JP7862002B2

JP7862002B2 - ハイブリッド抗体

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Description

本発明は、それらの治療的使用とともに、合成（天然に存在しない）ハイブリッド抗体、特にハイブリッドＩｇＥ抗体の設計にある。

免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ，immunoglobulin E）は、哺乳類にのみ見出されている抗体のクラス（又は、免疫グロブリン（Ｉｇ）「アイソタイプ」）である。ＩｇＥは形質細胞によって合成される。すべての抗体クラスと同様に、ＩｇＥの単量体は、２本のより大きな同一の重鎖（ε鎖）及び２本の同一の軽鎖（すべての抗体クラスに共通である）からなり、ε鎖は４つのＩｇ様定常ドメイン（Ｃε１～Ｃε４）を含有する。

異なる抗体クラスを区別するのは重鎖の性質であり、ＩｇＥクラスのものは、より一般的なＩｇＧクラスの重鎖よりも大きく、より大量にグリコシル化される。各抗体鎖は、一連の直列に並んだ免疫グロブリンドメインから構成される。Ｎ末端ドメイン（軽鎖及び重鎖上にそれぞれ１つ）は、広範にわたる抗原への結合を可能にする高度に可変の配列の領域（可変ドメイン）を含有する。残りのドメインは、高度に保存されたいわゆる定常（Ｆｃ）ドメインからなる。

ＩｇＥの１つの機能は、蠕虫等の寄生生物に対する免疫である。ＩｇＥは、アレルギー性喘息、大部分のタイプの副鼻腔炎、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、並びに特異的タイプの慢性蕁麻疹及びアトピー性皮膚炎等の様々なアレルギー性疾患として現れるＩ型過敏症においても必須の役割を有する。ＩｇＥは、アナフィラキシー性薬物、ハチの針、及び脱感作免疫療法において使用される抗原調製物等のアレルゲンに応答して極めて重大な役割も果たす。

ＩｇＥは、典型的に最も存在量の少ないアイソタイプであるが、正常な（「非アトピー性」）個体におけるＩｇＥレベルは、大部分の古典的適応免疫応答に関与するアイソタイプでありかつ最も強力な炎症反応を誘発し得る１０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧに関する７５％と比較して、Ｉｇ濃度のほんの０．０５％である。

ＩｇＧは、血液及び細胞外液に見出される主なタイプの抗体であり、身体組織の感染を制御することを可能にする。ウイルス、細菌、及び真菌等の多くの種類の病原体に結合することによって、ＩｇＧは身体を感染から守る。ＩｇＧ抗体は、４本のペプチド鎖から作製される約１５０ｋＤａの分子量を有する大きな分子である。各分子は、約５０ｋＤａの２本の同一クラスのγ重鎖、及び約２５ｋＤａの２本の同一の軽鎖、したがって四量体の４次構造を含有する。２本の重鎖は、互いに及び軽鎖に、それぞれジスルフィド結合によって連結される。結果として生じる四量体は２つの同一の半分を有し、それは一緒にＹ様の形状を形成する。二股の各末端は、同一の抗原結合部位を含有する。

構造の差異は、多数のエフェクター細胞、及び各抗体クラスの異なる定常ドメインに結合する因子に起因して、抗体のクラス間で異なる生物学的活性を付与する。ＩｇＧのガンマ鎖は、古典的な膜結合型表面受容体並びに非定型の細胞内受容体及び細胞質糖タンパク質を含む、幅広いファミリーの受容体に結合する。膜結合型表面受容体は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲIIａ、ＦｃγＲIIｂ、ＦｃγＲIIIａ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲIIIｂを含む。同様に、ＩｇＥのエプシロン鎖は、高アフィニティー受容体ＦｃεＲＩ及びより低いアフィニティー受容体ＦｃεＲIIに結合する。種々の免疫エフェクター細胞上のこれらの様々な受容体の差示的発現は、ＩｇＧ及びＩｇＥによって生み出され得る免疫応答のタイプを決定する。

非定型ＦｃγＲの間で、胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ，neonatal Fc receptor）は、ＩｇＧ生物学に対するその緊密な影響、及びアルブミンにも結合するその能力を考慮して、悪名を得ている。ＦｃＲｎは、循環においてＩｇＧ及びアルブミンを維持すること、並びに極性細胞壁を越えてこれら２種のリガンドを双方向に輸送することに関与する、リサイクリング又はトランスサイトーシス受容体として機能する。ＦｃＲｎは、ＩｇＧ免疫複合体（ＩＣ，immune complex）と相互作用し、かつそれに由来するペプチドの抗原提示を促すことによって、免疫受容体として作用することも解されている。

胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、広域でかつ機能的に多様なファミリーのＭＨＣ分子に属する。古典的ＭＨＣファミリーメンバーとは違って、ＦｃＲｎはほとんど多様性を所有せず、抗原を提示することができない。その代わりに、低いｐＨで高いアフィニティーでＩｇＧ及びアルブミンに結合するその能力を通じて、ＦｃＲｎは、これらタンパク質の両方の血清半減期を調節する。ＩｇＧは、ＦｃＲｎに結合しないＩｇＥを含む同様のサイズの球状タンパク質よりも実質的に長い血清半減期を享受する（ＩｇＧに関して大体２１日間、及びＩｇＧに関して２日間未満）。加えて、ＦｃＲｎは、ＩｇＧの寿命に影響を及ぼすその能力、並びに先天性及び適応免疫応答へのその参加の両方を通じて、粘膜及び全身部位での免疫において重要な役割を果たす。

ＦｃＲｎ発現は、広範囲であり、生涯にわたって存在し、かつ多くの異なる種における多種多様な実質細胞型によって発現されると現在認識されている。これらは、血管内皮（中枢神経系を含む）、胎盤等の大部分の上皮細胞型（合胞体性栄養膜）、表皮（ケラチノサイト）、腸（腸細胞）、腎糸球体（足細胞）、気管支、乳腺（乳管及び腺房）、網膜色素上皮細胞、腎臓近位尿細管細胞（ＰＴＣ，proximal tubular cell）、肝細胞、メラニン細胞、並びに目における脈絡膜、毛様体、及び虹彩の細胞を含む。ＦｃＲｎは、極性上皮細胞とは対照的に、それが細胞表面に相当な分量で検出される、単球、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ，dendritic cell）、好中球、及びＢ細胞を含む造血細胞によっても広く発現される（Zhu X et al (2001) J. Immunol. 166(5):3266-76）。

ヒトにおける４種のＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）のうち、ＦｃＲｎへの結合アフィニティーは２０ｎＭ（ＩｇＧ１）から８０ｎＭ（ＩｇＧ４）に及ぶ（West AP Jr, Bjorkman PJ (2000) Biochemistry 39(32):9698-708）。構造調査は、ＦｃＲｎが、非平衡又は平衡条件下で、それぞれ１：１又は２：１の化学量論でＩｇＧに結合することを示している（Popov S. et al (1996) Mol. Immunol. 33(6):521-30；Sanchez L.M. et al (1999) Biochemistry 38(29):9471-6）。ＦｃＲｎは、ＩｇＧホモ二量体の両部位に同一のアフィニティーで独立して結合する（Haberger M. et al (2015) mAbs 7:331-43）が、２：１の複合体形成により生じるアビディティー効果は、半減期延長に重要であることが公知である。

生化学的及び結晶学的データは、ｐＨ６．０で結合しても、ＦｃＲｎもＩｇＧも大きな立体構造的変化を受けないことを示す。ＦｃＲｎへの結合に影響を与えると考えられるＩｇＧ４における主要な残基は、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、及びＨｉｓ４３５である。ＩｇＧ１では、それは、結合を可能にする、Ｃγ２－Ｃγ３ヒンジ領域におけるヒスチジン残基のプロトン化である（Martin W.L. et al (2001) Molecular Cell 7:867-877）。それらのｐＫａに起因して、ヒスチジン残基はｐＨ約６でプロトン化され、それはＦｃＲｎ残基Ｇｌｕ１１５及びＡｓｐ１３０との相互作用を可能にする。ｐＨが６より上に増加するにつれて、ヒスチジンプロトン化は徐々に失われ、それは相互作用のｐＨ依存性を説明する（Oganesyan V. et al、上記；Raghavan M. et al (1995) Biochemistry 34:14649-57；Kim J.K. et al (1999) Eur J Immunol. 29:2819-2825）。これは、ＦｃＲｎ－Ｆｃ界面、具体的にはＦｃＲｎにおけるα２ドメインのＣ末端部分にある酸性残基での塩橋の形成を可能にする（West et al、上記、Martin et al、上記、Vaughn DE, Bjorkman PJ. (1998) Structure 6:63-73）。重鎖相互作用に加えて、β_２ｍも、Ｉｌｅ１残基を通じてＩｇＧとの接触を形成する（Shields R.L. et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604）。ＩｇＧ上のＦｃＲｎ結合部位は、ＩｇＧのＦｃ領域のＡｓｎ２９７残基におけるグリコシル化を要する、古典的ＦｃγＲに対する結合部位と明確に区別できかつそれから遠く離れている（Tao M.H., Morrison S.L. (1989) J. Immunol. 143:2595-601）。

慢性炎症、感染症、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、及び移植医学を含む広範なヒト病気における治療としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ，monoclonal antibody）の拡大する使用を考慮して、ＦｃＲｎは、ｍＡｂ効力の主たる修飾因子として浮上している（Chan A.C., Carter P.J. (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301-16；Weiner L.M. et al (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:317-27）。これは、血流における治療用抗体の持続性に直接関係し、それが今度は、標的部位への局在を増加させ得る。ＩｇＧの長い循環半減期を確保するために、ｐＨ依存的結合及びＦｃＲｎ依存的リサイクリングは重大である。重要なことには、細胞からのＩｇＧの適正な放出には、中性ｐＨでの限定された結合が要され、酸性ｐＨでＦｃＲｎへのｍＡｂアフィニティーを増加させることは半減期延長と相関する。したがって、ＦｃＲｎへのｐＨ依存的結合を最適化するようなＩｇＧＦｃ改変が、薬物動態を調整しかつＩｇＧｍＡｂ半減期を増加させるために探求されている（Dall'Acqua W.F. et al (2006) J. Biol. Chem. 281:23514-24；Yeung Y.A. et al (2009) J. Immunol. 182:7663-1；Zalevsky J. et al (2010) Nat. Biotechnol. 28:157-9）。

ＩｇＥは、大部分はアレルギーにおけるその有害な役割で知られるが、いくつかの調査は、この抗体アイソタイプの天然の腫瘍監視機能に長い間向いてきた（Jensen-Jarolim E. et al (2008) Allergy 63: 1255-1266；Jensen-Jarolim E., Pawelec G. (2012) Cancer Immunol. Immunother. 61: 1355-1357）。突き合わせて試験された、同じエピトープ特異性についてのＩｇＧ及びＩｇＥ抗体を用いた先駆的調査は、細胞傷害の観点からＩｇＥのより高い潜在性を明らかにした（Gould H.J. et al (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3527-3537）。

ＩｇＥは、組織に生息する多細胞寄生生物を殺傷するように進化しており、また大部分が組織に存在する固形腫瘍の治療における使用にとってそれを理想的にするいくつかの主要な特質をそれに授ける。ＩｇＥのエプシロン定常領域は、マクロファージ、単球、好塩基球、及び好酸球を含む免疫エフェクター細胞の表面にあるその同族受容体（ＦｃεＲＩ）に対して比類なく高いアフィニティーを有する（ＦｃεＲＩに対するＫａ約１０^１０／Ｍ、及びＣＤ２３三量体複合体に対するＫａ約１０^８～１０^９／Ｍ；Gould H.J., Sutton B.J. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8: 205-217）。この相互作用は、ＩｇＧのガンマ鎖がその同族受容体に対して有するアフィニティーよりも最高１０，０００倍大きく、これは、免疫エフェクター細胞の表面に恒久的に付着しているＩｇＥ分子の大多数をもたらす（Fridman W.H. (1991) FASEB J. 5: 2684-2690）。したがって、後者はプライムされ、ＩｇＥによって認識される抗原を発現する細胞をすぐに破壊できる。結果として、ＩｇＥは、ＩｇＧよりも有効に組織に浸透し得、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷し得る２つの主なメカニズムである抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ，antibody-dependent cell-mediated phagocytosis）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ，antibody dependent cell-mediated cytotoxicity）の両方の有意により大きなレベルを刺激し得る。細胞上のＦｃε受容体へのその迅速な結合に起因して、ＩｇＥは、循環から急速に除去され、ＩｇＧよりも有意に長い組織半減期を有し（２週間対２～３日間）、それは、血流における化合物の短い持続期間が理由で副作用の観点から有利であり、固形腫瘍の殺傷における役割も支持する。

さらに、例えば肥満細胞上のＦｃε受容体に結合したＩｇＥ抗体は、それらの細胞をシャトルシステムとして使用して悪性腫瘍に浸透し得るため、潜在的なＩｇＥ免疫療法は腫瘍組織に有効に分配されるはずであり、肥満細胞は組織に存在する免疫細胞であるため（St John A.L., Abraham S.N. (2013) J. Immunol. 190: 4458-4463）、この輸送は非常に効率的であろう。

他の考え得る利点は、抗原による活性化に対するＩｇＥエフェクター細胞の高い感度、並びに応答の速度及び大きさを含み、それは、アレルゲン曝露があると典型的には数分以内に始まるアレルギー反応及びアナフィラキシー反応の間に最も印象的に見られ得る。それと同時に、これは、がんに対してＩｇＥに基づく免疫療法を使用することの最も大きな関心事項でもあり：静脈内に適用される組換えＩｇＥは、アナフィラキシー反応のリスクを常に抱える。したがって、標的エピトープの慎重な選択は、これに関して極度に重要である。

