JPH01104164A - ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ誘導体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、生体に有毒なスーパーオ中シトを分解するス
ーパーオキシドジスムターゼの酵素活性を概ね保持した
ままで該スーパーオキシドジスムターゼに比べて大幅に
延長された血中半減期を有する新規なスーパーオキシド
ジスムターゼ誘導体およびその製造法に関する。

本発明、により提供されるスーパーオキシドジスムター
ゼ誘導体は活性酸素ラジカルが関与する種々の疾患に対
して有効であり、特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮
腫剤、抗パラコート中毒剤として使用することができる
。また該スーパーオキシドジスムターゼ誘導体は虚血性
心疾患治療剤または活性酸素ラジカルに起因する制癌剤
の副作用を軽減するための医薬としても有用である。

従来の技術 従来、スーパーオキシドジスムターゼ〔以下、これをＳ
ＯＤと略記する〕は動物、植物、微生物などの生体内に
広く存在し、生体に有害なスーパーオ午シトを分解する
酵素として知られている。

最近、単離されたＳＯＤを抗炎症剤として用いようとす
る試みがなされている〔ファルマシア、１７巻４１１頁
（１９８１年）およびカレント・セ２ポイテイツク・す
ｆ　−チ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＲ
ｅｓｅａｒｃｈ）、１６巻７０６頁（１９７４年）参照
〕０ＳＯＤを静脈内投与した場合、その血中半減期は僅
か４〜６分とされておｆｉ、ＳＯＤは速かに尿中に排泄
代謝される。ＳＯＤの血中半減期を延長させるためにＳ
ＯＤをフィコール、ポリエチレングリコールまたはジッ
トアルブミンで修飾し、巨大分子化することが試みられ
てきたが、フィコールまたはポリエチレングリコールで
修飾されたＳＯＤではＳＯＤの酵素活性が大幅に低下し
、またラットアルブミンで修飾されたＳＯＤには抗原性
があることが報告されているＱまたイヌリンで修飾され
たＳＯＤではＳＯＤに比べて酵素活性の低下が認められ
るが、その血中半減期は大幅に延長されることが知られ
ている〔特開昭５８−３２８２６号公報参照〕０ 発明が解決しようとする問題点 従来知られている種々の修飾ＳＯＤはすでに報告されて
いる上記の理由、または巨大分子化に伴う組織内浸透性
の低下などの点でいずれも実用上問題がある０ しかして１本発明の１つの目的は、ＳＯＤの酵素活性を
概ね保持したｔまで該ＳＯＤに比べて大幅に延長された
血中半減期を有する新規な非巨大分子化スーパーオ牛シ
トジスムターゼ誘導体を提供するにある。

本発明の他の１つの目的は、上記のスーパーオキシドジ
スムターゼ誘導体の製造法を提供するにある。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、上記の１つの目的は１式％式％（） 〔式中、（ＳＯＤ）はアミン基に換えてアミノ基から１
個の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパー
オキシドジスムターゼを表わし、〔ｚ〕Ｒ″′ −ＣＨｚ−Ｃ−（これらの式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ６
はそＣ０ＯＲ’ れぞれ水素原子またはメチル基を表わし　Ｒ２は水素原
子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし　Ｒ４
は水素原子または炭素数１ないし５のアルキル基を表わ
し　Ｒ６はメチル基またはエチル基を表わす）で示され
る基からなる群から選ばれる基。

すか、または炭素数１ないし４のアルカノール。

炭素数１ないし４のアルキル基部分を含むエチレングリ
コールモノアルキルエーテルもしくは炭素数１ないし４
のアルキル基部分を含むグリセリンシアル中ルエーテル
から水酸基を除いた残基を表わす）で示される基および 子の結合手は〔ＳＯＤ〕と結合するものであることを意
味する）で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が８００ないし２００００である共重合体の一価の基を
表わし、Ｘは［ＳＯＤ］が有するアミノ基から１個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし６の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体（以下
、これをＳＯＤ誘導体と称す）を提供することによって
達成される。

また本発明によれば、上記の他の１つの目的は、ＳＯＤ
と −ＣＨ２−Ｃ−（これらの式中、Ｒ１、Ｒ３およびＲ５
は〇〇〇Ｒ’ それぞれ水Ａ１１．子またはメチル基を表わＬｍ　Ｒ”
は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わ
し　Ｒ４は水素原子または炭素数１ないし５のアルキル
基を表わし％Ｒ６はメチル基またはエチル基を表わす）
で示される基から・なる群から選ばれる基、 すか、または炭素数１ないし４のアルカノール、炭素数
１ないし４のアル千ル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくハ炭素数１ないし４のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす）で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が８００
ないし２００００である共重合体（以下、これを共重合
体と略称する）とを州７〜１１のアルカリ水溶液中で反
応させることを特徴とする上記のＳＯＤ誘導体の製造法
を提供することによって達成される。

ＳＯＤと共重合体との反応は、通常炭酸ナトリウム、重
炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムな
どの塩の水溶液中にＳＯＤを溶解し、得られた溶液に粉
末状の共重合体またはジメチルスルホキシドなどの有Ｉ
ｆ＆溶媒に溶解した共重合体を添加することにより行わ
れる。反応中、溶液の州は７〜１１に維持されているこ
とが必要であり、…が７よシ低い場合には、共重合体の
溶解性が低下して反応は進行しない。−また、…が１１
より高い場合には、ＳＯＤの酵素活性が失活して本発明
の有効成分化合物である５ＯＤｐ導体を得ることはでき
ない。反応温度としては、約３〜５０℃が好ましく、３
〜４０℃がさらに好ましい。また、反応時間は反応温度
、共重合体の添加方法により異なるが、通常１０分〜３
時間である。共重合体の使用量はＳＯＤ１モルに対して
約０．５〜３０モルの範囲である。この使用量によって
ＳＯＤに結合させる共重合体の分子数を調整することが
できる。

このようにして得られた反応液にはＳＯＤ誘導体と未反
応のＳＯＤおよび共重合体などが存在するが、かかる反
応液を濾過し、濾液をゲル濾過し、得られるＳＯＤ誘導
体を含む溶出液を必要に応じてハイドロフォービック・
クロマトグラフィーに付したのち限外濾過に付すること
により濃縮したのち、凍結乾燥することによりＳＯＤ誘
導体の固型物を取得することができる。

上記の反応によシ％ＳＯＤが有するアミノ基と共重合体
が有する無水マレイン酸環とが結合し、ＳＯＤ誘導体が
生成する。例えば、ヒト型ＳＯＤ　　’には１分子当ジ
アミノ基が２２個（ヒト赤血球型ＳＯＤまたは酵母にて
遺伝子組換え操作により得られたヒト型５ＯＤ）または
２４個（大腸菌にて遺伝子組換え操作により得られたヒ
ト型５ＯＤ）存在するが、上記の反応により、いずれか
の７ミノ基と共重合体が有する１個の無水マレイン酸環
とが反応し、ＳＯＤの１分子当り共重合体が１〜６分子
結合したＳＯＤ誘導体が得られる。原料として用いる共
重合体には１分子中に通常無水マレイン酸環が平均０．
５〜２個存在するが、これらの無水マレイン酸環のなか
の１個がＳＯＤのアミノ基と結合した場合、残シの無水
マレイン酸環はさらに別のアミン基と反応することは少
なく、水とン酸由来の基となシ易い。したがって、ＳＯ
Ｄ９導体の構成単位には前記（ロ）の式においてＲ７が
水素原子である基も包含される。また原料として部分半
エステル化共重合体を用いる場合には、得られるＳＯＤ
誘導体の構造単位に前記（ロ）の基として上記のマレイ
ン酸由来の基が半エステル化されたものだけでなく、少
量の該マレイン酸由来の基が含まれる。共重合体の１分
子とＳＯＤの複数分子とが反応して該共重合体の複数個
の無水マレイン酸環と各ＳＯＤのアミノ基とがそれぞれ
結合した化合物が副生する可能性があるが、かかる副生
物が少量混入したＳＯＤ誘導体を本発明の有効成分化合
物として用いることに不都合はない。しかしながら、医
薬の有効成分化合物は単一の化学構造を有する化合物で
あることが好ましい状況にあることを考慮すれば、上記
の副生物の混入量が多いＳＯＤ誘導体については、これ
をゲル濾過などの操作に付することにより該副生物を除
外して本発明の有効成分化合物として用いることが好ま
しい。

