JPH01101881A - アルカリプロテアーゼ産生微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は土壌より分離して得られたバチルス属に属する
新規微生物に関する。更に、詳しくは洗浄剤に配合し、
アルカリ性条件下、低温洗浄（１５℃付近）での洗浄力
向上に寄与しうる新規のアルカリプロテアーゼを産生ず
る新規微生物に関する。

〔従来技術とその問題点コ 洗浄力の向上を企る為に、各種の加水分解酵素を洗浄剤
に配合することが種々検討されてきており、中でも蛋白
質分解酵素は洗浄剤単独では落し難い蛋白質汚垢を効率
良く分解する事から、洗浄剤への配合が広く行なわれて
おり、近年ではアルカリプロテアーゼの需要が増大して
いる。これらの内で洗浄剤添加酵素として実用に供され
ているものは、バチルス　リケニフォルミス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス　ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ３ｕｂｔｉｌｉｓ）等に由
来するアルカリプロテアーゼであり、例えばアルカラー
ゼ（ノボ社）、マキサタ−ゼ（ギスト社）等が使用され
ている。一方、我国では水道水を直接洗浄に用いる習慣
がある為、年間を通しての国内での平均洗浄温度は１５
℃前後である。しかしながらこれらの酵素を温度〜作用
特性の面から見ると、至適温度を６０℃近辺に持つ高温
・高活性型であり、低温（１５℃前後）ではその作用は
極めて限定されている。即ち、実際の洗浄は、酵素が十
分にその作用を発揮し得ない温度領域で行なわれている
。その他ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ）　、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
）　、アースロバフタ−属（Ａｒｔｈｒｏ−ｂａｃｔｅ
ｒ）　、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）等の微生物
により産生されるアルカリプロテアーゼも知られている
が、同じく低温での洗浄では十分に酵素の特性は発揮さ
れない。それ故我国の洗浄習慣に鑑みて、低温（１５℃
前後）でも高い活性が発現される酵素が見い出されれば
、その実用的価値は極めて高くそのような酵素の開発が
要望されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕 したがって本発明の目的は、洗浄剤溶液中で安定であり
且つ低温洗浄でも優れた酵素活性を発現し洗浄力改善に
寄与しうるアルカリプロテアーゼを産生ずる能力を有す
る新規な微生物を提供することである。

〔問題点を解決する為の手段〕

本発明者らは、上記目的を達成するため広く自然界より
アルカリプロテアーゼ産生微生物をスクリーニングした
結果、バチルス属に属する下記の菌学的性質を有する微
生物が、上記目的に合致した、公知のアルカリプロテア
ーゼには無い特徴を備えた、優れたアルカリプロテアー
ゼを産生ずる事を見い出し本発明を完成した。

菌学的性質の試験及び分類法はＢｅｒｇｅｙ’　ｓＭａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙ　（１９８６）に基づいて行なった。本発
明の微生物は、中性の培地での生育は概して良好でない
為に以下に述べる試験には炭酸ナトリウム１％を加えｐ
Ｈを１０に調整した培地を用いた。

Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃、２日間培養した時、以下の形
態的特徴が観察される。

１）細胞の形、大きさ：桿菌　０．６〜１．０μｍｘ３
．０〜５．０μｍ ２）多形性：無　し ３）運動性：周鞭毛を有し運動性有り ４）胞　子＝０．６〜１．０μｍＸ１．０〜２．０μｍ
の楕円形の胞子を中央からやや末端寄り の拠に形成する。胞子嚢の膨潤はほ ぼ認められない。

５）グラム染色性：陽　性 ６）抗　酸　性：陰性 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養 円形、扁平状、全縁のコロニーを形成する。

該コロニーの表面は滑らかで光沢があり、やや黄っぽい
クリーム色を呈する。

２）肉汁寒天斜面培養 拡帯状に生育し、光沢のあるやや黄っぽいクリーム色の
コロニーを形成する。

３）肉汁液体培養 生育良好で菌膜は形成しない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養 生育良好で液化する。

５）リトマスミルク 生育するが凝固は認められない。培地がアルカリ性の為
リトマスの変色は不明。

Ｃ１生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽　性 ２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト　：培地がアルカリ性の為明らかでない
。

