JPH01245146A - 酵素活性連続計測用バイオセンサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素活性連続計測用バイオセンサ、特にイオ
ン選択性電極、酵素電極等の感応電極を内蔵した酵素活
性連続計測用バイオセンサに関する。

〔従来の技術〕

現在、多くの領域で酵素が利用されているが、その場合
には酵素の活性を知ることが重要である。

また、医療分野では、人間等の体液中に存在する酵素に
ついて、その活性を計測し、該酵素の増減を調べること
により病態を診断する方法が広く用いられている。従っ
て、この場合も、酵素の活性を精確に、しかも迅速に知
ることが重要である。

上記のような酵素の活性を知る方法としては、例えば、
酸素電極等を用いて酵素の活性を計測する方法が知られ
ている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、上記の酸素電極等を用いる方式では、試
料液を調製するための前処理に長時間を要し、また、計
測のための操作が煩雑である等の問題があった。

従って、本発明の目的は、酵素の活性を、迅速且つ簡便
に計測でき、しかも連続して計測できる酵素活性連続計
測用バイオセンサを提供することにある。

［課題を解決するための手段〕 本発明は、基質導入部及び該基質導入部に多孔質膜を介
して連接され且つ感応電極が挿入されている試料導入部
を備え、上記基質導入部にはバッファに溶解されている
基質を連続導入する基質導入手段が接続され、且つ上記
試料導入部には被検酵素含有試料をキャリアと共に導入
する試料導入手段が接続されていることを特徴とする酵
素活性連続計測用バイオセンサを提供するものである。

〔作用〕

上記構成からなる酵素活性連続計測用バイオセンサによ
れば、上記多孔質膜を通して、一定量の基質が試料導入
部に供給・拡散された状態を定常的に形成することがで
きるため、該試料導入部に被検酵素を含有する試料を導
入することにより、上記試料導入部において該被検酵素
が関与する上記基質の反応を起こさせることができ、し
かもその際の反応の進行状況を反応系の変化から上記感
応電極で検出できるので、該検出結果から上記試料中の
被検酵素の活性を計測することが可能となる。従って、
キャリアの上流位置に試料を注入するだけで、該試料に
含有されている被検酵素の活性を、迅速且つ簡便に、し
かも連続して計測することが可能となる。そして、適切
な種類の基質及び感応電極等を選択使用することにより
、任意の酵素についてその活性を計測することが可能と
なる。

〔実施例〕

以下、本発明の好ましい実施例を図面に基づいて説明す
る。

第１図は本発明の一実施例である酵素活性連続計測用バ
イオセンサを示す概略説明図、第２図は上記酵素活性連
続計測用バイオセンサの要部を拡大して示す概略断面図
である。

本実施例の酵素活性連続計測用バイオセンサは、第２図
に示すように、その本体の外殻が筒状容器１で構成され
ており、該筒状容器１の下端部には基質導入部２が形成
され、該基質導入部２の上部には感応電極３が挿入され
ている試料導入部４が連接され、しかも上記基質導入部
２と試料導入部４との間には多孔質膜５が介在され、該
多孔質膜５により上記両導入部２及び４が仕切られてい
る。

そして、上記筒状容器ｌと上記感応電極３との間は該感
応電極３に周回されている０−リング６でシールされて
いる。そして、本実施例では、上記感応電極３が、イオ
ン選択性電極の−っである酸素電極である。

また、上記基質導入部２には、導入口２ａ及び排出口２
ｂが互いに対向する位置に設けられており、該導入口２
ａにはバッファに溶解されている基質を連続導入する基
質導入手段が接続されている。そして、上記試料導入部
４にも、導入口４ａ及び排出口４ｂが互いに対向する位
置に設けられており、該導入口２ａには被検酵素含有試
料をキャリアと共に導入する試料導入手段が接続されて
いる。

