JPH0141314B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、未過発酵液の新規な抽出方法、さ
らに詳しくは、腐生性条件下において麦角菌
（Claviceps purpurea）を適用して得られた未
過発酵液の抽出方法に関する。腐生性条件下で培
養された麦角菌は、まず、エルゴトキシン型アル
カロイドとしても知られるペプチドアルカロイ
ド、主としてエルゴコルニン及びそのエピマー、
エルゴコルニニン、ならびにα−及びβ−エルゴ
クリプチン及びそれらのエピマー、α−及びβ−
エルゴクリプチニン、さらに場合によつては非ペ
プチド型のアルカロイド、たとえば、エルゴメト
リン及びそのエピマー、エルゴメトリニンを生成
する。

ハンガリー特許第164658号明細書は、未過発
酵液の塩基性PH値における抽出による水溶性アル
カロイドの製造方法に関する。この方法では、
過された菌糸体の処理という問題が未解決であ
る。

英国特許第1158380号明細書は、主としてエル
ゴトキシン型のアルカロイドの製造方法に関す
る。この方法では、発酵液を過し、そして液
及び菌糸体を別々に抽出する。２％酒石酸水溶液
とアセトンとの混合物により菌糸体からエルゴト
キシン型のアルカロイドを抽出し、抽出物を濃縮
し、次いでエルゴトキシン型アルカロイドを塩基
性PH値においてクロロホルム中に溶解せしめ、然
る後にそれらをクロマトグラフイーにより精製す
る。過された発酵液からクロロホルムによりさ
らにエルゴトキシン型アルカロイドが得られる。

ハンガリー国特許第171659号明細書も同様に、
過された発酵液の処理に関連する。この処理に
おいては、エルゴトキシン型のアルカロイドが、
アンモニア性酢酸エチルを用いて過によつて分
離された菌糸体から塩基性PH値において溶解せし
める。

多量の発酵液の過はかなり大きい過容量を
必要とし、また、発酵液の過能力が個々のアル
カロイドの入手性にかなり影響を与えるので、よ
り最近の方法の開発においては過工程の除去が
目的とされていた。

しかしながら、過工程を含まない方法におい
ては、抽出物中に水溶性アルカロイドとエルゴト
キシン型アルカロイドとが一緒に抽出され、ま
た、両タイプのアルカロイドの若干量が菌糸体中
に残つた。従つて、これら２つのタイプのアルカ
ロイドを分離するためにはさらに相交換が必要で
ある。

ハンガリー国特許第164116号に開示された方法
は、未処理発酵液を処理するこのような方法に基
づく。この方法によれば、未過発酵液のPH値を
７に調整し、次いで硫酸アンモニウムで飽和し、
そしてアセトンで抽出する。抽出物のPH値を3.5
に調整し、一部分蒸発せしめ、次いで、残留物か
らクロロホルム抽出によつてエルゴトキシン型の
アルカロイドを分離しそしてクロマトグラフイー
により精製する。

公告されたハンガリー国特許出願第RI−631号
もまた一部分は、未過発酵液の処理に基づく方
法を開示している。未過発酵液のPH値を９〜10
に調整し、ペプチドアルカロイドをメチルイソブ
チルケトンで抽出し、次いでこれらを酸水溶液中
に溶解せしめ、然る後にクロロホルム中に溶解せ
しめる。

本発明者らは、未過発酵液を4.0乃至5.5の酸
性のPH範囲において抽出すれば、ペプチドアルカ
ロイドを得るのに従来使用されていた３工程を単
一の抽出工程に減じ得ることを見い出した。

しかも、4.0乃至5.5のPH範囲においては、ペプ
チドアルカロイドの抽出は充分に選択的である。
すなわち、前記方法（PH3.5；酒石酸媒体）より
もPH値を増大したにもかかわらず、水相には水溶
性アルカロイドが残る。同時に、意外なことに、
選択されたPH範囲（4.0乃至5.5）においてはペプ
チドアルカロイドの抽出効率は塩基性PH値におい
て実施される抽出の場合よりも有利である。

