JP7843666B2 - 硬質表面処理剤 - Google Patents

硬質表面処理剤

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Description

本発明は、硬質表面処理剤及びその利用に関する。
環境表面における微生物の汚染は病原菌の重要な感染源となっている（非特許文献１）。また、病原菌に限らず、シンク、排水口、洗濯槽などの微生物汚染は悪臭やぬめりなどの原因となる。こうした表面の微生物汚染は、典型的にはエタノール、次亜塩素酸、熱水、界面活性剤などを用いて除去されるが、微生物汚染の無い表面の維持には高頻度の清掃を要する。よって、シンク、排水口、洗濯槽、医療機器、病室環境、携帯物品、畜産用品などの表面上で持続的に微生物を制御する技術が求められている。
斯かる技術の例として、硬質表面において菌の増殖を抑制する抗菌加工をすることで衛生管理する技術がよく知られている。該技術は、例えば、公共のドアノブ、手すりやつり革といった不特定多数の人が接触する機会が多い硬質表面だけでなく、看護、介護施設や病院等で使用されているあらゆる設備や道具、一般生活用品にも多く利用されており、個人的な持ち物にも使われるようになってきている。これら技術は、硬質表面を構成するプラスチックに抗菌剤を練り込むこと、あるいは硬質表面に抗菌剤を塗布又はスプレーして表面に付着させることで抗菌性を付与する技術である。抗菌剤としては、抗菌作用がよく知られている有機化合物、銀や銅の金属粒子ないし金属イオンが一般的であるが、中には殺菌剤の残余効果を抗菌として主張する技術もある。特許文献１には、特定構造のシリコーンと４級アンモニウム化合物、フェノール樹脂、グアニド誘導体、アルキルアルコール他の殺菌剤を含有する硬質表面抗菌クリーナーが記載されている。特許文献２には、ナノ粒子化された銀微粒子を用いる抗菌性付与剤が記載されており、特許文献３及び４には、カチオン性ポリマーを含有する防汚剤が開示されている。特許文献５には、陽イオン性抗菌活性物質を含有する硬質表面用抗菌組成物が記載されており、特許文献６にはカテキンと陽イオン界面活性剤を含有する抗菌性洗浄剤組成物が開示されている。
酵素を用いる技術としては、黄色ブドウ球菌溶菌活性を有するリゾスタフィンをプラスチック表面に固定化することで、該表面に黄色ブドウ球菌殺菌活性を付与することができることが報告されている（非特許文献２）。この効果はリゾスタフィン溶液とプラスチックを接触させるだけで発現する。しかしながら、リゾスタフィンはStaphylococcus属に対してのみ効果的に作用することが知られており（非特許文献３）、より広範な微生物を制御する技術が必要である。一方、より広範な微生物に対して抗菌活性を示すリゾチームを用いた硬質表面抗菌化技術が報告されている（非特許文献４及び５）。しかしこれらの技術では表面への固定化に共有結合による架橋処理及び／又は表面への前処理を必要としており、適用可能範囲が限定的である。また、重大な危害菌である黄色ブドウ球菌はその細胞壁構造に起因してリゾチームに対して耐性を有することが知られている（非特許文献６）。
プロテアーゼのＭ２３Ａサブファミリーに属するβ－リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）は、黄色ブドウ球菌や枯草菌等のグラム陽性細菌に対して強い溶菌活性を有していることが報告されている（非特許文献７及び８）。また、Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼは、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼ遺伝子をバチルス属菌宿主に導入し、培養することで、培養物中から効率よく生産可能であることが見出されている（特許文献７）。
しかしながら、Ｍ２３Ａファミリープロテアーゼを硬質表面の防菌化に利用することはこれまでに報告されていない。
特表２００４－５３２３００号公報 特開２０００－１７８５９５号公報 特開２００２－６０７８６号号公報 特開２０２０－１５２８５６号公報 特表２００３－５１０４５０号公報 特開２００８－１９５９１７号公報 国際公開第２０１９／１４２７７３号
Donskey, Curtis J. American journal of infection control, 2013, 41(5): S12-S19 Shah, Anjali et al. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2004, 48(7): 2704-2707 Schindler, Ch A. and V. T. Schuhardt, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1964, 51(3): 414-421 Yuan, Shaojun, et al. Langmuir, 2011, 27.6: 2761-2774 Yu, Wu-Zhong, et al. Materials & Design, 2018, 139: 351-362 Bera, Agnieszka et al. Journal of Bacteriology, 2007, 189(1): 280-283 Li, Shaoliang et al. The Journal of Biochemistry, 1998, 124(2): 332-339 Ahmed, Kashfia et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2003, 95(1): 27-34