４）　Ｖ　Ｐテスト　：陽　性 ５）インドール生成：陰　性 ６）硫化水素生成：陰　性 ７）＃！９加水加水分解：性 ８）クエン酸の利用：陽　性 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を利用
する。

１０〉色素の生成：陰　性 １１）ウレアーゼ　：陰　性 １２）オキシダーゼ：陽　性 １３）カタラーゼ　：陽　性 １４）生育の温度範囲：４７℃以下 １５）生育のｐＨ範囲：７〜１２ １６）酸素に対する態度：好気性 １７）　ＯＦテスト　：弱いが醗酵 １８）糖類からの酸及びガスの生成 Ｌ−アラビノース　　　＋　　　　− Ｄ−キシロース　　　　十　　　　− Ｄ−フルクトース　　　十　　　　− Ｄ−グルコース　　　　十　　　　− Ｄ−マンノース　　　　十　　　　− Ｄ−ガラクトース　　　＋　　　　− マルトース　　　　　　十　　　　− シュークロース　　　　±　　　　− ラクトース　　　　　　＋　　　　− トレハロース　　　　　　十　　　　−澱粉　　　　十
　　− ソルビット　　　　　　−− イノシフト　　　　　　−− マンニット　　　　　　　−− グリセリン　　　　　−− ＋：生成する ±：僅かに生成する 一：生成しない り、その他の性質 １）塩化す）　ＩＪウム耐性：１０％ＮａＣβ下で生育
する。

２）洗浄剤溶液中で安定であり且つ低温洗浄（１５℃付
近）に於いても優れた酵素活性を発現し、洗浄力改善に
寄与しうるアルカリプロテアーゼを産生ずる。

上記菌学的性質を有する微生物の具体例として、バチル
ス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）　Ｔ　Ｎ
　Ｋ　−２株（微工研菌寄第９５６５号）を挙げること
ができる。

本ＴＮＫ−２株は上述の如く、好気性有胞子細菌であり
、バチルス属に属する事は明らかである。

本菌株の特徴的性状としてｐＨ７以下及びｐＨ１２以上
では生育出来ず最適ｐＨが１０付近にある事が挙げられ
る。即ち本菌株は好アルカリ性細菌であると判断される
。本菌株は公知の好アルカリ性バチルス属細菌とその菌
学的性状に於いて一部一致する点もあるが、主要な性状
に於いて異っており、総体的に判断するならば別異の菌
株としげ新菌種に位置付けるべきである。

以下に本菌株と公知の好アルカリ性バチルス属細菌との
主要な菌学的性質の比較を詳述する。対比株としてはま
ずアルカリプロテアーゼを産生ずる公知の好アルカリ性
バチルス属細菌として理研、掘越らのバチルス　アル力
ロフィラスＮα２２１”株（ＡＴＣＣ２１５２２）　、
Ｎ（１５８１）株及びＮｃＬＤ−６２）株、ライｔ’／
＠（ＤＸ、Ｙ、Ｐ及びＫａ３）ｎびに昭和電工■のＮＫ
Ｓ−２１株４）又文献記載の好アルカリ性バチルス属細
菌として理研、掘越らのアルカリカタラーゼ生産株Ｎ（
ＬＫＩＪ−１株５）、シクロデキストリングルコシルト
ランスフェラーゼ（以下ＣＤＧＴと略す）生産株６）並
びにアルカリペクチナーゼ生産株ＮαＰ−４−Ｎ株７）
を取り挙げた。

本菌株とこれら対比株との菌学的性質の差異について主
だった項目を第１表に要約した。

バチルス属の種間分類の重要な要件である胞子形成につ
いては、まず本菌株が中央から末端帯りに胞子を形成す
るのに対してＮａ　Ｄ　−６株、Ｙ、Ｘ、Ｐ及びに株は
末端に形成し、又、ＣＤＧＴ生産株は中央に胞子を形成
する点で明確に異なり、更に本菌株は胞子嚢はほとんど
膨潤しないのに対して、Ｎ（１２２１株、Ｎｏ、　Ｄ　
−６株、ＹＳＸＳＰ及びに株、Ｎｏ、　Ｐ　−４−Ｎ株
には明白な膨潤が認められ明らかに異っており、本菌株
と魔２２１株、ｋＤ−６株、ＹＳＸ、ＰＲびに株、ＣＤ
ＧＴ生産株並びに魔Ｐ−４−Ｎ株とは胞子形成特性に於
いて明確に区別される。