本実施例では、第１図に示すように上記基質導入手段が
、恒温水槽７に浸漬されているバッファ（緩衝液）貯留
部８と、該バッファ貯留部８から上記基質導入部２ヘバ
ツフアを供給するための管９と、咳管９に連結されてい
るポンプ１０とから構成されている。また、上記試料導
入手段も、恒温水槽７ａに浸漬されているキャリア貯留
部８ａと、該キャリア貯留部８ａから上記試料導入部４
ヘキ苓リアを供給するための管９ａと、該管９ａに連結
されているポンプｌｏａとから構成されている。更に、
上記管９ａには、試料を測定系に供給するための試料注
入部１１が設けられている。

尚、実施例では、排出口４ｂに接続されている管にポン
プ１０ｂが設けられている。

また、上記バッファ貯留部８及びキャリア貯留部８ａに
は、それぞれ貯留されているバッファ及びキャリアを酸
素で飽和するために、図示するように空気が吹き込まれ
ている。

次に、本実施例の作用を説明する。

先ず、バッファ貯留部８に貯留されているバッファ（基
質が所定１度で溶解されている）をポンプｌＯで、常時
、一定の流速で上記基質導入部２に導入しておくと同時
に、キャリア貯留部８ａに貯留されているキャリア用の
バッファをもポンプ１０ａで、常時、一定の流速で上記
試料導入部４に導入しておくことにより定常状態を形成
する。

尚、上記の基質溶解用及びキャリア用の何れのバッファ
も、被検酵素の種類と使用する基質との組合せに応じた
適切なものが用いられる。

その後、キャリアの上流に位置する管９ａに設けられて
いる試料注入部１１から被検酵素を含有する試料（被検
酵素含有試料）をキャリア中に注入し、該試料をキャリ
アと共に上記試料導入部４に導入する。

上記定常状態においては、上記多孔質１１＊５を通して
、一定量の基質が試料導入部４に透過・拡散された状態
が定常的に形成されている。換言すれば、上記試料導入
部４を流れるバッファ（キャリア）には常に一定の濃度
の基質が溶存している状態が形成されている。

従って、上記の如く、上記注入部１１から試料を注入し
、該試料を上記試料導入部４に導入することにより、該
試料導入部４において試料に含有されている被検酵素が
関与する上記基質と溶存酸素との反応を起こさせること
ができ、しかもその際の反応の進行状況を上記酸素電極
でバッファΦに溶存している酸素量、即ち酸素減少量を
容易に検出でき、その検出結果から上記試料中の被検酵
素の活性を計測することが可能となる。

上述した如く、本実施例の酵素活性連続計測用バイオセ
ンサを用いることにより、キャリアの上流位置に試料を
注入するだけで、該試料に含有されている被検酵素の活
性を、迅速且つ簡便に、しかも連続して計測することが
可能となる。

本発明の酵素活性連続計測用バイオセンサについて更に
詳述すると、基質導入部２と試料導入部４との間の多孔
質膜としては、該試料導入部４に基質を透過し且つ拡散
する機能を備えたものであれば、′その材料、厚さ及び
孔径等には特に制限はなく、種々変更使用することがで
きることはいうまでもないが、例えば、メンブランフィ
ルタ−１透析膜等を利用でき、材料としてはポリカーボ
ネイト、ポリエステル等の親水性ポリマーのほうがフッ
素樹脂等の疎水性ポリマーより好ましい、但し、これに
限るものではない。

また、基質が溶解されているバッファは、常に一定の濃
度の基質が含まれいることが重要であるが、試料導入部
４に透過・拡散して消費される基質の量に比ベバッファ
に溶解されている基質の濃度が十分に高い場合には、該
バッファを一回の使用の後に廃棄するのではなく、循環
させて繰り返して使用することも可能である。また、上
記キャリア用のバッファとしては、通常、上記基質を溶
解するために使用するバッファと同一であるが、異なっ
ていてもよい。

