JPH01256386A - ウロキナーゼ様酵素前駆体の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は菌体に生産させたウロキナーゼ様酵素前駆体（
以下ｐｒｏＵＫと略す）の精製法に関する。

［従来の技術］ ｐｒｏＵＫは、血液内に生じた血栓を分解する酵素の前
駆体プラスミノーゲンを活性化しプラスミンに変換させ
る酵素ウロキナーゼの前駆体である。

従来、人の尿から得られるウロキナーゼが血栓症の治療
に使用されてきたが、大量投与すると副作用を示す。そ
のため最近副作用の少ない新薬としてｐｒｏＵにが求め
られているが、ｐｒｏＵＫは天然界には極めて微量にし
か存在しない。そこでｐｒｏＵに遺伝子を組み込んだ大
腸菌にｐｒｏＵにを生産させる方法が開発された（特開
昭５９−５１３００号）。

この方法で生産されたｐｒｏＵＫは、菌体細胞内におい
てウロキナーゼ本来の高次構造を持たない不溶物として
存在する。特開昭５９−１６１３２１号では菌体細胞を
超音波処理又はフレンチプレス処理などで破砕した後に
遠心分離などの方法で不溶性画分を回収することにより
菌体内の可溶性物質を除去し、さらに塩酸グアニジン等
の変性剤で抽出し、次いで抽出液を稀釈するなどの処理
で変性剤の効果を弱めてｐｒｏｌＪＫを再構造化（リフ
ォールディング）させる方法について述べている。

しかしながら、この方法で得られたｐｒｏＵＫには、人
体に免疫源性を持つ宿主細胞由来の夾雑蛋白質や発熱源
物質が含まれており、医薬として用いるためにはさらに
高度に精製されなければならない。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明はこれらの問題点を解決したｐｒｏＬＩにの精製
法を提供することを目的とするものである。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、菌体に生産させたｐｒｏｌｌＫは、アル
キル基を結合した高分子ゲルに結合させ、分別溶出する
ことで好適に夾雑蛋白質を除去できることを見出した。

即ち本発明よりなる精製法の特徴は、菌体由来の再構造
化させたｐｒｏＵＫを、アルキル基を結合させた高分子
ゲルに吸着させて分別溶出するところにある。

［作　　　用］ 本発明で使用されるアルキル基を結合した高分子ゲルと
しては、アルキル基としては０１〜１０のアルキル基よ
り任意に選択され、高分子ゲルは天然高分子であるセル
ロースやアガロース、またはそれらに架橋をほどこして
機械的強度を持たせたもの、親水性合成高分子のゲル等
を挙げることができ、例えば東ソー■社製の高速、高圧
法用のカラム充填剤であるブチルトヨパール（商品名）
を具体的に例示できる。この吸着剤は水に懸濁し通常の
カラムに充填して使用する。

本発明の精製法に供せられるｐｒｏＵに含有の原料溶液
は、菌体に生産させたものをとり出し、再構造化するこ
とによって可溶化したｐｒｏＵＫを含むものである。ｐ
ｒｏｌｌＫを得るための菌体、破砕法、不溶物の分離法
、再構造化法には特に限定はなく、従来公知の方法を採
用すればよい。

例えばｐｒｏＵにの遺伝子を組み込んだ組み換え体大腸
菌にｐｒｏｔｌにを生産させ、菌体を公知の方法、例え
ば超音波破砕法やボウリンホモジナイザーなどの物理的
方法やりゾチーム処理などの化学的方法で破砕した後、
遠心分離又は？ＦＡなどして得られる不溶物から、ｐｒ
ｏＵにを例えばモノエタノールアミン水溶液やアンモニ
ア水溶液などのアルカリ性水溶液で抽出して、ｐＨ８〜
１０にコントロールする事により再構造化させたもの、
又は不溶物から塩酸グアニジン等の蛋白質変性剤溶液で
抽出後、稀釈又は透析により変性剤を除去して再構造化
したものを例示できる。