Zhu X et al (2001) J. Immunol. 166(5):3266-76 West AP Jr, Bjorkman PJ (2000) Biochemistry 39(32):9698-708 Popov S. et al (1996) Mol. Immunol. 33(6):521-30 Sanchez L.M. et al (1999) Biochemistry 38(29):9471-6 Haberger M. et al (2015) mAbs 7:331-43 Martin W.L. et al (2001) Molecular Cell 7:867-877 Oganesyan V. et al Raghavan M. et al (1995) Biochemistry 34:14649-57 Kim J.K. et al (1999) Eur J Immunol. 29:2819-2825 Vaughn DE, Bjorkman PJ. (1998) Structure 6:63-73 Shields R.L. et al (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604 Tao M.H., Morrison S.L. (1989) J. Immunol. 143:2595-601 Chan A.C., Carter P.J. (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301-16 Weiner L.M. et al (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:317-27 Dall'Acqua W.F. et al (2006) J. Biol. Chem. 281:23514-24 Yeung Y.A. et al (2009) J. Immunol. 182:7663-1 Zalevsky J. et al (2010) Nat. Biotechnol. 28:157-9 Jensen-Jarolim E. et al (2008) Allergy 63: 1255-1266 Jensen-Jarolim E., Pawelec G. (2012) Cancer Immunol. Immunother. 61: 1355-1357 Gould H.J. et al (1999) Eur. J. Immunol. 29: 3527-3537 Gould H.J., Sutton B.J. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8: 205-217 Fridman W.H. (1991) FASEB J. 5: 2684-2690 St John A.L., Abraham S.N. (2013) J. Immunol. 190: 4458-4463

したがって、ＩｇＥ及びＩｇＧアイソタイプの両方と比較して改善された特性を有し、例えばがんの治療において有用である抗体の必要性がある。

固形腫瘍背景におけるＩｇＧを上回るＩｇＥの利点にもかかわらず、ＩｇＧは、ＩｇＥと比較してより長い半減期等、ＩｇＥが欠くある特定の機能を所有する。したがって、免疫グロブリンドメイン間の高い程度の構造類似性を活用することによって、本発明は、１つの態様において、ＩｇＧ及びＩｇＥアイソタイプの組み合わせられた機能性を所有するＩｇＥ／ＩｇＧハイブリッド抗体を提供する。

１つの態様において、本発明は、Ｆｃε受容体及び胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合するハイブリッド抗体を提供する。この文脈において、「結合する」とは、典型的に、ハイブリッド抗体のその１又は２以上の定常ドメインを介した結合を指し、すなわち「結合する」とは、その可変ドメインを介した標的抗原へのハイブリッド抗体結合の特異性を指すわけではない。好ましくは、ハイブリッド抗体は、ＦｃＲｎにｐＨ依存的様式で結合する。例えば、ハイブリッド抗体は、ｐＨ７．４でよりもｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対するより高いアフィニティーを有し得る。

ハイブリッドという用語は、本明細書において、その構造が１種を上回るクラスの抗体に由来する抗体を指す。本発明において、それは典型的に、ハイブリッドであるＦｃ領域であり、それによって、種々のクラスの抗体と会合している、免疫系の細胞表面受容体に結合する能力を抗体に提供する。典型的に、ハイブリッド抗体は、Ｆｃε受容体及びＦｃＲｎ受容体の両方に結合し得かつ両方を活性化し得、それによって、これらの受容体が発現される免疫系の細胞において受容体シグナル伝達及びエフェクター機能を形質導入する。

１つの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＥ抗体に由来する（例えば、ε重鎖に由来する）１又は２以上の重鎖定常ドメインを含む。例えば、抗体は、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４から選択される１又は２以上のドメインを含み得る。好ましくは、抗体は、少なくともＣε３ドメイン、より好ましくは少なくともＣε２、Ｃε３、及びＣε４ドメインを含む。

１つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、定常ドメインの１又は２以上が、ＩｇＧにおけるＦｃＲｎ結合に関係があると同定される１又は２以上のアミノ酸置換を含み得る、ＩｇＥに由来するＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（すなわち、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４ドメイン）を含むＦｃ領域を有する四量体ＩｇＥを含み得る。ＦｃＲｎ結合は、四量体ＩｇＥの少なくとも１つのＦｃドメインにおける１又は２以上のアミノ酸置換によって提供され得る。フラグメント結晶化可能／定常領域（Ｆｃ領域，fragment crystallisable/constant region）は、細胞表面Ｆｃ受容体及び補体系の一部のタンパク質と相互作用する、抗体のテール領域である。この特性により、抗体は免疫系を活性化することが可能となる。

アミノ酸置換は、ＩｇＥのＣε３及びＣε４のいずれか又は両方において行われ得る。置換は、ＩｇＥにおける天然残基の、ＩｇＧの対応する位置に見出されるアミノ酸での置き換えであり得、それにより、ＩｇＧのＦｃＲｎ結合特性がＩｇＥに与えられ得る。例えば、ＩｇＥのＣε３Ｃε４ドメインは１又は２以上のＨｉｓ置換を含み得、それによって、ＩｇＥによるＦｃＲｎ結合（例えば、ｐＨ依存的様式での）を可能にする。四量体ＩｇＥは、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域を含み得、Ｆｃドメインは、少なくともＣε２、Ｃε３、及びＣε４ドメインを含む。

別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、定常ドメインの１又は２以上が、ＩｇＧ抗体に由来するＦｃＲｎに対する結合部位のすべて又は一部を含み得る、ＩｇＥに由来するＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（すなわち、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４ドメイン）を含むＦｃ領域を有する四量体ＩｇＥを含む。ＦｃＲｎ受容体結合部位又は配列は、ＩｇＧの１又は２以上の定常ドメインに見出される、ＩｇＧに由来する１又は２以上の配列によって提供され得る。ＦｃＲｎが結合するＩｇＧ上の領域との相同性を呈するＩｇＥ上の構造領域が同定され得る。そのような領域が同定されると、次いでアミノ酸及び／又は配列置換を行って、ＩｇＥバックグラウンドへのＩｇＧ機能性の移行を可能にし得る。

したがって、１つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、７８位にヒスチジン残基を含むＩｇＥＣε３ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号２に規定されるＩｇＥＣＨ３ドメイン、又はＴ７８Ｈ変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。この文脈において、番号付けは、ＩｇＥＣε３ドメインのスタートからのアミノ酸残基位置を指し、すなわちＩｇＥＣε３ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基は１位である。配列が、配列番号２を含みかつＴ７８Ｈ変異を含む抗体の機能的特性、例えばＦｃε受容体及びＦｃＲｎへの結合を保持するという条件で、配列番号２のバリアント及びフラグメントは、例えば配列番号２の少なくとも３０、５０、若しくは１００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号２の全長及び同様の長さのフラグメントにわたって、配列番号２の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。

別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、９５位にヒスチジン残基を含むＩｇＥＣε４ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号３に規定されるＩｇＥＣＨ４ドメイン、又はＳ９５Ｈ変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、９８位にヒスチジン残基を含むＩｇＥＣε４ドメインを含む。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号３に規定されるＩｇＥＣＨ４ドメイン、又はＱ９８Ｈ変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。この文脈において、番号付けは、ＩｇＥＣε４ドメインのスタートからのアミノ酸残基位置を指し、すなわちＩｇＥＣε４ドメインのＮ末端におけるアミノ酸残基は１位である。配列が、配列番号３を含みかつＳ９５Ｈ及び／又はＱ９８Ｈ変異を含む抗体の機能的特性、例えばＦｃε受容体及びＦｃＲｎへの結合を保持するという条件で、配列番号３のバリアント及びフラグメントは、例えば配列番号３の少なくとも３０、５０、若しくは１００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号３の全長及び同様の長さのフラグメントにわたって、配列番号３の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する配列を含む。

好ましくは、ハイブリッド抗体は、２つ又は３つのヒスチジン置換を含み、例えば抗体は、７８位にヒスチジン残基を含むＩｇＥＣε３ドメイン、並びに／又は９５及び／若しくは９８位にヒスチジン残基を含むＩｇＥＣε４ドメインを含む。特に好ましい実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号２に規定されるＩｇＥＣＨ３ドメイン、又はＴ７８Ｈ変異を含むそのバリアント若しくはフラグメント、並びに／或いは配列番号３に規定されるＩｇＥＣＨ４ドメイン、又はＳ９５Ｈ及び／若しくはＱ９８Ｈ変異を含むそのバリアント若しくはフラグメントを含む。

したがって、さらに好ましい実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号３１に規定されるＩｇＥＣε３ループ配列（すなわち、ＰＶＧＨＲ）、及び／又は配列番号３２若しくは３３に規定されるＩｇＥＣε４ループ配列（すなわち、ＡＨＰＳＨＴＶ又はＲＡＶＨＥＡＡＨＰＳＨＴＶ）を含み得る。

代替的に、ＦｃＲｎ受容体結合部位は、例えばＩｇＧに由来する１又は２以上のＦｃγドメインによって、ＩｇＥのＣ末端に付着され得る。別の表現をすると、ハイブリッド抗体は、ＩｇＥに由来するＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４ドメイン（すなわち、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４ドメイン）、並びにＩｇＧに由来するＣＨ２ドメイン又はそのバリアント（すなわち、Ｃγ２ドメイン）を含むＦｃ領域を含み得る。抗体は、ＩｇＧに由来するＣＨ３ドメイン若しくはそのバリアント（すなわち、Ｃγ３ドメイン）、及び／又はＩｇＧに由来するヒンジ領域のすべて若しくは一部をさらに含み得る。

１又は２以上の定常ドメインの付着は、任意の適切な付着、連結、移植、固定、又は融合によるものであり得る。例えば、構築物は、ＩｇＧに由来するヒンジ領域のすべて又は一部を含み得る。定常ドメイン配列のすべて又は一部、並びにそのバリアントが使用され得ることが解されるであろう。

本明細書に記載される抗体ドメインは、任意の種、好ましくは哺乳類種、より好ましくはヒトに由来し得る。

１つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、ＦｃＲｎ及びＦｃεＲＩに結合する。

他の受容体結合部位、及び腫瘍標的化の文脈においてＩｇＧに特異的な望ましい機能をＩｇＥ分子の上又は中に移植して、その機能性を変化もさせ得ることが解されるであろう。

ハイブリッド抗体は、１又は２以上の標的抗原への特異的結合を決定する可変ドメイン配列をさらに含み得る。そのような可変ドメイン配列は、任意の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ）に由来し得る。１つの実施形態において、可変ドメイン配列はＩｇＥに由来し得る。別の実施形態において、可変ドメイン配列は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１に由来し得る。代替的に、可変ドメインは、２又は３以上の異なるアイソタイプに由来する配列を含み得、例えば可変ドメインは、ＩｇＥに由来する部分配列及びＩｇＧ１に由来する部分配列を含み得る。１つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、ＩｇＥ以外の免疫グロブリンアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ、例えばＩｇＧ１）に由来する１又は２以上の相補性決定領域（ＣＤＲ，complementarity-determining region）、並びにアイソタイプＩｇＥの免疫グロブリンに由来する１若しくは２以上のフレームワーク領域及び／又は定常ドメインを含む。

可変ドメイン又はその一部分（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）又はフレームワーク領域）は、ハイブリッド抗体に存在する定常ドメインと同じ又は異なる哺乳類種にも由来し得る。したがって、ハイブリッド抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。

典型的に、抗体の可変ドメインは、がんの治療において有用な１又は２以上の標的抗原に、例えばがん抗原（すなわち、がん細胞上で選択的に発現される又はがん細胞上で過剰発現される抗原）に、又は免疫媒介性腫瘍細胞殺傷を阻害する若しくは抑制する抗原に結合する。１つのそのような可変ドメイン配列の（すなわち、がん抗原ＨＥＲ２／ｎｅｕに結合するトラスツズマブ（ハーセプチン）ＩｇＥの）配列が配列番号１に示される。

１つの実施形態において、抗体は、配列番号２６に規定されるＩｇＥアミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号２６の少なくとも５０、１００、若しくは２００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号２６の全長にわたって、配列番号２６の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型ＩｇＥＣＨ３及び／又はＣＨ４配列に対して少なくとも１、２、又は３つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号２６の７８、２０３、及び／又は２０６位にヒスチジン残基を含む。

別の実施形態において、抗体は、配列番号３４に規定されるＩｇＥ（例えば、重鎖）アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号３４の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号３４の全長にわたって、配列番号３４の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型ＩｇＥＣＨ３及び／又はＣＨ４配列に対して少なくとも１、２、又は３つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号３４の４０８、５３３、及び／又は５３６位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号３５に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号３５の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号３５の全長にわたって、配列番号３５の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。

別の実施形態において、抗体は、配列番号１８６に規定されるＩｇＥ（例えば、重鎖）アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号１８６の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号１８６の全長にわたって、配列番号１８６の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型ＩｇＥＣＨ３及び／又はＣＨ４配列に対して少なくとも１、２、又は３つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号１８６の４１１、５３６、及び／又は５３９位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号１８７若しくは１８９に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号１８７若しくは１８９の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号１８７若しくは１８９の全長にわたって、配列番号１８７若しくは１８９の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。

別の実施形態において、抗体は、配列番号１８８に規定されるＩｇＥ（例えば、重鎖）アミノ酸配列を含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えば配列番号１８８の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号１８８の全長にわたって、配列番号１８８の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。好ましくは、抗体は、野生型ＩｇＥＣＨ３及び／又はＣＨ４配列に対して少なくとも１、２、又は３つのヒスチジン置換を含み、例えばハイブリッド抗体は、配列番号１８８の４１０、５３５、及び／又は５３８位にヒスチジン残基を含む。これらの実施形態において、抗体は、好ましくは、配列番号１８７若しくは１８９に規定される軽鎖アミノ酸配列、或いは例えば配列番号１８７若しくは１８９の少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号１８７若しくは１８９の全長にわたって、配列番号１８７若しくは１８９の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をさらに含む。

一部の実施形態において、抗体は、配列番号１５～２５のうちのいずれか１若しくは２以上に規定されるＩｇＥアミノ酸配列、又はそのバリアント若しくはフラグメントを含み得る。例えば、ハイブリッド抗体は、配列番号１５～２５の配列のうちのいずれか１又は２以上と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

別の実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号９と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するＩｇＧＣＨ２アミノ酸配列を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１０と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するＩｇＧＣＨ３アミノ酸配列をさらに含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号８と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するＩｇＧヒンジアミノ酸配列をさらに含む。

特定の実施形態において、抗体は、ｉ）配列番号１～３と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する（例えば、ＩｇＥ由来）アミノ酸配列、好ましくは配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のそれぞれと少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；並びにii）配列番号８、９、及び／又は１０（より好ましくは、少なくとも配列番号９及び配列番号１０）と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する（例えば、ＩｇＧ由来）アミノ酸配列を含む。