また、上記の反応によって得られるＳＯＤ誘導体は５Ｏ
ＤＫ種々の分子数の共重合体が結合して得られたものの
混合物であシ、それら個々のＳＯＤ誘導体のＳＯＤに結
合している共重合体の分子数は同一ではない。したがっ
て、本発明の有効成分化合物であるＳＯＤ誘導体を表わ
す前記式において、ＸはＳＯＤ１分子に結合する共重合
体分子数の平均値を表わすことを意味する。しかしなが
ら、有効成分化合物としてＳＯＤに結合する共重合体の
分子数が同数のＳＯＤ誘導体が所望される場合には、前
記の方法により得られるＳＯＤ誘導体をさらにゲル濾過
などの操作に付することにより所望のＳＯＤ誘導体を取
得することが可能である。

なお、前記の反応および反応後の処理において、ＳＯＤ
誘導体が有するカルボキシル基がアルカリ金属塩または
アンモニウム塩を形成する可能性があるが、かかる塩を
形成したカルボキシル基を有するＳＯＤ誘導体も本発明
の有効成分化合物に包含される。

ＳＯＤ誘導体の酵素活性はＳＯＤに結合する共重合体の
分子数が増加するに従って徐々に低下する傾向（ある。

ＳＯＤに７分子以上の共重合体が結合したＳＯＤ誘導体
の酵素活性は低くなりすぎ、かかる誘導体は本発明の有
効成分化合物としては不適当である。ＳＯＤに１〜３分
子の共重合体が結合したＳＯＤ誘導体は酵素活性を高く
保持しており、かつ血中半減期が延長されるなどの特長
を有するので特に好ましい６ 原料として用いられるＳＯＤは、＃物（ヒト。

ウシなど）、植物、微生物などの生物中に含まれている
ものを公知の方法によりそれぞれの生物体から抽出され
たもの、ま念は遺伝子工学の手法を用いて取得されたも
のなどである。ＳＯＤの化学構造（配位金属、分子量、
アミノ酸配列など）はかなり解明されてきており、ＳＯ
ＤはＦｅ配位ＳＯＤ％Ｍｎ配位Ｓ　ＯＤ、　Ｃｕ−Ｚｎ
配位ＳＯＤの３ａｉ類に分類され、存在している生体組
織によって異なるが３万〜８万の分子量を有している。

ＳＯＤのアミノ酸配列も存在している生体組織によって
若干相異しているが、その詳細はスーパーオキサイドと
医薬？４−９０（大柳善彦著、共立出版刊、昭和５６年
５月２５日発行）；ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　２４６２８７５〜２
８８０（１９７１）；同ｌ互旦、６１０７〜６１１２（
１９７５）；　　Ｐ　Ｎ　Ａ　ＳＬ旦、３７２５〜３７
２９（１９７３）；　ＡＢＢＩ’ひ、２４３〜２５６　
（１９７７）　　などの文献の記載を参照されたい。原
料のＳＯＤとしてはヒト型のＣｕ−Ｚｎ配位ＳＯＤが好
ましい。このものは分子量３．３万を有し、また分子中
に２２個または２４個のアミン基を有する。ヒト型ＳＯ
Ｄは、例えば、ヒトの血液を順次熱処理、イオン交換、
ゲル濾過に付することにより、また遺伝子工学の手法を
用いることによって取得される。

また原料として用いる共重合体は、上記（イ）の構成単
位に対応する単量体と無水マレイン酸との共重合体を部
分加水分解〔少量（１分子当り平均０．５〜２個）の無
水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイン酸環は加水
分解〕することにより、また上記（イ）の構成単位に対
応する単量体と無水マレイン酸との共重合体をアルコー
ルで部分半エステル化〔、少量（１分子当り平均０．５
〜２個）の無水マレイン酸環が残存し、他の無水マレイ
ン酸環は半エステル化〕することにより得られる。この
ようにして得られる共重合体として、例えば、部分加水
分解されたスチレン、ｐ−クロロスチレン。

ｐ−ブロムスチレンまたはα−メチルスチレンと無水マ
レイン酸との共重合体； 部分半エステル化（メチルエステル、エチルエステル、
フロビルエステル、ｎ−ブチルエステル、エトキシエチ
ルエステル、エトキシエチルエステル、フロボキシエチ
ルエステル、２−ブ）＝？ジエチルエステル、１．３−
シメト牛シー２−プロピルエステル、２，３−ジメトキ
シ−１−プロピルエステル、１．３−ジェトキシ−２−
プロピルエステル、２−エトキシ−３−メトキシ−１−
プロピルエステル、１．３−ジプロポギシー２−プロピ
ルエステル、１，３−ジプト争シー２−プロピルエステ
ルなト）されたスチレン、ｐ−クロロスチレン、ｐ−ブ
ロムスチレンまたはα−メチルスチレンと無水マレイン
酸との共重合体； 部分加水分解されたエチレン、プロピレン、α−ブチレ
ン、インブチレン、１−ペンテン％　２−メチル−１−
ブテン、１−ヘキセンまたは１−ヘプテンと無水マレイ
ン酸との共重合体； 部分半エステル化（エステルの例示は上記と同様、以下
同じ）されたエチレン、プロピレン、α−ブチレン、イ
ンブチレン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、
１−ヘキセンまたは１−ヘプテンと無水マレイン酸との
共重合体； 部分加水分解された酢酸ビニルと無水マレイン酸との共
重合体； 部分半エステル化された酢酸ビニルと無水マレイン酸と
の共重合体； 部分加水分解された（メタ）アクリル酸メチルと無水マ
レイン酸との共重合体； 部分半エステル化された（メタ）アクリル酸メチルと無
水マレイン酸との共重合体； 部分加水分解され九（メタ）アクリル酸エチルと無水マ
レイン酸との共重合体； 部分半エステル化された（メタ）アクリル酸エチルと無
水マレイン酸との共重合体などが挙げられる０ これらの共重合体はいずれも疎水性基と親水性基の両者
を持つことによる適度な疎水性を有し、かつ他極の高い
カルボキシル基を有する。したがって、かかる共重合体
が結合しているＳＯＤ誘導体は血清蛋白および生体膜と
の可逆的な結合性を有しており、このととてより血中半
減期が延長され、また臓器への移行性が良好となる。な
かでも構成単位（づとしてスチレン由来の基を有するＳ
ＯＤ誘導体および構成単位（ロ）として半エステル化さ
れた基を有するＳＯＤ誘導体は疎水性がより高く、これ
らの効果を発現する点で好ましい。

共重合体において、構成単位（イ）と構成単位（ロ）お
よびＣ→の構成モル比「（イ）／（ロ）＋（ハ）」は実
質的に約１〜１．３の範囲であることが好ましく、通常
は１である０構成モル比が１よシも小さいものは構成単
位（イ）に相当する単量体と無水マレイン酸との共重合
で得ることは困難である。また、構成モル比が１．３よ
りも大きいものは、構成単位（ロ）か半エステル化され
たものである場合、かかる共重合体を塩の水溶液中に溶
解させてＳＯＤと反応させる際に、共重合体の水溶液へ
の溶解性が不良となるので好ましくない。

上記の共重合体はいずれも公知のものであり、それらの
重量平均分子量は通常８００〜２００００　　の範囲で
ある。これらの共重合体から得られるＳＯＤ誘導体の疾
患局所への移行性の点から、共重合体の重量平均分子量
は３０００以下であることが好ましい。共重合体の分子
量分布については特に制限はない。上記の構成単位（イ
）に相当する単量体と無水マレイン酸とを２ジ力ル共重
合することにより得られる共重合体（重量平均分子量／
数平均分子量との比が約２．０またはそれ以上のもの）
を分別することなく、そのまま部分加水分解または部分
半エステル化したものを原料として用いることもできる
し、また分別して分子量分布を狭くしたものを部分加水
分解ま、たけ部分半エステル化して原料として用いても
よい。