アルキル基を結合した高分子ゲルによる精製にこの溶液
を直接用いても良いが、塩析やエタノール分画など公知
の方法で夾雑物を可能なかぎり除去したものを原料とす
ることが好ましい。

精製はまず原料溶液に０〜１Ｍの塩類を添加し、沈澱し
た不純物を除去した後にアルキル基を結合した高分子ゲ
ルを充填したカラムに通す。

流速はカラムの容量、ゲルの充填量に依存し、溶液中の
ｐｒｏＵにが吸着し、溶出しない流速に調製する。この
とき使用する塩類は陰イオンとして硫酸、燐酸、カルボ
ン酸、塩素、硝酸、炭酸などであり、陽イオンとしては
ナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、
銅、鉄、などが用いられるが、好ましくは硫安、硫酸ソ
ーダ、硫酸マグネシウムなど水に対する溶解度が高く、
さらに２価以上の多価の塩が好ましい。添加する塩類の
濃度は溶液中の変性剤濃度に依存し、変性剤が多ければ
多量に必要となり、少なければ少量またはまったく必要
としない。このとき析出した不純物の沈澱は遠心分離ま
たはｒ過助剤を用いたｒ過により除去する。

ｐｒｏＬＩにの溶出には、例えばアミン系の有機溶媒即
ちモノエタノールアミン、アミノメチルプロバノール、
エチレンジアミン等の水溶液が用いられるが、これらの
水溶液は強いアルカリ性を示すので、ｐｒｏＵにの安定
化のため塩酸や硫酸でｐＨ７〜１１に調節して使用され
る。ｐｒｏＵＫ及び夾雑蛋白質の分別溶出は例えばアミ
ン系有機溶媒濃度を段階的に、または徐々に変化させる
ことにより行うことができる。

使用後のゲルは苛性ソーダ溶液またはエタノール溶液で
洗浄することにより繰返し使用することができる。

［実　施　例］ 次に本発明をさらに詳細に説明するため実施例をあげる
が、これらの実施例のみに本発明は限定されるものでは
ない。

なお実施例においてｐｒｏＵにの活性測定は、プラスミ
ンでｐｒｏＵＫをウロキナーゼに変換した後にＰｙｒ−
Ｇｌｙ・＾ｒｇ−ｐＮＡ　（Ｐｙｒはピログルタミル基
を表す）の加水分解活性を市販の標準ウロキナーゼ（商
品名Ｓ−２４４４；第一化学薬品社製）と比較して求め
た。また蛋白質濃度は、実施例１゜２ではバイオラッド
（ＢｉｏＲａｄ）社製プロティン分析キット（Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ　ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ）を用い、実施例３では２
８０ｎｍの吸光度により測定した。

実施例１ 大腸菌を培養し菌体をボウリンホモジナイザーで破砕し
た後、５％モノエタノールアミン水溶液でｐｒｏＵＫを
抽出しざらにシスティンを加えた溶液に塩酸を滴下して
ｐＨ９，５に調製した溶液１３５ｍ又を原料とした。

原料溶液に硫酸ソーダ１４ｇを添加した後セライト１０
ｇを加えて室温で３０分攪拌した。この溶液をｒ紙を用
いて一過してｒ液を回収した。

アルキル基結合高分子ゲルとして直鎖状ブチル基結合の
ブチルトヨパール（前出）を用いこれを径０　、７　ｃ
ｍ、長さ３ｃｍのカラムに充填した後、８％（ｗ／Ｖ）
の硫酸ソーダ水溶液で平衡化した。

コノカラムニ上記ｐｒｏＵＫ溶液を１０ｍｘ／ｌｌ１ｉ
ｎノ流速で通過させｐｒｏＵＫを吸着させた。ついでカ
ラムを８％硫酸ソーダ水溶液４ｍｌ、０．６！ｌ；（ｖ
／ｖ）　モノエタノールアミン／塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）　９．５ｎｌ！で順次洗浄した。