この事実を説明すれば、抽出前もしくは抽出中
に発酵液をアルカリ性にすれば、アルカロイドの
かなりの部分を吸着し得る高分子量有機物質が沈
澱することが、我々の詳細な実験において判明し
た。塩基性PH範囲において抽出を実施しそしてア
ルカロイドを塩析によつて沈澱せしめると、これ
らの沈澱物の形成はより激しくなり、分離能及び
収率は共に低下する。

抽出前にPH値が上昇しないことが必須であるの
で、発酵は4.0乃至5.5の所望のPH範囲内で終わら
せなければならない。

さらに重要なことは、菌糸体を含む発酵液の抽
出操作の間に２つの輸送プロセスが起こつている
ことである。一方は菌糸細胞から水性媒体へのア
ルカロイドの移動であり、他方は水性媒体から溶
剤媒体へのアルカロイドの移動である。従つて、
アルカロイドの分配及び抽出装置の性質に起因す
る滞留時間は菌糸細胞の抽出を完了させるには充
分ではなく、それ以上の時間が必要である。抽出
所要時間が細胞の抽出効率によつて決定されると
いうことは、これまで実現されなかつた驚意的で
且つ特有の事実である。従つて、抽出の間におい
て、細胞抽出に必要な時間が保証され得る。

抽出は任意の従来の操作法で実施できる。断続
運転抽出器を適用して、溶媒との混合を２〜３回
繰り返す。さらに、未過溶液は、たとえば、
RDC抽出器または向流回転〔たとえば、ポツド
ビールニアク（Podbielniak）〕抽出器中で抽出
し得る。

PHを4.0乃至5.5に固守することにより、沈澱形
成を回避できるため、相分離がかなり簡易になる
という操作上の利点がもたらされる。

従つて、水不混和性溶剤またはわずかに水混和
性の溶剤による未過麦角菌（Claviceps
purpurea）発酵液の抽出方法であつて、4.0乃至
5.5の最終PH値を有する未過麦角菌発酵液を最
終発酵液のPH値において水不混和性溶剤またはわ
ずかに水混和性の溶剤で抽出して、菌糸細胞の抽
出に必要な時間を保証し；次いで、主としてエル
ゴトキシン型のアルカロイドを含むアルカロイド
混合物を回収し；そして所望ならば、PHを７乃至
９に調節した後に主として水溶性型の麦角アルカ
ロイドを回収することを含んでなる方法に関す
る。

本発明の方法によれば、出発原料として、麦角
菌の菌株によつて生成された未過発酵液を用い
る。菌株としては、主としてエルゴトキシン型ア
ルカロイド、まず第一にエルゴコルニン及びその
エピマー、α−及びβ−エルゴクリプチンならび
にそれらのエピマー、さらに場合によつては水溶
性の麦角アルカロイドを生成する麦角菌の菌株を
使用できる。好ましくは、ハンガリー国、ブダベ
ストのナシヨナル・インステイテユート・オブ・
ヘルス（National Institute of Health）に寄託
されたMNG00022，MNG00088及びMNG00186
を使用できる。

発酵自体はそれ自体公知の方法に従つて、たと
えば、ハンガリー国特許第164016号明細書中に開
示された方法で実施できるが、発酵の最後に発酵
液のPH値が4.0乃至5.5、好ましくは4.7乃至5.2で
あるように気をつけなければならない。所望なら
ば、培地の浸透圧を増加させる添加剤を、ハンガ
リー国特許第153739号明細書中に開示された方法
に従つて発酵液に加える。浸透圧を増加する添加
剤としては、まず、有機もしくは無機の塩類、た
とえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム及び
マグネシウムの塩化物、硫酸塩、炭酸塩、燐酸
塩、酢酸塩、コハク酸塩もしくはアスパラギン酸
塩、または単糖類もしくは二糖類、たとえば、マ
ンニツト、ソルビツト、グルコースもしくはサツ
カロースを用いることができる。