更に、酵素活性連続計測用バイオセンサに適用される基
質導入手段及び試料導入手段は、それぞれ第１図に示し
た前記構成に限るものでなく、実質的に同様の機能を有
するものであれば種々変更可能であることはいうまでも
ない。

以上、本発明を実施例に基づいて詳細に説明してきたが
、本発明の酵素活性連続計測用バイオセンサは前記実施
例に示したものに限るものでないことはいうまでもない
。

例えば、感応電極としては、酵素電極に限らず他のイオ
ン選択性電極であっても、又は酵素電極等であってもよ
い。

感応電極として酵素電極を用いる酵素活性連続計測用バ
イオセンサの好ましい実施例を、第３図に基づいて説明
する。

上記第３図に要部を拡大して示す実施例の酵素活性連続
計測用バイオセンサは、後に説明する実験例２に通用し
て有効なものであり、感応電極（酵素電極）３は、前記
実施例と同様の酸素電極の先端に固定化酵素１２を配し
、該固定化酵素１２を、０−リング６で押さえ付けられ
ている分子透過性の膜１３で覆い且つ固定してなるもの
である。

上記固定化酵素１２を構成する酵素の種類及びその固定
化法等には特に制限はない、また、上記の分子透過性の
ｙ！１３にも特に制限はなく、例えば、メンブランフィ
ルタ−１透析膜又は限外濾過膜等の測定対象分子が透過
する性質を有している模を挙げることができる。

次に、本発明の酵素活性連続計測用バイオセンサについ
て、該センサーを用いて酵素の活性の計測を行う実験例
を挙げて具体的に説明する。

（実験例１） 酵素活性連続計測用バイオセンサとしては、要部を第２
図に示したものを用い、下記の条件の下でグルコースオ
キシダーゼ（酵素）の活性の計測を行った。

尚、上記センサの試料導入部４においては、次の（１１
式に示すようにグルコースの酸化反応が起こり、その際
にバッファ中の溶存酸素が消費され、減少する変化が起
こっている。この溶存酸素の減少量が酸素電極により測
定されるものである。

グルコース＋酸素 グルコノラクトン十過酸化水素　　　（１）計測条件 キャリア用バッファ ’Ｊ　７ｍａｉＥ液（０，０５Ｍ）　　　ｐＨ７，８温
度　　　　　　　　　　　　３５℃ 流速　　　　　　　人口：　０．７３　ｍｌ／５ｈｉｎ
。

出口：　０．８７ｍｌ／ｗｉｎ。

基質溶解用バッファ リン酸緩衝液（０，０５Ｍ）　　　ｐＨ７，８温度　　
　　　　　　　　　　３５℃ 流速　　　　　　　　　　０．２７ｍｌ／ｓｉｎ。

基質（グルコース）濃度　　　　１．０Ｍ多孔質膜　　
　　　　ポリカーボネート・ポリエステル製膜 孔径：２．０μｍ 上記条件の下で、試料注入部１１からグルコースオキシ
ダーゼの含有量の異なる試料を注入し、その際の試料に
含有されているグルコースオキシダーゼの単位量を横軸
に、レコーダ（図示せず）に記録された電流減少値（ピ
ーク高）を縦軸に採って両者の関係を表したのが第４図
に示したグラフである。尚、−回の計測に要した時間は
約１０分であった。

第４図から明らかなように、上記電流減少値とグルコー
スオキシダーゼの含有量との間には明確な相関性が認め
られ、それ故に上記酵素活性連続計測用バイオセンサを
用いることにより、グルコースオキシダーゼの活性を迅
速且つ簡便に計測することができることが分かった。

（実験例２） 酵素活性連続計測用バイオセンサとしては、要部を第３
図に示したものを用い、下記の条件の下でＬ　Ｄ　Ｈ（
Ｌａｃｔａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｚｅ　：酵素
）の活性の計測を行った。