ＩｇＧ由来アミノ酸配列は、好ましくは、直接的に又は適切なリンカー配列を使用して、ＩｇＥ由来アミノ酸配列のＣ末端に付着される。例えば、配列番号３の配列は、配列番号８、９、又は１０、好ましくは配列番号８の配列に近接してあり得る。したがって、一部の実施形態において、ハイブリッド抗体は、少なくともＣε４ドメイン及び少なくともＩｇＧヒンジ領域及びＣγ２ドメイン、好ましくは少なくともＣε４ドメイン並びに少なくともＩｇＧヒンジ領域並びにＣγ２及びＣγ３ドメインを含み得る。したがって、抗体は、配列番号２７又は配列番号２８と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

好ましい実施形態において、抗体は、例えば配列番号２９若しくは配列番号３０の少なくとも５０、１００、２００、３００、５００、若しくは７００個のアミノ酸残基にわたって、又は配列番号２９若しくは配列番号３０の全長にわたって、配列番号２９又は配列番号３０、最も好ましくは配列番号３０と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有する（例えば、重鎖）アミノ酸配列を含む。

ＩｇＥに由来する少なくともＣＨ３ドメイン又はそのフラグメント（すなわち、Ｃε３ドメイン）、及びＩｇＧＣＨ２ドメイン（すなわち、Ｃγ２ドメイン）に由来する１又は２以上のループ配列を含む抗体も本明細書に記載される。そのような抗体は、１又は２以上のループ配列（例えば、配列番号４及び５に規定される）が、Ｃγ２ドメインに由来する１又は２以上のＦｃＲｎ結合ループ（例えば、配列番号１１及び１２に規定される）によって置き換えられているＣε３ドメインを含み得る。ＩｇＥのＣε３ドメインにおいて置き換えられるループ配列は、ＩｇＧのＣγ２ドメインにおけるＦｃＲｎ結合ループとの構造相同性を示し得る。そのような抗体は、配列番号１５、１６、１９～２５の配列のうちのいずれか１又は２以上と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、ハイブリッドＣε３／Ｃγ２ドメインをコードする）を含み得る。

ＩｇＥに由来する少なくともＣＨ４ドメイン又はそのフラグメント（すなわち、Ｃε４ドメイン）、及びＩｇＧＣＨ３ドメイン（すなわち、Ｃγ３ドメイン）に由来する１又は２以上のループ配列を含む抗体も本明細書に記載される。そのような抗体は、１又は２以上のループ配列（例えば、配列番号６及び７に規定される）が、Ｃγ３ドメインに由来する１又は２以上のＦｃＲｎ結合ループ（例えば、配列番号１３及び１４に規定される）によって置き換えられているＣε４ドメインを含み得る。ＩｇＥのＣε４ドメインにおいて置き換えられるループ配列は、ＩｇＧのＣγ３ドメインにおけるＦｃＲｎ結合ループとの構造相同性を示し得る。そのような抗体は、配列番号１７、１８、２０～２５の配列のうちのいずれか１又は２以上と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列（例えば、ハイブリッドＣε４／Ｃγ３ドメインをコードする）を含み得る。

別の態様において、本発明は、がん、例えば良性又は悪性腫瘍を治療する又は予防することにおける使用のための、上に規定されるハイブリッド抗体を包含する。別の表現をすると、本発明は、がん、例えば良性又は悪性腫瘍を治療する、予防する、又は遅延させるための、ヒト又は動物への投与のための医薬の製造における、上で記載されるハイブリッド抗体の使用を包含する。別の態様において、本発明は、それに罹患した哺乳類におけるがん（例えば、良性又は悪性腫瘍）を予防する、治療する、及び／又は遅延させる方法であって、方法は、上で記載されるハイブリッド抗体の治療有効量を哺乳類に投与するステップを含む、方法を包含する。

がんは、例えば黒色腫、メルケル細胞がん腫、非小細胞肺がん（扁平上皮型及び非扁平上皮型）、腎細胞がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮細胞がん腫、中皮腫、ウイルスにより誘導されたがん（子宮頸がん及び鼻咽頭がん等）、軟部組織肉腫、血液悪性腫瘍、例えばホジキン及び非ホジキン疾患、並びにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（例えば、黒色腫、メルケル細胞がん腫、非小細胞肺がん（扁平上皮型及び非扁平上皮型）、腎細胞がん、膀胱がん、頭頸部扁平上皮細胞がん腫、及び中皮腫、又は例えばウイルスにより誘導されたがん（子宮頸がん及び鼻咽頭がん等）、及び軟部組織肉腫）であり得る。本発明のハイブリッド抗体は、薬学的に許容される組成物又は製剤の形態で投与され得ることが解されるであろう。

さらに別の態様において、本発明は、上で記載されるハイブリッド抗体、及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体を含む組成物にある。組成物は、別の抗体若しくはそのフラグメント、アプタマー、又は小分子等の治療剤をさらに含んでいてもよい。組成物は、無菌の水溶液中にあり得る。

なおさらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする（組換え）核酸であって、重鎖が、（ｉ）配列番号１、及び（ii）配列番号１５～２６のうちのいずれか１又は２以上、好ましくは配列番号２６と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。

さらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする（組換え）核酸であって、重鎖が、配列番号３４と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。

なおさらなる態様において、ハイブリッド抗体の重鎖のすべて又は一部をコードする（組換え）核酸であって、重鎖が、（ｉ）配列番号１、２、及び３のうちのいずれか１又は２以上、並びに（ii）配列番号８及び配列番号９及び／又は配列番号１０と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、核酸が提供される。１つの実施形態において、核酸は、配列番号９又は配列番号３０と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。

上で規定される核酸を含むベクターであって、任意で、ベクターはＣＨＯベクター（すなわち、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ，Chinese Hamster Ovary）細胞におけるハイブリッド抗体の発現に適切な発現ベクター）である、ベクターも提供される。

さらなる態様において、上で記載されるハイブリッド抗体をコードする組換え核酸、又は本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞であって、コード核酸が、哺乳類細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結されている、宿主細胞が提供される。

抗体の発現のための条件下で、本明細書に記載される宿主細胞を培養するステップ、及び宿主細胞培養物から抗体又はそのフラグメントを回収するステップを含む、上で記載されるハイブリッド抗体を産生する方法も本明細書において提供される。

ＦｃＲｎへのＩｇＥバリアント抗体結合についてのシングルサイクル速度論的分析の概略図である。ＦｃＲｎへのハイブリッド抗体の結合を示すアッセイ結果の図である。ｐＨ６．０でのビオチン捕捉を使用した、ＦｃＲｎへのＩｇＥバリアント抗体及び融合構築物の結合を示すアッセイ結果の図である。ＦｃＲｎへのＩｇＥバリアント抗体結合についての多重サイクル速度論的分析の概略図である。生データのセンサーグラムへの変換を示す定常状態分析の例示の図である。ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ捕捉を使用した、ＦｃＲｎへのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３融合タンパク質の結合を示すアッセイ結果の図である。ｐＨ６．０での、ヒトＦｃＲｎへのハーセプチン、野生型ＩｇＥ、ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３、３×ＩｇＧヒスチジン残基を含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ２及びループ３ａを含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ１を含有するＩｇＥ、並びにＩｇＧＦｃＲｎループ１、ループ２、及びループ３ａを含有するＩｇＥの結合を示すアッセイ結果の図である。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎ捕捉を使用した、ＦｃＲｎへのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及びＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３融合タンパク質の結合を示すアッセイ結果の図である。ｐＨ７．４での、ヒトＦｃＲｎへのハーセプチン、野生型ＩｇＥ、ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３、３×ＩｇＧヒスチジン残基を含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ２及びループ３ａを含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ１を含有するＩｇＥ、並びにＩｇＧＦｃＲｎループ１、ループ２、及びループ３ａを含有するＩｇＥの結合を示すアッセイ結果の図である。ＩＧＥＧを発現するベクターの概略である。シングルサイクル速度論的分析による、ヒトＨｅｒ２抗原へのトラスツズマブＩＧＥＧバリアントの結合を査定するために使用されたＢｉａｃｏｒｅアッセイの概略である。ヒトＨＥＲ２：トラスツズマブＩＧＥＧバリアントの１：１結合を示す図である。構築物は、実施例５に記載されるとおりである。Ｆｃガンマ受容体への抗体結合を査定するために使用されたＢｉａｃｏｒｅアッセイの概略である。～ヒトＦｃ受容体へのＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧ（ＣＨ）バリアント結合を示す図である。（ａ）ヒトＦｃｇＲＩ：ＨＭＷ－ＭＡＡ－ＩＧＥＧバリアントの１：１結合。（ｂ）ヒトＦｃｅＲＩａ：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの１：１結合。（ｃ）ヒトＦｃγＲIIIＡ_{１７６Ｖａｌ}：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの結合－生のセンサーグラム。（ｄ）ヒトＦｃγＲIIIＡ_{１７６Ｖａｌ}：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの定常状態結合－分析されたデータ。この図において、「ＣＨ」とは抗ＨＭＷ－ＭＡＡ（すなわち、ＣＳＰＧ４）抗体を指し、バリアント名称は、別様に実施例５に記載されるとおりである。ＦｃＲｎへの抗体結合を査定するために使用されたＢｉａｃｏｒｅアッセイの概略である。～ヒトＦｃＲｎへのＨＭＷ－ＭＡＡ（ＣＨ）ＩＧＥＧバリアント結合を示す図である。（ａ）ＦｃＲｎｐＨ６．０：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの結合－生のセンサーグラム。（ｂ）ＦｃＲｎｐＨ６．０：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの定常状態結合－分析されたデータ。（ｃ）ＦｃＲｎｐＨ７．４：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの結合－生のセンサーグラム。（ｄ）ＦｃＲｎｐＨ７．４：ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントの定常状態結合－分析されたデータ。この図において、「ＣＨ」とは抗ＨＭＷ－ＭＡＡ（すなわち、ＣＳＰＧ４）抗体を指し、バリアント名称は、別様に実施例５に記載されるとおりである。～ＨＭＷ－ＭＡＡ（ＨｕＣＨ）ＩＧＥＧバリアントの生体内安定性分析を示す図である。（ａ）蛍光熱融解曲線重ね合わせ。（ｂ）ＳＬＳ４７３安定性プロファイル曲線重ね合わせ。この図において、「ＣＨ」とは抗ＨＭＷ－ＭＡＡ（すなわち、ＣＳＰＧ４）抗体を指し、バリアント名称は、別様に実施例６に記載されるとおりである。Ａ３７５細胞への抗ＨＭＷ－ＭＡＡ（ＨｕＣＨ）ＩＧＥＧ抗体の結合を示す図である。（ａ）抗ＩｇＧ二次抗体を用いた検出。（ｂ）抗ＩｇＥ二次抗体を用いた検出。この図において、「ＣＨ」とは抗ＨＭＷ－ＭＡＡ（すなわち、ＣＳＰＧ４）抗体を指し、バリアント名称は、別様に実施例４及び５に記載されるとおりである。ｈｕＣＨＩｇＥ３－Ｈｉｓとは、例えば配列番号１８８及び１８９に規定される重鎖及び軽鎖配列を含む、実施例４に記載される抗体を指す。 Attune（登録商標）NxT Acoustic Focusing Cytometerから取得されたデータのＲ１、Ｒ２、Ｒ３ゲーティングを示す図である。抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に対する、トラスツズマブＩｇＧ、ハーセプチンＩｇＧ、トラスツズマブ－ＩＧＥＧ（標識されたＣＨ２ＣＨ３）、トラスツズマブ－ＩＧＥＧ－Ｃ２２０Ｓ（標識されたＣＨ２ＣＨ３Ｃ２２０Ｓ）、及びアイソタイプＩｇＧ抗体の効果を示す図である。（ａ）種々の濃度（１２０～７．５ｎＭ）での、ＡＤＣＰ及びＡＤＣＣに対する抗体の効果。（ｂ）ＡＤＣＰ及びＡＤＣＣに対する抗体の効果を示すグラフ。

本明細書において使用するとき、「a」、「an」、及び「the」という単数形形態は、文脈上別様に明瞭に述べられない限り、単数形及び複数形の指示対象の両方を含む。

本明細書において使用される「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される」という用語は、「含む（including）」、「含む（includes）」、又は「含有する（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、内包的であり又は無制限であり、付加的な列挙されていないメンバー、要素、又は方法ステップを除外しない。該用語は、「からなる」及び「から本質的になる」も包含する。

メンバーの群の１又は２以上のメンバー等、「１又は２以上」という用語は、さらなる例示によってそれ自体が明瞭である一方で、該用語は、とりわけ、メンバーのいずれか１つへの言及、又はメンバーのいずれか２若しくは３以上、例えばメンバーの任意の≧３、≧４、≧５、≧６、若しくは≧７等、及び最高すべてのメンバーへの言及を包含する。

本明細書において使用するとき、「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、概して免疫学的結合剤を指す。「抗体」という用語は、免疫を含む方法によって作出される抗体を含むだけでなく、目的の抗原上のエピトープに特異的に結合し得る少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含するように作製される任意のポリペプチド、例えば組換えで発現されるポリペプチドも含む。したがって、該用語は、それらがインビトロ又はインビボで産生されるかどうかにかかわらず、そのような分子に適用される。

抗体は、ポリクローナル抗体、例えばそこから精製された（例えば、アフィニティー精製された）抗血清又は免疫グロブリンであり得る。抗体は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の混合物であり得る。モノクローナル抗体は、より大きな選択性及び再現性を有して、特定の抗原又は抗原内の特定のエピトープを標的にし得る。例としてであり限定ではなく、モノクローナル抗体は、Kohler et al 1975（Nature 256: 495）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書にある）によって作製され得る。モノクローナル抗体は、例えばClackson et al 1991 (Nature 352: 624-628)及びMarks et al 1991 (J. Mol. Biol. 222: 581-597)によって記載される技法を使用したファージ抗体ライブラリーからも単離され得る。

抗体という用語は、任意の動物種、好ましくは例えば鳥類及び哺乳類を含む脊椎動物種に由来する１又は２以上の部分を起源とする又はそれを含む抗体を含む。限定されることなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、ウズラ、又はキジであり得る。また限定されることなく、抗体は、ヒト、ネズミ科（例えば、マウス、ラット等）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、ラクダ（例えば、フタコブラクダ（Camelus bactrianus）及びヒトコブラクダ（Camelus dromaderius））、ラマ（例えば、アルパカ（Lama paccos）、ラマ（Lama glama）、又はビクーニャ（Lama vicugna））、又はウマであり得る。