本発明は、硬質表面に防菌性を付与できる硬質表面処理剤、及びそれを用いた硬質表面処理方法を提供することに関する。
本発明者は、ＢＬＰを硬質表面に接触させるだけで、該表面に防菌性を付与することができることを見出した。
すなわち、本発明は、以下の１）～３）に係るものである。
１）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドを有効成分とする、硬質表面処理剤。
２）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチド、又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させる工程を含む、硬質表面処理方法。
３）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチド、又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させる工程を含む、硬質表面への防菌性付与方法。
本発明により提供される酵素ポリペプチドは、硬質表面と接触させるだけで、硬質表面に防菌性を付与することができる。当該酵素は、界面活性剤の共存下でも防菌性を付与可能である。付与された防菌性は、酵素と硬質表面の接触後に該硬質表面を洗浄や乾燥に供しても維持することができる。
ＢＬＰ及びリゾスタフィンの溶液中における殺菌活性。 ＢＬＰのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰ、リゾスタフィン、及びリゾチームのステンレスに対する防菌活性。 ＢＬＰ及びリゾスタフィンのプラスチックに対する防菌活性。
本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関する「少なくとも８０％の同一性」とは、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
本明細書において、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の同一性は、リップマン－パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－４１）によって計算することができる。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res., 22:4673-4680）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（European Bioinformatics Institute: EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html]）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的配列のアミノ酸残基又はヌクレオチドの位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
本明細書において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
Ｍ２３Ａサブファミリープロテアーゼとは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有し、ＭＥＲＯＰＳデータベースの分類法（Rawlings, Neil D., et al. "MEROPS: the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors." Nucleic acids research 42.D1 (2013): D503-D509）に従って分類した際に、Ｍ２３ファミリーに属するメタロプロテアーゼのサブファミリーである、Ｍ２３Ａサブファミリーに分類されるプロテアーゼをいう。
「β－リティックメタロプロテアーゼ（beta-lytic metallopeptidase；ＢＬＰ）」（ＭＥＲＯＰＳ ＩＤ：Ｍ２３．００１）とは、β－リティックプロテアーゼとも呼ばれる酵素であり、Ｍ２３Ａサブファミリーに属するプロテアーゼの１種をいう。
本発明のポリペプチドとしては、ＢＬＰ及びこれと同等の機能を有するポリペプチドが包含され、これらの１種を適宜選択して使用するのが好ましい。
ＢＬＰは、配列番号１の５９５～１１３４位のヌクレオチド配列にコードされる、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。ＢＬＰは、ペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有する。
また、ＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。ＢＬＰと同等の機能を有するポリペプチドの好ましい例としては、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であって、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列の２２位、１２１位及び１２３位に相当する位置にＨｉｓ、３６位に相当する位置にＡｓｐを有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合分解活性を有するポリペプチドが挙げられる。
尚、グリシン－グリシン結合分解活性の有無は、例えばオリゴグリシンペプチドやＦｒｅｔ－ＧＧＧＧＧ基質などの分解性を試験することで判定できる。ただしこの方法に限定されるものではない。