次に、５ＯＤｐ導体の薬理学的特性についての試験例を
示す。

試験例１ 局所用が低下した組織へのＳＯＤ誘導体の特異的集積作
用 マウス（２０ｒ）の左側大腿筋に０．１５Ｍのヘベス（
ＨＥＰＥＳ　）　バッフ７　　（ＰＨ６，０）をｏ、２
１１Ｌ１１また右側大腿筋に生理食塩水を０．２−それ
ぞれ筋肉内投与した直後に１合成例２の記載の方法に準
じて調製した　１２５工標識ＳＯＤ誘導体（１４ｎｍｏ
ｌ）、まえは合成例２で用いたＢｕ−８ＭＡ（部分中ブ
チルエステル化したスチレン−無水マレイン酸共重合体
を意味する。以下１、本明細書において同じ。）と同様
の３Ｈ標識Ｂｕ−８ＭＡ（０，２２μｍＯ１）を静脈内
投与し、経時的に左右の大腿筋に集積した放射活性を測
定した。結果を第１３図に示す。右側大腿筋（コントロ
ール側）に比べて、左側大腿筋（酸性側）の放射活性は
有意に高い。このことから、合成例２で得られるＳＯＤ
誘導体はＢｕ−８ＭＡが結合していることによって酸性
組織（炎症局所の田は低下している）へ選択的に取りこ
まれることがわかる。

試験例２ 抗虚血障害作用および抗炎症作用 試験方法 ＳＤ系雄性ラット（体！２００？）を−晩絶食させたの
ち、１群６匹としてストレスケージに入れて拘束し、ラ
ットの胸から下を２２℃の水に浸漬し、ラットにストレ
スを負荷した。かかるストレス負荷により、ラットの胃
粘膜での血流量が減少し１局所的虚血が起こる結果、急
性炎症が房起され、潰瘍が発生する。上記のストレス負
荷の２時間後、４時間後および６時間後にラットを水か
ら引揚げて殺し、胃を摘出した。胃内腔に１ｏチホルマ
リンを注入して組織を固定した。固定後、粘膜面の線状
潰瘍の長さを測定し、その総和を潰瘍係数（Ｕｌｃｅｒ
　Ｉｎｄｅｘ）として表示した。

なお、被検化合物はラットに水浸拘束直前に投与した。

コントロール群にはＱ、　５　ｍ／の生理食塩水を、ま
た試験群にはｌｎｙ／ラットのＳＯＤまたは後述の合成
例２で得られたＳＯＤ訪導体をＱ、　５　ｒｘｌの生理
食塩水溶液としてそれぞれ静脈内投与（ｌ。

ｖ、）シた。

試験結果 得られた潰瘍係数（ｍｍ／１ｉｓｓｕｅ）をストレス負
荷時間とともに第１４図に示す。第１４図において○印
およびΔ印はそれぞれコントロール群およびＳＯＤ誘導
体投与群の試験結果を表わす。なお、ＳＯＤ投与群の試
験結果はコントロール群のものとほぼ同等であったため
図中に表示することを省略する。

ＳＯＤ投与群には潰瘍の発生を抑制する作用は全く認め
られなかったが５合成例２で得られたＳＯＤ誘導体の投
与群では潰瘍の発生が顕著に抑制されていることは第１
４図から明らかである。

このようにＳＯＤ誘導体は局所組織の田が低下する疾患
における抗虚血障害剤、抗炎症剤として優れた特性を有
する。

試験例３ 抗脳浮腫作用 ラット（２０Ｏｒ）の右大脳半球を頭骸骨外側から液体
窒素にて３０秒間処理すると着側な右側性脳浮腫が起こ
る。このラットに０．２μｍｏｌの試験例１で用いたと
同じ３Ｈ標識Ｂｕ−８ＭＡを静脈内投与すると、浮腫を
起こして２（が低下した病巣側に放射活性の特異的集積
が起こった〔第１５図（２）参照〕。また、このラット
に２７　ｎｍｏｌの試験例１で用いたと同じ１２６工標
識ＳＯｂ誘導体を静脈内投与すると、障害側に放射活性
の特異的集積が見られた〔第１５図（１）参照〕。この
ことにより　、Ｂｕ−８ＭＡが結合した合成例２で得ら
れるＳＯＤ誘導体は脳障害局所へよく集積することがわ
かる。なお、ＳＯＤ誘導体の集積によシ浮腫の発現は着
側に低下した。

試験例４ 抗酸素毒性作用 マウス（２０り）に２００■／神のパラコートを腹腔内
投与すると、酸素ラジカルが発生し、肝細胞障害が起こ
り、血中のＧＯＴレベルが着側に増加する。このパラコ
ート処理マウスに２０４／１＃の前記と同じＳＯＤ誘導
体を静脈内投与すると血中ＧＯ’Ｉ’の増加が顕著に抑
えられた（第１６図参照）。Ｂｕ　−Ｓ　ＭＡが結合し
ていないＳＯＤを投与した場合には、この様な保護効果
が認められず、血中のＧＯＴレベルはコントロール群の
それと差がなかった。

また％ＳＯＤ誘導体は毒性試験においても低毒性である
ことが確認されている。

以上の結果より、ＳＯＤ誘導体は活性酸素ラジカルが関
与する種々の疾患に対して有効であり。

特に抗炎症剤、抗虚血障害剤、抗脳浮腫剤、抗パラコー
ト中毒剤として使用することができる。

さらにＳＯＤ誘導体は虚血性心疾患治療剤または活性酸
素ラジカルに起因する制癌剤の副作用を軽減するための
医薬としても有用である。

ＳＯＤ誘導体の投与量は疾病、患者の型温度、薬物に対
する忍容性などにより異なるが、通常成人１日あ九り０
．１〜５００ｒｑ、好ましくは０．５〜１００９の景で
あシ、これを１回または分割して投与するのがよい。投
与に際しては投与ルートに適した任意の形態をとること
ができる。

ＳＯＤ誘導体は任意慣用の製剤方法を用いて投与用に調
製することができる。したがって、本発明は少なくとも
１種のＳＯＤ誘導体を含有する医薬組成物をも包含する
ものである。このような組成物は任意所要の製薬用担体
、賦形剤などの医薬上許容される添加剤などを使用して
慣用の手段によって調製される。

この組成物が経口用製剤である場合には、該製剤は消化
管からの吸収に好適な形態で提供されるのが望ましい。

経口投与の錠剤およびカプセルは単位量投与形態であシ
、結合剤、例えばシロップ。

アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラカント、ポ
リビニルピロリ゛トンなど；賦形薬、例えば乳糖、とう
もろこし澱粉、りん酸カルシウム、ソルビット、グリシ
ンなど；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、ポリエチレングリコール、シリカなど；崩壊剤、
例えば馬鈴薯澱粉など；または許容し得る湿潤剤１例え
ば５’）リル硫酸ナトリウムなどのような慣用の賦形剤
を含有していてもよい。錠剤は当朶界において周知の方
法でコーティングしてもよい。経口用液体製剤は水性ま
たは油性懸濁剤、溶液、シロップ、エリ午シル剤、その
他であってもよく、あるいは使用する前に水または他の
適当なビヒクルで再溶解させる乾燥生成物であってもよ
い。このような液体製剤は普通に用いられる添加剤、例
えば懸濁化剤、例１ｆソルビットシロップ、メチルセル
ロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキ
シエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース。

ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用脂なト；　
乳化剤、　例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン
、アラビアゴムなト：非水性ビヒクル、例えばアーモン
ド油、分別ココナツト油、油性エステル、フロピレンゲ
リコール、エチルアルコールなど；防腐剤、例えばｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プ
ロピル、ソルビン酸などを含有してもよい。

また注射剤を：Ａ製する場合には、ＳＯＤ誘導体を生理
食塩水、注射用ブドウ糖液などの溶剤に溶解し、ＳＯＤ
誘導体２〜２０キ／溶剤２〜１ＯＮＩの濃度にＦＡ整し
、常法により皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。調製
時に必要によシ水溶液に田調整剤、緩衝剤、安定化剤、
保存剤、可溶化剤などを添加することができる。

上記の医薬組成物は、その形態等に依存して。

ＳＯＤ誘導体を一般に約０．Ｏ１〜５０１ｉ量係、好ま
しくは約０．１〜２０重量−の濃度で含有することがで
きる。

以下余白 実施例 以下に、実施例によシ本発明を説明する。なお、本発８
１ｊはこれらの実施例により限定されるものではない。

参考例１ スチレン−無水マレイン酸共重合体の合成無水マレイン
酸３８３　ｔ　（３，９ｍｏｌｅ）をクメン３．７ｔに
加えてクメ７還流下に攪拌した。この溶液にジクミルパ
ーオキシド１６．３　ｆ　（６０ｍｍｏｌｅ）およびス
チレｙ２０３　？　（１，９５ｍｏｌｅ）をクメン１．
７ｔに溶解させて得られた溶液を約４０分間を要して徐
々に滴下した。滴下終了後、１時間加熱攪拌を続けた。