ｐｒｏｗｌにの溶出は５％（Ｖ／Ｖ）モノエタノールア
ミン／塩酸緩衝液（ｐＨ１０，０）　８　ｍｌで溶出し
た。

コノとき得られたｐｒｏＵＫの比活性は５７００００７
ｍｇ、活性の回収率は６６＊であった。

精製のパターンは表１に示す。

表　　　１ 実施例２ 実施例１と同様に調製した原液２００＋ｎＱに硫安１４
ｇを添加して３０分攪拌した後にセライト５ｇを加えて
さらに２時間攪拌した。

ｒ紙で一過してｒ液をとり、実施例１と同じカラムに通
過させてｐｒｏＵＫを吸着させた。

Ｏ，ａ９ｇモノエタノールアミン／塩酸緩衝液（ｐＨ９
，０）　２０ｍ１でカラムを洗浄したのちに６％モノエ
タノールアミン／塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）１８ｍｆｉ
でｐｒｏＵにを溶出した。得られたｐｒｏＵにの比活性
は５９００００／ｍｇ、活性の回収率は２８％であった
。精製のパターンは表２に示す。

表　　　２ 実施例３ ｐｒｏＵに遺伝子を組み込んだ組み換え体大腸菌を培養
し菌体をゴーリンホモジナイザーで破砕した。この懸濁
液１．４℃に、８Ｍ塩酸グアニジン水溶液を１．４　ｆ
ｌ加えてｐｒｏＵにを可溶化した後に、酸化型グルタチ
オン０．０２ｍＪｉ１元型グルタチオン０．２ｍＭを含
むｐＨ８の緩衝液で４倍に稀釈することによりｐｒｏｌ
ｌＫを再構造化させた。このｐｒｏＵＫ溶液に硫安を２
５％飽和になるように加えて生じた沈澱を一過して除去
し、さらに硫安を加えて６０％飽和としてｐｒｏｌｌＫ
を沈澱させた。この沈澱を回収し、その一部分を７％（
ｗ／Ｖ）の硫安溶液に再溶解させて原料溶液とした。

アルキル基結合高分子ゲルとしてブチルトヨパール（前
出）を用い、これを直径０．９ｃｍ、長さ１０ｃ＋ｎの
カラムにバッキングし、水で平衡化させた。サンプルを
吸着させた後０．６＊モノエタノールアミン／塩酸緩衝
液（ｐＨ９，５）　２００ｍ文で夾雑物を溶出した後に
６％モノエタノールアミン／塩酸緩衝液（ｐＨ９，５）
によりｐｒｏｔｌＫの溶出を行った。このときの流速は
２　ｍｕ／ｍｉｎで行った。ここで得られたｐｒｏＵＫ
の比活性は９１０００ｔｌハ２６０、活性の回収率は６
２％であった。

使用後のカラムは水と苛性ソーダを交互に流すことによ
り洗浄した。

このときの精製パターンを表３に示す。

表　　　３ ［発明の効果コ 本発明方法により、菌体に生産されたｐｒｏＬＩＫを高
度に精製することができ、宿主細胞由来の夾雑蛋白質や
発熱性物質を高度に除去することができる。またこれら
は非常に簡便な操作で行なうことができるという効果が
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　菌体に生産させたウロキナーゼ様酵素の前駆体をア
   ルキル基を結合させた高分子ゲルに吸着させて分別溶出
   することを特徴とするウロキナーゼ様酵素前駆体の精製
   法。 ２　菌体がウロキナーゼ様酵素前駆体の遺伝子を組み込
   んだ組み換え体大腸菌である請求項１に記載のウロキナ
   ーゼ様酵素前駆体の精製法。 ３　ウロキナーゼ様酵素前駆体の分別溶出が溶出溶液中
   のアミン系有機溶媒濃度を調節することによる請求項１
   又は２記載のウロキナーゼ様酵素前駆体の精製法。