本発明のポリペプチドは、それを生産する微生物又はその培養物から抽出又は調製することができる。例えば、ＢＬＰは、Lysobacter sp. (NBRC 12725又はNBRC 12726)、Achromobacter lyticus M497-1、Lysobacter sp. IB-9374、Lysobacter gummosus DSMZ 6980等、又はその培養物から抽出又は調製することができる。上記微生物は公的微生物保存機関より購入することができる。
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた微生物又は培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による微生物の分離、上清又はろ液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、等の通常の方法を用いて行うことができる。
あるいは、本発明のポリペプチドは、上述したアミノ酸配列を利用して、化学合成又は生物学的手法により製造することができる。例えば、前記特許文献７に記載の方法に準じ、本発明のポリペプチドを本来生産する微生物から常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成し、さらに必要に応じて変異を導入して調製したタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現するように形質転換したバチルス属菌を培養し、培養物から目的の酵素を調製することで、本発明のポリペプチドを得ることができる。ここで調製される形質転換バチルス属菌としては、例えば、制御領域と作動可能に連結された本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を、宿主細胞のゲノム中若しくはプラスミド中に導入して得られたバチルス属菌、適切な位置に目的遺伝子が組み込まれた発現ベクターを導入したバチルス属菌、等が挙げられる。
ここで、遺伝子の「制御領域」とは、該領域の下流の遺伝子の細胞内における発現を制御する機能を有し、好ましくは、下流遺伝子を構成的に発現又は高発現させる機能を有する領域である。具体的には、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流に存在し、ＲＮＡポリメラーゼが相互作用して当該遺伝子の転写を制御する機能を有する領域と定義され得る。好ましくは、遺伝子の制御領域とは、当該遺伝子におけるコーディング領域の上流２００～６００ヌクレオチド程度の領域をいう。制御領域は、遺伝子の転写開始制御領域及び／又は翻訳開始制御領域、あるいは転写開始制御領域から翻訳開始制御領域に至るまでの領域を含む。転写開始制御領域はプロモーター及び転写開始点を含む領域であり、翻訳開始制御領域は開始コドンと共にリボソーム結合部位を形成するＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列に相当する部位である（Shine,J.,Dalgarno,L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1974, 71:1342-1346）。
本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターは、該遺伝子を安定に保持でき、宿主微生物内で複製維持が可能であり、かつ該ポリペプチドを安定に発現させることができるベクターに、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を組込むことで作製することができる。斯かるベクターとしては、例えばｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
宿主バチルス属菌の形質転換は、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主バチルス属菌としては、好ましくは枯草菌又はその変異株である。例えば、Ｍ２３Ａ成熟化能が十分な範囲で細胞外プロテアーゼ生産を減少させた枯草菌株等が挙げられる。
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養物から、一般的な方法によって酵素の採取、調製を行い、さらに凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。例えば、培養物からの酵素の回収及び調製は、遠心分離又はろ過による組換え微生物の分離、上清又はろ液中の酵素の、硫酸アンモニウム等の塩を加えることによる沈殿又はエタノール等の有機溶媒を加えることによる沈殿、限外ろ過膜等を用いた濃縮や脱塩、イオン交換又はゲルろ過等の各種クロマトグラフィーを用いた精製、等の通常の方法を用いて行うことができる。
あるいは、本発明のポリペプチドは、それを含む酵素組成物等から調製することができる。例えば、ＢＬＰは、アクロモペプチダーゼから調製することができる。アクロモペプチダーゼは、Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ ｅｎｚｙｍｏｇｅｎｅｓ由来の溶菌酵素であり、ＢＬＰを含有する。アクロモペプチダーゼは、和光純薬工業（株）等から市販されている。