得られた反応液を一夜静胃し、上澄液を除去したのち、
容器に付着した粘稠生成物をアセトンに溶解させて回収
した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去して
スチレン−無水マレイン酸共重合体（以下、これをＳＭ
Ａと略称する）を３５３ｆ得た。

ＳＭＡの分別 上記の方法で得られた５ＭＡｌ２Ｏ，ＯＦをアセトン３
ｔに溶解し、この溶液にｎ−ヘキサン４．９ｔを攪拌下
に約１時間で滴下した。白濁したアセトンとｎ−ヘキサ
ンとの混合液を別の容器に移し、この混合液にｎ−ヘキ
サン９．７４１を攪拌下に約１．５時間で滴下した。容
器の器壁に付着したアメ状物をアセトンに溶解させて回
収した。得られた回収液からアセトンを減圧下に留去し
たのち、７０〜８０℃の温度で一夜真空乾燥を行い、Ｓ
ＭＡの分別沈殿物を４９．２ｆ得た。

このようＫして得られたＳＭＡの分別沈殿物４０、Ｏｆ
をアセトン１ｔに溶解し、この溶液に表面シラン処理を
し九ガラスピーズ（平均粒径０．１ｗｍ　）　３．８−
を加えたのち、アセトンを蒸発させることによシガラス
ビーズ表面にＳＭＡを付着させた０ 内径８０ｍ、長さ８０ｃＷｔのカラムに上記のＳＭＡを
付着したガラスピーズおよびアセトンとｎ−ヘキサンと
の混合液（２５℃における容積比が２４ニア６であるも
の）１．４Ａを充填したカラム系の温度を２５℃に保ち
つつ２１９１の容積比のアセトンとｎ−へキサンとの混
合液〔アセトンとｎ−ヘキサンとの２５℃における容積
比が（１）２４ニアｓ。

混合液上、ｅｔおよび（１０３７：　６３の混合液６．
０ｔの頭で〕、ついでアセトン３．ＯＬの項でカラムの
上部よシ滴下供給した。上記のアセトンとｎ−ヘキサン
との容積比が３７　＋　６３の混合液が溶出する流出分
を集めた。この流出分から減圧下に低沸点物を留去し、
ついで７０〜８０℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ目的とする分別８Ｍ人を３１．８Ｆ得た。このものの
ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（以下、これ
をＧＰＣと略称する；テトラヒドロフラン溶出液、ポリ
スチレン標準）Ｋよる分析で重量平均分子量（Ｍｗ　）
および蒸気圧浸透圧計による測定ではＭｎは１２１０で
あった。また得られた分別ＳＭＡ中の無水マレイン酸含
有率を電位差滴定法によ〕求めたところ、４７．３モル
チであった。

上記の方法で分別された５ＭＡｌ０．Ｏｆ、ｎ−ブチル
アルコール２．２０ｆ、無水酢酸リチウム０．１０ｆお
よびジオキサン２０　ｄを磁気攪拌子を備えた約４０ｄ
容のアンプルに仕込み封管した。

このアンプルの内容物を攪拌下に９０℃の温度で２０時
間加熱した。得られた反応液の一部を取シ、反応液中の
未反応ｎ−ブチルアルコール量をエチルセロソルブを内
部標準としてガスクロマトグラフィーによシ定量し、仕
込みｎ−ブチルアルコールの反応率から共重合体中に存
在していた無水マレイン酸環の半ブチルエステル化度を
算出したところ６２％であった。次に、反応液をジオキ
サン２０１＋４で希釈し、この希釈液をｎ−ヘキサン４
００ｄ中に滴下して再沈殿の操作を行い、得られた沈殿
を回収して約６０℃の温度で一夜真空乾燥することによ
シ、目的とする部分半ブチルエステル化スチレンー無水
マレイン酸共重合体を１１．５ｆ得た。

このものの赤外線吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ。

ＫＢｒディスク法）の波数１７８０　ｃｔｓ−”　オヨ
Ｕ　７００ｃｔｓ−”における吸収強度を基にして、残
存無水マレイン酸環の含有率を求めたところ３０．３モ
ルチ（Ｂｕ−８ＭＡＩ分子中に含まれる無水マレイン酸
環は平均１．８個存在）であった。またＧＰＣの測定か
ら、このもののＭｖは１５３０であル、Ｍｎは１４４０
であった（　Ｍｙ／Ｍｎ＝１．０６　）。

合成例１ ヒト赤血球型５ＯＤ（３，０００単位／岬）５０〜（１
，５Ｘ１０　　モル）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶
液（田８．ｏ）１ｏｙに３７℃で攪拌しながら溶解させ
た。溶解後、この溶液にスチレン−無水マレイン酸共重
合体〔ジクミルパーオキシドを開始剤としてクメン中で
溶液重合したもの、スチレンと無水マレイン酸との共重
合モル比１：１．ＭＹ＝１２８０、分子量分布ｓ　Ｍｙ
／Ｍｎ　＝　１．２０以下〕を部分半ブチルエステル化
したスチレン−無水マレイン酸共重合体（ＭＹ：１６０
０％エステル化度；６０モルチ、無水マレイン酸環含有
量＝２５モルチ（１分子中に含まれゐ無水マレイン酸環
は平均１．６個存在））８０１１１９（５ｍＭ、反応液
中の最終Ｂｕ−８ＭＡ濃度を意味する。以下同様。）を
固体粉末のｉｔ徐々に添加し、−時間反応させた。

ヒト赤血球型ＳＯＤのアミノ基がＢｕ−８ＭＡと反応す
る経過を観察するためにトリニトロベンゼンスルホン酸
ナトリウム（ＴＮＢＳ）で残存アミノ基を定量した。用
いたヒト赤血球１１ｓＯＤには１分子当）２２側のアミ
ノ基が存在しておシ、これらのアミノ基のうちでＴＮＢ
Ｓ法によシ定量可能なアミノ基は約１０〜１１個である
が、上記の反応条件下ではヒト赤血球Ｗ　Ｓ　ＯＤｏの
アミノ基の２０モル％（定量可能なアミノ基の約４４モ
ルチに相当）がＢｕ−８ＭＡと反応したことが確認され
た。反応液を濾過後、濾液をセファデックスＧ−１００
（商品名、７ア一マシア社製、スエーデｙ国）を充填し
九に５０／３０カラム（商品名、ファーマシア社製、ス
エーデン国）に注入し、ゲル濾過した。２０−０重炭酸
アンモニウムと炭酸アンモニウムとの混合液を溶出液と
し、流出液を２　ｇ　Ｑ　ｎｍで検出し、吸収部分の溶
出液を分取し、限外濾過膜（ザルトリウス５Ｍ１４５−
３９）Ｐｃよシ濃縮し、これを凍結乾燥し、白色粉末５
２”Ｆを得意。得られ六粉末のＵＶ吸収スペクトル〔第
２図においてＳＯＤ誘導体（１）として示す〕および原
料ＳＯＤとＢｕ−８ＭＡのＵＶ吸収スペクトルをリン酸
緩衝液を用いて４７．１ｉで測定し、それぞれ第２図に
示した。また、同様にして作成した５μｌの：、Ｃｒラ
ベル標品（反応生成物）を用いてアンフオラインによる
等電点分画（１１，５〜６．０．７００ｍＶ、１２時間
通電、１ＷＩｌ／フラクシヨンで分画）を行い、Ｆ！（
と放射活性を測定し、その結果を第８図に示した。得ら
れた粉末の等電点け２．０であった。さらに、得られ九
白色粉末の蛋白質含有量をローリ−法で測定したところ
５Ｏｔｓであつ几。これらの結果に基づき、５ＯＤＩ分
子当シ結合したＢｕ−８ＭＡの分子数を決定し九〇 以上のことよシ、得られた白色粉末は５ＯＤＩとのモル
比１：１．６０％ブチルエステル化、Ｍｙ＝１６００　
）が平均５分子結合（ＳＯＤの７ミノ基とＢｕ−８ＭＡ
の無水マレイン酸環との反応による結合）Ｌ、ｆＩ−８
ｏＤ誘導体であると同定し九。

