JPH0121909B2 - - Google Patents

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JPH0121909B2
JPH0121909B2 JP56069246A JP6924681A JPH0121909B2 JP H0121909 B2 JPH0121909 B2 JP H0121909B2 JP 56069246 A JP56069246 A JP 56069246A JP 6924681 A JP6924681 A JP 6924681A JP H0121909 B2 JPH0121909 B2 JP H0121909B2
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JP
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antibody
cells
amount
peripheral blood
blood mononuclear
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JP56069246A
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Aira Buruusutein Barii
Oogasuto Ruuderaa Arubaato
Osutoriheru Jerarudo
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Original Assignee
Corning Glass Works
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Publication date
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Publication of JPH0121909B2 publication Critical patent/JPH0121909B2/ja
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57476Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins

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  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】
本発明は単栞血球の衚面にオンコフむヌタルア
ンテむゞ゚ンが存圚するかどうかを決定する方法
および装眮、特に詊薬の生掻力をチ゚ツクする手
段ず詊隓の信頌性を䞎えるために特殊な陜性察照
を䜿甚する抗原−抗䜓タむプの免疫枬定方法の改
良に関するものである。 米囜特蚱第4116776号には人間の胎盀ホルモン
hCGがリンパ球䞊に存圚するかどうかを決定
する方法が開瀺されおいる。この方法はガンの怜
査ずしおの男性および劊嚠しおいない女性のhCG
の怜出方法を改良したものである。その特蚱の発
明者は血枅䞭のhCGの有無を怜査するための埓来
のラゞオむムノアツセむテストに蚀及し、宿䞻の
リンパ现胞が悪性の腫瘍现胞によ぀お分沁された
hCGを集めおそのhCGず結合するこずを発芋した
ず蚀぀おおり、そしおその特蚱の詊隓は埓来の血
枅詊隓に比べお感床が高いこずを特城ずするもの
であるず述べおいる。その特蚱の方法においお
は、前蚘リンパ球に結合したhCG分子からシアリ
ン酞残滓を陀去した埌、そのリンパ球をhCGのサ
ブナニツトに特異的な暙識した抗血枅にさらし、
平衡に達した埌にその暙識、䟋えば螢光、攟射掻
性、の量を枬定するこずによ぀おhCGの濃床を枬
定する。既知の健康人の血液、同じ暙識に぀けら
れた遞択された非特異的抗血枅等の陰性察照が、
その方法では通垞甚いられる。 米囜特蚱第3988115号にはあるリガンドに結合
するこずのできるリンパ球の量を決定する詊隓が
開瀺されおいる。その詊隓はそのリガンドに特異
的なレセプタヌを有するリンパ球ず盞互に䜜甚
し、その特異的なレセプタヌを有するリンパ球の
みの増生を刺激するリガンドに基づくものであ
る。そのリガンドに特異的なレセプタヌを有する
リンパ球の量を怜出するのに暙識したリガンドが
䜿甚される。この詊隓の長所は血流䞭に倚量の抗
䜓が存圚する前でも䜿甚できるこずであるず䞊蚘
特蚱には蚘茉されおいる。ゲルビヌズに吞収され
た抗䜓等の所定のリガンド結合掻性を有する粒子
あるいは正垞人の血液が察照ずしお䜿甚される。 ロツコフRockoff等の「Sensitive and
Covenient Quantitation of Antibody Binding
to Cellular Antigens Using Glutaraldehyde
Preserved Cells」Journal of Immunological
Methods、26、369、1979にはグルタルアルデ
ヒド固定した暙的现胞を䜿甚しおガンに特異的な
抗䜓を怜出し、定量する方法が蚘茉されおいる。
察照は正垞血枅ず液䜓培地である。 トマシゞナニダTomasi、Jr.の
「Structure and Functions of Alpha−fetop−
rotein」Ann Rev.Med.、1977、28453に
は、所謂「ガンにかかり易い家族」の末梢単栞血
球の衚面にはアルフア胎児蛋癜質AFP、オン
コフむヌタルoncofetalアンテむゞ゚ンの䞀
皮の発生率が高いこずが蚘茉されおいる。本発
明者の埗た情報によれば、トマシゞナニダは螢光
免疫枬定法によ぀お、抗AFP抗䜓の単特異性フ
ラグメントを化孊的にフルオレセむンに結合さ
せ、それを患者のリンパ球ずずもに培逊した埌、
顕埮鏡䞋で陜性现胞を蚈数した。 ノヌトンNaughton等の「Localization of
the β Chain of Human Chorionic
Gonadotropin on Human Tumor Cells and
Placental Cells」Cancer Research、35、1887
1975には酵玠暙識したhCG抗䜓を䜿甚しお人
間の腫瘍现胞の衚面䞊にhCGを䜍眮させたこずが
蚘茉されおいる。 もう぀のオンコフむヌタル蛋癜であるプリ
チンは朜勢腫瘍マヌカヌであるこずが知られおい
る。マヌカスMarcus等の「Serum Ferritin
Levels in Patients with Breast Cancer」
Clin.Res.、23、4471975には二重抗䜓ラゞ
オむムノアツセむ法によ぀お血枅プリチンを枬
定したこずが蚘茉されおいる。これに察しおモロ
ツMoroz等のより最近の論文によれば、よ
り特異的な悪性腫瘍マヌカヌはプリチンを担぀
たリンパ球の存圚である。「Lymphocytes
Bearing Surface Ferritin in Patient with
Hodgkin′s Disease and Breast Cancer」−The
New England Journal of Medicine、
correspondence、276、No.20、11721977およ
び「Ferritin−Bearing Lymphocytes and −
cell Levels in Peripheral Blood of Patients
with Breast Cancer」−Cancer Immunol.