後述の実施例に示すように、本発明のポリペプチド、例えばＢＬＰは、硬質表面に対する防菌作用を有し、硬質表面と接触させることで、該硬質表面に防菌性を付与することができる。ＢＬＰの溶液中での黄色ブドウ球菌殺菌作用が、非特許文献２に記載されるリゾスタフィンと同等である一方、ＢＬＰを硬質表面と接触させることにより奏される防菌作用は、予想外にもリゾスタフィンを硬質表面と接触させることにより奏される防菌作用よりも優れていた。また、驚くべきことに、ＢＬＰの硬質表面に対する防菌作用は、ＢＬＰと硬質表面との接触後に該硬質表面を洗浄した場合であっても、すなわち、該硬質表面が水に接触した場合であっても、乾燥させた場合であっても、高度に維持されていた。さらに、ＢＬＰの硬質表面に対する防菌作用は、硬質表面の素材によらず、硬質表面がステンレス表面であってもプラスチック表面であっても認められ、また、界面活性剤共存下でも認められた。
したがって、本発明のポリペプチドは、硬質表面に防菌性を付与するための硬質表面処理用酵素として有用であり、硬質表面処理剤、好ましくは防菌性を付与するための硬質表面処理剤となり得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、硬質表面処理剤、好ましくは防菌性を付与するための硬質表面処理剤を製造するために使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、硬質表面処理のため、好ましくは防菌性を付与するための硬質表面処理のために使用することができる。例えば、対象の硬質表面に本発明のポリペプチドを接触させることにより、該硬質表面に防菌性を付与することができる。
本発明において、「防菌」とは、硬質表面における細菌の付着抑制、硬質表面における細菌の残留抑制、硬質表面において細菌を死滅させる「殺菌」、「滅菌」、硬質表面において細菌の発生、発育、増殖を抑える「抗菌」、「静菌」、「制菌」のいずれの概念をも含む語である。本発明者らは特に、ＢＬＰは硬質表面の細菌の残留または付着を抑制する点に優れていることを見出した。
防菌活性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、硬質表面を有するテストピースを目的のポリペプチドを含む溶液に所定時間浸漬して該ポリペプチドと接触させ、該テストピースを試験菌を含む試験液に所定時間浸漬して該試験菌と接触させ、次いで、該テストピースより該試験菌を抽出し、適当な固形培地にて培養し、生じたコロニー数を測定して該テストピースに付着した生菌数を算出することによって評価できる。
本発明において、「防菌」の対象となり得る細菌としては、特に限定されないが、グラム陽性細菌が好ましい。グラム陽性細菌としては、例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）等のブドウ球菌；ルテウス菌（Micrococcus luteus）等のマイクロコッカス属細菌；肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、緑色レンサ球菌（Streptococcus viridans）、Ａ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、Ｂ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus agalactiae）等のレンサ球菌；フェカーリス菌（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌；炭疽菌（Bacillus anthracis）等のバチルス属細菌；破傷風菌（Clostridium tetani）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）等のクロストリジウム属細菌；ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）等のコリネバクテリウム属細菌；リステリア菌（Listeria monocytogenes）等のリステリア属細菌等が挙げられる。このうち、ブドウ球菌及びマイクロコッカス属細菌がより好ましく、黄色ブドウ球菌及びルテウス菌がさらに好ましい。
本発明の硬質表面処理剤は、本発明のポリペプチドを単独で使用する形態であってもよく、また、これを含む酵素組成物の形態であってもよい。当該酵素組成物は、粉末等の固形組成物であっても液体組成物であってもよい。また、当該酵素組成物は、未希釈の形態であってもよく、また、希釈形態であってもよい。未希釈の形態は、希釈されることなく、硬質表面処理に用いられる。希釈形態は、希釈された後の本発明のポリペプチドの含有量が下記範囲内となるように水等の適当な媒体によって希釈されて、硬質表面処理に用いられる。
好適には、硬質表面処理剤は、細菌が存在している、細菌が存在している可能性がある、又は細菌が付着する可能性がある無生物対象物の硬質表面の防菌化等の処理に使用される製品や製剤となり、或いは当該製品や製剤に防菌化のための素材として使用される。
硬質表面としては、細菌が存在している、細菌が存在している可能性がある、又は細菌が付着する可能性がある無生物対象物の硬質表面が挙げられ、例えば、家庭や事業施設における、カウンタ、シンク、化粧室、トイレ、洗濯槽、浴槽、シャワー台、床、窓、扉、ドアノブ、壁、下水口、パイプ等の硬質表面；キッチン用品、家具、電話、玩具、医療機器、畜産機器、食品加工機器等の各種器具及び食品加工装置、道具、雑貨等の硬質表面；ビル空調設備等の水冷塔の水が接触する硬質表面等が挙げられる。硬質表面の材質は、例えば、プラスチック（シリコーン樹脂等を含む）、金属、陶器、木、ガラス又はこれらの組み合わせが挙げられ、好ましくはプラスチック、金属又はこれらの組み合わせであり、より好ましくはプラスチック、ステンレス又はこれらの組み合わせである。