当業者であれば、抗体は、１又は２以上のアミノ酸欠失、付加、及び／又は置換（例えば、保存的置換）を、そのような変化がそれぞれの抗原についてのその結合を保つ限りにおいて含み得ることを理解するであろう。抗体は、その構成成分アミノ酸残基の１又は２以上の天然又は人工の修飾（例えば、グリコシル化等）も含み得る。

ポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにそのフラグメントを産生する方法は、組換え抗体又はそのフラグメントを産生する方法のように、当技術分野において周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988；Harlow and Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447；"Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760；"Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229；Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921を参照されたい）。

したがって、提示担体に付着されていてもよい、本明細書において教示される任意の１又は２以上の（単離された）マーカー、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質、及びそのフラグメントを使用して（すなわち、免疫抗原として使用して）、動物、例えば実験動物又は家畜等の非ヒト動物に免疫するための方法も開示される。免疫、及び免疫血清からの抗体試薬の調製は、それ自体が周知であり、本明細書における他の箇所で言及される文書に記載される。免疫される対象となる動物は、任意の動物種、好ましくは温血種、より好ましくは例えば鳥類、魚類、及び哺乳類を含む脊椎動物種を含み得る。限定されることなく、抗体は、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、ホロホロチョウ、サメ、ウズラ、又はキジであり得る。また限定されることなく、抗体は、ヒト、ネズミ科（例えば、マウス、ラット等）、ロバ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、サメ、ラクダ、ラマ、又はウマであり得る。「提示担体」又は「担体」という用語は、概して、第２の分子に結合した場合に、通常では付加的なＴ細胞エピトープの提供を通じて、後者に対する免疫応答を増大させる免疫原性分子を表す。提示担体は、とりわけグリカン、ポリエチレングリコール、ペプチド模倣体、合成ポリマー等、（ポリ）ペプチド構造又は非ペプチド構造であり得る。例示的な非限定的な担体は、ヒトＢ型肝炎ウイルスコアタンパク質、多重Ｃ３ｄドメイン、破傷風毒素フラグメントＣ、又は酵母Ｔｙ粒子を含む。

本明細書に記載される本発明は、ハイブリッドＩｇＥ分子をもたらす、改変された重鎖（Ｆｃ）部分を有するＩｇＥ抗体にある。ＦｃＲｎが結合するＩｇＧ上の同様の領域との相同性を呈する、ＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４ドメインの構造領域を同定した。そのような領域を同定したら、ＩｇＥバックグラウンドへのＩｇＧ機能性の移行を可能にするアミノ酸置換を行った。特に、ＩｇＥの１又は２以上の定常ドメインにおける１又は２以上のループにおけるアミノ酸又は配列を、ＩｇＧＦｃＲｎアミノ酸又は配列で置き換えて、ＩｇＥにＦｃＲｎ機能性を与えた。

本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、典型的に、Ｆｃε受容体に、例えばＦｃεＲＩ及び／又はＦｃεＲII受容体に結合し得る。好ましくは、抗体は、ＦｃεＲＩ（すなわち、高アフィニティーＦｃε受容体）に少なくとも結合し得る、又はＦｃεＲII（ＣＤ２３、低アフィニティーＦｃε受容体）に少なくとも結合し得る。

典型的には、ＩｇＥによって媒介されるエフェクター機能を始動するために、抗体は、例えば免疫系の細胞上に発現した、Ｆｃε受容体も活性化し得る。例えば、抗体は、ＦｃεＲＩに結合し得、かつ肥満細胞、好塩基球、単球／マクロファージ、及び／又は好酸球を活性化し得る可能性がある。

これらの受容体相互作用に関与するＩｇＥ上の部位は、Ｃε鎖上のペプチド配列にマッピングされており、明確に区別できる。ＦｃεＲＩ部位は、Ｇｌｎ３０１とＡｒｇ３７６との間の残基によって創出される裂け目にあり、Ｃε２及びＣε３ドメイン間の接合部を含む（Helm, B. et al. (1988) Nature 331, 180183）。ＦｃεＲII結合部位は、Ｖａｌ３７０残基周辺のＣε３内に位置する（Vercelli, D. et al. (1989) Nature 338, 649-651）。２種の受容体を識別する主たる差異は、ＦｃεＲＩは単量体Ｃεに結合し、一方でＦｃεＲIIは二量体化Ｃεにのみ結合し、すなわち２本のＣε鎖が会合しなければならないことである。ＩｇＥはインビボでグリコシル化されるが、これは、ＦｃεＲＩ及びＦｃεＲＲIIへのその結合に必要であるわけではない。結合は、実際、グリコシル化の非存在下においてわずかにより強い（Vercelli, D. et al (1989)、上記）。

したがって、Ｆｃε受容体への結合及び関連するエフェクター機能は、典型的に、抗体の重鎖定常ドメインによって、特に抗体のＦｃ領域を一緒に形成するドメインによって媒介される。本明細書に記載される抗体は、典型的に、ＩｇＥ抗体の少なくとも一部分、例えばＩｇＥ、好ましくはヒトＩｇＥに由来する１又は２以上の定常ドメインを含む。特定の実施形態において、抗体は、Ｃε１、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４から選択される（ＩｇＥに由来する）１又は２以上のドメインを含む。１つの実施形態において、抗体は、少なくともＣε２及びＣε３、より好ましくは少なくともＣε２、Ｃε３、及びＣε４を含み、好ましくはドメインはヒトＩｇＥに由来する。１つの実施形態において、抗体は、エプシロン（ε）重鎖、好ましくはヒトε重鎖を含む。

ヒトＩｇＥに由来する定常ドメイン、特にＣε１、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４ドメインが、それぞれ配列番号１、２、及び３に示される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝暗号に従って当業者によって推測され得る。ヒトＣε１、Ｃε２、Ｃε３、及びＣε４ドメイン並びにヒトε重鎖配列を含む、他のヒト及び哺乳類ＩｇＥ並びにそのドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、公的にアクセス可能なデータベースから入手可能である。例えば、ヒト免疫グロブリン配列のデータベースは、http://www.imgt.orgにてInternational ImMunoGeneTics Information System（ＩＭＧＴ（登録商標））ウェブサイトからアクセス可能である。１つの例として、様々なヒトＩｇＥ重（ε）鎖アレル及びそれらの個々の定常ドメイン（Ｃε１～４）の配列は、http://www.imgt.org/IMGT_GENE-DB/GENElect?query=2+IGHE&species=Homo+sapiensにてアクセス可能である。

本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、典型的に、胎児Ｆｃ（ＦｃＲｎ）受容体にさらに結合し得る。好ましくは、ハイブリッド抗体は、ＦｃＲｎに結合し得かつ活性化し得、及び／又はそのような受容体を発現する免疫系の細胞（例えば単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、及び好酸球等、造血系の骨髄細胞を含む）を活性化し得る。

好ましくは、ハイブリッド抗体は、ＦｃＲｎにｐＨ依存的様式で結合する。特に、ハイブリッド抗体は、酸性ｐＨでＦｃＲｎに優先的に結合し得、例えば抗体は、ｐＨ７又はそれよりも上でと比較して、７より下のｐＨでＦｃＲｎに対するより高いアフィニティーを有し得る。例えば、１つの実施形態において、抗体は、４～６．５のｐＨで（例えば、ｐＨ６．０で）ＦｃＲｎに結合するが、ｐＨ７．０又は７．４では結合しない。

本明細書に記載される抗体は、典型的に、ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合に関与するＩｇＧ抗体の少なくとも一部分、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）、好ましくはヒトＩｇＧに由来する１又は２以上の配列又はアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、抗体は、四量体ＩｇＥの少なくとも１つのＦｃドメインにおける１又は２以上のアミノ酸置換を含む。例えば、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＩｇＥのＣε３において行われ得る。代替的に又は加えて、少なくとも１つのアミノ酸置換は、ＩｇＥのＣε４において行われ得る。具体的には、１つのアミノ酸置換がＣε３において行われ得、２つのアミノ酸置換がＩｇＥのＣε４において行われ得る。

好ましくは、ＩｇＥに、例えばＩｇＥのＣε３又はＣε４ドメインに存在する少なくとも１つの天然アミノ酸は、ヒスチジンに置換される。したがって、ハイブリッド抗体は、１又は２以上の非天然ヒスチジン残基、すなわちＩｇＥ配列におけるその位置で典型的にはヒスチジンでない残基を含むＩｇＥであり得る。典型的に、非天然ヒスチジン残基は、ヒスチジン残基が存在するＩｇＧ抗体における位置に対応するＩｇＥ抗体の位置に存在する。したがって、ＩｇＥ抗体は、典型的に、ＩｇＥ抗体にＦｃＲｎ結合を付与し得る１、２、又は３つの異種ヒスチジン残基を含む。この文脈において、「異種」又は「非天然」とは、それが比較されている実体の残りのそれとは遺伝子型的に明確に区別できる実体に由来することを意味する。例えば、異なるポリペプチドに遺伝子改変技法によって導入される、特定のタンパク質又はポリペプチドに由来するアミノ酸残基又は配列は、異種又は非天然残基である。したがって、例えば、天然に存在する、野生型の、又は天然のＩｇＥドメインにおいて通常ではヒスチジンでない位置にヒスチジン残基を含むＩｇＥ抗体は、その位置に異種又は非天然ヒスチジン残基を含むと言われる。

例えば、ＩｇＥのＣε３のループ２において、トレオニン残基がヒスチジンに置換され得る。付加的に又は代替的に、ＩｇＥのＣε４のループ３において、セリン残基がヒスチジンに置換され得、グルタミンがヒスチジンに置換され得る。そのようなバリアントの例は、配列番号２６及び３１～３４に見出され得る。

別の実施形態において、抗体は、Ｃγ２及び／又はＣγ３に見出されるループ配列から選択される、ＩｇＧに由来する配列を含む。１つの実施形態において、抗体は、Ｃγ２、より好ましくは少なくともＣγ２及びＣγ３に由来するループ配列の少なくとも一部を含み、好ましくはドメインはヒトＩｇＧ１抗体に由来する。１つの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１に由来するヒンジ領域をさらに含む。

ヒトＩｇＧに由来する定常ドメインＣγ２及びＣγ３が、それぞれ配列番号９及び１０に示される。ヒトＩｇＧに由来するヒンジドメインは、配列番号８に記される。これらのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、遺伝暗号に従って当業者によって推測され得る。ヒトＣγ２及びＣγ３ドメイン並びにヒンジ配列を含む、他のヒト及び哺乳類ＩｇＧ定常ドメインのアミノ酸配列は、当技術分野において公知であり、ＩｇＥ定常ドメインに関して上で記載されるように、公的にアクセス可能なデータベースから入手可能である。

１又は２以上のＩｇＥドメイン及び１又は２以上のＩｇＧドメインのアミノ酸配列は、直接的に又は適切なリンカーを介して連結され得る。ポリペプチドドメインを接合するための適切なリンカーは、当技術分野において周知であり、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態において、リンカー配列は、最高２０個のアミノ酸残基を含み得る。

Ｆｃε及びＦｃＲｎ受容体へのハイブリッド抗体の結合は、標準的技法を使用して査定され得る。結合は、例えば、抗原／抗体解離速度を判定することによって、競合ラジオイムノアッセイによって、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）によって、又は表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）によって測定され得る。結合アフィニティーは、例えばFrankel et al (1979) Mol. Immunol. 16:101-106によって記載されるスキャッチャード法に基づく、標準的方法を使用しても計算され得る。

一般的に、本明細書に規定される配列の機能的フラグメントは、本発明において使用され得る。機能的フラグメントは、フラグメントが、抗体に存在する場合に、要される活性（例えば、ＦｃＲｎ及び／又はＦｃε受容体への結合）を保持するという条件で、任意の長さ（例えば、少なくとも５０、１００、３００、若しくは５００個のヌクレオチド、又は少なくとも５０、１００、２００、３００、若しくは５００個のアミノ酸）のものであり得る。

本明細書に記載されるアミノ酸及びヌクレオチド配列のバリアントも、結果として生じる抗体が、ＦｃＲｎ及びＦｃε受容体の両方に結合するという条件で、本発明において使用され得る。典型的に、そのようなバリアントは、本明細書において指定される配列の１つと高い程度の配列同一性を有する。

アミノ酸又はヌクレオチド配列間の類似性は、別様に配列同一性と称される、配列間の類似性の観点から表現される。配列同一性は、同一性（又は類似性又は相同性）パーセンテージの観点からしばしば測定され；パーセンテージが高ければ高いほど、２つの配列はより類似している。アミノ酸又はヌクレオチド配列のホモログ又はバリアントは、標準的方法を使用してアラインした場合に、比較的高い程度の配列同一性を所有するであろう。

比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482；Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443；Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444；Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151；Corpet et al (1988) Nucleic Acids Research 16:10881；及びPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444に記載される。Altschul et al (1994) Nature Genet. 6:119は、配列アライメント法及び相同性計算についての詳細な検討事項を提示する。

ＮＣＢＩの基本的ローカルアライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ，Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403）は、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘと関連した使用のために、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ，National Center for Biotechnology Information、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．）を含むいくつかの供給源から及びインターネットで利用可能である。このプログラムを使用して配列同一性を判定する方法についての説明は、インターネットでＮＣＢＩウェブサイトにて入手可能である。

本明細書に記載される特異的抗体又はそのドメイン（例えば、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、又はＣＨドメイン）のホモログ及びバリアントは、典型的に、初期設定パラメーターに設定されたＮＣＢＩＢｌａｓｔ２．０、ギャップありｂｌａｓｔｐを使用して、例えば少なくとも２０、５０、１００、２００、若しくは５００個のアミノ酸残基にわたって、又は抗体若しくはそのドメインのアミノ酸配列との全長アライメントにわたってカウントされる、元の配列（例えば、本明細書に規定される配列）と少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。約３０個のアミノ酸よりも大きいアミノ酸配列の比較に関しては、初期設定パラメーター（１１のギャップ存在コスト、及び１の残基あたりのギャップコスト）に設定された初期設定ＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用して、Ｂｌａｓｔ２配列機能が採用される。短いペプチド（おおよそ３０個のアミノ酸よりも少ない）をアラインする場合、アライメントは、初期設定パラメーター（オープンギャップ９、伸長ギャップ１ペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０行列を採用した、Ｂｌａｓｔ２配列機能を使用して実施されるべきである。参照配列とさらに大きな類似性を有するタンパク質は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性等、この方法によって査定された場合、増加する同一性パーセンテージを示すであろう。全体に満たない配列が配列同一性に関して比較されている場合、ホモログ及びバリアントは、典型的に、１０～２０個のアミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を所有すると考えられ、参照配列とのそれらの類似性に応じて、少なくとも８５％又は少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を所有し得る。そのような短いウィンドウにわたる配列同一性を判定するための方法は、インターネットでＮＣＢＩウェブサイトにて利用可能である。当業者であれば、これらの配列同一性域は、単なる手引きのために提供されるものであり；提供される域から外れる強力に有意なホモログが獲得され得ることは全く可能であることを解するであろう。