合成例２ ヒト赤泊球型５ＯＤ（３，０００単位／ＩＩＦ　）　５
０叩を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（ＰＨ８，０）
１０ｄに３７℃で攪拌しながら溶解させ念ｏ得られ念溶
液に合成例１で用いたＢｕ−８ＭＡと同じもの３０η（
１，９ｍＭ）を徐々に添加し１合成例１と同様に上記ヒ
ト由来ＳＯＤと反応させ、得られた反応液を合成例１と
同様に処理し、白色粉末４５Ｑを得意〇得られた白色粉
末について合成例１と同様に測定したＵＶ吸収スペクト
ルを第２図〔ＳＯＤ誘導体（ＩＩ）として示す〕に示し
１等電点分画を行い％田と放射活性を測定した結果を第
９図に示した。得られ九粉末の等電点け４．４であった
０ま之。

残存アミノ基′ｆ：ＴＮＢＳ法で定量し念結果、原料Ｓ
ＯＤのアミノ基の約９−ｅルー（定量可能なアミノ基の
約２０モル１１に相当）がＢｕ−８ＭＡと反応したこと
が確認された。

以上のことよシ、得られた白色粉末は、５ＯＤ１分子当
り平均２分子のＢｕ−８ＭＡが結合し九Ｓ０Ｄ誘導体で
あると同定し±０ 合成例３ ヒト赤血球型５ＯＤ（３，０００単位／冨ｇ）５言ｑ（
１，５長１０−７モル）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水
溶液（…８．０　）　１　ｒａｔに溶解したのち、得ら
れた溶液に合成例１で用いたＢｕ−８ＭＡと同じもの４
１３９（２，ｓｍＭ）を加えて３７℃で反応させ、反応
時間の経過とＳＯＤが有するアミノ基量との関係を第５
図に示した０なお、アミン基の定量はＴＮＢ　Ｓ法によ
シ行つ九。用いたヒト赤血球型５ＯＤＫは１分子当９２
２個のアミン基が存在しており、これらのアミノ基のう
ちでＴＮＢＳ法により定量可能なアミノ基は約１０〜１
１個であるが、上記の反応条件下では１時間に定量可能
なアミノ基の約３８モルチがＢｕ−８ＭＡと反応し几こ
とが確認され、５ＯＤＩ分子に約４分子（Ｄ　Ｂｕ　−
Ｓ　ＭＡ　ｆ）ｘ結合し九ＳＯＤ誘導体を得ることがで
き九０２時間反応させたのち１反応液にさらに同量のＢ
ｕ−８ＭＡを添加した場合、第１図に示すように（・・
・・・・・・・・・・・）アミノ基量けさらに減少した
。これより明らかなように１反応させるＢｕ−３ＭＡの
量を変えることによｐ、ＳＯＤ分子に結合するＢｕ−８
ＭＡの量をコントロールすることが可能であることがわ
かる。

合成例４ ヒト赤血球型５ＯＤ（３，０００単位／■）１０富９（
３，０Ｘ１０−７モル）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水
溶液（ｐＨ８，０）１ｍｌに溶解し、得られた溶液に第
１表に示す種々の部分加水分解されたスチレン−無水マ
レイン酸共重合体または部分半エステル化され念スチレ
ンー無水マレイン酸共重合体を反応液における最終濃度
が２．５　ｍＭになるように加え。

３７℃で１時間反応させ九〇反応後、ＳＯＤ中の残存ア
ミノ基をＴＮＢＳ法で定量した結果、いずれの場合も定
量可能なアミン基の１５〜２５モルチのアミン基が減少
していることが確認された。

いずれの場合も５ＯＤＩ分子に平均１．７〜２．８個の
ヌチレンーマレイン酸共重合体が結合したＳ。

Ｄ誘導体が得られた。

第１表 ４−１　　有（ブチルエステル）　　　　　６０　　　
　　１．３　　　１２００４−２　有（ｐ　　　　）　
　　　　４０　　　　　２．０　　　１６００４−３　
有（＃　　　　）　　　　　７０　　　　　１．５　　
　１６００４−４　有（１）　　　　　６０　　　　１
．９　　　２０００４−５　有（メチルエステル）　　
　　　６０　　　　　１．３　　　１６００４−６　有
（エチルエステル）　　　　　６０　　　　　１．７　
　　１６００メトキシエチル ４−７　有（−’）　　　　　６０　　　　　１．３　
　　１６００ニスアル ２−７ト“′ジ　　　　　　６０　　　　　　　１．７
　　　　　１６００４−８　　有（，１エユテ。

１゛３−ジ””’−２）　　　　６　０　　　　　　　
　１．４　　　　　１６００４−９　有（−プ。ヒλエ
ユア。

１°３−ガト”−２）　　　　　　６　０　　　　　　
　　１．３　　　　　１６００４−１０　有（−プ。う
７エテヤ 合成例５ 合成例４においてスチレン−無水マレイン酸共重合体の
代りに部分加水分解されたインブテン−無水マレイン酸
共重合体（ＭＷ＝２５００．無水マレイン鎖環含量＝３
．０個／１分子）を用いる以外は合成例４と同様に反応
および分離操作を行や。

５ＯＤＩ分子に約４個のイソブチン−マレイン酸共重合
体が結合したＳＯＤ誘導体を得た。

合成例６ 合成例４においてスチレン−無水マレイン酸共重合体の
代りに第２表に示す種々の共重合体を用いる以外は合成
例１と同様に反応および分離操作を行い、それぞれ対応
するＳＯＤ誘導体を得た。

以下余白 合成例７ 所定量のヒト赤血球型５ＯＤ（シグマ社製、３２００単
位／１ｑ）を０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（田８．
０）に５８１／Ｉｄの濃度となるように溶解させた。こ
の溶液に部分加水分解されたスチレンと無水マレイン酸
との共重合体（分子量約１４００．１分子あたりの無水
マレイン鎖環含量約１．０個）、部分加水分解されたｐ
−ブロムスチレンと無水マレイン酸との共重合体（分子
量約１６００．１分子あたシの無水マレイン鎖環含量約
１．５個）、部分加水分解され九α−メチルスチレンと
無水！レイン酸との共重合体（分子量約１６００１分子
あたシの無水マレイン鎖環含量約３．３個）または部分
加水分解されたイソブチレンと無水マレイン酸との共重
合体（分子量２５００，１分子あたシの無水！レイン鎖
環含量約３．５個）の所定量を各々加え、２５℃の温度
で１時間反応させた。得られた反応液をセファデックス
Ｇ−７５スーパーフアイン（商品名、ファーマシア社製
、スエーデン国）を充填し九に２６／４０カラム（商品
名、ファー嗜シア社製、スエーデン国）に注入し、ゲル
濾過した。１０ｍＭの重炭酸アンモニウムと炭酸アンモ
ニウムとの混合液を溶出液とし、流出液を２８０ｎｍ、
２５４ｎｍで検出し、未反応の共重合体を除いた吸収部
分の溶出液を分取し、これを凍結乾燥し、白色粉末状の
５ＯＤｉ９導体を各々得た。結果を第３表に示りには１
分子当＃）２２個のアミノ基が存在しておシ、これらの
アミノ基のうちでＴＮＢ　Ｓ法により定量可能なアミノ
基は約１０〜１１個である。

ヒト赤血球型ＳＯＤおよびウシ赤血球型ＳＯＤのＩＲ吸
収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ％ＫＢｒディスク法）を各々
第４図（１）および第４図（２）に示し、第３表中の１
６７−１、Ａ７’−２および４７−３のＳＯＤ誘導体の
ＩＲ吸収スペクトル（ＦＴ−ＩＲ。

ＫＢｒディスク法）を各々第５〜７図に示す。

第５〜７図には第４図（１）に示されるヒト赤血球型Ｓ
ＯＤの吸収スペクトルに加えて各共重合体由来の吸収ス
ペクトル（矢印で示す部分）が認められ、これらの図に
示される吸収スペクトルからＳＯＤに各共重合体が結合
していることがわかる。

また上記の方法においてヒト赤血球型ＳＯＤの代シにウ
シ赤面゛録型ＳＯＤを用いる以外は同様の反応および分
離操作を行うことによシ、対応する同様のＩＲ吸収スペ
クトルを有するＳＯＤ誘導体を得た。