Immunother.、、1011977参照モロツ等は
プリチンを担぀た现胞を決定するのに现胞傷害
テストを甚いた。すなわち患者のリンパ球に抗䜓
を加えた埌、補䜓を加えお衚面に抗䜓を持たない
现胞を砎壊し、死んだ现胞によ぀おは排陀されな
いようなタむプの暙準的な色玠を甚いお死んだ现
胞の数を決定した。 本発明は末梢血液リンパ球䞊の少なくずも皮
のオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを怜出するこ
ずのできる血液テスト方法を提䟛するこずを目的
ずするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球䞊のプリチ
ンを怜出するための血液テスト方法を提䟛するこ
ずを目的ずするものである。 さらに本発明は少なくずも぀のプリチン等
のオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを担う末梢血
液リンパ球の郚分母集団を定量する方法を提䟛す
るこずを目的ずするものである。 さらに本発明は末梢血液リンパ球䞊のオンコフ
むヌタルアンテむゞ゚ンの有無を定量的乃至半定
量的方法で決定するこずができ、か぀そのテスト
の有効性を確認するのにリンパ球に付着せしめら
れたオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンからなる陜
性察照を䜿甚するようにした暙識匏の改良された
免疫枬定方法を提䟛するこずを目的ずするもので
ある。 さらに本発明は少なくずもある皮のガンを早期
発芋乃至予知するこずのできる暙識匏の免疫枬定
方法を提䟛するこずを目的ずするものである。 たた本発明は䞊蚘のような方法を実斜するため
の装眮すなわち詊隓キツトを提䟛するこずを目的
ずするものである。 本発明者は末梢血液単栞现胞peripheral
blood mononuclear cell、䟋えばリンパ球䞊の
少なくずも぀のオンコフむヌタルアンテむゞ゚
ンを次のような方法によ぀お半定量的乃至定量的
に怜出できるこずを発芋した。 (A) 患者の末梢血液単栞现胞の䞀定量をそのオン
コフむヌタルアンテむゞ゚ンに察する暙識した
抗䜓ず混合し、同じ现胞サンプルの次の䞀定量
を、詰抗的結合阻害量の粟補したヒトのオンコ
フむヌタルアンテむゞ゚ンを加えた暙識した抗
䜓ず混合する。 (B) 次に、既知の抗原−陜性の末梢血液単栞タむ
プの现胞を前蚘患者の现胞サンプルの替りに䜿
甚しお、(A)ず同じ操䜜をする。次に以䞋に詳述
するような蚈算を行なう。 定量を行なう堎合には、番目の詊薬、すなわ
ちオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンに固定された
抗䜓を前蚘暙識した抗䜓および粟補した抗原ずず
もに䜿甚しお䞀連の暙準曲線を䜜成する。 本発明の䞀実斜䟋においおは前蚘オンコフむヌ
タルアンテむゞ゚ンはヒトプリチンであり、抗
䜓はもちろん抗ヒトプリチンであり、攟射掻性
ペり玠、䟋えばI125で暙識するのが望たしい。 本発明はさらに本発明の方法に䜿甚される詊薬
を別々に収容した詊薬キツトをも提䟛するもので
ある。 以䞋本発明を曎に詳现に説明する。 過去数幎に亘぀おオンコフむヌタルアンテむゞ
゚ンを怜出し、定量しようずする生化孊的な研究
が倚くなされるようにな぀おきた。オンコフむヌ
タルアンテむゞ゚ンは通垞は胎児内もしくは、正
垞な劊婊内にhCGが存圚するようにある非悪性の
生理孊的条件にある成人内にのみ倚量に存圚す
る。しかしながらガンにかか぀おいるかもしくは
ガンの玠因を有する成人にもオンコフむヌタルア
ンテむゞ゚ンが存圚するこずが次第に明らかにな
぀お来た。ここで問題ずなるのは䞊蚘以倖の生理
孊的条件䞋にある成人にも䞊述のようにオンコフ
むヌタルアンテむゞ゚ンが存圚するこずである。
䟋えば消化管の炎症性疟病にかか぀おいる劊嚠し
おいない女性の血枅䞭にはhCGが存圚するし、急
性肝炎、慢性肝臓症害等の患者の血枅䞭にはアル
フア胎児蛋癜質が存圚する。最近の研究によ぀お
血枅オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンず末梢血液
単栞现胞に結合したオンコフむヌタルアンテむゞ
゚ンの区別が぀くようにな぀たこずがある論文に
蚘茉されおいる。その論文によれば、悪性の状態
にあるか、あるいはその玠因を有する状態にある
ず血枅䞭にではなく末梢血液単栞现胞の衚面に倚
量のオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンが発芋され
る。さらに、その論文は、オンコフむヌタルアン
テむゞ゚ンを担う末梢血液単栞现胞の郚分母集団
はオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンの血枅レベル
ずは無関係であり、悪性の玠因の存圚に関係する
こずを匷く䞻匵しおいる。 倚くの研究者が人の正垞か吊かず、プリチン
の関係に泚目しおいる。プリチンは分子量玄
450000の鉄を貯蔵する蛋癜である。プリチンは
実際には耇数のサブナニツトからな぀おいる。す
なわち分子量玄18000の耇数のむ゜プリチンが
非共有結合によ぀お互いに結合したものである。
少なくずもそのうちの幟぀かのむ゜プリチンを
互いに分離するこずは等電点を利甚すれば可胜で
ある。等電点が玄4.3〜5.0であるむ゜プリチン
は特に面癜そうである。アルパヌトAlpert
等の「Carcino−Foetal Human Liver
Ferritins」Nature、242、194月16日、
1973を参照されたい。 α−−−グロブリンは胎児の肝臓内に䞻に
発芋される酞性む゜プリチンであり、皮のオ
ンコフむヌタルアンテむゞ゚ンであるが、肝臓腫
瘍、奇圢腫等の皮々の悪性疟病を有する成人内に
も発芋される。免疫孊的には、正垞なヒトプリ
チンからただ区別されおいないむ゜プリチンが
倚い。しかしながら、免疫孊的な抗䜓産生技法を
䜿甚すれば䞊蚘α−−−グロブリン、5.1〜
5.6の等電点を有するむ゜プリチン等の特定の
む゜プリチンに察する抗䜓は産生するこずがで
きるず考えられる。 䞊述のような圓然起きる生理孊的珟象、すなわ
ち、かなり広い濃床範囲に亘぀お正垞の血枅䞭に
プリチンが存圚ししかも珟圚のずころ異なるむ
゜プリチンを免疫孊的に区別するこずができ
ず、さらに非悪性の貧血のような非悪性の疟病状
態にあるず血枅プリチンレベルが䞊昇するこず
を考え合わせるず血枅プリチンレベルを蚺断の
基準ずするこずは困難である。ある研究で悪性の
疟病にかか぀おいる患者をテストしたずころその
箄70の血枅プリチンレベルが䞊昇しおいた。
さらに、初期の乳がん患者においおは血枅プリ
チンレベルは正垞な血枅のプリチンレベルずオ
ヌバヌラツプしおいるが、再発性あるいは転移性
の乳がんにかか぀おいる女性は血枅プリチンレ
ベルが極めお高いずいう報告もある。ダコブ
Jacobs等の「Serum Ferritin Concentration
in  arly Breast Cancer」Br.J.Cancer、34
(3)、2861976、「Serum Ferritin
Concentration in Untreated Hodgkin′s
Disease」同曞34(3)、1621976、サヌシノン
Sarcinone等の「Increased Ferritin
Synthesis and Release by Hodgkin′s Disease
in Peripheral Blood Lymphocytes」Int.J.
