体への吸着ならびに蛋白
   質の溶離、 免疫吸着的濃縮、 逆免疫吸着による高度精製に付すことからな
   る方法。 ３ 免疫学的検査および下記のPP₉蛋白質の検出
   に有用な抗血清を製造するための、下記の理化学
   的性質すなわち ａ 炭水化物含量5.57±1.35％（そのうちヘキソ
   ース4.9±1.0％、ヘキソースアミン0.1±0.1％、
   フコース0.07±0.05％、およびノイラミン酸0.5
   ±0.2％）、 ｂ 沈降係数S^o _20,w 3.2±0.2S、 ｃ 超遠心器で測定された分子量 35100±3800、 ｄ ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）含有ポリア
   クリルアミドゲル中で測定された分子量40000
   ±4000、 ｅ 吸光率 Ｅ１％ １cm（280nm） 14.6±1.0、 ｆ β₁−グロブリンの範囲内にある電気泳動運動
   性、および ｇ PH6.4〜6.7の範囲内にある等電点を有する蛋
   白質PP₉を含有する抗原。