JP4373185B2 - 洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

本発明は、抗菌性を発揮する洗浄剤組成物に関する。

近年、衛生、防臭に対する意識の向上から、住宅機器、台所の水切りカゴ、三角コーナー、まな板、レンズやガラス製品等の身の回りの硬質表面や、衣類、まくらカバー、シーツ、手拭、タオル、ハンカチ、台所の布巾等における細菌やカビ等の微生物の繁殖を抑制し、不快臭の発生等を抑えることが望まれ、斯かる観点から洗浄剤に抗菌性化合物を配合する試みがなされている。

一方、ヒスタチン類は、ヒトの顎下腺及び耳下腺唾液中に認められる高ヒスチジン含有ペプチドであり、ヒトの口腔内において、ハイドロキシアパタイトへの吸着作用（例えば、非特許文献１、非特許文献２参照）やアパタイト結晶の成長阻害作用（例えば、非特許文献３、非特許文献４参照）を有する他、口内におけるカンジダ症の原因菌として知られるCandida albicans（例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）、齲蝕原因菌として知られるStreptococcusmutans（例えば、非特許文献７、非特許文献８参照）及び歯周病原因菌として知られるPorphyromonas gingivalis（例えば、非特許文献９参照）に対して抗菌活性を示すことが報告されている。

しかしながら、ヒスタチン類が環境中に存在する一般細菌に対して抗菌作用を有することはこれまでに知られていない。
Hay D. I., Arch. Oral. Biol., 20:553,(1975) Jensen J. L. et.al., J. Dent. Res., 71:1569,(1992) Oppenheim F. G. et.al., J. Biol. Chem., 261:1177,(1986) Richardson C. F. et.al., Arch. Oral. Biol., 38:997,(1993) Pollock J. J. et.al., Infect. Immun., 44:702,(1984) Xu T. et.al., Infect. Immun., 59:2549,(1991) MacKay B. J. et.al., Infect. Immun., 44:695,(1984) Xu T. et.al., J. Dent. Res., 69:239,(1990) Colon J. O. et.al., J. Dent. Res., 72:322,(1993)

本発明は、硬質表面、洗濯品等の汚れを除去すると共に、微生物の繁殖を抑えることが可能な洗浄剤組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、ヒスタチン類の抗菌作用について検討したところ、ヒスタチン類を界面活性剤と共に洗浄剤組成物中に配合して用いた場合に、大腸菌や黄色ブドウ球菌等の一般細菌に対して優れた抗菌活性を示し、汚れを除去すると共に、微生物の繁殖を抑制できることを見出した。

すなわち本発明は、ヒスタチン類及び界面活性剤を含有する洗浄剤組成物を提供するものである。

本発明の洗浄剤組成物は、大腸菌や黄色ブドウ球菌等の一般細菌に対して優れた抗菌活性を示すことから、硬質表面、洗濯品上、或いはヒトや動物の皮膚上の汚れを除去すると共に、微生物の増殖を抑制することができる。従って、本発明の洗浄剤組成物は、微生物との接触による疾病の危険性の回避、洗濯物の生乾き臭の発生抑制、コンタクトレンズ製品の保存等を目的とした洗浄剤として有用である。

本発明の洗浄剤組成物に含有されるヒスタチン類としては、天然ヒトヒスタチン類の他、それらのアミノ酸配列の一部、又は天然ヒトヒスタチンの改変体であって、天然ヒトヒスタチンと同様の生理活性及び機能を有し、本発明の効果を奏するものが含まれる。

天然ヒスタチンは、これまでにヒスタチン１〜１２までの１２種類のヒスタチン分子種が分離精製され、一次構造が明らかにされているが、その中でヒスタチン１、ヒスタチン３、ヒスタチン５の３種は、ヒスタチン全体の８５〜９０％を占めており、メジャーヒスタチンと呼称され、これらのアミノ酸配列間には高い相同性が認められている。
本発明においては、斯かる天然ヒスタチンのいずれをも使用することができるが、メジャーヒスタチンを用いるのが好ましく、特にヒスタチン５を用いるのが好ましい。斯かるヒスタチン５は、ヒスタチン３とＮ末端のアスパラギン残基から２４番目のチロシン残基までが同一の配列であり、以降の８残基が欠落した形をとっている［Oppenheim F. G. et.al.,J. Biol. Chem., 263:7472,(1988)、Troxler R. F. et.al.,J. Dent. Res., 69:2,(1990］。よって、本発明のヒスタチン類には、ヒスタチン５とは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも含まれ、さらに、天然ヒトヒスタチンと同様の生理活性又は／及び機能を有するものが特に好ましい。