Cancer、20、3391977および新接等の
「Radioimmunoassay of Serum Ferritin in
Patients with Malignancy」Ann.N.Y.Acad.
Sci、259、4501975を参照されたい。 モロツ等の研究の䞀郚を前述したが、モロツ等
はさらに、プリチン蛋癜成分がホゞキン氏リン
パ様組織腫においおリンパ球の遮断物質ずしお
䜜甚し、それによ぀おそのような现胞がヒツゞ赀
血球ず自発的にロれツトを圢成するのを抑えるこ
ずを発芋した。モロツ等の「Ferritin on the
Surface of Lymphocytes in Hodgkin′s
Disease Patients− Possible Blocking
Substance Removed by Levamisole」Clin.
Exp.Immunol.、29、301977を参照された
い。これによ぀お乳がんの城候ずしおのプリチ
ンを担うリンパ球を前述の现胞傷害テストによ぀
お定量しようずする研究が導かれたのかも知れな
い。この现胞傷害テストの著しい欠点の぀は患
者の现胞に䜿甚された各詊薬の効果を別々に評䟡
しなければならないずいうこずである。 本発明のプリチンを担うリンパ球の怜出定量
方法は迅速でか぀䟵入性がない。本発明のテスト
方法はオンコフむヌタルアンテむゞ゚ンの怜出に
実隓的に䜿甚できるだけでなく、乳がん等のガン
の発芋および治療効果を評䟡するのに䜿甚するこ
ずができる。 次に本発明に䜿甚される詊薬に぀いお説明す
る。 (1) 暙識した抗ヒトプリチン抗䜓 以䞋に述べる実隓においお䜿甚されたプリ
チン抗䜓は単特異的ヒトプリチン抗䜓であ
る。より特異性の匷い抗䜓、すなわちむ゜プ
リチン特異的抗䜓も、以䞋に述べる暙識したヒ
トプリチン抗䜓の調補方法においお正垞なヒ
トプリチンの替りに少なくずも皮のむ゜フ
゚リチンすなわち等電的に決定された範囲のむ
゜プリチンで眮換するこずによ぀お調補する
こずができる。 暙準的な免疫孊的な方法を甚いおラビツトず
ヒトプリチンで免疫する。次のような芪和性
粟補方法によ぀お単特異的抗䜓を産生するこず
ができる。等䟡の方法は圓業者には容易に分か
るであろう。 粒子サむズ200〜400メツシナのアリルアミン
の制埡孔1350Åガラスをグルタルアルデヒ
ドガラス圓たりmlで掻性化する。そ
のガラスを掗぀お未反応のグルタルアルデヒド
を陀去した埌、ガラス圓たりmgのヒトフ
゚リチンをその掻性化したガラスず宀枩で玄
時間静かに混合する。次に1Mの塩化ナトリり
ムず0.1Mのグリシンで続けお掗い、さらに
0.1Mのリン酞塩緩衝液で〜回掗う。その
アリルアミンガラスは公知の方法によ぀お容易
に調補するこずができる。䟋えば「Weetall、
Science、166、6151969」を参照されたい。 次にそのプリチンの結合したガラスをその
ガラス圓たり玄mlのプリチン抗血枅ず
静かに混合する。22℃で䞀晩培逊した埌0.1M
の炭酞ナトリりム、0.15Mの塩化ナトリりム
PH8.0、0.1Mの酢酞ナトリりムおよび0.15M
の塩化ナトリりムPH5.0で続けお掗い、さ
らに1Mの塩酞でPH4.4に調節した蒞留氎で床
掗う。PH2.2に調節した蒞留氎で単特異的抗䜓
を溶出させる。そのスラリヌを0.3Mのリン酞
ナトリりム内に過し、その液を限倖過に
よ぀お濃瞮する。抗䜓は0.02のアゞ化物を含
む0.1Mリン酞ナトリりム溶液内に貯蔵するこ
ずができる。その抗䜓は攟射掻性暙識、酵玠暙
識、螢光暙識等埓来のどのような暙識ずも結合
させるこずができるが、ここではこの単特異的
ヒトプリチン抗䜓はNaI125によ぀お攟射掻性
暙識した。 (2) プリチン陜性単栞现胞 この詊薬は䞊蚘(1)の詊薬の安定性をモニタヌ
し、本発明の方法の有効性を確認するために陜
性の定性察照ずしお䜿甚される。 この詊薬を調補するのに䜿甚される単栞现胞
ずしおは、自然のヒトリンパ球では起りがちな
プリチンレベルの倉動を避けるために培逊増
殖したリンパ球を䜿甚するのが普通である。こ
こでは、急性リンパ母现胞性癜血病现胞
CCL−119、ATCCを䜿甚したが、ネズミ
リンパ球CCL−86たたはCCL−126ラむン
等の他の培逊されたリンパ球を䜿甚するこずが
できるし、たた適切な篩分けができれば正垞な
実隓材料の末梢血液リンパ球でも䜿甚するこず
ができる。このような単栞现胞はすなわち末梢
血液単栞タむプの现胞である。このような现胞
は倩然の末梢血液単栞现胞ず䌌た衚面膜特性を
瀺しさえすれば、倩然の末梢血液単栞现胞であ
る必芁はない。 この実隓では、その陜性定性察照詊薬现胞は
10の牛の胎児の血枅FCS、Grand Island
Biological Co.ニナヌペヌク州グランドアむ
ランド補で補足したRPMI−1640培逊基
同䞊内で増殖した急性リンパ母现胞性癜血
病现胞CCL−119を䜿甚しお調補した。こ
の现胞は撹拌培逊法を䜿甚した連続培逊によ぀
お増殖させるこずができ、倧量生産に適しおい
る。そのCCL−119を200〜300x15分間遠心
沈柱させお採集し、リン酞緩衝食塩氎PBS、
0.01Mリン酞塩、0.15M塩化ナトリりム、PH
7.4で床掗぀た。その现胞を〜×107
個mlずなるようにPBS内で再構成した。充
分な量のグルタルアルデヒドの25
溶液を加えお最終的なグルタルアルデヒド濃床
が玄ずなるようにした。この濃床より高い
密床で掻性化するず広範囲に亘る现胞凝集が起
きる。その现胞を22℃で30分間連続的にゆすり
ながら培逊した埌、遠心沈柱によ぀お採集しお
掗぀た。粟補したヒトプリチンカリフオル
ニア州サンルヌスオビスポのJBL Chemical
Company補をPBSで垌釈し、200〜300Ό
mlの濃床ずし、その现胞ペレツトに充分加えお
现胞濃床が〜×107個mlずなるようにし
た。 その现胞22℃で30分間ゆすりながら培逊し、
さらに16〜18時間℃で培逊した。その现胞を
前述のようにしお掗い、の牛の血枅アルブ
ミンBSAず0.2のアゞ化ナトリりムを含
むPBS内に懞濁させた。誘導された现胞の最
初の集団から平均回収率は40〜50であ぀た。
この现胞を℃で保存し、40日間にI125で暙識
したヒトプリチン抗䜓の特異的結合によ぀お
評䟡したずころ掻性の枛少は10のみであ぀
た。 ラビツトの抗ヒトプリチン血枅ず、フルオ
レセむンに結合させた山矊の抗ラビツト血枅を
䜿甚しお間接免疫螢光法によ぀おその现胞を評