生育特性については、本菌株の生育温度上限が４７℃で
あるのに対しＮｏ、２’２１株、ＮＩＩＫｕ　−１株並
びにＮｏ、　Ｐ　−４−Ｎ株が５５℃であり、又Ｎに５
−２１株が４１ｔである点、又、生育ｐＨ範囲に於いて
も本菌株が７〜１２であるのに対し、Ｎα２２１株、Ｎ
ａＫｕ　−１株及びｋＰ　　４−Ｎ株が７〜１１、Ｎ１
５８株、Ｎｏ、Ｄ−６株及びＣＤＧＴ生産株が７．５〜
１１、又Ｙ、Ｘ、Ｐ及びに株が６〜１２と明確に異って
おり、生育特性に於いても本菌株は上記の全公知菌株と
容易に区別される。

さらに、生理的特質に於いても本菌株が硝酸塩を還元す
るのに対しＮα５８株、ＮＫＳ−２１株が還元しない点
、本菌株がＶＰテスト陽性であるのに対し、Ｎ（１２２
１株、Ｎｏ、Ｄ−６株、ＸＳＹ、Ｐ及びに株、ＮＫＳ−
２１株、並びにＮｏ、Ｋｕ　−１株が陰性であり、又、
ｃＤａｒ生産株並びにＮｏ、Ｐ−４−Ｎ株が不明瞭であ
る点、本菌株がクエン酸塩を利用するのに対しＮｏ、Ｋ
ｕ　−１株並びにＮａＰ−４−Ｎ株は利用せず、更にＮ
ａＤ＝６株並びにＹＳＸ。

Ｐ及びに株はほとんど利用しない点、本菌株がウレアー
ゼ陰性であるのに対してＮａＤ−６株、ＹｌＸ、Ｐ及び
に株は陽性である点に於いて異なっており、本菌株と上
記全公知株とは明確に区別される。更に、糖からの酸生
成に於いても本菌株がグリセリン、マンニット、ソルビ
ット、イノシフトの糖Ｔルコールから酸を生成しないの
に対してＮα２２１株並びにＮα５８株はマンニットと
ソルビットより、ＮａＤ−６株はグリセリン、マンニッ
トよリ、Ｙ、ＸＳＰ及びに株はマンニットより、更にＮ
ＫＳ−２１株はクリセリン、マンニット、ソルビット、
イノジットより酸を生成する点に於いて区別される。

以上述べたように、本菌株は、菌学的性質において公知
の好アルカリ性バチルス属細菌とは明瞭に区別され、パ
ージェーズマニニアル記載の既知の種のいずれとも、特
徴的性質に於いて全く相違し、明らかに既知の菌種中に
一致する種を見い出し得ない。よって本菌株は新菌種と
して設定する事が妥当である。

本発明の微生物には、前記バチルス属ＴＮＫ−２株のほ
か、その天然または人為的変異株であって１．アルカリ
性条件下、低温洗浄での洗浄力向上に寄与するアルカリ
プロテアーゼＬの産生能を有するものも含まれる。

次に本発明の微生物を培養して、培養物より新規アルカ
リプロテアーゼＬを採取する方法について説明する。

使用される培地としては、通常の微生物の培養に用いら
れるもので、本菌株に利用可能なものであれば何でも良
く、例えば有機炭素源及び窒素源としては澱粉、デキス
トリン、糖蜜、乾燥酵母、大豆粉、ペプトン等が良く、
無機塩としてはリン酸二カリウム、硫酸マグネシウムの
添加が有効であり、更に炭酸塩を加えたアルカリ性培地
が好ましい。その他、必要に応じて菌の生育、酵素の産
生に必要な各種有機物、無機物を添加する事が出来る。