尚、上記センサの試料導入部４においては、次の（２）
式に示すように乳酸の税水素反応によりピルビン酸が生
成する反応が起こり、このピルビン酸を酵素電極で測定
することにより、上記ＬＤＨの活性を計測するものであ
る。ここで使用される酵素電極としては、ピルビン酸酸
化酵素（ｐｙｒｕｖａｔｅｏｘｔｄａｓｅ）が固定され
た固定化酵素１２が酸素電極の先端に配されているもの
であり、該酵素電極の内部に位置するバッファ中では、
次の（３）式に示す反応が起こり、溶存酸素が消費され
、減少する変化が起こりている。この溶存酸素の減少量
が前記実験例１の場合と同様に酸素電極により測定され
るものである。

乳酸＋Ｎ　Ａ　Ｄ　−−！− ピルビン酸十Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ（２１ ここで、ＮＡＤはｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ−ａｄｅｎ
ｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅであり、ＮＡＤＨはそ
の還元型である。

ピルビン酸＋酸素 アセチルリン酸＋酢酸十ＣＯ，＋　Ｈ，０２＋３１計測
条件 キャリア用バッファ リン酸緩衝液（０，０５Ｍ）　　　ｐＨ７，０温度　　
　　　　　　　　　　３５℃ 流速　　　　　　　人口：　０．７３＋ｍｌ／ｍｉｎ。

出口：　０．８１　ｍｌ／５ｈｉｎ。

基質溶解用バッファ リン酸緩衝液（０，０５Ｍ）　　　ｐＨ７，０温度　　
　　　　　　　　　　３５℃ 流速　　　　　　　　　　０．２７　ｍｌ／ｓｉｎ。

基質（乳酸）濃度　　　　　　　１．０Ｍ多孔質膜　　
　　　　ポリカーボネート・ボリエステル製膜 孔径；２．０μｍ 固定化酵素の量：　　　　　　　　　４０ｕｎｉｔ分子
透過性の膜：　　　メンブランフィルタ−（孔径２μｍ
） 上記条件の下で、前記実験例の場合と同様に、試料注入
部１１からＬＤＨの含有量の異なる試料を注入し、その
際の試料に含有されているＬＤＨの単位量を横軸に、レ
コーダ（図示せず）に記録された電流減少値（ピーク高
）を縦軸に採って両者の関係を表したのが第５図に示し
たグラフである。

第５図から明らかなように、上記電流減少値とＬＤＨの
含有量との間にも明確な相関性が認められ、それ故に上
記酵素活性連続計測用バイオセンサを用いることにより
、グルコースオキシダーゼの活性を迅速且つ簡便に計測
することができるたとが分かった。

〔発明の効果〕

本発明の酵素活性連続計測用バイオセンサは、酵素の活
性を、迅速且つ簡便に計測でき、しかも連続して計測で
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例である酵素活性連続計測用バ
イオセンサを示す概略説明図、第２図は上記酵素活性連
続計測用バイオセンサの要部を拡大して示す概略断面図
、第３図は他の実施例の要部を拡大して示す概略断面図
、第４図及び第５図はそれぞれ酵素活性連続計測用バイ
オセンサを用いて行った実験結果をしめずグラフである
。 １・・・筒状容器　　２・・・基質導入部３・・・感応
電極　　４・・・試料導入部５・・・多孔質膜 特許出願人　　　　　　　大洋漁業株式会社第２図　　
　　第３図 グルコースオキシダーゼ活性（Ｕ） 乳酸脱水素酵素活性（Ｕ）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質導入部及び該基質導入部に多孔質膜を介して
   連接され且つ感応電極が挿入されている試料導入部を備
   え、上記基質導入部にはバッファに溶解されている基質
   を連続導入する基質導入手段が接続され、且つ上記試料
   導入部には被検酵素含有試料をキャリアと共に導入する
   試料導入手段が接続されていることを特徴とする酵素活
   性連続計測用バイオセンサ。
2. （２）上記感応電極が、イオン選択性電極又は酵素電極
   である請求項（１）記載の酵素活性連続計測用バイオセ
   ンサ。