また、硬質表面としては、定期的若しくは不定期に水に接触する環境にある硬質表面、又は定期的若しくは不定期に乾燥する環境にある硬質表面が好ましい。本発明の硬質表面処理剤による硬質表面に対する防菌作用は、斯かる環境下であっても維持される。ここで、「環境」は、硬質表面をとりまく外部条件を指し、自然発生的な環境だけでなく、意図的な行為により生じる環境をも包含する。よって、「水に接触する環境にある硬質表面」とは、自然の存在状態において水に接触することがある硬質表面、又は使用者の意図により水に接触することがある硬質表面であり得、「乾燥する環境にある硬質表面」とは、自然の存在状態において乾燥することがある硬質表面、又は使用者の意図により乾燥することがある硬質表面であり得る。
上記製品や製剤の形態としては、液状、乳液状、クリーム状、ローション状、ペースト状、ジェル状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状、オイル状、ゲル状等の形態であり得るが、これらに限定されない。
上記製品や製剤は、本発明のポリペプチドに加えて、適宜次亜塩素酸、過酸化水素、銀イオン化合物等の抗菌性物質や、カチオン性抗菌剤（塩化ベンゼトニウム等）、殺菌剤(トリクロサン、イソプロピルメチルフェノール等)、エタノール、界面活性剤等を含んでいてもよく、キレート剤、保湿剤、潤滑剤、ビルダー、緩衝剤、研磨剤、電解質、漂白剤、香料、染料、発泡制御剤、腐食防止剤、精油、増粘剤、顔料、光沢向上剤、本発明のポリペプチド以外の他の酵素、洗剤、溶媒、分散剤、ポリマー、シリコーン、向水性物質等の添加剤を適宜配合して、常法に従って調製することができる。
本発明の硬質表面処理剤における本発明のポリペプチドの含有量は、酵素組成物の形態に応じて適宜決定できる。例えば、本発明のポリペプチドの含有量は、組成物全質量に対して、好ましくは０．００００１質量％以上、より好ましくは０．０００２質量％以上、さらに好ましくは０．０００５質量％以上、さらに好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．００５質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上であり、そして好ましくは２０質量％以下、より好ましくは５質量％以下、さらに好ましくは２質量％以下である。また、本発明のポリペプチドの含有量の数値範囲は、０．００００１～２０質量％とするのが好ましく、０．０００２～５質量％とするのがより好ましく、０．０００５～２質量％とするのがさらに好ましく、０．００１～２質量％とするのがさらに好ましく、０．００５～２質量％とするのがさらに好ましく、０．０１～２質量％とするのがさらに好ましい。
本発明の硬質表面処理剤は、硬質表面と接触させることにより使用され、該硬質表面に防菌性を付与することができる。接触時間は、防菌性の付与の観点から、好ましくは１０秒以上、より好ましくは１分以上、さらに好ましくは５分以上であり、さらにより好ましくは１０分以上である。接触時間の上限は、特に限定されず、接触後にそのまま放置してよいが、接触後に洗浄などを行う場合には、作業負荷の観点から、好ましくは３時間以下、より好ましくは１時間以下、さらに好ましくは３０分以下である。また、接触時間は、１０秒以上３時間以下とするのが好ましく、１分以上１時間以下とするのがより好ましく、５～３０分とするのがさらに好ましく、１０～３０分とするのがさらにより好ましい。接触の手段としては、特に限定するものではなく、硬質表面処理剤を硬質表面に塗布する方法、或いは硬質表面処理剤に硬質表面を浸漬する方法、或いはポンプスプレー、エアゾール、加圧液噴霧スプレー又は加圧空気霧化噴霧装置等の霧化装置を用い、硬質表面処理剤を霧化させた状態で硬質表面に噴霧又は散布する方法、或いは硬質表面処理剤を含浸させたシート、ガーゼ、タオル、おしぼり、ティッシュ、ウェットティッシュ等で硬質表面を拭き取る方法、上流に設置した硬質表面処理剤から流水によって徐放させて下流の硬質表面に接触させる方法等、の何れでもよい。
本発明の硬質表面処理剤を硬質表面と接触させる際の本発明のポリペプチドの濃度は、防菌性の付与の観点から、好ましくは１ｐｐｍ以上、より好ましくは５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１０ｐｐｍ以上である。ポリペプチドの濃度の上限は、特に限定されないが、好ましくは１０００ｐｐｍ以下、より好ましくは５００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは１００ｐｐｍ以下である。また、該濃度の数値範囲は、１～１０００ｐｐｍとするのが好ましく、５～５００ｐｐｍとするのがより好ましく、１０～１００ｐｐｍとするのがさらに好ましい。
別の一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを用いる硬質表面処理方法を提供する。また別の一態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを用いる硬質表面への防菌性付与方法を提供する。当該方法は、本発明のポリペプチド又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させることを含む。
本発明のポリペプチドと硬質表面の接触の態様は、硬質表面の形状や素材の種類によって適宜選択すればよく、処理時間、酵素の使用量も処理の態様に応じて任意に設定することができる。例えば、硬質表面に、本発明のポリペプチドを含む溶液を塗布、噴霧又は散布し、一定時間（例えば１０秒以上３時間以下）放置すること、或いは当該溶液に硬質表面を浸漬し、一定時間（例えば１０秒以上３時間以下）放置することが挙げられる。接触後の硬質表面は、水などの媒体により洗浄又はすすぎをしてもよく、さらに、乾燥させてもよい。洗浄回数は、特に制限されないが、例えば、少なくとも１回であり、好ましくは４回以下、より好ましくは２回以下である。乾燥の態様としては、特に制限されず、自然乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の態様を開示する。