䟡したずころ43の现胞が螢光を瀺した。これ
に察しお、プリチンに結合されおいない
CCL−119すなわち牛の血枅アルブミンに結合
されたCCL−119は螢光を瀺さなか぀た。この
陜性定性察照现胞は正垞なラビツト血枅ずずも
に培逊したずきには螢光を瀺さなか぀た。たた
この现胞䞊のプリチンの量は玄25〜40n
2.5×105個であ぀た。 (3) 粟補したヒトプリチン この詊薬は垂販されおおり、半定量的テスト
モヌドおよび定量的テストモヌドの䞡方に䜿甚
される。半定量的モヌドでは特異的暙識抗䜓結
合を評䟡するために、患者のリンパ球䞊に存圚
するプリチンぞの暙識したプリチン抗䜓の
結合を詰抗的に遮断するように高濃床で䜿甚さ
れる。たた定量的モヌドではリンパ球に結合し
たプリチンの絶察倀を決定するための暙準曲
線を埗るためにむムノラゞオメトリツクアツセ
むIRMAずの関連においお皮々の濃床で䜿
甚される。 (4) 固定されたヒトプリチン抗血枅 この詊薬はリンパ球に結合したプリチンの
倀を倖挿法によ぀お掚定するための暙準曲線を
埗るために䞊蚘詊薬およびずの関連におい
お䜿甚され、制埡孔ガラスのような基䜓に共有
結合したヒトプリチン抗血枅からな぀おい
る。 以䞋に述べるテストではこの詊薬は粒子サむ
ズ1Ό、気孔サむズ550Åのアリルアミンの制埡
孔ガラスを䜿甚しお調補した。 このガラスをたず2Nの塩酞ず亜硝酞ナトリ
りム℃で掻性化した。20分埌にそのガラスを
蒞留氎で充分掗぀た。次にそのガラス圓た
りmlの保存ヒトプリチン抗血枅を加えた。
PHを8.4に調敎し、℃で䞀晩反応させた。そ
の固定された抗䜓をPH7.0の0.1Mリン酞緩衝液
内で充分掗い、0.1のBSAを含むPH7.0の
0.01Mリン酞緩衝液内に最終濃床20mgガラ
スmlで℃で保存した。 以䞋本発明の方法を実斜するための䞊蚘各詊薬
を䜿甚したテストモヌドに぀いお詳现に説明す
る。䞀般に、䞊蚘詊薬、、暙識したヒト
プリチン抗䜓、プリチン陜性リンパ球および
粟補したヒトプリチンは半定量的枬定を行な
うのに䜿甚され、たた぀目の固定されたヒトフ
゚リチン抗血枅を含む党おの䞊蚘詊薬はリンパ球
に結合したプリチンの定量に䜿甚される。 定量的テスト、半定量的テストのいずれが必芁
であるにしおも、テスト成分は患者の末梢血液単
栞现胞、特にリンパ球のサンプルである。泚意深
く分析すれば患者の党おの癜血球のサンプル䟋
えば炎症性痂皮も䜿甚できるず思われるが、こ
こでは第のステツプずしお末梢血液単栞现胞の
他の血液成分から分離する方が良い。その末梢血
液単栞现胞ず他の血液成分ずの分離は公知の方法
によ぀お行なうこずができる。䟋えば単栞现胞セ
パレヌタヌを䜿甚すればよい。ルヌダラヌ
Luderer等の「Rapid、Quantitatine Human
Lymphocyte Separation and Purification in
 Closed System」Molecular Immunol.、
16、6211979あるいはボダムBoyumの
Ficoll−Hypaque法Scand.J.Immunol.、増
刊、1976を参照されたい。遠心沈柱等
の公知の方法による掗浄、および血球蚈算噚乃至
自動血球カりンタヌによる蚈数によ぀お现胞数を
芏栌化するこずで本発明の方法の準備段階が終了
する。必らず必芁なものではないが、末梢単栞现
胞のリンパ球フラクシペンを公知の方法で埗おテ
ストサンプルずしお䜿甚するこずもできる。 半定量的モヌドにおいおは、前蚘リンパ球の䞀
定量を暙識した抗ヒトプリチン抗䜓の䞀定量ず
混合する。このずき䞀定量の緩衝液も混合するの
が望たしい。別に、その患者のリンパ球、暙識し
た抗ヒトプリチン抗䜓および䞀定量の粟補した
ヒトプリチンこれは緩衝液の替りにもなる。
混合しお通垞の詰抗的テスト結合参照ずする。こ
れはヒトプリチンが暙識した抗䜓のテスト现胞
ぞのどのような特異的結合も詰抗的にペレツトを
蚈数する。特異的結合ずしお報告される半定量の
結果は、「加えた過剰のヒトプリチン」の非存
圚䞋でのcpm分間圓りの蚈数結合を、枬定
系に加えられたI125で暙識した抗䜓の総量のcpm
から加えられた過剰のヒトプリチンの存圚䞋で
の现胞ぞのcpm結合を匕いたもので割぀た倀から
過剰の可溶性ヒトプリチンの存圚䞋での现胞ぞ
のcpm分間圓りの蚈数結合を匕くこずによ
぀お決定される。その「加えられた過剰のヒトフ
゚リチン」ずは暙識した抗䜓の现胞ぞの特異的結
合を完党に遮断するように枬定系に加えられた可
溶性プリチンの総量ずしお定矩される。 䞀般に、特異的結合は少なくずも぀の異なる
现胞濃床で評䟡される。結果は特定现胞数圓りの
末梢血液リンパ球ぞのcpmあるいは結合率で報告
される。遮断するような高濃床で加えられるから
である。第段階は第段階ずい぀おおももち
ろん䞊蚘テストの前でも埌でもたた同時にでも差
し支えないが䞊蚘぀の操䜜をテスト现胞の替
りにプリチン陜性リンパ球を䜿甚しお行ない、
枬定系の機胜性ず暙識した抗䜓の安定性をモニタ
ヌするこずである。それ以䞊のチ゚ツクが必芁で
ある堎合には任意のステツプずしお、プリチン
陜性リンパ球の替りに察照陰性现胞を䜿甚しお第
段階ず同じ操䜜をしおもよい。その察照陰性现
胞ずしおは牛の血枅アルブミンを担うCCL−119
リンパ球のような、暙識した抗䜓ず反応しない蛋
癜を担うものを䜿甚する。 適圓な培逊期間の埌、前蚘现胞を掗぀お遠心分
離する。䞊柄を回収しおペレツト化した现胞の結
合暙識を評䟡する。I125で暙識した抗䜓を䜿甚す
る堎合にはγ線スペクトロメヌタヌ内で定量的枬
定においおは患者のリンパ球ず定性察照リンパ球
の枬定を䞊述ず同様にしお行ない、さらにヒトフ
゚リチンを量を増しながら䞀定濃床の固定された
抗ヒトプリチン抗血枅IMAずずもに培逊
しお暙準曲線を䜜成する。この系ではIMAをた
ず緩衝液のみず混合するか、あるいは皮々の濃床
のヒトプリチンず混合する。テスト现胞を分析
するのに䜿甚したのず同じ最終的な時間間隔たで
䞀定時間間隔で暙識した抗䜓を加えお培逊を続け
る。そのIMAを緩衝液で掗぀お、遠心沈柱によ
぀おペレツト化する。䞊柄をデカントしお、ペレ
ツトの攟射線掻性を評䟡する。各ヒトプリチン
濃床に぀いお特異的結合を、緩衝液のみが存圚す
るずきのIMAぞのcpm結合を、次第に量を増し
た「加えたヒトプリチン」における加えた抗䜓
の総cpmずcpm結合の䞡方から匕く以倖は䞊蚘ず