培養形態については液体又は固体培養のいずれでも良い
。本発明のバチルス　エスピーＴＮＫ−２株の培養の具
体例を以下に示す。

まず、上記成分を含む培地を通常の方法で滅菌し、本菌
株を接種し、振盪培養又は通気撹拌培養等を行なう。例
えば２０〜３５℃で４０〜１００時間培養する。培養終
了後、培養物より菌体を分離し、上滑を得る。この上清
液を硫安塩析にかける事によりアルカリプロテアーゼを
得る。得られたアルカリプロテアーゼの酵素活性はアン
ソン−萩原の変法に従って測定する。即ち、酵素と０．
６％カゼイン基質溶液（ｐＨ１０，５）とを３５℃、１
０分間反応させトリクロロ酢酸混液を用いて反応を停止
させた後、濾過し、濾液の吸光度を２７５ｎｍで測定す
る。前記条件下で１分間にチロシン１μｇ相当量を遊離
させる酵素量を１単位（Ａ　Ｐ　Ｕ）とする。

〔実施例〕

本発明者らが自然界より分離採取した本菌株のスクリー
ニング方法を詳述する。

１）好アルカリ性プロテアーゼ産生菌の分離１％炭酸ナ
トリウムを含むブイヨン培地５ｒｎｌを分注した試験管
（φ１６．５Ｘ１６５ｍｍ）にサンプル土壌約１０■を
入れ２０℃にて２日間振盪培養を行なった。その培養液
の一部を上記培地に寒天１．５％を含むプレート上に接
種し、２０℃にて２日間培養を行ない、好アルカリ性菌
の分離を行なった。得られた分離菌をスキムミルク１％
、酵母エキス０．０２５％、ペプトン０．０５％、炭酸
水素ナトリウム１％、寒天１．５％を含むプレートに穿
刺し、２０℃、２日間培養後、コロニー周縁部にハロを
形成するものを好アルカリ性プロテアーゼ産生菌として
分離した。

２）界面活性剤耐性を有するアルカリプロテアーゼ産生
菌の選別 溶性澱粉２％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％
、リン酸二カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０
２％、炭酸す）　ＩＪウム１％を含む液体培地５０ｄを
５０〇−容坂ロフラスコにて滅菌調製後、１）で得られ
た分離株を接種し、２０℃、３日間振盪培養を行なった
。得られた培養液を８．００　Ｏｒｐｍ　、　５分間の
遠心分離に供し、得られた培養上清に洗浄剤を０．５％
になるように配合した後、ｐＨを１０．５に調整し、４
０℃、４時間保温した。残存活性を測定する事により界
面活性剤耐性を有するアルカリプロテアーゼの産生菌を
選別した。

３）低温洗浄での洗浄力向上に寄与しろるアルカリプロ
テアーゼ産生菌の選定 上記２）の培地培養条件を経て得られた培養上清を７０
％飽和硫安塩析後、透析する事により洗浄力評価用粗酵
素液を調製した。洗浄力試験は油化学３０．４３２〜（
１９８１）に示された方法に準じて行ない、洗浄の対象
となる布は蛋白質配合人工湿式汚垢布を使用した。低温
（１５℃）洗浄で公知のアルカリプロテアーゼより高い
洗浄力寄与を示すアルカリプロテアーゼ産生菌を選定し
た。

上記のスクリーニング法により自然界より分離、採取さ
れた微生物が本発明のバチルス属に属し、洗浄剤に安定
配合可能で且つアルカリ性条件下低温洗浄での洗浄力向
上に寄与しろる新規のアルカリプロテアーゼＬを産生ず
る能力を有するバチルス　エスピーＴＮＫ−２株である
。本菌株は神奈川県山北町の土壌より分離された。

〔参考例〕

溶性澱粉２０ｇ１ペプトン５ｇ１酵母エキス５ｇ１リン
酸二カリウム１ｇ１硫酸マグネシウム０．２ｇを水８０
０ｍｌに溶解し、これを、５００ｍｌ容坂ロフラスコに
８０ｍｊｉずつ分注し、１２１℃、２０分間滅菌後、別
途滅菌した５％炭酸ナト’Ｊウム水溶液を各２０ｍ１加
え、培養液とした。この培地にバチルス　エスピーＴＮ
Ｋ　　２株（微工研菌寄第９５６５号）を−白金耳接種
して２０℃で７２時間振盪培養すると２１０ＡＰＵ／−
のプロテアーゼ活性を有する培養液が得られた。８００
０ｒｐｍ　、　５分間の遠心上清９００ｍ１に対し、冷
アセトン２倍容を加えてアルカリプロテアーゼを沈澱さ
せた。これを遠心分離し、アセトン脱水したところアル
カリプロテアーゼＬの粗酵素粉末（３９，０００ＡＰＵ
／ｇ）　４．４　ｇを得た。本菌株の産生ずるアルカリ
プロテアーゼを洗浄剤に配合して低温洗浄力の改善度を
調べた。