試験例５ ヒト赤血球ＷＩＳＯＤ５可／ｄを３７℃、田８．０で種
々の濃度（０，１４，０，３７，０，７５，１，５，３
，６および１２ｒｌ１Ｍ）のＢｕ−８ＭＡと１時間反応
させ、Ｂｕ−８ＭＡの結合量の変化した種々のＳＯＤ誘
導体を調製し、得られたＳＯＤ誘導体のＢｕ−８ＭＡの
結合量と酵素活性との関係を調べた。なお、酵素活性の
測定はジャーナル・オブ・バイオロジカルケミストリー
（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅ
ｍｉｓｔｒ７　）　、　２４４　、６０４９〜６０５５
（１９６５）に記載されている方法に従った。反応液中
のＢｕ−８ＭＡ濃度と得られたＳＯＤ誘導体が有する残
存アミン基量（ＴＮＢＳ法で測定）および酵素活性との
関係を第３図に示した。第３図によればＢｕ−８ＭＡ濃
度が６ｍＭの場合、得られ九ＳＯＤ誘導体中のＴＮＢＳ
反応性アミノ基の残存量は約５０チであるが（前述のよ
うに原料５ＯＤＩ分子中のアミノ基２２個のうちでＴＮ
ＢＳ反応性アミノ基は約１０〜１１個であるので、この
場合５個のアミノ基が反応し、１７個のアミノ基が未反
応で残っていることＫなる）、酵素活性が５０チ維持さ
れていること、またそれ以上Ｂｕ−Ｓ　Ｍ　Ａの結合量
が増加すると酵素活性が５０チ以下に低下することがわ
かる。したがって、ＳＯＤへの極度の化学修飾は酵素活
性の維持に好ましくな（、ＳＯＤの酵素活性を維持させ
るためには５ＯＤＩ分子に結合される共重合体の数は約
６分子までに抑える必要がある。なお、第３図に示され
るように、ＳＯＤ１分子に２分子のＢｕ−８ＭＡが結合
したＳＯＤ誘導体の場合にはＳＯＤそのものの酵素活性
に対して８０チの酵素活性が維持されている。

合成例２で得られたＳＯＤ誘導体と原料ＳＯＤのプロテ
アーゼ感受性を比較検討した。反応は田７．４．３７℃
で行った。ＳＯＤ誘導体およびＳＯＤを１ｄ当り１５ユ
ニツト（５μｇ／ｍｌ）で各々Ｑ、１１Ｎｉ／Ｊのトリ
プシン、キモトリプシンおよびパパインと反応させ九。

それらの結果を第１１図に示した。両者ともパパインで
僅かく酵素活性が低下するが、他のプロテアーゼでは失
活することなく、両者とも安定であった。したがって、
ＳＯＤを共重合体が修飾してもその酵素化学的安定性は
変化しないと結論される。

試験例６ 合成例２で得られたＳＯＤ誘導体と原料のＳ０Ｄのそれ
ぞれをクシ血清アルブミン−セファｏ　−ヌカ２ムによ
るアフイニテイクロマトグラフイーに付した。それらの
結果を第１０図に示した。原料の８０Ｄはアルブミンに
結合せず、ナベてカラムを素通りした。ＳＯＤ誘導体は
９５ｑ６以上がアルブミンカラムに結合した。ＳＯＤ＠
導体のかなシの部分が０．１％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）処理によシカラムから溶出されたが、この
条件下では依然として約３０％のＳＯＤ誘導体がカラム
に結合しておシ、次にカラムを塩酸グアニジンで変性処
理することによってＳＯＤ誘導体のすべてが溶出された
。また、０．５％のＳＤＳ処理ではほぼ全景のＳＯＤ誘
導体がアルブミンカラムから溶出された。このことはＢ
ｕ−８ＭＡが結合し九ＳＯＤ誘導体は原料ＳＯＤとは異
なシ、アルブミンと強く結合することを示す。

次に、合成例２で得られたＳＯＤ誘導体ま之は原料のＳ
ＯＤのそれぞれをラットに静脈内投与し、血中での濃度
変化を測定した。それらの結果を第１２図に示す。第１
２図から明らかなように、原料ＳＯＤは血中濃度が短時
間で低下する（半減期５分）のに比し、ＳＯＤ誘導体の
血中濃度は極めて長時間高いレベルに保たれる（半減期
６時間）。

このことはＳＯＤ誘導体がＢｕ−ＳＭＡの存在によって
血中のアルブミンと強く結合することによるものと推察
される。

合成例４．５および６で得られたＳＯＤ紡導体について
も、上記と同様にウシ血清アルブミン−セファロースカ
ラムによるアフイニテイクロマトグラフイーを行った。

いずれのＳＯＤ誘導体についても、その９０ヂ以上がア
ルブミンカラムに結合し、カラムからの溶出にはドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理を必要とした。このこ
とはいずれの；ＯＤ誘導体もアルブミンと強く結合する
ことを示すものであＪ’％　ＳＯＤと結合している共重
合体中の疎水性基およびカルボキシル基の存在によるも
−のと推察される。

また、合成例２においてヒト赤血球型ＳＯＤの代りにウ
シ赤血球型ＳＯＤを用いる以外は合成例２と同様の反応
および分離操作を行うことＫよシ、ウシ赤血球型５ＯＤ
Ｉ分子にＢｕ−ＳＭＡが２分子結合した５ＯＪＩ導体が
得られた。この８０１）誘導体についても上記の試験結
果と同様の結果が得られ、ヒト赤血球型ＳＯＤとウシ赤
血球型ＳＯＤとでは差はみられなかった。

試験例７ 合成例２で得られたＳＯＤ誘導体をラット血清と混和し
、混和物をゲル濾過の操作（セファクリルＳ−２００、
ＳＤラット血清Ｑ、　２＃Ｉｌｌ、サンプル０、２　Ｗ
　’）に付した場合、５ｏＤｓ導体はアルブミンを主体
とする血清蛋白質に結合して溶出することが認められた
。一方、原料ＳＯＤをラット血清と混和し、混和物につ
いて同様のゲル濾過を行ったところ、ＳＯＤは血清蛋白
質と相互作用することなく、それ自身の分子量３３，０
００の位置に溶出された。

また、アルブミンを欠損する無アルブミンラットの血清
と上記のＳＯＤ誘導体を混和し、混和物について同様に
ゲル濾過を行った場合、かなシの量のＳＯＤ誘導体が非
アルブミン画分の血清蛋白質に結合して溶出された。し
たがって、血中のアルブミン濃度が低い場合には、ＳＯ
Ｄ誘導体は他の血清蛋白質に結合して挙動すると考えら
れる。

このことは血清アルブミン濃度が低下する疾患に対して
もＳＯＤ誘導体が有効に作用できることを示す。′ 試験例８ 合成例２に記載の方法に準じて調製した５１０ｒ標識し
１ｐｓｏｏｉｙｌ導体、合成例２で用いたＢｕ−ＳＭＡ
と同様の３Ｈ標識したＳＭＡおよびＳＯＤをそれぞれラ
ット（体重２００　ｔ　）　Ｋ　２００，０００　ｃｐ
ｍ／ｒａｔ量静脈内投与し、１時間後の臓器中の放射活
性を測定した。それらの結果を第４表に示す。第４表か
ら明らかなとおり、ＳＯＤ誘導体の尿中排泄は着側に抑
制されており、血中半減期が延長し、ＳＯＤ誘導体は各
臓器に高濃度に移行することがわかる。

以下余白 第　　　４　　　表 放射性ＳＯＤの臓器分布 血液（ｃｐｍ／ｓ＃）　　　　　　４７　　　４４００
　　　７０４５脳　　　　　　　　　　　　　２７　　
　　２６２　　　　２３０肺臓　　　　１９０　　８４
９　　４５４心臓　　　　１２７　　２６２　　３８３
肝臓　　　　２６１　１１６６７　　８３２腎＠　　　
　１６２００　３３７２０　　４３４尿　　　　　　　
　　　８９７２５　　　　　　６７　　　　２４８牌臓
　　　　　８０　　４９６　　３８５胃　　　　　　　
　　　　　　　　　　１２０　　　　　　２７１　　　
　　　３６３小腸（ｃｐｍ／２ｆ）　　　　１６０　　
　１３００　　　　１５９以上の試験例の結果から明ら
かなように、５ＯＤｌｌ導体は、ＳＯＤそのものに近い
酵素活性を有し、かつＳＯＤそのものに比べ大幅に延長
された血中半減期を有する。また、ＳＯＤ誘導体は血清
蛋白質との可逆的な相互作用を有してお６、ｓ。