発酵後に、発酵液のPH値を前もつて変化させる
ことなく、未過発酵液を不連続式もしくは連続
式の抽出器中で水不混和性もしくはわずかに水混
和性の溶液で抽出する。抽出剤としては、まず、
水不混和性のもしくは水とわずかだけ混和性の低
級脂肪族ケトン、好ましくはメチルイソブチルケ
トン、または低級脂肪族カルボン酸エステル、好
ましくは酢酸エチル、または塩素化炭化水素、好
ましくはクロロホルムもしくはジクロロエタンを
使用できる。

抽出過程においては、未過発酵液と抽出剤と
が、真菌細胞の適当な抽出に必要な期間適切に接
触するように注意しなければならない。抽出は、
抽出剤と未過発酵液が適当な期間一緒にとどま
るように予備撹拌容器を抽出器の前に挿入して用
いることにより且つ撹拌しながら実施するのが好
ましい。適当な撹拌条件下において真菌細胞の最
大抽出能の95％は約３分以内に達成できる。

一般に、最適抽出時間は撹拌条件に応じて３乃
至15分、好ましくは３乃至８分である。

蒸発及び／または石油エーテルによる沈澱によ
つて抽出物からエルゴトキシン型のアルカロイド
を得ることができる。

然る後に、抽出された発酵液のPHを７乃至９に
調整し、次いで水溶性アルカロイドをそれ自体公
知の方法で、好ましくはマレイン酸塩の形で得
る。

本発明に係る方法をさらに以下の実施例につい
て説明するが、これらは本発明と何ら限定するも
のではない。

実施例 １ ハンガリー国特許第164816号明細書中に開示さ
れたのと同様にして麦角菌（Claviceps
purpurea）MNG00088を培養することによつて
得られた深部培養物250を抽出した。ただし、
ハンガリー国特許第153739号明細書に開示され
た、培地の浸透圧を増加させる添加剤を適用し
た。培養物はエルゴトキシン型アルカロイド
0.812mg／ml及びエルゴメトリン0.350mg／mlを含
んでいた。抽出は最初の発酵液自体のPH値（4.8）
において10分間撹拌しながらメチルイソブチルケ
トン125を用いて実施した。

然る後に、抽出された発酵液及び菌糸体ならび
に抽出物を含む混合物を遠心過機（filter−
centrifuge）中で過し、次いで相を分離した。
メチルイソブチルケトン125を再び水相に加え、
次いで菌体をまた加え、そして混合物をもう一度
10分間撹拌した。過後に相を分離した。

溶媒相を40℃以下の温度において容量２まで
減圧蒸発せしめ、次いで激しく撹拌しながら蒸発
残留物を石油エーテル20中に注入した。分離し
た沈澱物を10分間放置し、次いで過し、石油エ
ーテル0.1で２回洗浄し、次いで40℃以下の温
度で減圧乾燥した。得られた生成物の重量は
279.5ｇであつた。

生成物はエルゴトキシン型アルカロイド730
mg／ｇ及びエルゴメトリン20mg／ｇを含んでい
た。

然る後に、水相と菌糸体との混合物のPH値を濃
水酸化アンモニウム水溶液で８に調整し、次いで
撹拌しながら混合物をメチルイソブチルケトン
125で２回抽出した。反応混合物から過及び
液相の分離によつて水溶性アルカロイドを含む抽
出物を得た。合した有機相を最大40℃において容
量５まで減圧蒸発し、次いで激しく撹拌しなが
らPH値が４になるまでメチルイソブチルケトン中
マレイン酸溶液を蒸留残留物に加えた。沈澱した
エルゴメトリンマレエートを過し、メチルイソ
ブチルケトン各300mlで２回洗浄し、次いで最大
40℃において減圧乾燥した。得られた生成物は重
量が116.4ｇで、エルゴメトリンマレエートの形
でエルゴメトリン683mg／ｇを含んでいた。