典型的に、バリアントは、元のアミノ酸又は核酸配列と比較して、１又は２以上の保存的アミノ酸置換を含有し得る。保存的置換とは、ＦｃＲｎ及び／又はＦｃε受容体に対する抗体のアフィニティーに実質的に影響を及ぼさない又は減少させないそうした置換である。例えば、ＦｃＲｎ及び／又はＦｃεに結合するヒト抗体は、元の配列（例えば、上で規定される）と比較して、最高１、最高２、最高５、最高１０、又は最高１５個の保存的置換を含み得、ＦｃＲｎ及び／又はＦｃε受容体への特異的結合を保持し得る。保存的変動という用語は、抗体がＦｃＲｎ及び／又はＦｃεに結合するという条件で、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含む。非保存的置換とは、活性、又はＦｃＲｎ及び／若しくはＦｃε受容体への結合を低下させるものである。

保存的置換によって交換され得る機能的に類似したアミノ酸は、当業者に周知である。以下の６つの群は、互いに対して保存的置換であると見なされるアミノ酸の例である：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

上で記載されるドメイン（例えば、１又は２以上のＩｇＥ及びＩｇＧ定常ドメイン）は、典型的に、抗体における重鎖に存在する。ハイブリッド抗体は、本明細書に記載される１又は２以上の重鎖配列に加えて、１又は２以上の軽鎖をさらに含み得る。例えば、１つの実施形態において、ハイブリッド抗体は、配列番号３５に規定される軽鎖配列、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含み得る。抗体は、典型的に、そのそれぞれが、可変重（ＶＨ）領域及び可変軽（Ｌ）領域と称される可変領域を有する、重鎖及び軽鎖から構成される。一緒になって、ＶＨ領域及びＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原に結合することに関与する。典型的に、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖を有する。２種のタイプの軽鎖、ラムダ（λ）及びカッパ（ｋ）がある。したがって、ハイブリッド抗体は、典型的に、例えば各重鎖のＣ末端で融合したＩｇＧヒンジ、ＣＨ２、及び／又はＣＨ３ドメインを含むＩｇＥ抗体に基づく、２本の重鎖及び２本の軽鎖（例えば、ジスルフィド結合によって接合した）を含む。

本明細書に記載されるハイブリッド抗体は、がんを治療するのに有用な１又は２以上の標的抗原に特異的に（すなわち、それらの可変ドメイン又はその相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して）結合し得る。例えば、ハイブリッド抗体は、１又は２以上のがん抗原（すなわち、がん細胞上で選択的に発現される又は過剰発現される抗原）に特異的に結合し得る。組み合わされたＦｃεＲ及びＦｃＲｎ結合能により形質導入されたエフェクター機能の新規の組み合わせは、免疫系細胞（例えば、単球／マクロファージ及びナチュラルキラー細胞）の細胞傷害、貪食（例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ）、及び他のがん細胞殺傷機能を増強させ得る。例えば、ハイブリッド抗体は、例えばＥＧＦ－Ｒ（上皮成長因子受容体）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、又はｅｒｂＢ２受容体（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）に特異的に結合し得る。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに選択的に結合する可変ドメインを含む抗体の１つの例はトラスツズマブ（ハーセプチン）である。

一部の実施形態において、可変ドメインの１若しくは２以上及び／又はＣＤＲの１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくは６つすべてのＣＤＲは、以下の抗体：アレムツズマブ（配列番号３６～４１）、アテゾリズマブ（配列番号４２～４７）、アベルマブ（配列番号４８～５３）、ベバシズマブ（配列番号５４～５９）、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、セミプリマブ、セルトリズマブ（配列番号６０～６５）、セツキシマブ（配列番号６６～７１）、デノスマブ、デュルバルマブ（配列番号７２～７７）、エファリズマブ（配列番号７８～８３）、イピリムマブ、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ（配列番号８４～８９）、パニツムマブ（配列番号９０～９５）、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ（配列番号９６～１０１）、リツキシマブ（配列番号１０２～１０７）、又はトラスツズマブ（配列番号１０８～１１３）のうちの１又は２以上に由来し得る。

そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表１に挙げられる抗体の１つ由来のＣＤＲの１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくはＣＤＲ配列の６つすべてを含み得る。

代替的な実施形態において、可変ドメインの１若しくは２以上及び／又は１若しくは２以上のＣＤＲ、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくは６つすべてのＣＤＲは、以下の抗体：アブシキシマブ、アダリムマブ（配列番号１１４～１１９）、アデュカヌマブ、アデュカヌマブ、アレファセプト、アリロクマブ、アニフロルマブ、バルスチリマブ、バシリキシマブ（配列番号１２０～１２５）、ベリムマブ（配列番号１２６～１３１）、ベンラリズマブ、ベズロトクスマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ、ブロスマブ、カナキヌマブ、カプラシズマブ、クリザンリズマブ、ダクリズマブ（配列番号１３２～１３７）、ダラツムマブ、ジヌツキシマブ、ドスタルリマブ、デュピルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エマパルマブ、エミシズマブ、エプチネズマブ、エレヌマブ、エトロリズマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、フレマネズマブ、ガルカネズマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イバリズマブ、イダルシズマブ、イネビリズマブ、インフリキシマブ（配列番号１３８～１４３）、イサツキシマブ、イキセキズマブ、ラナデルマブ、レロンリマブ、マルジェツキシマブ、メポリズマブ、モガムリズマブ、ムロモナブ、ナルソプリマブ、ナタリズマブ（配列番号１４４～１４９）、ナキシタマブ、ネシツムマブ、オビルトキサキシマブ、オクレリズマブ、オムブルタマブ、パリビズマブ（配列番号１５０～１５５）、ラムシルマブ、ラニビズマブ（配列番号１５６～１６１）、レスリズマブ、リサンキズマブ、ロモソズマブ、サリルマブ、サトラリズマブ、セクキヌマブ、スパルタリズマブ、スチムリマブ、タファシタマブ、タネズマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、チルドラキズマブ、トシリズマブ、トリパリマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、又はザリフレリマブのうちの１又は２以上に由来し得る。

そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表２に挙げられる抗体の１つ由来のＣＤＲの１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくはＣＤＲ配列の６つすべてを含み得る。

他の実施形態において、可変ドメインの１若しくは２以上及び／又はＣＤＲ配列の１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくは６つすべてのＣＤＲは、抗ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体に由来し得る。１つの実施形態において、可変ドメインの１若しくは２以上及び／又はＣＤＲ配列の１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくは６つすべてのＣＤＲは、国際公開第２０１３／０５０７２５号パンフレットに記載される抗ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体に由来し得る（可変ドメインに関しては配列番号１６８及び１６９、並びにＣＤＲに関しては配列番号１６２～１６７）。ＨＭＷ－ＭＡＡとは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４，chondroitin sulfate proteoglycan 4）又は黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ，melanoma chondroitin sulfate proteoglycan）としても知られる高分子量－黒色腫関連抗原を指し、例えばＵｎｉｐｒｏｔＱ６ＵＶＫ１を参照されたい。

そのような実施形態において、抗体の可変ドメインは、表３に規定される、ＣＤＲ配列の１若しくは２以上、好ましくは少なくとも３つのＣＤＲ、又はより好ましくはＣＤＲ配列の６つすべてを含み得る。他の実施形態において、抗体の可変ドメインの１又は２以上は、表３に挙げられる可変ドメイン配列の１又は２以上を含む。

担体、並びにＦｃＲｎ及びＦｃε受容体又はその機能的フラグメントに結合する１又は２以上のハイブリッド抗体を含む組成物が本明細書において提供される。組成物は、対象への投与のための単位剤形で調製され得る。投与の量及びタイミングは、所望の目的を達成するための、治療を行う医師の裁量にある。抗体は、全身又は局所（腫瘍内等）投与のために製剤化され得る。１つの例において、抗体は、静脈内投与等の非経口投与のために製剤化され得る。

投与のための組成物は、水性担体等の薬学的に許容される担体中に溶解された抗体又はその機能的フラグメントの溶液を含み得る。多様な水性担体、例えば緩衝生理食塩水等が使用され得る。これらの溶液は無菌であり、一般的に、望ましくない物質を含んでいない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌され得る。

組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等、生理学的条件に近づけるために要される薬学的に許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤における抗体の濃度は、広く変動し得、選択された投与の特定の様態及び対象の必要性に従って、主として流体容量、粘度、体重等に基づいて選択されるであろう。

静脈内投与のための医薬組成物の典型的な用量は、１日あたり対象のｋｇ体重あたり約０．１～１５ｍｇの抗体を含む。特に、薬剤が、体腔に又は臓器の内腔に等、隔離された部位に投与され、循環系又はリンパ系に投与されない場合、１日あたりｋｇあたり０．１～最高約１００ｍｇの投薬量が使用され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知である又は明らかであると考えられ、Remington's Pharmaceutical Science, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1995)等の刊行物により詳細に記載される。

抗体は、凍結乾燥形態で提供され得、投与の前に滅菌水で水和され得るが、既知の濃度の滅菌溶液でも提供される。次いで、抗体溶液は、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加され得、典型的に、体重の０．５～１５ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与され得る。抗体は、静脈内プッシュ又はボーラスでよりもむしろ緩徐な注入によって投与され得る。１つの例において、より高い負荷用量が投与され得、後続の維持用量がより低いレベルで投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量が、およそ９０分間の期間にわたって注入され得、前の用量が良好な忍容性を示された場合、その後に、３０分間の期間にわたって注入される２ｍｇ／ｋｇの４～８週間の週１回の維持用量が続く。

本明細書に記載される抗体（又はその機能的フラグメント）を投与して、がん細胞等の細胞の増殖を遅らせ得る又は阻害し得る。これらの適用において、治療有効量の抗体が、がん細胞の増殖、複製、若しくは転移を阻害する、又はがんの兆候若しくは症状を阻害するのに十分な量で対象に投与され得る。一部の実施形態において、抗体を対象に投与して、転移の進行を阻害し得る若しくは阻止し得る、又は微小転移、例えば領域リンパ節への微小転移等の転移のサイズ若しくは数を減少させ得る（Goto et al (2008) Clin. Cancer Res. 14(11):3401-3407）。

抗体の治療有効量は、疾患の重症度及び患者の健康の全般的状態に依存するであろう。抗体の治療有効量は、症状の主観的軽減、又は臨床医若しくは他の有資格観察者によって気付かれる客観的に確認可能な改善のいずれかを提供するものである。これらの組成物は、同時に又は逐次的に、別の化学療法剤と併せて投与され得る。

多くの化学療法剤が現在当技術分野において公知である。１つの実施形態において、化学療法剤は、分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、インターカレート抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答修飾因子、抗ホルモン、例えば抗アンドロゲン、及び抗血管新生剤からなる群から選択され得る。

本明細書において引用されるすべての文書は、参照によりそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によってより詳細に記載されるであろう。
［実施例］

以下の実施例において、ＩｇＥのＣＨ３及びＣＨ４ドメインにおける特異的アミノ酸を、ＩｇＧのＦｃＲｎ結合部位に見出されるアミノ酸で置き換えることによって、ＦｃＲｎ結合がＩｇＥ抗体に付与され得ることが実証される。

ＦｃＲｎ構築物
ＩｇＥのＣε３及びＣε４ドメインに見出されるループに点変異が行われた、ＩｇＥバリアントを創出した。変異により、固有のアミノ酸は、ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用に関わることが公知の位置にてヒスチジンで置き換えられた。ＩｇＥ抗体は、例えばKaragiannis et al (2009) Cancer Immunol. Immunother. 58(6):915-30に開示されるトラスツズマブＩｇＥに基づいた。

ＩｇＥのＣε３及びＣε４ドメインにおけるループが、ＩｇＧ抗体のＣγ２及びＣγ３ドメインに由来する１又は２以上のＦｃＲｎ結合ループで置き換えられた、さらなるバリアントＩｇＥ抗体を作出した。ＩｇＥのＣε３及びＣε４ドメインにおいて置き換えられたループは、ＩｇＧのＣγ２及びＣγ３ドメインにおけるＦｃＲｎ結合ループとの構造相同性を示す。

比較のために、ｉ）ＩｇＧに由来するヒンジ及びＣγ２ドメインがトラスツズマブＩｇＥのＣ末端に融合され、並びにii）ＩｇＧヒンジ並びにＣγ２及びＣγ３ドメインがトラスツズマブＩｇＥのＣ末端に融合され、２種のＩｇＥ融合構築物を創出した。

構造分析により、ＩｇＧＣＨ２（Ｃγ２）及びＣＨ３（Ｃγ３）から、３つのループがＦｃＲｎ結合に関わると同定された。ＩｇＥにおける構造的に等価のループを同定し、ＩｇＧループでの置き換えに選定した。３つのループＬ１、Ｌ２、及びＬ３を同定し、ループ３は、短縮置換（Ｌ３ａ）又は伸長置換（Ｌ３ｂ）のいずれかを含有した。付加的に、ＩｇＧＣＨ２ＣＨ３内の３つのヒスチジン残基が、ＦｃＲｎとの相互作用に関わると同定された。ＩｇＥにおける等価の残基を同定し、ヒスチジンによって置き換えた。

ヒト重鎖及びカッパ軽鎖に対するAbzena社製pANT二重Ig発現ベクターシステムへのクローニングのための隣接制限酵素部位を有して、野生型（ＷＴ，wild type）ＩｇＥ定常ドメイン、及び別個に、ＩｇＧＦｃＲｎＬ１、２、３ａ又はＬ１、２、３ｂを含有するＩｇＥの両方に相当するＤＮＡ配列を合成した（GeneArt、ThermoFisher Scientific社）。トラスツズマブＶＨも含有する重鎖を、Mlu I及びKpnI制限部位の間にクローニングした。別個に合成されたトラスツズマブＶｋを、Pte I及びBamH I制限部位の間にクローニングした。目的のループを増幅する特異的プライマーを使用し、及びすべての考え得る組み合わせで１つ又は２つのＩｇＧ１ループを有するＩｇＥを作出するプルスルー（pull through）ＰＣＲを使用して、個々のループバリアントを構築して、合計８種の付加的な構築物（Ｌ１単独、Ｌ２単独、Ｌ３単独、Ｌ１＋２、Ｌ１＋３ａ、Ｌ１＋３ａ、Ｌ２＋３ａ、及びＬ２＋３ｂを含有する）を作出した。