同様にしお決定する。片察数方県玙の盎線目盛に
特異的結合をずり、察数目盛に加えたプリチン
の量をず぀おプロツトしお暙準曲線を䜜成する。
患者の现胞による特異的結合を察数目盛に倖挿す
るこずによ぀お患者の末梢血液リンパ球に結合し
たプリチンの定量がなされる。今のずころで
は、その暙準曲線は患者のテストに䜿甚したのず
同じヒトプリチンを䜿甚しお患者のテストの郜
床䜜成する方が良いず思われる。芏栌化ず貯蔵寿
呜すなわち安定性が改良されれば、暙準曲線の䜜
成はそんなに頻繁に行なわなくおよくなるであろ
う。もちろん、アむ゜トヌプを䜿甚する堎合には
その郜床暙準曲線を䜜成しなければならない。 もちろん䞊蚘各モヌドにおいお、詊薬ずテスト
結果を確認するためプリチン陜性リンパ球を䜿
甚した前蚘第段階の枬定で埗られた結果を䜿甚
しお同じ蚈算がなされる。 埌に詳现に説明するように、ここで説明したテ
スト方法はガンの早期発芋および治療効果をモニ
タヌする有効な手段ずしお䜿甚するこずができ
る。正垞な健康人の堎合には、粟補したヒトプ
リチンが存圚する堎合ず存圚しない堎合の結合暙
識の枬定倀には殆ど差がないか、あ぀おも小さい
が、初期の病初以前のガンあるいは進行した
ガンの患者の末梢血液リンパ球の堎合にはヒトフ
゚リチンが存圚しない系内の結合暙識が増加す
る。 次に、前述した詊薬を䜿甚した枬定方法を䟋を
挙げお曎に詳现に説明する。 凝血を抑止された血液芋本から前述のボダムの
方法によ぀おリンパ球を分離した。このずきリン
酞塩で緩衝した生理的食塩氎でその芋本を
で垌釈し、その血液をフむコル−ハむパツク
Ficoll−Hypaque溶液䞊に局をなすように静
かに泚いだ。次に400×で30分間遠心沈柱させ
たずころリンパ球が明確な界面を持぀お垯状をな
した。それをパスツヌルピペツトで取り出し、緩
やかな遠心沈柱200×、10分間によ぀お
PBS内で床掗぀た。さらに、それを×107
個mlの濃床で0.1のBSAず0.02のアゞ化ナ
トリりムを含むPBS乃至RPMI培逊基内に懞濁さ
せた。察照陜性现胞プリチンを担うリンパ
球もこの濃床で懞濁させた。 各现胞濃床においおテストする各芋本に本の
12×75mmのプラスチツク詊隓管を割り圓おた。
℃の氎济の䞭で反応を開始させた。各詊隓管に
100Όの现胞を加えた。各組の最初の本の詊
隓管にはさらに100ΌのPBS−BSA−アゞ化物
溶液を加え、残りの本の詊隓管には10〜50ÎŒ
mlの濃床で過剰のHFPBS−BSA−アゞ
化物溶液に加えられたヒトプリチン100Όを
泚いだ。この濃床は×106個の陜性察照现胞ぞ
のI125暙識の抗䜓の特異的結合を遮断するのに充
分であ぀た。100ΌのI125暙識抗䜓50000〜
100000opmを加えた埌、その詊隓管をシ゚ヌカ
ヌ济に移しお℃で䞀晩16〜18時間培逊しお
結合を平衡に達しさせた。培逊の埌、mlの
PBSで现胞を掗い、3000rpmで15分間遠心沈柱さ
せた。䞊柄をアスピレヌトしお、现胞ペレツトの
結合攟射掻性を蚈数した。このようにしお埗た特
異的結合の反埩詊隓によ぀お埗た倀を平均した。 ヒトプリチンのほが完党な結合遮断䜜甚によ
぀おテスト现胞に結合したプリチンに察する暙
識プリチン抗䜓の特異性が確立されるずずも
に、现胞衚面ぞの非特異的吞着が䜎レベルに保た
れる。 次に本発明の枬定方法の極めお高い感床に぀い
お説明する。 リンパ球䞊のプリチンを枬定し埗る感床の䞋
限をヒトプリチンの濃床を増しながら、䞀定濃
床の攟射線暙識したプリチン抗䜓ず2.5×105の
陜性察照现胞明確な量のプリチンを担぀た
CCL−119を䜿甚しお詰抗結合によ぀お決定し
た。怜出の䞋限は〜2.5×19-9、あるいは4.4
〜5.5×10-6ナノモルであるこずが分か぀た。こ
の䞋限は攟射線暙識したプリチン抗䜓の陜性察
照现胞ぞの特異的結合を再珟可胜に犁止し埗るヒ
トプリチンの最少量に基づくものである。 陰性现胞の集団内のプリチンを担う现胞の怜
出可胜な最少の数を最終现胞数2.5×105個ずなる
ように陰性现胞ず混合した察照陜性现胞を䜿甚し
お研究した。この现胞密床においお、12500個の
现胞が特異的結合の識別レベルで怜出するこ
ずができた。前蚘定量デヌタから芋るず、これは
怜出の䞋限であるプリチンの絶察倀玄2nに
察応しおいる。したが぀お现胞数×106の集団
の堎合には1.25の陜性现胞が怜出し埗るず考え
られる。文献によればリンパ球の総数のうち16.6
がプリチン陜性现胞であるずするず乳がんの
城候があるずされおいるからモロツ等の
「Cancer Immunol.Immunother.」、、101
1977これは極めお玠晎らしい倀である。 次に定量的な枬定においお暙準曲線を䜜成する
䞀般的な方法を説明する。 耇数の党く同じ12×75mmの詊隓管に保存IMA
ガラス20mgmlから取り出しおPBS−BSA−
アゞ化物溶液で予め10で垌釈したヒトプリ
チン抗血枅IMA100Όを加える。各セツトの詊
隓管に100Όの緩衝液を単独で加えるか、ヒト
プリチンを緩衝液で皮々の量に垌釈したものを
加える。この枬定は℃の氎济内で開始する。次
にその詊隓管をシ゚ヌカヌ济内で30分間22℃に保
぀。この時間の終りに攟射線暙識したプリチン
抗䜓100ΌIMAを入぀た各詊隓管に加え、
曎に30分間保枩を続ける。その詊隓管を陜性察照
芋本ず同じ方法で掗぀お遠心沈柱させる。察照芋
本の堎合ずは異なり、攟射線暙識した抗䜓は枬定
の開始時には加えず30分埌に加える。これによ぀
お暙識した抗血枅を加える前にヒトプリチンが
IMA抗血枅ず平衡に達するこずができる。しか
しながら培逊時間が適圓であれば暙識した抗䜓を
同時に加えるこずもできる。 皮々の濃床に垌釈した陜性察照现胞に察する特
異的結合を暙準曲線から倖挿するこずによ぀おフ
゚リチン結合の絶察量を決定するこずができる。 第衚は本発明の半定量モヌドの枬定方法によ
぀お倚数の患者をテストした結果を瀺すものであ
る。正確床および患者の皮類は他の蚺断方法䟋え
ば生䜓組織怜査によ぀お決定した。
【衚】 第衚から明らかなように本発明のテストは非
悪性の患者を芋分け、たた治療効果を芋るのに適
しおいる。 第衚は攟射線暙識I125した抗ヒトプリ
チン抗䜓を䜿甚し℃で16〜18時間培逊しお半定
量テストを行な぀たずきのプリチン陜性リンパ
球の実際的な平均倀を瀺すものである。この第
衚の倀は少数の患者に基づくものではあるが悪性
の状態ず非悪性の状態の間の盞察倀を瀺しおい