実施例 ２ ハンガリー国特許第164816号明細書中に開示さ
れた発酵方法に従つて寄託番号MNG00186の下
に寄託された麦角菌（Claviceps purpurea）の
変異株を用いて調製された発酵液100を、発酵
中止後に、発酵液自体のPH値（5.2）において40
／時間の速度で混合抽出器中に供給し、同時に
30／時間の速度で酢酸エチルを加えた。発酵液
100中にはエルゴコルニン及びそのエピマーが
0.351mg／mlの濃度で、α−エルゴクリブチン及
びそのエピマーが0.137mg／mlの濃度でそしてβ
−エルゴクリブチン及びそのエピマーが0.152
mg／mlの濃度で含まれていた。然る後に、撹拌混
合物を自排式箱型分離器（self−emptying
chamber separator）で酢酸エチルと水性菌糸体
相に分離した。この操作は、発酵液の抽出器中滞
留時間が６乃至８分間であるようにして実施し
た。分離後、酢酸エチル抽出物中にはエルゴコル
ニン及びそのエピマーが0.427mg／mlの濃度で、
α−エルゴクリブチン及びそのエピマーが0.172
mg／mlの濃度でそしてβ−エルゴクリブチン及び
そのエピマーが0.187mg／mlの濃度で含まれてい
た。

実施例 ３ ハンガリー国特許第164816号明細書の方法に従
つて寄託番号MNG00022の下に寄託された麦角
菌（Claviceps purpurea）の菌株を用いて得ら
れた発酵液10m³を未過発酵液自体のPH値（4.5）
で２回抽出した。発酵液10m³はエルゴコルニン及
びそのエピマーを0.423mg／mlの濃度で、α−エ
ルゴクリブチン及びそのエピマーを0.381mg／ml
の濃度でそしてβ−エルゴクリブチン及びそのエ
ピマーを0.093mg／mlの濃度で含んでいた。抽出
は、回転数1500回／分で操作されるポツドビール
ニアク（Podbielniak）D36型の抽出器中で酢酸
エチルを用いて実施する。発酵液１m³に対して酢
酸エチルを400×２用いた。菌糸細胞から水性
発酵液へのアルカロイドの移動に必要な６分間の
平均滞留時間を保証するために、発酵液はまず、
予備混合タンク中で撹拌し、次いで、これに40容
量％の酢酸エチルを添加した。予備混合タンクの
全量を抽出器中に移し、その中であらかじめ予備
混合タンク中に添加された酢酸エチルを使用して
抽出を実施した。然る後に、40容量％の酢酸エチ
ルを用いて抽出を繰り返した。酢酸エチルが抽出
器中で連続相を形成し且つ発酵液がその中に分散
するように抽出器を操作した。従つて、抽出器内
の活性部において発酵液0.1乃至0.15について
酢酸エチル約１を用いた。酢酸エチル抽出物を
合し、そしてさらに処理するために貯蔵した（本
明細書中において、この合した酢酸エチル抽出物
を「酸性のPH値で得られた抽出物」とも称する）。
然る後に、残りの発酵液のPH値を濃水酸化アンモ
ニウム水溶液で8.5に調整し、次いで酢酸エチル
で２回抽出した。抽出物を合した。

酸性のPH値で得られた酢酸エチル抽出物を40℃
以下の温度において容量50まで減圧蒸発せし
め、次いで激しく撹拌しながら蒸発残留物を石油
エーテル500中に注入した。沈澱したアルカロ
イド混合物を遠心過機で過し、石油エーテル
15で２回洗浄し、次いで最高40℃において減圧
乾燥した。得られた生成物は重量が12.19Kgで、
以下の組成を有していた： エルゴコルニン及びそのエピマー
302mg／ｇ α−エルゴクリブチン及びそのエピマー
270mg／ｇ、及び β−エルゴクリブチン及びそのエピマー
68mg／ｇ。