＜１＞配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドを有効成分とする、硬質表面処理剤。
＜２＞防菌性を付与するための硬質表面処理剤である、＜１＞記載の硬質表面処理剤。
＜３＞前記硬質表面が好ましくはプラスチック表面、金属表面又はこれらの組み合わせであり、より好ましくはプラスチック表面、ステンレス表面又はこれらの組み合わせである、＜１＞又は＜２＞記載の硬質表面処理剤。
＜４＞前記防菌性がグラム陽性菌に対する防菌性である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の硬質表面処理剤。
＜５＞前記硬質表面が定期的又は不定期に水に接触する環境にある硬質表面である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の硬質表面処理剤。
＜６＞前記硬質表面が定期的又は不定期に乾燥する環境にある硬質表面である、＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の硬質表面処理剤。
＜７＞配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチド、又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させる工程を含む、硬質表面処理方法。
＜８＞配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチド、又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させる工程を含む、硬質表面への防菌性付与方法。
＜９＞前記硬質表面が好ましくはプラスチック表面、金属表面又はこれらの組み合わせであり、より好ましくはプラスチック表面、ステンレス表面又はこれらの組み合わせである、＜７＞又は＜８＞記載の方法。
＜１０＞前記ポリペプチド又はこれを含有する酵素組成物を前記硬質表面と好ましくは１０秒以上、より好ましくは１分以上、さらに好ましくは５分以上、さらにより好ましくは１０分以上接触させる工程を含む、＜７＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記ポリペプチド又はこれを含有する酵素組成物を前記硬質表面と、該ポリペプチドとして好ましくは１ｐｐｍ以上、より好ましくは５ｐｐｍ以上、さらに好ましくは１０ｐｐｍ以上の濃度で接触させる工程を含む、＜７＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞前記ポリペプチド又はこれを含有する酵素組成物を含む溶液を前記硬質表面に塗布、噴霧又は散布する工程を含む、＜７＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞前記ポリペプチド又はこれを含有する酵素組成物を含む溶液に前記硬質表面を浸漬する工程を含む、＜７＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
＜１４＞前記防菌性がグラム陽性菌に対する防菌性である、＜８＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
＜１５＞前記硬質表面が定期的又は不定期に水に接触する環境にある硬質表面である、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１６＞前記硬質表面が定期的又は不定期に乾燥する環境にある硬質表面である、＜７＞～＜１４＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞硬質表面処理剤を製造するための、好ましくは防菌性を付与するための硬質表面処理剤を製造するための、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドの使用。
＜１８＞硬質表面処理のための、好ましくは硬質表面に防菌性を付与するための、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドの使用。
＜１９＞前記硬質表面が定期的又は不定期に水に接触する環境にある硬質表面である、＜１７＞又は＜１８＞記載の使用。
＜２０＞前記硬質表面が定期的又は不定期に乾燥する環境にある硬質表面である、＜１７＞又は＜１８＞記載の使用。
実施例１
（１）酵素調製
配列番号２のアミノ酸配列から成るＢＬＰを特願２０２０－１８２９４５の実施例１に記載の方法で培養及び精製をして調製した。リゾチーム（富士フイルム和光純薬、１２９－０６７２３）、リゾスタフィン（富士フイルム和光純薬、１２０－０６６１１）は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した。酵素溶液の濃度測定にはＤＣプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いた。タンパク質量算出のための標準液にはＢＳＡ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（富士フイルム和光純薬）を用いた。
（２）殺菌試験