ＷＴＩｇＥ定常ドメインを鋳型として使用した部位指向性変異導入、関連残基をヒスチジンで置き換えることによって、３Ｈｉｓバリアントを作出した。

ＩｇＥ－ＩｇＧ１ＣＨ２及びＣＨ２－ＣＨ３融合バリアントを作出するために、特異的プライマーを使用してＷＴＩｇＥを増幅し、一方でＩｇＥＣＨ４の末端における終止コドンを除去し、かつ別個の反応において、別個に合成されるＩｇＧ１ＣＨ２又はＩｇＧ１ＣＨ２－ＣＨ３のいずれかを増幅した。プルスルーＰＣＲを使用して、両フラグメントを組み合わせ、二重発現ベクターへのクローニングのためのMlu I及びKpnI制限部位を導入した。

以下のハイブリッド抗体分子を構築した。
ＩｇＧＦｃＲｎループ１を含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ２を含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ３ａを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ３ｂを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ２を含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ３ａを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ２＋ループ３ａを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ２＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ２＋ループ３ａを含有するＩｇＥ；
ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ２＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ；及び
３×ＩｇＧヒスチジン残基入れ替えのみを含有するＩｇＥ

加えて、以下の融合タンパク質を構築した。
ＩｇＥ＋ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２
ＩｇＥ＋ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３

野生型トラスツズマブＩｇＥに対する配列は以下のとおりであった。

ＷＴＩｇＥ＿ＶＨ＿ＣＨ１＿ＣＨ２：

ＷＴＩｇＥ＿ＣＨ３（置き換えられたループは下線が引かれている；ヒスチジンで置き換えられた残基は太字の斜体である）：

ＷＴＩｇＥ＿ＣＨ４：

ＩｇＥループ１：

ＩｇＥループ２：

ＩｇＥループ３ａ：

ＩｇＥループ３ｂ：

野生型ＩｇＧに対する配列は以下のとおりであった。

ＷＴＩｇＧ＿ヒンジ：

ＷＴＩｇＧ＿ＣＨ２（ループは斜体でかつ下線が引かれている；置換ヒスチジンは太字である）：

ＷＴＩｇＧ＿ＣＨ３：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ１：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ２：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ３ａ：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ３：

ハイブリッド分子に対する配列は以下のとおりであった。各ハイブリッド分子は、野生型ＩｇＥ＿ＶＨ＿ＣＨ１＿ＣＨ２（すなわち、配列番号１）をさらに含む。

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ１を含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ２を含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ３ａを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ３ｂを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ１＋ループ２を含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ１＋ループ３ａを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ１＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ２＋ループ３ａを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎ結合ループ２＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ２＋ループ３ａを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＧＦｃＲｎループ１＋ループ２＋ループ３ｂを含有するＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４：

ＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４３Ｈｉｓ

融合タンパク質に対する配列は以下のとおりであった。各融合タンパク質は、野生型ＩｇＥ＿ＶＨ＿ＣＨ１＿ＣＨ２及びＩｇＥ＿ＣＨ３（すなわち、配列番号１及び２）をさらに含む。

ＩｇＥ＿ＣＨ４＋ＩｇＧ１ヒンジ＿ＣＨ２（ＲＳリンカーを含有する）：

ＩｇＥ＿ＣＨ４＋ＩｇＧ１ヒンジ＿ＣＨ２＿ＣＨ３（ＲＳリンカーを含有する）

ＩｇＥの重鎖＋ＩｇＧ１ヒンジ＿ＣＨ２構築物の全アミノ酸配列が下に示される：

ＩｇＥの重鎖＋ＩｇＧ１ヒンジ＿ＣＨ２＿ＣＨ３構築物の全アミノ酸配列が下に示される：

以下の変異体ループ配列は、ＩｇＥ３Ｈｉｓ構築物のＣＨ３及びＣＨ４ドメインに見出される。

ＩｇＥループ２：

ＩｇＥループ３ａ：

ＩｇＥループ３ｂ：

ＩｇＥ３Ｈｉｓ構築物の重鎖の全アミノ酸配列が下に示される（すなわち、ＷＴＩｇＥ＿ＶＨ＿ＣＨ１＿ＣＨ２＋ＩｇＥ＿ＣＨ３＿ＣＨ４３Ｈｉｓ）：

ＩｇＥ３Ｈｉｓ構築物の軽鎖の全アミノ酸配列（及び、本明細書に開示される他の構築物）が下に示される：

すべての構築物をシーケンシングによって確認した。ＤＮＡを調製し、OC-400プロセシングアセンブリを有するMaxCyte STX（登録商標）エレクトロポレーションシステム（MaxCyte社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）を使用して、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの７～１０日後、上清を採取した。

抗体（すなわち、上で記載されるバリアント重鎖及びトラスツズマブＩｇＥに由来するカッパ軽鎖を含む）を、ＩｇＧ１ＣＨ２－ＣＨ３融合体に対して、CaptureSelect（登録商標）IgEアフィニティーマトリックス（ThermoFisher社、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）又はMab Select Sureカラム（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のいずれかを使用して、細胞培養上清から精製した。溶出された画分をＰＢＳにバッファー交換し、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数（Ｅ_{ｃ（０．１％）}）を使用したＡ_{２８０ｎｍ}による定量の前に濾過滅菌した。

ＦｃＲｎへのＩｇＥバリアントの結合
ＦｃＲｎ（Sino Biological社、カタログ番号ＣＴ００９－Ｈ０８Ｈ）への抗体バリアントの結合を査定するために、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞培養物由来の上清に対して、単一濃度でのＢｉａｃｏｒｅ速度論的分析を実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0（GE Healthcare社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランするBiacore T200（シリアル番号１９０９９１３）で、速度論的実験を実施した。アッセイの原理は図１に示される。すべての速度論的実験を、０．０５％Ｐ２０（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）及び付加的な１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．０）を含有するＰＢＳを用いて２５℃でランした。CaptureSelectビオチン抗IgE抗体（Thermo社、カタログ番号７１０３５４２５００）をあらかじめロードされたストレプトアビジン（Straptavidin）チップ（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のＦ_ｃ２、Ｆ_ｃ３、及びＦ_ｃ４に抗体をロードした。抗体を１０μｌ／分の流速で捕捉して、約２５０ＲＵの固定化レベル（ＲＬ）を与えた。２０００ｎＭのＦｃＲｎを１０μｌ／分の流速で４０秒間用いて、結合データを獲得した。野生型ＩｇＥを陰性対照として使用した。参照チャネルＦ_ｃ１（抗体なし）からのシグナルをＦ_ｃ２、Ｆ_ｃ３、及びＦ_ｃ４のものから差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正した。抗ＩｇＥ抗体捕捉表面の再生を、グリシンｐＨ２．０の１回のインジェクションを使用して行った。

図２に見てわかるように、捕捉された抗体のレベルの有意な差異が見られた。ループ１又は３ｂ又は２種ループ入れ替えのいずれかを含有するバリアントを用いて捕捉された量は、野生型ＩｇＥＩｇＧ融合抗体又は３Ｈｉｓ置換抗体に関して観察されたものよりもはるかに低いようであった。この理由は、発現が低い又は捕捉があまり効率的でないということであり得る。ＦｃＲｎ結合ランの間の十分なローディングを可能にするように、希釈及び接触時間を調整した。

図３に見てわかるように、バリアントに関して結合の差異が観察されたが、いくつかのバリアントをさらに追求することは興味深い。概して、対照タンパク質は、予想通りに挙動するようであり、野生型ＩｇＥの結合は見られなかったが、一方でＩｇＥ－ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３の結合は観察された。参照Ｆ_ｃ１へのいくらかの結合があり得、ＩｇＥバリアントの一部に対するベースラインを下回る推移につながる。

非精製タンパク質を使用した場合、結合速度論は、融合タンパク質ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３に関して観察されたものとは異なるようである。融合タンパク質ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３の結合プロファイルは、代わりに、チップにカップリングされたＦｃＲｎを用いてランされたアッセイから予想されるであろう結果と同様である。精製抗体を用いる場合、標準的アミン化学を使用してチップにＦｃＲｎを固定化すること、及び種々の濃度の抗体の上を流すことが典型的である。上清におけるＩｇＥの濃度は未知であるため、この手法は適切ではない。

CaptureSelectへの結合が低い場合には、代替的な精製が必要とされ得る。発現が低い場合には、精製及びさらなる分析のための十分な抗体を作出するために、大容量の細胞が要され得ることが推察された。しかしながら、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ，size exclusion chromatography）とともに抗カッパセレクト樹脂を使用した精製により、発現は問題ではないことが示唆される（示されず）。

これらの結果に基づき、標準的アッセイセットアップにおいて精製材料を使用して、バリアントの大多数を精製しかつ再試験することを決定した。

精製ハイブリッドＩｇＥバリアントの結合
この実験の目標は、ヒトＦｃＲｎへの精製ＩｇＥバリアント抗体の結合を査定することであった。野生型ＩｇＥを陰性対照として使用し、ハーセプチンを陽性対照として使用した。

ＦｃＲｎへのＩｇＧの結合はｐＨ依存的であり、血清中に戻るエンドソームに取り入れられる抗体のリサイクリングに関わる。ＦｃＲｎは、ｐＨ７．４でよりもｐＨ６．０で、ＩｇＧに対するより高いアフィニティーを有する。

ＦｃＲｎへの選択されたバリアントの速度論を判定するために、精製抗体に対してマルチサイクル速度論的分析を実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0（GE Healthcare社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランするBiacore T200（シリアル番号１９０９９１３）で、速度論的実験を実施した。すべての速度論的実験を、０．０５％Ｐ２０（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）及び付加的な１５０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ６．０又はｐＨ７．４）を含有するＰＢＳを用いて２５℃でランした。アッセイの原理は図１に示される。ヒトＦｃＲｎを、標準的アミン化学を使用して、CM5チップ（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）に約３００ＲＵまで直接カップリングした。任意の潜在的な大量輸送制限を最小限に抑えるために、精製抗体を３０μｌ／分の流速で分析物として用いて、マルチサイクル速度論データを獲得した。抗体の２４．７ｎＭ～２０００ｎＭの５点３倍希釈域をｐＨ６．０分析に関して使用し、ｐＨ７．４分析に関しては、抗体の２２２．２ｎＭ～２０００ｎＭの３点３倍希釈域を使用した。抗体のインジェクションに対する会合相を２５秒間モニターし、解離相を７５秒間測定した。ＦｃＲｎ表面の再生を、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０インジェクションを使用して実施した。参照チャネルＦ_ｃ１からのシグナルを差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正し、定常状態結合モデルを使用してデータをフィットさせた。

結果として生じたデータに対して定常状態分析を行い、そのような分析は、低アフィニティー相互作用に特に適切である。平衡状態にある応答（Ｒ_ｅｑ）のプロットを濃度に対してプロットする。アフィニティー測定に関して、センサーグラムは、結合の会合相の間に定常状態（Ｘにおけるプラトー）に達するべきである（図５を参照されたい）。応答対濃度のプロット上で、Ｋ_Ｄ値は、最大応答の５０％を与える濃度に等しい。平衡状態にある応答（Ｒ_ｅｑ）が濃度に対してプロットされた場合に合理的な曲率が獲得された場所で、Ｋ_Ｄは提供される。

図６及び表１は、ｐＨ６．０での、ＦｃＲｎへのＩｇＧ１、ＩｇＧ４、及び融合構築物ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３の結合を示している。

表１：

図７及び表２は、ｐＨ６．０での、ヒトＦｃＲｎへのハーセプチン、野生型ＩｇＥ、ＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３、３×ＩｇＧヒスチジン残基を含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ２及びループ３ａを含有するＩｇＥ、ＩｇＧＦｃＲｎループ１を含有するＩｇＥ、並びにＩｇＧＦｃＲｎループ１、ループ２、及びループ３ａを含有するＩｇＥの結合に関する生データ及びフィットさせたデータを示している。

表２：

図８及び９並びに表３及び４は、ｐＨ７．４で行われた同じ実験の結果を示している。

表３：

表４：

見てわかるように、ＦｃＲｎへのＩｇＥ＿ＩｇＧ＿ＣＨ２＿ＣＨ３の結合は、野生型ＩｇＧのものと概ね同様である。

別様に指定されない限り、技術的及び科学的用語を含む、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通に理解される意味を有する。さらなる手引きによって、用語定義は、本発明の教示をよりよく解するために含まれ得る。

抗ＨＭＷ－ＭＡＡハイブリッド抗体
さらなる実施例において、別のＩｇＥ３Ｈｉｓバリアントを創出する（実施例１、配列番号３４及び３５を参照されたい）。この実施例において、ＩｇＥ抗体は、実施例１にあるトラスツズマブＩｇＥではなく、例えば国際公開第２０１３／０５０７２５号パンフレットに開示される抗ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体に基づく。したがって、この実施例において、トラスツズマブＶＨ及びＶＬドメイン（配列番号３４及び３５に存在する）は、抗ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体ＶＨ及びＶＬドメインで置き換えられる。抗体は、実施例１に記載されるように産生されかつ精製される。抗体結合の分析は、実施例２～３に記載されるように試験される。

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥに対する可変ドメイン配列は以下のとおりである。

ＨＭＷ－ＭＡＡＶＨ（配列番号１７０）：

ＨＭＷ－ＭＡＡＶＬ（配列番号１７１）：

代替的な実施形態において、ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥに対する可変ドメイン配列は以下のとおりである。

ＨＭＷ－ＭＡＡＶＨ（配列番号１８４）：

ＨＭＷ－ＭＡＡＶＬ（配列番号１８５）：

したがって、具体的な実施形態において、抗ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体は、以下の重鎖又は軽鎖配列の１つを含み得る（下線は可変ドメイン配列を示し、標準的文字列はＩｇＥＦｃ配列を示し、太字の下線配列はＨｉｓ変異を示す）。