実施例 ４ ハンガリー国特許第164816号明細書に開示され
た方法に従つて寄託番号MNG00088の下に寄託
された麦角菌（Claviceps purpurea）の菌株を
用いて得られた発酵液250をRDC（回転円板カ
ラム）式の抽出器中で未過発酵液自体のPH値
（4.7）において酢酸エチルを用いて抽出した。発
酵液250はエルゴトキシン型アルカロイド822
mg／ml及びエルゴメトリン0.150mg／mlを含んで
いた。

抽出器の内径は150mmであり、ミキサーの回転
数は150回／分であり、活性セル数は50であつた。
菌糸細胞から水性発酵液へのアルカロイドの移動
に必要な５分間の平均滞留時間を保証するために
抽出器の前に予備混合器を挿入した。未過発酵
液はまず、予備混合器中で撹拌し、次いで、これ
に40容量％の酢酸エチルを添加した。予備混合器
中の全量を抽出器中に移し、その中であらかじめ
予備混合器中に添加された酢酸エチルを使用して
抽出を実施した。然る後に、40容量％の酢酸エチ
ルを用いて抽出を繰り返した。抽出過程におい
て、予備混合した発酵液は連続向流RDC抽出器
の上部の第０番目のセルに60／時間の速度で供
給し、酢酸エチルは下部の第50番目のセルに48
／時間の速度で供給した。発酵液100に対し
て酢酸エチル80を用いた。抽出器中で酢酸エチ
ルは連続相であり、抽出器の活性（混合）部にお
いて発酵液0.1乃至0.25を酢酸エチル１中に
分散せしめた。約90分間の誘導時間の後に、残つ
た抽出物（上部のセルに残つている酢酸エチル
相）及びラフイネート（下部のセルに残つている
抽出された発酵液）のアルカロイド濃度は一定に
なつた、すなわち、抽出器の操作は平衡化された
と考えられる。次いで、受け器を交換し、そして
実質的に任意の時間抽出器を操作した時、抽出物
及び平衡組成を有するラフイネートを受け器に回
収した。発酵液をちようど10供給した時に得ら
れた抽出物及びラフイネートを回収すると、抽出
物の容量は63、ラフイネートの容量は110.5
であつた。

主としてエルゴトキシン型のアルカロイドを含
んでなる抽出物は、エルゴトキシン型アルカロイ
ド1.217mg／ml及びエルゴメトリン0.011mg／mlを
含んでいた。主としてエルゴメトリンを含むラフ
イネートはエルゴトキシン型アルカロイドを
0.0529mg／ml及びエルゴメトリンを0.133mg／ml
含んでいた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不混和性溶剤またはわずかに水混和性の溶
   剤による未過麦角菌（Claviceps purpurea）
   発酵液の抽出方法であつて、4.0乃至5.5の最終PH
   値を有する未過麦角菌発酵液を最終発酵液のPH
   値において水不混和性溶剤またはわずかに水混和
   性の溶剤で抽出して、菌糸細胞の抽出に必要な時
   間を保証し；次いで、主としてエルゴトキシン型
   のアルカロイドを含むアルカロイド混合物を回収
   し；そして所望ならば、PHを７乃至９に調節した
   後に主として水溶性型の麦角アルカロイドを回収
   することを含んでなる方法。 ２ 前記麦角菌が、ハンガリー国、ブダペストの
   ナシヨナル・インステイテユート・オブ・ヘルス
   （National Institute of Health）に寄託された
   麦角菌（Claviceps purpurea）MNG00022，
   MNG00088及びMNG00186から選ばれる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ３ 抽出剤として、水不混和性のもしくはわずか
   に水混合性の低級脂肪族ケトンまたはカルボン酸
   エステルもしくは塩素化炭化水素を用いる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ４ 4.7乃至5.2のPH値において抽出を実施する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。