試験菌としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５を用いた。ＳＣＤ液体培地はＳＣＤ培地「ダイゴ」，一般細菌検査用（富士フイルム和光純薬）を、ＳＣＤ寒天培地はＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」，一般細菌検査用（富士フイルム和光純薬）を、ＬＰ希釈液はＬＰ希釈液「ダイゴ」（富士フイルム和光純薬）を、バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。終濃度１ｐｐｍの各酵素（ＢＬＰ、リゾスタフィン）を含むバッファーを試験液として用いた。ＳＣＤ液体培地中で３７℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、１０８－９ＣＦＵ／ｍＬに調製した。各試験液５００μＬに対して菌液を５μＬ添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。試験液をＬＰ希釈液で段階希釈し、１００μＬずつＳＣＤ寒天培地に塗布した。３７℃、２４時間インキュベートした後、コロニーを数えることで試験液１ｍＬ中に含まれる生菌数（ＣＦＵ／ｍＬ）を算出した。
ＢＬＰとリゾスタフィンはバッファー中において同程度の黄色ブドウ球菌殺菌活性を示した（図１）。
（３）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（ＢＬＰによるステンレスの防菌化）
試験菌としてＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓを用いた。バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。ポリスチレン製１２穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、３５１１４３）の各ウェルにバッファーで１０ｐｐｍに希釈したＢＬＰ溶液を１ｍＬずつ分注した。１×１５×１５ｍｍのＳＵＳ４３０テストピース（エンジニアリングテストサービス）を各ウェルに１枚ずつ入れて室温で１０分間浸漬した。テストピースの水分を切ってバッファーを２ｍＬずつ分注した新しい１２穴プレートに移し、２分間軽く振盪した。再度、テストピースの水分を切ってバッファーを２ｍＬずつ分注した新しい１２穴プレートに移し、２分間軽く振盪した後、テストピースを回収した。ＳＣＤ寒天培地上で３７℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、およそ１０８ＣＦＵ／ｍＬに調製した。新しい１２穴プレートに上記の菌液を１．５ｍＬずつ分注し、酵素浸漬処理済みのテストピースを１枚ずつ入れた。室温で１５分間静置した後、テストピースの水分を切ってバッファーを２ｍＬずつ分注した新しい１２穴プレートに移し、１分間軽く振盪した。再度、テストピースの水分を切ってバッファーを２ｍＬずつ分注した新しい１２穴プレートに移し、１分間軽く振盪した。７ｍＬのＬＰ希釈液を入れた５０ｍＬチューブにテストピースを１枚ずついれて３０分間の超音波処理により菌を抽出した。抽出液をＬＰ希釈液で段階希釈し、１００μＬずつＳＣＤ寒天培地に塗布した。３７℃、２４時間インキュベートした後、コロニーを数えることでテストピース１枚に付着した生菌数（ＣＦＵ／ｐｉｅｃｅ）を算出した。
あらかじめＢＬＰに浸漬したテストピースは、バッファーのみに浸漬したテストピースと比較して付着生菌数が大幅に減少した（図２）。
（４）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（ＢＬＰ浸漬時間の影響）
テストピースの酵素溶液への浸漬時間を１、５、１０、３０分間に変更した以外は（３）と同様にして細菌付着抑制試験を行った。
ＢＬＰは１分間の浸漬でもバッファーのみに浸漬した場合と比較して付着生菌数をおよそ９０％減少させた（図３）。
（５）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（表面残留酵素の耐性）
浸漬酵素濃度を２０ｐｐｍに変更し、酵素浸漬後のテストピースとして以下の４条件で処理したものを用いた以外は（３）と同様にして細菌付着抑制試験を行った。
条件１：すすぎ２回（（３）と同条件）
条件２：すすぎ４回
条件３：すすぎ２回後にテストピースを室温で３時間乾燥
条件４：すすぎ２回後にテストピースを室温で２１時間乾燥
ＢＬＰに浸漬したテストピースは、４回のすすぎや２１時間の乾燥後にも付着生菌数減少効果を維持していた（図４）。
（６）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（黄色ブドウ球菌への効果）
試験菌をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５に、浸漬酵素濃度を２０ｐｐｍに変更した以外は（３）と同様にして細菌付着抑制試験を行った。
ＢＬＰに浸漬したテストピースは、黄色ブドウ球菌に対しても付着生菌数減少効果を示した（図５）。
（７）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（黄色ブドウ球菌への効果）
バッファーを、市販衣料洗剤（アタックＺＥＲＯ、花王）を水道水で３０００倍に希釈した液に変更した以外は（３）と同様にして細菌付着抑制試験を行った。
ＢＬＰの付着生菌数減少効果は、界面活性剤を含む水溶液中でも維持された（図６）。
（８）ステンレスに対する細菌付着抑制試験（他の溶菌酵素との性能比較）
試験菌をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５に、浸漬酵素濃度を２０ｐｐｍに変更し、酵素としてＢＬＰ、リゾスタフィン又はリゾチームを用いた以外は（３）と同様にして細菌付着抑制試験を行った。