Ｄを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利である。一
般に、炎症局所および虚血性疾患局所の田は低下してお
シ、このような局所にはプロトン化されたカルボキシル
基含有化合物が集積分布すると言われている。ＳＯＤ誘
導体はカルボキシル基を有していることから、このカル
ボキシル基がプロトン化されることＫよシ、炎症局所お
よび虚血性疾患局所に効率よく集積分布されることが期
待される。

次に、本発明の５ＯＪＩ導体のうち合成例２で得られた
ＳＯＤ誘導体を有効成分として含有する製剤例を示す。

製剤例１ 下記の成分を用いて常法によシ腸溶性カプセル剤を調製
した。

合成例２で得られた５ＯＤｉＩ！導体　　２０岬乳糖　
　　　　　　４６９ コーンスターチ　　　　　　　　　　１６ｗｇ結晶性セ
ルロース　　　　　　　　　　１２１１Ｐグリコール酸
セル四−ス　　　　　　　５ｑ（１カプセル当夛）　　
　　　　　　１０９１９上記の腸溶性カプセル剤は、通
常大人に１回２カプセルを食後に１日３回投与する。

製剤例２ 下記の成分を用いて常法によシ腸溶錠剤を調製し九。

合成例２で得られたＳＯＤ誘導体　　　　２０　１１Ｉ
乳糖　　　　　　　　７９　Ｔｌｖ コーンスターチ　　　　　　　　　　　　　４５．５１
ｖ（１錠当シ）　　　　　　　　　　　　　　１４５　
　ｍｙ上記の腸溶錠剤は、通常大人に１回２錠を食後に
１日３回投与する。

製剤例３ 次の方法によシ注射用製剤を調製した。

合成例２で得られたＳＯＤ誘導体１０岬を生理食塩水に
溶解して容積を５−とし滅菌ミクロボア・フィルターで
濾過した。濾液を滅菌こはく色ガラスびん（１型、３７
）に封入した。

発明の効果 本発明によれば、ＳＯＤの酵素活性を概ね保持し九まま
で該ＳＯＤに比べて大＠に延長された血中半減期を有す
る新規な非巨大分子化ＳＯＤ誘導体が提供される。ＳＯ
Ｄ誘導体は血清蛋白質との可逆的な相互作用を有してお
ｊ）、ＳＯＤを疾患局所へ移行させるうえで非常に有利
である。またＳＯＤ誘導体は抗炎症作用、抗虚血障害作
用、抗脳浮腫作用、抗バラコート中毒作用を併わせ有す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、合成例３に示すＳＯＤとＢｕ　−Ｓ　Ｍ人と
の反応において、反応時間とＳＯＤ中のＴＮＢＳ反応性
アミノ基減少率との関係を示した図である。第２図は合
成例１および合成例２で得られたＳＯＤ誘導体ならびに
原料である８０Ｄ＞よびＢｕ−８ＭＡのＵＶスペクトル
を示した図である。 第３図は試験例５に示す反応液中のＢｕ　−８Ｍ人濃度
と得られたＳＯＤ誘導体が有するＴＮＢＳ反応性アミノ
基量および８０Ｄ活性との関係を示した図である。第４
図（１）はヒト赤血球型ＳＯＤのＩＲスペクトルを示し
た図であシ、第４図（２）はウシ赤血球型ＳＯＤのＩＲ
スペクトルを示した図である。 第５図、第６図および第７図は各々合成例７のＡ７−１
、ｌ６７−２および屋７−３で得られた各々のＳＯＤ誘
導体のＩＲスペクトルを示した図である。第８図は合成
例１で得られたＳＯＤ誘導体を５１Ｃｒでラベルし、等
電点分画を行い、田と放射活性を測定した結果を示した
図である。第９図は合成−２で得られたＳＯＤ！！ｌＩ
導体を５１Ｃｒでラベルし、等電点分画を行い、田と放
射活性を測定した結果を示した図である。第１０図は合
成例２で得られたＳＯＤ誘導体および原料ＳＯＤのウシ
血清アルブミン−セファロースカラムによるアフイニテ
ィクロマトグツフィーの結果を示した図である。第１１
図は合成例２で得られたＳＯＤ誘導体および原料ＳＯＤ
の各種グロテアーゼに対する抵抗性を比較した図である
。第１２図は合成例２で得られたＳＯＤ誘導体または原
料ＳＯＤのそれぞれをラットに静脈内投与したときの経
過時間による血中濃度の変化を示し意図である。第１３
図は左側大腿筋Ｋ　Ｏ，２ａｄのへペスバツファ−（Ｆ
４（６，０）を、また右側大腿筋に０．２　ｄの生理食
塩水をそれぞれ筋肉内投与したマウスにＳＯＤ誘導体ま
たは部分半フチルエステル化シタスチレン−無水マレイ
ン酸共重合体（以下、これをＢｕ−８ＭＡと略記する）
を静脈内投与し、左側（酸性側）と右側（コントロール
側）におけるＳＯＤ誘導体またはＢｕ−８ＭＡの経時的
組織集積量を示した図である。第１４図は水浸拘束によ
シ誘起されるラットの急性胃粘膜障害に対するＳＯＤ誘
導体の抗消化性潰瘍作用に関し、潰瘍係数（ｍｍ／　ｔ
ｉｓｓｕｅ）とストレス負荷時間との関係を示した図で
ある。第１５図（１）はラットの脳浮腫を起こした右大
脳半球（病側）、左大脳半球（体側）または血液中にお
けるＳＯＤ誘導体の組織集積量を示した図であシ、第１
５図（２）は同じラットの病側、体側または血液中にお
けるＢｕ−８ＭＡの組織集積量を示した図である。第１
６図は、パラコート処理マウスにＳＯＤ誘導体を投与し
た場合と、投与しない場合（コントロール）とについて
、パラコート投与後の時間と血漿中のＧＯＴレベルとの
関係を示した図である。 幡　′Ｌ　　図 父人時間（時開〕 箒　２　図 う皮表（ｎｍ） 第３　区 日ｕ−５ＭＡ　Ｊ　１１　　　（ｍＭ）吸光度 吸光度 圃し老膚 σ　　　　　　　δ −舊 第　１０　図 第１１図 反応持藺０痺聞） 第１２　　ｆｆｉ 経通錆聞扮） 第１３　口 注Ｘ後の時間　　（弁） 第１４　図 ストレス夛Ｕ野涛聞　（時間） 第１５　図 壌１６　図 手続補正Ｓ　（自発） 昭和６２年７月２日 昭和６２年特許願第７５２５３号 ２、発明の名称 スーパーオキシドジスムターゼ誘導体 およびその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 熊本重態本市池田３丁目４９−３ 井上正康 倉敷１ｒｌｆｉ津１６２１１ｊｌｋ ４、代理人 倉敷市酒津冑江山２０４５の１ 株式会社　　り　　ラ　　し　　内 電話　東京　０３（２７７）３１８２ ５、補正の対象 明細書の特許請求の範囲の欄、発明の詳細な説明の欄お
よび図面の簡単な説明の欄な６、補正の内容 （１）明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。 （２）明細書第８頁第１０行の１’−（ＳＯＤ）−（Ｚ
″ｌｘ　Ｊをｒ（ＳＯＤ）（Ｚ）ｘＪに訂正する。 （３）°明細書第１２頁第８行の「有効成分化合物であ
る」を「目的とする」に訂正する。 （４）明細書第１４頁第６行の「構造単位」を「構成単
位」に訂正する。 （５）　　明細書第１４頁第１３〜１４行の「有効成分
化合物として」を「ＳＯＤ誘導体の医薬用途Ｋｌに訂正
する。 （６）明細書第１４頁最下行および第１６頁第５行の「
本発明」を「医薬」Ｋ訂正する。 （γ）　明細書第１５頁第６〜７行の「有効成分化合物
である」を削除する。 （８）明細書第１５頁第１０行および第１９行の「有効
成分化合物」を「５ＯＤｌ！導体」に訂正する。 （９）明細書第１７頁第６行の［ＰＮＡｓＪを［プロシ
ーデイングズ・オプ・ザ・ナショナル・アカテミイ・オ
フ−サイエンシス（ＰｒＯＣｅｅｄｌｎｇ８０ｆｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎ
ｃｅｓ　）　Ｊに訂正する。 （３）明細書第１７頁第７行の１’−ＡＢＢＪを「アル
カビンス・オプ・バイオケミストリー・アンド・（ロ）
明細書第２７頁第４〜７行の「したがって、本発明−中
略−このような組成物Ｊを［ＳＯＤ誘導体を少なくとも
１種含有する医薬組成物］Ｋ訂正する。 （２）明細書第２７頁第１４〜１５行の「トラカント」
を［トラガカントー］に訂正する。 α鴫　明細書第３４頁第１２行の「溶液重合」を「ラジ
カル重合」に訂正する。 に）明細書第３７頁第８行の「ヒト由来ＳＯＤ　Ｊを［
ヒト赤血球型５ＯＤＪに訂正する。 （ロ）明細書第４１頁第６行の「合成例１」を「合成例
４」に訂正する。 （ロ）明細書第４３頁第２〜３行の「シグマ社製、３２
００単位／岬」を「シグマ社製」に訂正する０（ロ）明
細書第５０頁第１５行のｒ３３，０００」を「約３３，
０ＯＯＪに訂正する。 （ホ）明細書第５１頁第１０行の「ＳＭＡ」を［Ｂｕ−
８ＭＡｊに訂正する。 （２）明細書第５４頁下から第５行のｌ’−５ｇｇとし
」を「５ゴとし、」に訂正する。 −明細書第５７頁第１〜３行の「部分半ブチルエステル
化したスチレン−無水マレイン酸共重合体（以下、これ
をＢｕ−ＳＭＡと略記する）」をｒＢｕ−８ＭＡＪに訂
正する。 緯）第４図（１）、第４図（２）、第５図、第６図およ
び第７図を別紙のとおシ訂正する。 （別　　紙） 「２、特許請求の範囲 １、式 ％式％（： 〔式中、〔ＳＯＤ〕はアミン基に換えてアミノ基から′
１個の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパ
ーオキシドジスムターゼを表わし、〔ｚ〕は およびＲ５はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし
、Ｒ２は水素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基
を表わし　Ｈ４は水素原子または炭素数１ないし５のア
ルキル基を表わし、Ｒ６はメチル基またはエチル基を表
わす）で示される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数１ないし４のアルカノール、炭素数
１ないし４のアルキル基部分を含むエチレングリコール
モノアルキルエーテルもしくは炭素数１ないし４のアル
キル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから水
酸基を除いた残基を表わす）で示される基および。 子の結合手は（ＳＯＤ）と結合するものであ、ることを
意味する）で示される基を構成単位とし、かつ平均分子
量が８００ないし２００００である共重合体の一価の基
を表わし、Ｘは［ＳＯＤ］が有するアミノ基から１個の
水素原子を除いた基の数に対応する工ないし６の整数を
表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ防導体。 ２、スーパーオキシドジスムターゼと ＲＩ　　　　　　　　Ｒ３ はそれぞれ水素原子またはメチル基を表わし　Ｒ２は水
素原子、塩素原子、臭素原子またはメチル基を表わし、
Ｒ４は水素原子または炭素数１ないし５のアルキル基を
表わし　Ｒ８はメチル基またはエチル基を表わす〕で示
される基からなる群から選ばれる基、 すか、または炭素数１ないし４のアルカノール、炭素数
１ないし４のアルキル基部分を含むエチレンクＩＪコー
ルモノアルキルエーテルもしくａ炭素数１ないし４のア
ルキル基部分を含むグリセリンジアルキルエーテルから
水酸基を除いた残基を表わす）で示される基および で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が８００
ないし２００００である共重合体とを…７〜１１のアル
カリ水溶液中で反応させることを特徴とする式　　（Ｓ
ＯＤ）ＣＺ）ｘ 〔式中、〔ＳＯＤ〕はアミン基に換えてアミノ基から１
個の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパー
オキシドジスムターゼヲ表わし、〔２〕よびＲ６は前記
定義のとおシである〕で示される基からなる群から選ば
れる基、 シである）で示される基および 子の結合手は（ＳＯＤ）と結合するものであることを意
味する）で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量
が８００ないし２０００Ｇである共重合体の一価の基を
表わし、Ｘは（ＳＯＤ）が有するアミノ基から１個の水
素原子を除いた基の数に対応する工ないし６の整数を表
わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
法。　　　　　　　　　　　　　　　　　」鏝光度 吸光度 吸光度 吸光座

