JPH01187450A - 液体クロマトグラフィー方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 本発明は、液体クロマトグラフィー方法におけるグラジ
ェント溶出において、グラジェント溶出の状況を容易、
正確かつ迅速にモニタリングすることを目的とするもの
である。

〔従来技術〕

液体クロマトグラフィーは有用物質含有液から溶離液を
用いて有用物質を分離精製する手段として広く用いられ
ている。その溶離液として、複数の成分の組成比を連続
的又は段階的に変化させて用いる方法があり、グラジェ
ント溶出法と呼ばれる。

グラジェント溶出法においては、通常、組成比の異なる
二種の溶離液を準備し、運転開始直後に先ず一方の溶離
液（初期段階溶離液。

以下初期液と言うこともある。）を供給し、次いで、他
方の溶離液を連続的又は段階的に最初の溶離液に加えて
行き、最終的に他方の溶離液（最終段階溶離液。以下最
終液と言うこともある。）のみを供給する方法である。

組成比を変化させるには、通常グラジェントミキサーや
ポンプ及び中央制御装置（ｃｐｔｙ）から成るグラジェ
ント制御システムが用いられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、このようなシステムを用いても。

予定通りグラジェント溶出が行なわれているかどうかは
実測してみないと把握できず、例えば予想と異なる分離
、溶出挙動を示した場合、その原因がグラジェント溶出
が不適切だったのか、それとも充填剤の劣化等、他の原
因なのか、判断することが困難であった。

さらに、グラジェント溶出液を紫外線吸光度でチェック
しようとしても、グラジェント溶媒の紫外線吸光度が非
グラジェント成分と比べ、相対的に小さい場合やグラジ
ェント溶媒自体の紫外線吸光度が小さい場合には、グラ
ジェント溶媒による紫外線吸光度の変化は検知できなか
った。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、グラジェントにともなう溶離液の組成が予定
どおり変化しているかどうか、溶出状態が予定どおりで
あるかどうかをカラムの入口部分又は出口部分で紫外線
吸光度を測定することによりチェックし、その結果を溶
離液の組成変化等にフィードバックすることができるよ
うに、溶離液の初期段階組成物と最終段階組成物との紫
外線吸光度の格差が溶離液の組成変化を充分チェックで
きるに充分なものとすることを特徴とする液体クロマト
グラフィー方法に関する。

本発明で言うグラジェント溶出とは前述の通り、溶離液
の組成比を溶出時間の経過と共に連続的又は段階的に変
化させて溶出する方法を指し、組成比が変化する成分を
グラジェント成分、変化しない成分を非グラジェント成
分という。

このようなグラジェント溶媒を連続的に紫外線吸光度を
測定し、吸光度の変化がグラジェントに伴って変化すれ
ば、グラジェント溶出はうまく行っていると考えてもよ
い。

本発明の対象となる溶出液は、それ自体紫外線吸光度が
小さいか、又は非グラジェント成分に比べてグラジェン
ト成分の吸光度が比較的小さいものであり、具体的には
アセトニトリル等のニトリル類や、メタノール、エタノ
ール等の低級アルコールが例示される。

これらの成分は、例えば非グラジェント成分として酢酸
と混合されると、溶離液全体の紫外線吸光度としてはほ
とんど酢酸のみが検出されてしまい、従ってグラジェン
ト溶出の適確性を把握することができない。

本発明は、溶離液の初期段階組成物と最終段階組成物と
の紫外線吸光度の格差が溶離液の組成変化を充分チェッ
クできるに十分なものとしたものである。

具体的には、初期組成物又は最終組成物の一方に、紫外
線吸光度が大きく、しかもグラジェント溶出に実質的に
影響を与えないような成分を加える方法や、紫外線吸光
度の大きい非グラジェント溶媒の組成比を初期組成物又
は最終組成物の一方において若干変化させる方法、即ち
、非グラジェント成分をグラジェント成分化する方法が
挙げられる。

前者の方法において、上記の条件を満足する添加成分と
してはアセトン、酢酸、トリフルオロ酢酸などが挙げら
れる。

又、後者の方法においては、初期組成物中の、本来は非
グラジェント成分である成分の組成比を若干増加させた
り、又は減少させ、他方、最終組成物においては非グラ
ジェント成分の組成比は本来の組成比とする例や、その
逆とする例が挙げられる。この例として、酢酸やトリフ
ルオロ酢酸などが例示される。

本発明において、充分チェックできる紫外線吸光度の格
差とは、一般的に吸光度として２％以上とする。上限は
、特に限定されず、実際のケースに応じてグラジェント
溶出に影響を与えぬ範囲とする。一般的に好ましくは５
〜１５％の差があればよい。この格差が２％未満となる
と、非グラジェント成分の影響を受け、溶離液全体の吸
光度としては実質的に差が出にくくなる。