すなわち、第２表に示した洗浄剤組成物を調製し、各酵
素を０．５％配合のとき、２０００ＡＰＵ／ｇ洗浄剤組
成物（Ａ酵素４０万ＡＰＵ／ｇのものを０．５％配合し
た場合に相当）、１．５％配合のとき６．０００ＡＰＵ
／ｇ洗浄剤組成物（Ａ酵素４ａ万ＡＰＵ／ｇのものを１
．５％配合した場合に相当）となるように添加し、洗浄
力を評価した。

ＡＯ５：　Ｃ１４−＋ｓ　α−オレフィンスルホン酸ナ
トリウム ＬΔＳ：アルキル基の炭素数が１０〜１４の直鎖アルキ
ルベンゼンスルホン酸ナトリ ウム ゼオライト＝Ａ型合成ゼオライト ケイ酸Ｎａ　　：　Ｎａ２Ｏ：　Ｓ　１０ｘ　＝　１　
：　２．２炭酸Ｎａ　　：　Ｎａ２ＣＯ３（試薬品）Ｐ
ＥＧ　　：ポリエチレングリコール平均分子量亜硫曹　
：　Ｎａ２Ｓ　０３　　（試薬品）結果を第３表に示す
。

第　　　３　　　表 ＊公知酵素であるＡｎ素の２５℃、０．５％の洗浄力を
１００としたときの相対値で示す。

〔発明の効果〕

本発明の微生物は、洗浄剤溶液中で安定であり、低温洗
浄でも優れた酵素活性を発現し、洗浄力改善に寄与しう
るアルカリプロテアーゼを産生ずる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の菌学的性質を有する、バチルス属に属する
   アルカリプロテアーゼ産生微生物。 Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃、２日間培養した 時、以下の形態的特徴が観察される。 １）細胞の形、大きさ：桿菌０．６〜１．０μｍ×３．
   ０〜５．０μｍ ２）多形性：無し ３）運動性：周鞭毛を有し運動性有り ４）胞子：０．６〜１．０μｍ×１．０〜２．０μｍの
   楕円形の胞子を中央からやや末端 寄りの拠に形成する。胞子嚢の膨 潤はほぼ認められない。 ５）グラム染色性：陽性 ６）抗酸性：陰性 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養 円形、扁平状、全縁のコロニーを形成する。 該コロニーの表面は滑らかで光沢があり、 やや黄っぽいクリーム色を呈する。 ２）肉汁寒天斜面培養 拡帯状に生育し、光沢のあるやや黄っぽい クリーム色のコロニーを形成する。 ３）肉汁液体培養 生育良好で菌膜は形成しない。 ４）肉汁ゼラチン穿刺培養 生育良好で液化する。 ５）リトマスミルク 生育するが凝固は認められない。培地がア ルカリ性の為リトマスの変色は不明。 Ｃ、生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト：培地がアルカリ性の為明かでない。 ４）ＶＰテスト：陽性 ５）インドール生成：陰性 ６）硫化水素生成：陰性 ７）澱粉加水分解：陽性 ８）クエン酸の利用：陽性 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を利用
   する。 １０）色素の生成：陰性 １１）ウレアーゼ：陰性 １２）オキシダーゼ：陽性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）生育の温度範囲：４７℃以下 １５）生育のｐＨ範囲：７〜１２ １６）酸素に対する態度：好気性 １７）ＯＦテスト：弱いが醗酵 １８）糖類からの酸及びガスの生成 ▲数式、化学式、表等があります▼ Ｄ、その他の性質 １）塩化ナトリウム耐性：１０％ＮａＣｌ下で生育する
   。 ２）洗浄剤溶液中で安定であり且つ低温洗浄（１５℃付
   近）に於いても優れた酵素活性 を発現し、洗浄力改善に寄与しうるアルカ リプロテアーゼを産生する。
2. （２）バチルスエスピーＴＮＫ−２（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｓｐ． ＴＮＫ−２）（微工研菌寄第９５６５号）である特許請
   求の範囲第（１）項記載の微生物。