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 〔ＳＯＤ〕−〔Ｚ〕＿ｘ 〔式中、〔ＳＯＤ〕はアミノ基に換えてアミノ基から１
   個の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパー
   オキシドジムターゼを表わし、〔Ｚ〕は （イ）▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
   学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
   ます▼ または▲数式、化学式、表等があります▼（これらの式
   中、Ｒ＾１、Ｒ＾３およびＲ＾５はそれぞれ水素原子ま
   たはメチル基を表わし、Ｒ＾２は水素原子、塩素原子、
   臭素原子またはメチル基を表わし、Ｒ＾４は水素原子ま
   たは炭素数１ないし５のアルキル基を表わし、Ｒ＾６は
   メチル基またはエテル基を表わす）で示される基からな
   る群から選ばれる基、 （ロ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ＾
   ７は水素原子を表わすか、または炭素数１ないし４のア
   ルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部分を含む
   エチレングリコールモノアルキルエーテルもしくは炭素
   数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリンジアル
   キルエーテルから水酸基を除いた残基を表わす）で示さ
   れる基および （ハ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、カル
   ボニル基の炭素原子の結合手は〔ＳＯＤ〕と結合するも
   のであることを意味する）で示される基を構成単位とし
   、かつ平均分子量が８００ないし２００００である共重
   合体の一価の基を表わし、Ｘは〔ＳＯＤ〕が有するアミ
   ノ基から１個の水素原子を除いた基の数に対応する１な
   いし６の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体。 ２、スーパーオキシドジスムターゼと （イ）▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
   学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
   ます▼ または▲数式、化学式、表等があります▼（これらの式
   中、Ｒ＾１、Ｒ＾３およびＲ＾５はそれぞれ水素原子ま
   たはメチル基を表わし、Ｒ＾２は水素原子、塩素原子、
   臭素原子またはメチル基を表わし、Ｒ＾４は水素原子ま
   たは炭素数１ないし５のアルキル基を表わし、Ｒ＾６は
   メチル基またはエチル基を表わす）で示される基からな
   る群から選ばれる基、 （ロ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ＾
   ７は水素原子を表わすか、または炭素数１ないし４のア
   ルカノール、炭素数１ないし４のアルキル基部分を含む
   エチレングリコールモノアルキルエーテルもしくは炭素
   数１ないし４のアルキル基部分を含むグリセリンジアル
   キルエーテルから水酸基を除いた残基を表わす）で示さ
   れる基および （ハ）▲数式、化学式、表等があります▼ で示される基を構成単位とし、かつ平均分子量が８００
   ないし２００００である共重合体とをｐＨ７〜１１のア
   ルカリ水溶液中で反応させることを特徴とする式〔ＳＯ
   Ｄ〕−〔Ｚ〕＿ｘ 〔式中、〔ＳＯＤ〕はアミノ基に換えてアミノ基から１
   個の水素原子を除いた基を１ないし６個有するスーパー
   オキシドジスムターゼを表わし、〔Ｚ〕は （イ）▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化
   学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があり
   ます▼または ▲数式、化学式、表等があります▼（これらの式中、Ｒ
   ＾１、Ｒ＾２、Ｒ＾３、Ｒ＾４、Ｒ＾５およびＲ＾６は
   前記定義のとおりである）で示される基からなる群から
   選ばれる基、 （ロ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ＾
   ７は前記定義のとおりである）で示される基および （ハ）▲数式、化学式、表等があります▼（式中、カル
   ボニル基の炭素原子の結合手は〔ＳＯＤ〕と結合するも
   のであることを意味する）で示される基を構成単位とし
   、かつ平均分子量が８００ないし２００００である共重
   合体の一価の基を表わし、Ｘは〔ＳＯＤ〕が有するアミ
   ノ基から１個の水素原子を除いた基の数に対応する１な
   いし６の整数を表わす〕 で示されるスーパーオキシドジスムターゼ誘導体の製造
   法。