なお、本発明においてはグラジェント成分及び非グラジ
ェント成分の数は特に限定されない。

本発明において、グラジェント溶出液の紮外線吸光度の
測定は第１図に示すように、初期液と最終液が混合され
てポンプ輸送された直後に、グラジェントモニター用の
紫外線吸光度測定器を設置すればよい。

グラジェント溶出中に、予想外の溶出挙動となった場合
、グラジェントモニターを見れば、その原因がグラジェ
ントにあるのかどうかすぐわかるので、グラジェントに
原因あれば、プログラムを改編したり、ポンプやバルブ
等の修理を行なう等、ただちに対応することが出来る。

また、溶出挙動を見る迄もなく、モニターの紫外線吸光
度の値を刻々ＣＰＵにフィードバックし、予めプログラ
ムされた組成比と対比させることによって、もし両者に
畢離が生じてきたら、初期液又は最終液の供給量を弁の
開閉度の調整により、常に最適のものと制御することも
できる。

本発明の液体クロマトグラフィー方法は、従来、グラジ
ェント液出方法が採用されていた場合や、非グラジェン
トの場合でも吸光度が極めて小さく実質的に供給状態が
チェック出来ない場合などに適用することができる。

〔実施例〕

第１図のようなフローに従って液体クロマトグラフィ一
方法を実施した。

１は初期段階組成の溶離液（Ａ液）タンク、２は最終段
階組成の溶離液（Ｂ液）タンク、３はＡ液とＢ液の割合
を調節するためのグラジェント制御用ＣＰＵシステム、
４，５は前記ＣＰＵシステムの指示に応じて動く調節バ
ルブ、６，７は、Ａ液、Ｂ液を移送するパイプ、１０は
Ａ液とＢ液を均一に混合するためのグラジェントミキサ
ー、１１は移送用ポンプ、１２は入口部分に設置された
グラジェントモニター用の紫外線吸光度測定器（ＵＶＩ
ＬＯＧ５１１１Ａ、波長２００ｎｍ、セル長０．５ｍｍ
１）、１３は液体クロマトグラフィー装置（ＫＵＲＩＴ
Ａ　　ＬＣ−３００−Ｗ）　、１４は出口部分に設けら
れた紫外線吸光度測定装置である。

前記ＫＵＲＩＴＡ　ＬＣ−３００−Ｗは、カラム径５０
ｍｍφ、カラム長５００ｍｍ　Ｌ、充填材はオクタデシ
ルシラン処理をしたシリカゲルである。

溶離液の流速は５０ｍΩ／分とした。

グラジェントのかけ方は０〜１０分間はＡ液１００％、
ついで１０〜４０分間かけて直線的にＡ液とＢ液の割合
を変化させ４０分後にＢ液１００％とした。Ｂ液１００
％になってからさらに１０分間ＢＢ液００％を流した。

Ａ液の組成ニ アセトニトリル５％水溶液／酢酸＝９５１５Ｂ液の組成
ニ アセトニトリル２０％水溶液／酢酸＝９５１５．５かく
して、グラジェントの分はほんの少しではあるが、その
紫外線吸光度の変化（第２図、１２の測定値）は第２図
のグラフに示すとおり明らかに変化しており（吸光度と
して１０％の格差）、正確なモニターが可能であること
を示している。

〔比較例〕 比較のため、溶離液の Ａ液組成：実施例と同じ Ｂ液組成ニアセトニトリル２０％水溶液／酢酸＝９５／
　５を用いて実施例と同一の方法を実施した。この場合
は第２図のグラフに示すとおり紫外線吸光度に変化を検
知することはできなかった。

〔効　果〕

本発明方法によりグラジェント状態を常にモニタリング
できるため、（イ）測定結果をすぐフィードバックし、
適切な制御が容易に実施できる。（ロ）プログラムの手
直し、ポンプやバルブの調節など、操作に関連する各種
の問題に対し、すみやかな対応ができる、等の効果が得
られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法の一実施例のフローを説明するも
のである。又、第２図は縦軸に時間に対応する紫外線吸
光度の変化値、すなわち実施例の紫外線吸光度測定器１
２で測定した初期段階組成物の数値に対する測定時の数
値の差を、横軸に時間（単位分）をとったグラフである
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、溶離液の組成を連続的又は段階的に濃度変化させて
   目的物質をカラムからグラジェント溶出させる液体クロ
   マトグラフィー方法において、溶離液の初期段階組成物
   と最終段階組成物との紫外線吸光度の格差が、溶離液の
   組成変化を充分チェックできるに充分なものとすること
   を特徴とする液体クロマトグラフィー方法。