る。 第衚  正垞な女性における結合は0.4〜4.5の範囲
にあり、平均であ぀た。これに察しお50才
を超えた女性の堎合はその倀が倧きか぀た。  乳挏症、繊維腫瘍、繊維腺腫を含む良性乳ガ
ン患者の堎合は平均1.6であ぀た。この倀は
充分正垞な範囲にある。  乳房切陀術を受け再発の城のない女性たたは
攟射線療法および化孊療法を受けおいる女性の
堎合は治療を受けおいない転移性の女性患者
平均に比べお結合が枛少した平均2.5
。  乳ガンの手術を受ける前の女性の堎合は結合
レベルが高か぀た6.5〜10。 なお、圓業者には明らかなように本発明には
皮々のバリ゚ヌシペンがある。䟋えばグルタルア
ルデヒドの替りにシアナミド、ゞむ゜シオシアネ
ヌト等の皮々のカツプリング剀を䜿甚するこずが
できるし、ガラスの替りに柱粉、ゲルビヌズ等の
他の運動抑制基䜓を䜿甚するこずができるし、䞊
蚘以倖の暙準曲線䜜成方法も䜿甚できるし、たた
プリチンの替りに、アルフア胎児蛋癜、ガン胚
抗原、絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合
抗原pancreatic associated antigen、プト
サルフオグリコプロテむン
fetosulfoglycoprotein等も察応する適圓な抗
䜓ずずもに䜿甚するこずができる。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンを怜出する方法においお、 癜血球サンプル内に含たれる末梢血液単栞现胞
    の䞀定量を前蚘アンテむゞ゚ンに察する暙識した
    オンコフむヌタル抗䜓の䞀定量ず混合し、前蚘现
    胞に付着しなか぀た前蚘抗䜓を陀去し、前蚘现胞
    に付着した前蚘抗䜓の盞察量を前蚘暙識を䜿甚し
    お決定する第のテストを行なう工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の他の䞀定量を暙識した
    ヒトオンコフむヌタル抗䜓の䞀定量および詰抗的
    に結合を犁止する量の前蚘オンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンず混合し、前蚘现胞に付着しなか぀た
    前蚘抗䜓を陀去し、その现胞に付着した前蚘抗䜓
    の盞察量を前蚘暙識を䜿甚しお決定する第のテ
    ストを行なう工皋、 前蚘第、第のテストによ぀お埗られた倀か
    ら前蚘现胞によ぀お担われおいる前蚘アンテむゞ
    ゚ンの盞察量を決定する盞察量決定工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の替りに既知の量の前蚘
    オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを担う末梢血液
    単栞タむプの现胞を䜿甚しお前蚘第、第のテ
    ストの工皋および盞察量決定工皋を行なう参照工
    皋、および 前蚘参照工皋の結果から方法の劥圓性および前
    蚘暙識した抗䜓詊薬の有効性をチ゚ツクするチ゚
    ツク工皋、 からなるこずを特城ずする方法。  前蚘末梢血液単栞现胞を前蚘癜血球サンプル
    から分離しお䜿甚するこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の方法。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがアル
    フア胎児蛋癜質、プリチン、ガン胚抗原、ヒト
    絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗原、
    およびプトサルフオグリコプロテむンからなる
    矀から遞択されるこずを特城ずする特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の方法。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがプ
    リチンであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項蚘茉の方法。  前蚘暙識が攟射掻性暙識、酵玠暙識および螢
    光暙識からなる矀から遞択されるこずを特城ずす
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  前蚘末梢血液単栞现胞がリンパ球であり、そ
    のリンパ球を前蚘癜血球サンプルから分離しお䜿
    甚するこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘
    茉の方法。  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンを定量する方法においお、 癜血球サンプル内に含たれる末梢血液単栞现胞
    の䞀定量を前蚘アンテむゞ゚ンに察する暙識した
    オンコフむヌタル抗䜓の䞀定量ず混合し、前蚘现
    胞に付着しなか぀た前蚘抗䜓を陀去し、前蚘现胞
    に付着した前蚘抗䜓の盞察量を前蚘暙識を䜿甚し
    お決定する第のテストを行なう工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の他の䞀定量を暙識した
    ヒトオンコフむヌタル抗䜓の䞀定量および詰抗的
    に結合を犁止する量の前蚘オンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンず混合し、前蚘现胞に付着しなか぀た
    前蚘抗䜓を陀去し、その现胞に付着した前蚘抗䜓
    の盞察量を前蚘暙識を䜿甚しお決定する第のテ
    ストを行なう工皋、 前蚘第、第のテストによ぀お埗られた倀か
    ら前蚘现胞によ぀お担われおいる前蚘アンテむゞ
    ゚ンの盞察量を決定する盞察量決定工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の替りに既知の量の前蚘
    オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを担う末梢血液
    単栞タむプの现胞を䜿甚しお前蚘第、第のテ
    ストの工皋および盞察量決定工皋を行なう参照工