ＨＭＷ－ＭＡＡ重鎖（配列番号１８６）：

ＨＭＷ－ＭＡＡ軽鎖（配列番号１８７）：

代替的ＨＭＷ－ＭＡＡ重鎖（配列番号１８８）：

代替的ＨＭＷ－ＭＡＡ軽鎖（配列番号１８９）：

ヘテロ二量体ＩｇＥの産生
ＩｇＥ－ＩｇＧ－Ｆｃ（ＩＧＥＧ）融合タンパク質の構築
ＷＴＩｇＥ定常ドメインに相当するＤＮＡ配列をＣＨＯ発現のためにコドン最適化し、ヒト重鎖及びカッパ軽鎖に対するpANT二重Ig発現ベクターシステムへのクローニングのための隣接制限酵素部位を有して合成した（GeneArt、ThermoFisher Scientific社、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）。トラスツズマブＶＨも含有する重鎖を、Mlu I及びKpn I制限部位の間にクローニングした。別個に合成されたトラスツズマブＶｋを、カッパ定常領域の上流にあるBssH II及びBamH I制限部位の間にクローニングした。

ＩｇＥ－ＩｇＧ（ＩＧＥＧ）融合体を作出するために、特異的プライマーを使用してＷＴＩｇＥを増幅し、一方でＩｇＥＣＨ４の末端における終止コドンを除去し、かつ別個の反応において、別個に合成されるＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を増幅した。プルスルーＰＣＲを使用して、両フラグメントを組み合わせ、二重発現ベクターへのクローニングのためのMlu I及びKpnI制限部位を導入した。その後、BsmBI制限部位を部位指向性変異導入（Quikchange、Agilent社）によってトラスツズマブＶＨのＦＷ４領域内に導入し、それは、Mlu IとともにＶＨ領域の入れ替えを可能にした（ベクターの略図に関しては、図１０を参照されたい）。

ＩｇＧヒンジ領域内の潜在的遊離システイン残基を除去するために、BsmBI含有ＩｇＥ－ＩｇＧ構築物を鋳型として使用した部位指向性変異導入によって、Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒアミノ酸置換を導入するようにプライマーを設計した（番号付けは、ＩＧＥＧ配列のＩｇＧ部分を参照して、ＥＵ番号付けスキームに基づく）。Ｃｙｓ２２０Ｓｅｒ変異は、下の配列において青色で示される。

ＦｃＲｎに結合するＩＧＥＧのＩｇＧ部分の能力を除去するために、通常ＦｃＲｎ結合に関わる３つの残基においてアミノ酸置換Ｉｌｅ２５３Ａｌａ、Ｈｉｓ３１０Ａｌａ、及びＨｉｓ４３５Ａｌａを行った（番号付けは、ＩＧＥＧ配列のＩｇＧ部分を参照して、ＥＵ番号付けスキームに基づく）。プライマーを設計し、BsmBI含有ＩｇＥ－ＩｇＧ構築物（Ｃｙｓ２２０又はＳｅｒ２２０のいずれかを含有する）を鋳型として使用して、部位指向性変異導入（Agilent社Quikchange）を実施した。

構築物のＣＨ１シリーズを作出するために、ＣＨ１ＶＨ及びＶＫを合成し（GeneArt）、ＩＧＥＧベクターにクローニングした。ＣＨ１ＶＨをMluI及びBsmBI制限部位の間にクローニングし、ＣＨ１ＶｋをBssH II及びBamH I制限部位の間にクローニングした。

すべての構築物をサンガーシーケンシングによって確認した。

配列は以下のとおりであった（下線は可変ドメイン配列を示し、標準的文字列はＩｇＥＦｃ配列を示し、太字はＩｇＧ由来配列を示し、太字の下線は特異的変異を示す）。

トラスツズマブＩｇＥ／ＩＧＥＧバリアント配列

トラスツズマブＩｇＥ重鎖（配列番号１７２）

トラスツズマブＩｇＥ－ＩｇＧ－Ｆｃ重鎖（配列番号１７３）

トラスツズマブＩｇＥ－ＩｇＧ－ＦｃＣ２２０Ｓ重鎖（配列番号１７４）

トラスツズマブＩｇＧ－ＩｇＧ－ＦｃｄＦｃＲｎ重鎖（配列番号１７５）

トラスツズマブＩｇＧ－ＩｇＧ－ＦｃｄＦｃＲｎＣ２２０Ｓ重鎖（配列番号１７６）

カッパトラスツズマブ軽鎖（配列番号１７７）

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥ／ＩＧＥＧバリアント配列

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥ重鎖（配列番号１７８）

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥＩｇＧ－Ｆｃ重鎖（配列番号１７９）

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＥ－ＩｇＧ－ＦｃＣ２２０Ｓ重鎖（配列番号１８０）

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＧ－ＩｇＧ－ＦｃｄＦｃＲｎ重鎖（配列番号１８１）

ＨＭＷ－ＭＡＡＩｇＧ－ＩｇＧ－ＦｃｄＦｃＲｎＣ２２０Ｓ重鎖（配列番号１８２）

ＨＭＷ－ＭＡＡカッパ軽鎖（配列番号１８３）

ＩｇＥ－ＩｇＧ（ＩＧＥＧ）バリアントのＣＨＯ一過性発現
種々のＩＧＥＧ構築物をコードするエンドトキシンフリーＤＮＡを、OC-400プロセシングアセンブリ及びMaxCyte STX（登録商標）エレクトロポレーションシステム（MaxCyte社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）を使用して、Freestyle（登録商標）CHO-S細胞（ThermoFisher社、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に一過性に共トランスフェクトした。細胞回収の後、細胞をプールし、８ｍＭＬ－グルタミン（ThermoFisher社）及び１×ヒポキサンチン－チミジン（ThermoFisher社）を含有するCD Opti-CHO培地（ThermoFisher社）中にて３×１０^６個細胞／ｍＬに希釈した。トランスフェクションの２４時間後、培養温度を３２℃に低下させ、３０％（スタート容量の）Efficient Feed B（ThermoFisher社）、３．３％ FunctionMAX（登録商標）TiterEnhancer（ThermoFisher社）、及び１ｍＭ酪酸ナトリウム（Sigma社、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を添加した。培養物に、１５％（現容量の）CHO CD Efficient Feed B（ThermoFisher社）及び１．６５％ FunctionMAX（登録商標）TiterEnhancer（ThermoFisher社）の添加によって７日目に培養物を供給した。すべてのトランスフェクションを、上清を採取する前に最高１４日間培養した。

ＩＧＥＧバリアントの精製及び分析
培養物採取の後、抗体上清を濾過して、残存する細胞残屑を除去し、１０×ＰＢＳを補給してｐＨを中和した。大多数のＩＧＥＧ精製（ｄＦｃＲｎＩＧＥＧを含む）を、バッチ結合様態で、IgE CaptureSelect（登録商標）アフィニティー樹脂（ThermoFisher Scientific社）を使用して実施した。アフィニティー樹脂をＰＢＳｐＨ７．２中で平衡化し、次いで、回転させながら室温で２時間各試料とともにインキュベートし、その後に一連のＰＢＳ洗浄が続いた。すべての試料を、５０ｍＭクエン酸ナトリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ３．５中に溶出し、ＰＢＳｐＨ７．２にバッファー交換した。試料を、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数（Ｅ_{ｃ（０．１％）}）を使用してＯＤ_{２８０ｎｍ}によって定量した。

選択されたＩＧＥＧ構築物（例えば、Ｃｙｓ２２０又はＳｅｒ２２０のいずれかを含有するトラスツズマブＩＧＥＧ）を、プロテインＡを使用して精製して、プロテインＡ結合の保持を実証した。培養物採取の後、抗体上清を濾過して、残存する細胞残屑を除去し、１０×ＰＢＳを補給してｐＨを中和した。次いで、ＰＢＳｐＨ７．２で事前に平衡化された１ｍＬ Hitrap MabSelect PrismAカラム（Cytiva社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を使用して、抗体を上清から精製した。試料ローディングの後、カラムをＰＢＳｐＨ７．２で洗浄し、タンパク質を０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．０で溶出した。画分を収集し、ｐＨを１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ９．０で調整し、その後にＰＢＳｐＨ７．２へのバッファー交換が続いた。試料を、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数（Ｅ_{ｃ（０．１％）}）を使用してＯＤ_{２８０ｎｍ}によって定量した。

すべてのＩＧＥＧ抗体バリアントを、ＰＢＳｐＨ７．２を移動相として使用したHiLoad（登録商標）26/60 Superdex（登録商標）200pg分取SECカラム（GE Healthcare社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）を使用してさらに精製した。単量体タンパク質を含有する精製物からのピーク画分をプールし、濃縮し、予測アミノ酸配列に基づく減衰係数（Ｅ_{ｃ（０．１％）}）を使用したＡ_{２８０ｎｍ}による定量の前に濾過滅菌した。

次いで、精製された材料を、分析的ＳＥ－ＨＰＬＣ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。Dionex Ultimate 3000RS HPLCシステム（ThermoFisher Scientific社、ＨｅｍｅｌＨｅｍｐｓｔｅａｄ、ＵＫ）に接続されたAcquity UPLC Protein BEH SEC Column、２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（Waters社、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＵＫ）及びAcquity UPLC Protein BEH SEC guard column ３０×４．６ｍｍ、１．７μｍ、２００Å（Waters社、Ｅｌｓｔｒｅｅ、ＵＫ）を使用して、分析的ＳＥＣを実施した。方法は、１０分間にわたるイソクラテイック溶出からなり、移動相は、０．２Ｍリン酸カリウムｐＨ６．８、０．２Ｍ塩化カリウムであった。流速は０．３５ｍＬ／分であった。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収によって検出を行った。精製の後、すべてのＩＧＥＧ抗体バリアントは、９５％を超える単量体種を含有することが示された。

同族抗原へのＩＧＥＧバリアントのシングルサイクル速度論的分析
Ｂｉａｃｏｒｅ分析による、ＨＭＷ－ＭＡＡＩＧＥＧバリアントのその同族抗原への結合分析は、立体構造的に適当な抗原がないことに起因して不可能であった。その代わりに、結合をフローサイトメトリーによって分析した。

ヒトＨｅｒ２抗原への精製トラスツズマブＩＧＥＧバリアントのすべてについての結合を査定するために、シングルサイクル速度論的分析を精製抗体に対して実施した。Biacore T200 ControlソフトウェアV2.0.1及びEvaluationソフトウェアV3.0（Cytiva社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランするBiacore T200で、速度論的実験を２５℃で実施した。プロセスの概略に関しては、図１１を参照されたい。

１％ＢＳＡ（Sigma社、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を補給したHBS-EP+（Cytiva社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランニングバッファーとして、並びにリガンド及び分析物希釈に使用した。精製抗体を、ランニングバッファー中にて１０μｇ／ｍＬに希釈した。各サイクルのスタート時に、抗Fab抗体（抗カッパ抗体及び抗ラムダ抗体の混合物からなる）CM5センサーチップ（Cytiva社、ＬｉｔｔｌｅＣｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）のＦ_ｃ２、Ｆ_ｃ３、及びＦ_ｃ４に抗体をロードした。抗体を１０μｌ／分の流速で捕捉して、約４５ＲＵの固定化レベル（Ｒ_Ｌ）を与えた。次いで、表面を安定させた。

任意の潜在的な大量輸送効果を最小限に抑えるために、組換えヒトＨｅｒ２抗原（Sino Biological社、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を４０μＬ／分の流速でインジェクトされる分析物として使用して、シングルサイクル速度論データを獲得した。ランニングバッファー中の抗原の１．１ｎＭ～３０ｎＭの４点３倍希釈域を、各濃度間での再生なしで使用した。増加する濃度の抗原の４回のインジェクションのそれぞれに対して、会合相を２４０秒間モニターし、抗原の最後のインジェクションの後に、単回解離相を６００秒間測定した。センサーチップ表面の再生を、１０ｍＭグリシンｐＨ２．１の２回のインジェクションを使用して行った。

参照チャネルＦ_ｃ１（捕捉された抗体なし）からのシグナルをＦ_ｃ２、Ｆ_ｃ３、及びＦ_ｃ４のものから差し引いて、バルク効果及び参照表面への非特異的結合の差異を補正した。各抗体ブランクラン（抗体は補足されたが抗原なし）からのシグナルを差し引いて、表面安定性の差異を補正した（図１２を参照されたい）。試験された各トラスツズマブ構築物は、ヒトＨｅｒ２への同様の結合を示した（表６）。

ヒトＦｃ受容体へのＩＧＥＧバリアント結合についての査定
高及び低アフィニティーＦｃガンマ受容体並びに高アフィニティーＦｃエプシロン受容体への精製ＩＧＥＧの結合を、３０μｌ／分の流速でランする、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランするBiacore T200（シリアル番号１９０９９１３）機器を使用してシングルサイクル分析によって査定した。ヒトＦｃガンマ受容体のすべて（低アフィニティー受容体ｈＦｃγＲIIIａ（１７６Ｆ及び１７６Ｖ多型の両方）及びｈＦｃγＲIIIｂとともにｈＦｃγＲＩ）を、Sino Biological社（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）から獲得し、ｈＦｃεＲ１をR&D Systems社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）から獲得した。標準的アミン化学を使用して、His capture kit（Cytiva社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してあらかじめカップリングしたCM5センサーチップ上にＦｃＲｓを捕捉した。Ｆｃガンマ受容体への抗体結合を査定するために使用されたアッセイを詳述する概略は、図１３に見出され得る。

各サイクルのスタート時に、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０（HBS-P+）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中に希釈したＨｉｓタグ付けされたＦｃ受容体を、指定のＲＵレベルまでロードした（表７）。各濃度間での再生なしで、試験抗体の５点３倍希釈域を、試験された各受容体に対して使用した。各Ｆｃ受容体に対してロードされた標的ＲＵ、各試験抗体に対して使用された濃度域とともに試験抗体結合に使用された会合及び解離時間が（表７）に示される。すべての場合において、抗体を、増加する濃度でチップ上を通過させ、その後に単回の解離ステップが続いた。解離の後、グリシンｐＨ１．５の２回のインジェクションを用いて、チップを再生した。参照チャネルＦ_ｃ１（ブランク）からのシグナルを、受容体をロードされたＦ_ｃのものから差し引いて、参照表面への非特異的結合の差異を補正した。高アフィニティー相互作用を、１：１フィットを使用して分析し（例となるデータに関しては、図１７ａ及び１７ｂを参照されたい）、一方で低アフィニティー相互作用を、定常状態モデルを使用して分析した（例となるデータに関しては、図１７ｃ及び１７ｄを参照されたい）。表８は、獲得されたデータの要約を示している。ＩＧＥＧバリアントは、試験されたＦｃガンマ受容体及びＦｃエプシロン受容体の両方に結合した。ＩｇＧ対照は、Ｆｃガンマ受容体に行き着いたがＦｃエプシロンには行き着かず、一方で逆に、ＩｇＥ対照は、Ｆｃエプシロン受容体に行き着いたが試験されたＦｃガンマ受容体には行き着かなかった。

