JPH01243993A

JPH01243993A - 苔類の細胞培養によるエイコサペンタエン酸及びそれを含有する脂質の製造方法

Info

Publication number: JPH01243993A
Application number: JP63068219A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Suzuki; 賢一鈴木; Yoshiji Shinmen; 新免　芳史; Kenji Kato; 加藤　研治
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1988-03-24
Filing date: 1988-03-24
Publication date: 1989-09-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、苔類を用いるエイコサペンタエン酸（以後Ｅ
ＰＡという場合がある）の新規な製造方法に関する。

〔従来技術〕

従来からＥＰＡの製造方法としては、魚油又はある種の
藻類より抽出、精製する方法が用いられている。しかし
ながら、いずれの方法においても夾雑する他の不飽和脂
肪酸が多く、高純度のＥＰＡを得ることは困難である。

また、ＥＰＡは一部のコケ植物に含まれていることが知
られており、レプトブリュウム（Ｌｅｐｔｏ−ｂｒｙｕ
ｍ）属に属する膵類から誘導される培養細胞群を培養し
、培養細胞群からＥＰＡを含有るす脂質を抽出するＥＰ
Ａの製造方法が報告されている（巳、Ｈａｒｔｍａｎｎ
、ｅｔａｌ、、ＦＥＢＳ　　ＬＥＴＴｔＥＲ，Ｖｏｌ、
１９８．Ｎｏ、１゜ｐｐ５１−５５　（１９８６）が、
培養細胞群の発育が悪＜ＥＰＡの採取量は少ない。

なお、マルカンティア属苔類の培養細胞を用いるＥＰＡ
の製造方法は知られていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、マルカンティア属苔類から誘導された培養細
胞群を使用し、単純な工程で高純度のＥＰＡを又はそれ
を含有する脂質を大量に製造することができる方法を提
供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

上記の目的は、マルカンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔ　ｉ
ａ　）漠に属する苔類から誘導される培養細胞群を高増
殖律で培養し、培養細胞群からエイコサベンクエン酸を
含有する脂質を得るか、又はこの脂質から高純度のエイ
コサベンクエン酸を採取することを特徴とするエイコサ
ベンクエン酸又はそれを含有する脂質の製造方法により
達成される。

〔発明の効果〕

本発明では、マルカンティア属苔類の培養細胞群を高増
殖律で培養することにより、前記のレプトブリュウム属
蘇類の培養細胞群に比べて半分の培養日数で約１０倍の
培養細胞を得、さらに乾燥細胞光たりのＥＰＡ含有量も
約２倍に増加したことから、約２０倍のＥＰＡを短期間
で採取することに成功した。

また、マルカンティア属培養細胞に含まれる脂質には、
その全脂肪酸の４．０〜８．０％のＥＰＡが含まれてお
り、その他は、パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸
、リルン酸等の飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸が大部分で
ある。従って、マルカンティア属培養細胞は他にドコサ
ヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を大量に含む魚油よ
りも、精製の点でＥＰＡ供給源として優れている。

〔具体的な説明〕

本発明においては、使用する苔類としては、マルカンテ
ィア属に属し、ＥＰＡ生産能を有する苔類であれば全て
使用できる。このような苔類として、例えばマルカンテ
ィア・ポリモーファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ　ｐｏｌｙ
ｒｎｏｒｐｈａ和名；ゼニゴケ）やマルカンティア・ト
サナ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ　ｔｏｓａｎａ和名；トサ
ノゼニゴケ）等を挙げることができる。これらの苔類は
、平地、とくに人家に近いところの上玉や岩上に群生し
ており、容易に入手できる。

マルカンティア属苔類からカルスを誘導するには一般的
な公知の手法が適用できる。即ち、子嚢中に含まれる胞
子を無菌状態で発芽させ、得られた原糸体あるいは配偶
体を既知の培地、例えばＭｕｒａｓｉｇｅ−３ｋｏｏｇ
（ＭＳ）寒天培地に静置、培養してカルスを得る。また
、無性芽から直接カルスを誘導してもよい。培地は他に
、Ｋｎｏｐ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｈｅ１ｌｅｒ培地の
いずれでもよく、またこれらの培地に限定することなく
公知のどの培地を使用することもでき、それらの基本組
成を適宜改変してもよい。培地には、ビタミン類として
ニコチン酸アミド、チアミン塩酸塩、イノシトール等、
糖及び糖アルコール類としてグリコース、ラムノース、
マンニトール等、有機酸としてリンゴ酸、フマル酸、ク
エン酸等をそれぞれ必要に応じて適当量を添加する。ま
た、生長調整物質としてオニキシン類、例えば２．４−
ジクロロフェノキシ酢酸、インドール酢酸等やサイトカ
イニン類、例えばカイネチン、ベンジルアデニン等、ま
たジベレリンとしてＧＡ、等を適宜組み合わせて用い、
ココナツツミルク、バナナ汁、イーストエキス、ペプト
ン等天然抽出物も適宜加え得る。さらに、炭化水素、脂
肪酸、脂肪酸塩又は油脂を添加しても良い。明所または
暗所で２０〜３０℃の条件で培養することにより１〜３
週間後にカルスが誘導される。誘導されたカルスは緑色
を呈しており、細胞乾重量の約２％に相当する葉緑素を
含んでいる。