    皋、 前蚘参照工皋の結果から方法の劥圓性および前
    蚘暙識した抗䜓詊薬の有効性をチ゚ツクするチ゚
    ツク工皋、 前蚘アンテむゞ゚ンを所定の量の固定された抗
    䜓および所定の量の暙識した抗䜓ず、量を次第に
    増やしながら混合し、暙準曲線を䜜成する暙準曲
    線䜜成工皋、 前蚘暙識を䜿甚しお各アンテむゞ゚ン濃床にお
    ける特異的結合を決定する工皋、および 前蚘盞察量決定工皋によ぀お埗られた倀を前蚘
    暙準曲線ず比范しおその倀に察応したアンテむゞ
    ゚ンの量を決定する工皋、 からなるこずを特城ずする方法。  前蚘末梢血液単栞现胞を前蚘癜血球サンプル
    から分離しお䜿甚するこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の方法。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがアル
    フア胎児蛋癜質、プリチン、ガン胚抗原、ヒト
    絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗原、
    およびプトサルフオグリコプロテむンからなる
    矀から遞択されるこずを特城ずする特蚱請求の範
    囲第項蚘茉の方法。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがフ
    ゚リチンであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲
    第項蚘茉の方法。  前蚘暙識が攟射掻性暙識、酵玠暙識および
    螢光暙識からなる矀から遞択されるこずを特城ず
    する特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  前蚘末梢血液単栞现胞がリンパ球であり、
    そのリンパ球を前蚘癜血球サンプルから分離しお
    䜿甚するこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項
    蚘茉の方法。  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルア
    ンテむゞ゚ンを怜出するのに䜿甚する装眮におい
    お、 前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンに察する
    暙識したヒトオンコフむヌタル抗䜓からなる第
    の詊薬、 前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンからなる
    第の詊薬、および 既知の量の前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚
    ンを担う末梢血液単栞タむプの现胞からなる第
    の詊薬、 を別々の詊薬ずしお備えおおり、癜血球サンプル
    の䞀定量が前蚘第の詊薬ず混合され、該癜血球
    サンプルの他の䞀定量が前蚘第および第の詊
    薬ず混合され、前蚘第の詊薬の䞀定量が前蚘第
    の詊薬ず混合され、前蚘第の詊薬の他の䞀定
    量が前蚘第および第の詊薬ず混合され、次い
    で、前蚘癜血球サンプル䞭の末梢血液単栞现胞に
    より担われおいる前蚘アンテむゞ゚ンの盞察量が
    決定できるようにな぀おいるこずを特城ずする装
    眮。  前蚘暙識が攟射掻性暙識、酵玠暙識、およ
    び螢光暙識からなる矀から遞択されるこずを特城
    ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装眮。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがア
    ルフア胎児蛋癜質、プリチン、ガン胚抗原、ヒ
    ト絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗
    原、およびプトサルフオグリコプロテむンから
    なる矀から遞択されるこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の装眮。  前蚘末梢血液単栞タむプの现胞が前蚘アン
    テむゞ゚ンを担う培逊されたリンパ球であるこず
    を特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装
    眮。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがフ
    ゚リチンであり、前蚘末梢血液単栞タむプの现胞
    がプリチンを担う培逊されたリンパ球であるこ
    ずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装
    眮。  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルア
    ンテむゞ゚ンを怜出するのに䜿甚する装眮におい
    お、 前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンに察する
    暙識したヒトオンコフむヌタル抗䜓からなる第
    の詊薬、 前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンからなる
    第の詊薬、および 既知の量の前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚
    ンを担う末梢血液単栞タむプの现胞、および 基䜓䞊に固定された前蚘オンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンに察するヒトオンコフむヌタル抗䜓か
    らなる第の詊薬、 を別々の詊薬ずしお備えおおり、癜血球サンプル
    の䞀定量が前蚘第の詊薬ず混合され、該癜血球
    サンプルの他の䞀定量が前蚘第および第の詊
    薬ず混合され、前蚘第の詊薬の䞀定量が前蚘第
    の詊薬ず混合され、前蚘第の詊薬の他の䞀定
    量が前蚘第および第の詊薬ず混合され、次い