ヒトＦｃＲｎへのＩＧＥＧバリアント結合についての査定
ＦｃＲｎへの精製抗体の結合を、Biacore T200 EvaluationソフトウェアV3.0.1（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）をランするBiacore T200（シリアル番号１９０９９１３）機器を使用して、定常状態アフィニティー分析によって査定した。ｈＦｃＲｎ（Sino Biological社、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）を、標準的アミンカップリングを使用して、酢酸ナトリウムｐＨ５．５中１０μｇ／ｍＬでSeries S CM5（カルボキシメチル化デキストラン）センサーチップ（Cytiva社、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上にカップリングした。精製ＨＭＷ－ＭＡＡ抗体を、ｐＨ６．０で０．０５％ポリソルベート２０（Ｐ２０，Polysorbate 20）を含有するＰＢＳ中３１．２５ｎＭ～２０００ｎＭの７点２倍希釈、又はｐＨ７．４で０．０５％ポリソルベート２０（Ｐ２０）を含有するＰＢＳ中２５０ｎＭ～２０００ｎＭの４３点２倍希釈において力価測定した。抗体を、３０μｌ／分の流速でかつ２５℃で、増加する濃度を用いてチップ上を通過させた。インジェクション時間は濃度あたり４０ｓであり、解離時間は７５秒であった。単回解離の後、０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．０を用いて、チップを再生した。図１５は、ＦｃＲｎへの抗体結合を査定するために使用されたアッセイの概略を示している。相互作用を、定常状態モデルを使用して分析した（例となるデータに関しては、図１６ａ～１６ｄを参照されたい）。表９は、獲得されたデータの要約を示している。ＦｃＲｎ結合部位が除去されたもの（ｄＦｃＲｎ）及びＦｃＲｎに結合できなかったものを除いて、ＩＧＥＧバリアントはｐＨ６．０でＦｃＲｎに結合した。ＩｇＧ対照は、予想通りＦｃＲｎに行き着き、一方でＩｇＥはＦｃＲｎへのいかなる結合も示さなかった。

ＩＧＥＧバリアントについてのUNcle生体内安定性プラットフォーム分析
ＩＧＥＧバリアントを、UNcle生体内安定性プラットフォーム（Unchained labs社、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して熱安定性について分析した。熱傾斜安定性実験（Ｔｍ及びＴａｇｇ）は、タンパク質及び製剤を安定性についてランク付けするための十分に確立された方法である。タンパク質の変性プロファイルは、その熱安定性についての情報を提供し、構造的変更及び製剤バッファー変更を査定するための構造的「フィンガープリント」を表す。タンパク質の熱構造安定性についての広く使用されている測定は、それが天然状態から変性状態にアンフォールドする温度である。多くのタンパク質に関して、このアンフォールディングプロセスは、狭い温度域にわたって生じ、この遷移の中間点は「融解温度」又は「Ｔｍ」と称される。タンパク質の融解温度を判定するために、UNcleは、タンパク質が立体構造的変化を受けるときのSypro Orange（タンパク質の曝露された疎水性領域に結合する）の蛍光を測定する。

各バリアントに対する試料を、０．８ｍｇ／ｍＬの最終濃度でＰＢＳ及びSypro Orange中に製剤化した。９μＬの各試料混合物を、UNiマイクロキュベットに二つ組でロードした。試料を、０．３℃／分の傾斜速度及び４７３ｎｍでの励起を用いて、２５～９５℃の熱傾斜に供した。全発光スペクトルを２５０～７２０ｎｍから収集し、５１０～６８０ｎｍ間の曲線下面積を使用して、遷移曲線の変曲点（Ｔ_開始及びＴ_ｍ）を計算した。４７３ｎｍでの静的光散乱（ＳＬＳ，static light scattering）のモニタリングにより、タンパク質凝集の検出が可能となり、Ｔ_ａｇｇ（凝集の開始）を、結果として生じるＳＬＳプロファイルから計算した。データ分析を、UNcle（登録商標）ソフトウェアバージョン4.0を使用して実施し、表１０に要約した。Ｔｍ１値は、各セットのバリアント内並びにＩｇＥ及びＩＧＥＧバリアント間で概ね一貫していた（図１７ａ）が、しかしながら、ＩＧＥＧバリアントは、等価のＩｇＥバリアント単独と比較して、静的光散乱プロファイルの有意な改善を示した（図１７ｂ）。

Ａ３７５細胞へのＩＧＥＧバリアント結合についての査定
ＨＭＷ－ＭＡＡへの実施例４及び５に詳述される抗体バリアントの結合を、ＨＭＷ－ＭＡＡ（ＣＳＰＧ４）を発現するＡ３７５細胞を使用して査定した。

方法
Ａ３７５細胞を採取する
Ａ３７５細胞を、標準的方法を使用して培養した。Ａ３７５細胞がコンフルエントになった場合、細胞を採取した。簡潔には、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後TrypLE（登録商標）と３７℃で１０分間インキュベートして、細胞をフラスコから切り離した。細胞を１０ｍＬの培地に再懸濁し、２５０ｇで３分間遠心分離した。次いで、細胞を１ｍＬＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Cellometer（登録商標）でカウントして、細胞数及び生存率を判定した。この後、細胞をＦＡＣＳバッファーを用いてｍＬあたり１×１０^６個細胞に希釈し、この細胞懸濁液の１００μＬをプレート上にウェルごとに播種した。

結合アッセイ
Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳ）への精製ＩＧＥＧの結合を、AttuneソフトウェアV3.1.2をランするAttune（登録商標）NxT Acoustic Focusing Cytometer（ThermoFisher Scientific社、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を使用して、フローサイトメトリーによって査定した。Ａ３７５細胞を一次抗体（実施例５に記載される）とともに４℃で３０分間インキュベートし、その後に、１０μｇ／ｍｌのFITCコンジュゲートヤギ抗ヒト抗IgG又はIgE二次抗体（Vector Laboratories社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）との４℃でさらなる３０分間のインキュベーションが続いた。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、次いでAttune（登録商標）NxT Acoustic Focusing Cytometer上に取得した。FlowJo（登録商標）ソフトウェアバージョン10（Becton, Dickinson and Company社、ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵＳ）及びGraphPad Prism 8（GraphPad Software社、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）を使用して、データを分析した。

結果
図１８ａ及び１８ｂに実証されるように、すべてのＨＭＷ－ＭＡＡ抗体及びバリアントはＡ３７５細胞に結合した。

ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイ
アッセイを実施して、免疫エフェクター細胞が腫瘍細胞を殺傷し得る２つの主なメカニズムである抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の両方のレベルに対する、記載される抗体の効果を判定した。実施例５に記載される抗体バリアントを、トラスツズマブＩｇＥ及びハーセプチンＩｇＧ抗体と比較した。

方法
Ｕ－９３７エフェクター細胞及びＳＫ－ＢＲ－３標的細胞を使用して、当技術分野に存在するもの（例えば、Three-colour flow cytometric method to measure antibody-dependent tumour cell killing by cytotoxicity and phagocytosis. J Immunol Methods. 2007 Jun 30;323(2):160-71を参照されたい）と同様の方法を使用して、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイを実施した。

アッセイを実施する前日、Ｈｅｒ２発現腫瘍細胞（ＳＫ－ＢＲ－３）を染色した。これを行うために、ＳＫ－ＢＲ－３細胞を、TrypLEを使用してプレートから切り離し、完全RPMI培地（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ及び１０％ＨＩＦＢＳを補給されたRPMI 1640培地）で洗浄し、その後、無血清HBSSに添加した。HBSS中０．７５μＬの０．５ｍＭカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ）を１×１０^６個細胞ごとに添加し、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を播種し、一晩インキュベートした。

翌日、Ｕ－９３７エフェクター細胞を継代し、トリパンブルーを使用してカウントし、完全RPMI培地に再懸濁して、ｍＬあたり１．５×１０^６個細胞を提供した。ＣＦＳＥ標識ＳＫ－ＢＲ－３細胞をTrypLE処理によって切り離し、洗浄し、カウントし、完全RPMI培地に再懸濁して、ｍＬあたり０．５×１０^６個細胞を提供した。次いで、実施例５に詳述されるトラスツズマブＩｇＥ、ハーセプチンＩｇＧ、トラスツズマブ－ＩＧＥＧ、トラスツズマブ－ＩＧＥＧ－Ｃ２２０Ｓ、及びＩｇＧアイソタイプ抗体を、１２０ｎＭのスタート濃度に希釈し、次いで６の倍数で連続希釈した。２５μＬの各抗体希釈物を、５０μＬのＳＫ－ＢＲ－３細胞懸濁液（２５０００個細胞と等価）及び２５μＬのＵ－９３７エフェクター細胞懸濁液（３７５００個細胞と等価）とともに、９６ウェルプレートに二つ組で添加した。ＣＳＦＥ染色、Ｕ－３９７細胞、ＳＫ－ＢＲ－３細胞、生存ＳＫ－ＢＲ－３細胞（熱ショックされたＳＫ－ＢＲ－３細胞によって置き換えられた）、又は試験抗体のうちの１又は２以上を欠く、適当な対照ウェルがアッセイに含まれた。次いで、プレートを３７℃で３時間インキュベートし、遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ）で２回洗浄し、その後、２μＬ CD89 APCコンジュゲート標識化抗体を有する１００μＬＦＡＣＳに再懸濁した。対照ウェルをＦＡＣＳバッファー単独に再懸濁した。４℃で３０分後、プレートを遠心分離し、ＦＡＣＳバッファーで再度２回洗浄し、その後、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ，propidium iodide）染色剤（１００μＬあたり５μＬ）を含有する１００μＬＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。対照ウェルをＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。

次いで、５０，０００個細胞／チューブをAttune（登録商標）NxT Acoustic Focusing Cytometer上に取得した。補償は、対照ウェルを使用したセットアップであった。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３ゲーティングを分析ソフトウェア（Flow Jo）において適用し（図１９）、細胞カウントをゲートごとに獲得した。次いで、計算を実施して、細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は貪食（ＡＤＣＰ）活性を判定した。

結果
図２０に実証されるように、トラスツズマブ－ＩＧＥＧ（ＩＧＥＧ－ＣＨ２ＣＨ３）抗体は、試験されたすべての濃度（１２０～７．５ｎＭ）にわたって、ハーセプチンＩｇＧ及びトラスツズマブＩｇＥ抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。トラスツズマブ－ＩＧＥＧ－Ｃ２００Ｓ（ＩＧＥＧ－ＣＨ２ＣＨ３－Ｃ２２０Ｓ）抗体は、ハーセプチンＩｇＧ及びトラスツズマブＩｇＥ抗体よりも高いレベルの貪食をもたらすようである。加えて、結果は、トラスツズマブＩｇＥ、ハーセプチンＩｇＧ、及び両ＩＧＥＧ抗体が、細胞傷害に対して同等の効果を有したことを実証する。

本出願は、２０１９年１０月１日に出願された英国特許出願第１９１４１６５．４号明細書、２０１９年１１月２２日に出願された英国特許出願第１９１７０５９．６号明細書、及び２０２０年６月２日に出願された英国特許出願第２００８２４８．３号明細書からの優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。上記明細書において言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の記載される実施形態の様々な変更及び変形が当業者に明らかであろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているものの、主張される本発明は、そのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である、本発明を行うための記載される様態の様々な変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図される。

Claims

Ｃε２、Ｃε３及びＣε４ドメイン、又はその機能的フラグメントを含む、Ｆｃε受容体及び胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する、ＩｇＥとＩｇＧとのハイブリッド抗体であって、
（ａ）前記ハイブリッド抗体が、ＩｇＧ抗体に由来する、ＦｃＲｎに対する結合部位を含むか、あるいは
（ｂ）ＦｃＲｎ結合が、７８位にヒスチジン残基を含むＣε３ドメイン、及び、９５位にヒスチジン残基と、９８位にヒスチジン残基とを含むＣε４ドメインによって提供される、
前記ハイブリッド抗体。
（ｉ）配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、Ｔ７８Ｈ変異を含むＩｇＥＣε３ドメイン；並びに
（ii）配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、かつ、Ｓ９５Ｈ及びＱ９８Ｈ変異を含むＩｇＥＣε４ドメイン；
を含む、請求項１に記載のハイブリッド抗体。
（ｉ）配列番号３１に規定されるＩｇＥＣε３ループ配列；及び／又は
（ii）配列番号３２若しくは３３に規定されるＩｇＥＣε４ループ配列；
を含む、請求項１又は２に記載のハイブリッド抗体。
ＦｃＲｎへの結合がｐＨ依存的である、請求項１～３のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
ＦｃＲｎへの結合がｐＨ依存的であり、ｐＨ７．４でよりもｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対するより高いアフィニティーを有する、請求項１～４のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
がん抗原に特異的に結合する、請求項１～５のいずれかに記載のハイブリッド抗体。
請求項６に記載のハイブリッド抗体と、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物。
がんの予防又は治療における使用のための、請求項６に記載のハイブリッド抗体又は請求項７に記載の医薬組成物。
請求項１～６又は８のいずれかに記載のハイブリッド抗体をコードする核酸。
請求項９に記載の核酸を含む発現ベクター。
請求項９に記載の核酸を含む発現ベクターであって、（ｉ）前記ベクターがＣＨＯベクターであり、及び／又は（ii）前記核酸が、哺乳類細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結されている、前記発現ベクター。
請求項１～６のいずれかに記載のハイブリッド抗体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞。
請求項９に記載の核酸又は請求項１０若しくは１１に記載のベクターを含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
請求項１～６のいずれかに記載のハイブリッド抗体の発現のための条件下で、請求項１２又は１３に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記宿主細胞培養物から前記ハイブリッド抗体又はそのフラグメントを回収するステップとを含む、前記ハイブリッド抗体を産生する方法。