得られたカルスは、そのままでは生長が遅いので、同様
の組成の液体培地に移し、１．０００〜１０、０００ル
クスの照明下に往復振盪培養、回転培養又は通気培養す
ることにより、その生長を著しく増加することができる
。光照射下で炭酸ガスを唯一の炭素源とする無機培地で
培養することにより、光合成的独立栄養生長を行わせる
こともでき、炭素源として糖、例えばグリコース等を添
加し培養する光混合栄養生長を行わせることもできる。

この様にして得られる培養細胞を約２週間毎に培地をと
りかえ継代培養を重ねて、性質の安定化した培養細胞を
得る。

培養細胞より直接ＥＰＡを採取する場合には、例えば次
のようにして行う。培養細胞はそのままの状態でも、細
胞を破砕した状態でも抽出を行うことができるが、好ま
しくは、水又はメタノール・クロロホルム等の有機溶媒
中でホモジナイザー等により、破砕してから抽出を行う
。培養細胞又は培養細胞のホモジネートは好ましくは乾
燥する。

乾燥は凍結乾燥、風乾等によって行うことができる。乾
燥物は、好ましくは窒素気流下で有機溶媒によって抽出
処理する。有機溶媒としてはエーテノヘヘキサン、メタ
ノール、エタノーノヘクロロホルム、ジクロロメタン、
石油エーテル等を用いることができ、またメタノールと
石油エーテルの交互抽出や、クロロホルム−メタノール
−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果
を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留
去することにより、高濃度のＥＰＡを含有した脂質が得
られる。

また、上記の方法に代えて湿培養細胞又は湿培養細胞ホ
モジネートを用いて抽出を行うことができる。この場合
にはメタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶
媒、又はこれらと水及び他の溶媒とから成る水に対して
相溶性の混合溶媒を使用する。その他の手順は上記と同
様である。

上記のようにして得られた脂質中には、ＥＰＡが脂質化
合物、例えば脂肪の構成成分として含まれているこれら
を、直接分離することもできるが、低級アルコールとの
エステル、例えばエイコサペンタエン酸メチルとして分
離するのが好ましい。

このようなエステルにすることにより、他の脂質成分か
ら容易に分離することができ、また、培養細胞中に生成
する他の脂肪酸、例えばバルミチン酸、オレイン酸、リ
ノール酸すルン酸等（これらも、ＥＰＡのエステル化に
際してエステル化される）から容易に分離することがで
きる。例えばＥＰＡのメチルエステルを得るには、前記
の抽出脂質を無水メタノール−塩酸５％〜１０％、ＢＦ
３−メタノール１０％〜５０％等により、室温にて１〜
２４時間処理するのが好ましい。

前記の処理液からエイコサベンクエン酸メチルエステル
を回収するにはヘキサン、エーテノヘ酢酸エチル等の有
機溶媒で抽出するのが好ましい。

次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し
、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより主
として脂肪酸エステルから成る混合物が得られる。この
混合物中には、目的とするエイコサペンタエン酸メチル
エステルの他に、バルミチン酸メチルエステル、オレイ
ン酸メチルエステル、リレール酸メチルエステル、リル
ン酸メチルエステル等が含まれている。これらの脂肪酸
メチルエステル混合物からエイコサペンタエン酸メチル
エステルを単離するには、カラムクロマトグラフィー、
低温結晶化法、尿素包接体法等を、単独で、又は組み合
わせて使用することができる。

こうして単離されたエイコサベンクエン酸メチルからＥ
ＰＡを得るには、アルカリで加水分解しこ後、エーテノ
ペ酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。

また、ＥＰＡをそのメチルエステルを経ないで採取する
には、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸
化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、この
分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法
により抽出・精製することができる。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明におけるＥＰＡの製造方法は、決してこれ
らの例に限られるものではない。

実施例１　ゼニゴケ培養細胞の調製ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈ
ａ　）の杯状体をイオン交換水で十分洗浄後、塩化ベン
ザルコニウム水溶液（０，１％）と次亜塩素酸ナトリウ
ム水溶液（３％）を用い殺菌したのち滅菌水で十分洗浄
した。