ＢＬＰは最も大きい付着生菌数減少効果を示した（図７）。
（９）プラスチックに対する細菌付着抑制試験
試験菌としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＴＣ８３２５を用いた。バッファーは２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いた。ポリスチレン製１２穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ、３５１１４３）の各ウェルにバッファーで１０ｐｐｍに希釈した酵素溶液を１ｍＬずつ分注し、室温で１０分間浸漬した。ピペットでウェルの溶液をすべて除去し、バッファーを２ｍＬずつ分注して２分間軽く振盪した。再度、ピペットでウェルの溶液をすべて除去し、バッファーを２ｍＬずつ分注して２分間軽く振盪した後、ピペットでウェルの溶液をすべて除去した。ＳＣＤ寒天培地上で３７℃、一晩振盪培養した試験菌を回収してバッファーで洗浄・再懸濁し、およそ１０８ＣＦＵ／ｍＬに調製した。酵素処理済みの１２穴プレートに上記の菌液を１．５ｍＬずつ分注した。室温で１５分間静置した後、ピペットでウェルの溶液をすべて除去し、バッファーを２ｍＬずつ分注して２分間軽く振盪した。再度、ピペットでウェルの溶液をすべて除去し、バッファーを２ｍＬずつ分注して２分間軽く振盪した。ピペットでウェルの溶液をすべて除去し、ＬＰ希釈液を２ｍＬずつ分注してシールで密閉し、３０分間の超音波処理により菌を抽出した。抽出液をＬＰ希釈液で段階希釈し、１００μＬずつＳＣＤ寒天培地に塗布した。３７℃、２４時間インキュベートした後、コロニーを数えることで各ウェルに付着した生菌数（ＣＦＵ／ｗｅｌｌ）を算出した。
ＢＬＰはポリスチレンに対しても付着生菌数減少効果を示し、その効果は非特許文献２に示されるリゾスタフィンの効果よりも大きかった（図８）。

Claims (4)

  1. 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチドを有効成分とする、硬質表面におけるグラム陽性細菌の付着抑制剤。
  2. 配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつペプチド配列中のグリシン－グリシン結合の分解活性を有するポリペプチド、又はこれを含有する酵素組成物を硬質表面と接触させる工程を含む、硬質表面へのグラム陽性細菌の付着抑制方法。
  3. 前記硬質表面が定期的又は不定期に水に接触する環境にある硬質表面である、請求項２記載の方法。
  4. 前記硬質表面が定期的又は不定期に乾燥する環境にある硬質表面である、請求項２記載の方法。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508677A (ja) 1996-12-18 2001-07-03 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ バイオフィルムの酵素的処理方法
JP2019064993A (ja) 2017-10-05 2019-04-25 国立大学法人広島大学 改質剤、抗菌剤および抗菌性材料
JP2019112360A (ja) 2017-12-25 2019-07-11 花王株式会社 硬質表面処理剤組成物
WO2019142773A1 (ja) 2018-01-16 2019-07-25 花王株式会社 Ｍ２３ａファミリープロテアーゼの製造方法
WO2021085563A1 (ja) 2019-10-30 2021-05-06 花王株式会社 皮革改質剤

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001508677A (ja) 1996-12-18 2001-07-03 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ バイオフィルムの酵素的処理方法
JP2019064993A (ja) 2017-10-05 2019-04-25 国立大学法人広島大学 改質剤、抗菌剤および抗菌性材料
JP2019112360A (ja) 2017-12-25 2019-07-11 花王株式会社 硬質表面処理剤組成物
WO2019142773A1 (ja) 2018-01-16 2019-07-25 花王株式会社 Ｍ２３ａファミリープロテアーゼの製造方法
WO2021085563A1 (ja) 2019-10-30 2021-05-06 花王株式会社 皮革改質剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AFOSHIN A. S . et al.，Lytic potential of Lysobacter capsici VKM B-2533T: bacteriolytic enzymes and outer membrane vesicles，Scientific Reports，2020年06月19日，Vol.10, No.1, Articles No. 9944，pages 1 to 13，doi:10.1038/s41598-020-67122-2
GenBank databases, NCBI. ACCESSION No. QGQ32939，2019年12月04日，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/QGQ32939

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