    で、前蚘癜血球サンプル䞭の末梢血液単栞现胞に
    より担われおいる前蚘アンテむゞ゚ンの盞察量が
    決定され、前蚘第の詊薬を増加させながら所定
    量の前蚘第および第の詊薬ず混合するこずに
    よ぀お暙準曲線が䜜成され、前蚘決定されたアン
    テむゞ゚ンの盞察量が前蚘暙準曲線ず比范できる
    ようにな぀おいるこずを特城ずする装眮。  前蚘暙識が攟射掻性暙識、酵玠暙識、およ
    び螢光暙識からなる矀から遞択されるこずを特城
    ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装眮。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがア
    ルフア胎児蛋癜質、プリチン、ガン胚抗原、ヒ
    ト絚毛膜性生殖腺刺激ホルモン、すい臓結合抗
    原、およびプトサルフオグリコプロテむンから
    なる矀から遞択されるこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の装眮。  前蚘末梢血液単栞タむプの现胞が前蚘アン
    テむゞ゚ンを担う培逊されたリンパ球であるこず
    を特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装
    眮。  前蚘オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンがフ
    ゚リチンであり、前蚘末梢血液単栞タむプの现胞
    がプリチンを担う培逊されたリンパ球であるこ
    ずを特城ずする特蚱請求の範囲第項蚘茉の装
    眮。  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルア
    ンテむゞ゚ンを怜出するのに䜿甚する方法におい
    お、 癜血球サンプル内に含たれる末梢血液単栞现胞
    の䞀定量を前蚘アンテむゞ゚ンに察する暙識した
    オンコフむヌタル抗䜓の䞀定量ず混合し、前蚘现
    胞に付着しなか぀た前蚘抗䜓を陀去し、前蚘现胞
    に付着した前蚘抗䜓の盞察量を前蚘暙識を䜿甚し
    お決定する第のテストを行なう工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の他の䞀定量を暙識した
    ヒトオンコフむヌタル抗䜓の䞀定量および詰抗的
    に結合を犁止する量の前蚘オンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンず混合し、前蚘现胞に付着しなか぀た
    前蚘抗䜓を陀去し、その现胞に付着した前蚘抗䜓
    の盞察量を前蚘暙識を䜿甚しお決定する第のテ
    ストを行なう工皋、 前蚘第、第のテストによ぀お埗られた倀か
    ら前蚘现胞によ぀お担われおいる前蚘アンテむゞ
    ゚ンの盞察量を決定する盞察量決定工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の替りに既知の量の前蚘
    オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを担う末梢血液
    単栞タむプの现胞を䜿甚しお前蚘第、第のテ
    ストの工皋および盞察量決定工皋を行なう参照工
    皋、 前蚘参照工皋の結果から方法の劥圓性および前
    蚘前蚘暙識した抗䜓詊薬の有効性をチ゚ツクする
    チ゚ツク工皋、および 前蚘末梢血液単栞タむプの现胞の替りに前蚘オ
    ンコフむヌタル抗䜓ず反応しないこずが知られお
    いる蛋癜物質を担う现胞を䜿甚しお前蚘第のテ
    ストの工皋、第のテストの工皋、盞察量決定工
    皋、参照工皋、およびチ゚ツク工皋を繰り返す工
    皋、 からなるこずを特城ずする方法。  末梢血液単栞现胞䞊のオンコフむヌタルア
    ンテむゞ゚ンを怜出するのに䜿甚する方法におい
    お、 癜血球サンプル内に含たれる末梢血液単栞现胞
    の䞀定量を前蚘アンテむゞ゚ンに察する暙識した
    オンコフむヌタル抗䜓の䞀定量ず混合し、前蚘现
    胞に付着しなか぀た前蚘抗䜓を陀去し、前蚘现胞
    に付着した前蚘抗䜓の盞察量を前蚘暙識を䜿甚し
    お決定する第のテストを行なう工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の他の䞀定量を暙識した
    ヒトオンコフむヌタル抗䜓の䞀定量および詰抗的
    に結合を犁止する量の前蚘オンコフむヌタルアン
    テむゞ゚ンず混合し、前蚘现胞に付着しなか぀た
    前蚘抗䜓を陀去し、その现胞に付着した前蚘抗䜓
    の盞察量を前蚘暙識を䜿甚しお決定する第のテ
    ストを行なう工皋、 前蚘第、第のテストによ぀お埗られた倀か
    ら前蚘现胞によ぀お担われおいる前蚘アンテむゞ
    ゚ンの盞察量を決定する盞察量決定工皋、 前蚘末梢血液単栞现胞の替りに既知の量の前蚘
    オンコフむヌタルアンテむゞ゚ンを担う末梢血液
    単栞タむプの现胞を䜿甚しお前蚘第、第のテ
    ストの工皋および盞察量決定工皋を行なう参照工
    皋、 前蚘参照工皋の結果から方法の劥圓性および前
    蚘前蚘暙識した抗䜓詊薬の有効性をチ゚ツクする
    チ゚ツク工皋、 前蚘アンテむゞ゚ンを所定の量の固定された抗
    䜓および所定の量の暙識した抗䜓ず、量を次第に
    増やしながら混合し、暙準曲線を䜜成する暙準曲
    線䜜成工皋、 前蚘暙識を䜿甚しお各アンテむゞ゚ン濃床にお
    ける特異的結合を決定する工皋、および 前蚘盞察量決定工皋によ぀お埗られた倀を前蚘
    暙準曲線ず比范しおその倀に察応したアンテむゞ
    ゚ンの量を決定する工皋、 前蚘末梢血液単栞タむプの现胞の替りに前蚘オ
    ンコフむヌタル抗䜓ず反応しないこずが知られお
    いる蛋癜物質を担う现胞を䜿甚しお前蚘第のテ
    ストの工皋、第のテストの工皋、盞察量決定工
    皋、参照工皋、チ゚ツク工皋、暙準曲線䜜成工皋
    および前蚘特異的結合を決定する工皋を繰り返す
    工皋、 からなるこずを特城ずする方法。
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