この杯状体に形成されている無性芽をＫｎｏｐ寒天培地
に静置した。ここで用いたＫｎｏｐ寒天培地にはショ糖
（２％）、インドール酢酸（４ｐｐｍ）およびジベレリ
ン（ＧＡ３）　（６ｐｐｍ）をさらに添加した。このよ
うな寒天培地で、明所または暗所の条件下で培養するこ
とにより、２週間後にカルスが誘導された。

このカルスを！Ｊｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｓｋｏｏｇ改変液
体培地（ＭＳＫ−１）に移し、３．０００ルクスの照明
した２５℃往復振盪培養した。ここで用いたＭＳＫ−１
培地は！、ｌｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｓｋｏｏｇ培地の無機
塩に炭素源としてグリコース（２％）を、有機酸として
ピルビン酸ナトリウム（２０ｐｐｍ）、クエン酸、フマ
ル酸、リンゴ酸（それぞれ４０ｐｐｍ）を糖及び糖アル
コール類トシてレブロース、リボース、キシロース、マ
ンノース、ラムノース、セルビオース、マンニトール、
ソルビトール（それぞれ２．５　ｐｐｍ）を、ビタミン
類としてイノシトール（１００ｐｐｍ）　、ニコチン酸
アミド、ピリドキシン塩酸塩、チアミン塩酸塩、パント
テン酸カルシウム、塩化コリン（それぞれ１ｐｐｍ）、
葉酸（０，４ｐｐｍ）、アスコルビン酸（２ｐｐｍ）、
リホフラビン（０，２ｐｐｍ）、Ｐ−アミノ安息香酸、
ジアノコバラミン（それぞれ０．０２ｐｐｍ）　、ビチ
オン（０，０ｉｐｐｍ）を、生長調製物質として２．４
−ジクロロフェノキシ酢酸（１ｐｐｍ）をそれぞれ添加
した。

培養細胞は、安定化するまで２週間毎に上記と同様の組
成を有する培地に植え継いだ。

実施例２　　ＥＰＡの製造実施例１で得られた細胞のうち９０ｍｇ（乾燥型）の細
胞を、実施例１に示した新鮮な液体培地１００−／フラ
スコに植えかえ同様の条件で１０日間培養した。得られ
た培養細胞群を濾過により細胞と培地に分離した後、細
胞を風乾した。これにより１．５ｇの乾燥培養細胞を得
た。この細胞より、クロロ・ホルム−メタノール−水の
一層系の溶媒を用いる旧ｉｇｈ　＆　Ｄｙｅｒの抽出法
によって総脂質を抽出したところ、１３５ｍｇの脂質が
得られた。この脂質を無水メタノール−塩酸（９５：　
５　）を用いて、２０℃にて３時間処理することによっ
てメチルエステル化し、エーテルで抽出して９０ｍｇの
脂肪酸メチルを得た。この脂肪酸メチルの組成はガスク
ロマトグラフィーによに分析で、バルミチン酸メチル２
６．８％ニオレイン酸メチル１７．３％、リノール酸メ
チル１４．６％、リノール酸メチル２８．５％、アラキ
ドン酸メチル４．１％、エイコサペンタエン酸メチル６
．６％、そのイ也２．１％であることがＳ忍められた。

この混合脂肪酸メチルをカラムクロルトゲラフイーによ
って分離し、エイコサペンタエン酸メチル画分を分取し
、ロータリーエバポレーターによって溶媒を留去した結
果、４．５　ｍｇの精製されたエイコサペンタエン酸メ
チルを得た。本標品と市販のエイコサペンタエン酸メチ
ル標準サンプルについて、ガスクロマトグラフィー分析
、高速液体クロマトグラフィー分析、質量分析、及びＮ
ＭＲ分析によって比較を行なったところ、両者はいずれ
の分析においても一致した。精製前及び精製後のエイコ
サペンタエン酸メチル量は乾燥培養細胞当りそれぞれ４
　ｍｇ／　ｇ　、　３　ｍｇ／　ｇであった。これを常
法にしたがって加水分解することによりエイコサペンタ
エン酸を得る。

Claims

【特許請求の範囲】１、マルカンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）属に属す
る苔類から誘導される培養細胞群（カルス）を培地中で
培養し、培養細胞群からエイコサペンタエン酸を含有す
る脂質を生成せしめ、この脂質からエイコサペンタエン
酸を採取することを特徴とするエイコサペンタエン酸の
製造方法。２、マルカンティア（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ）属に属す
る苔類から誘導される培養細胞群（カルス）を培地中で
培養し、培養細胞群からエイコサペンタエン酸を含有す
る脂質を生成せしめ、これを採取することを特徴とする
エイコサペンタエン酸を含有する脂質の製造方法。