本発明のヒスタチン類には、天然ヒスタチンのアミノ酸配列の一部、又は天然ヒスタチンの改変体であって、ヒスタチンと同様の機能を発揮するペプチド、すなわち界面活性剤と共に洗浄剤組成物中に配合して用いた場合に、一般細菌に対して優れた抗菌活性を示すという作用を発揮するものが含まれる。
天然ヒスタチンのアミノ酸配列の一部としては、例えば、Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ［Raj, P., A., et. al. J. Biol. Chem., 265:3898, (1990)］が挙げられる。

また、天然ヒスタチンの改変体としては、天然ヒスタチンのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなるヒスタチン変異体が挙げられる。

斯かるヒスタチン類は、唾液より精製できる他、化学合成やこれらの遺伝子をクローニングした原核細胞や真核細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物）から得ることができる。唾液からのヒスタチン類の精製に関しては[Oppenheim F. G. et.al., J. Biol. Chem., 263:7472,(1988)]に記載の方法を用いることができる。また、化学合成においては当技術分野で広く知られている手法（アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法等）を用いることができる。遺伝子工学的手法を用いたヒスタチン類の生産、すなわち生体からの抽出や増幅、公知のアミノ酸配列に基づく化学的合成等の公知の方法により取得したヒスタチン類をコードするＤＮＡから発現ベクターの構築、ベクターの種々の宿主細胞への形質転換、そして形質転換された宿主細胞からのペプチドの生産は、例えばManiatisら［Maniatis, T., et.al., Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)］に記載の方法で行うことができる。

ヒスタチン類の配合量は、効果の増強及び経済性等の観点から、組成物全体に対して、１〜５０質量％、好ましくは５〜１５質量％とするのが望ましい。

本発明洗浄剤組成物における界面活性剤としては、陰イオン（アニオン）系界面活性剤、非イオン（ノニオン）系界面活性剤、陽イオン（カチオン）系界面活性剤、両性イオン系界面活性剤の1種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン（アニオン）系界面活性剤、非イオン（ノニオン）系界面活性剤である。

陰イオン（アニオン）系界面活性剤としては、平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するオレフィンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するアルカンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するα−スルホ脂肪酸メチルあるいはエチルエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩が好ましい。特に、α−オレフィンスルホン酸塩、２−スルホ脂肪酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩が好適である。

非イオン（ノニオン）系界面活性剤としては、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均１〜２０モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、平均炭素数８〜２０のアルキル基を有し、グルコースの重合度が１〜３のアルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテルが好適である。

両性イオン系界面活性剤としては、平均炭素数８〜２０のアルキル基、又はアルケニル基を少なくとも１つ有するカルボベタイン、スルホベタイン、アルキルアミノ脂肪酸塩、アミンオキシド等が好ましい。特に、アルキルベタインが好適である。

斯かる界面活性剤の配合量は、組成物全体に対して、洗浄性、泡立ち性、使い勝手の点で、０．５〜６０質量％、特に粉末状洗剤組成物については１０〜４５質量％、液体洗剤組成については２０〜５０質量％配合することが好ましい。

本発明の洗浄剤組成物のｐＨは、２〜１２、好ましくは、６〜１１、更に好ましくは、７〜１１に調整するのが望ましい。
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、セスキ炭酸ナトリウム等の炭酸塩、珪酸ナトリウム、珪酸カリウム等の珪酸塩、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアルカノールアミン等、また塩酸、硫酸、クエン酸等の酸類を用いることができる。

本発明の洗浄剤組成物には、上記成分の他に、必要に応じて、更にトリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩、ジグルコール酸塩等のキレ−ト剤、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、防腐剤、色素、香料、紫外線吸収剤、塩類、増粘剤、減粘剤等を適宜配合することができる。

本発明の洗浄剤組成物は、通常の方法により、例えば、各成分を混合配合することにより製造することができ、水溶液状、粉状、粒状、シート状、タブレット状等の各種剤型とすることができる。

斯くして調製される本発明の洗浄剤組成物は、後記実施例に示すように大腸菌、黄色ブドウ球菌、肺炎桿菌等の一般細菌に対して、微生物の増殖抑制作用を有する。
陶器、ガラス、石、コンクリート、金属、木材、紙、繊維、樹脂等の硬質表面、或いはヒトや動物の毛髪、皮膚、爪上には、一般細菌が付着し、悪臭の発生、アレルギー反応等の皮膚又は粘膜上の疾患を引き起こす。また、洗濯品には、Staphylococcus epidermidis、Staphylococcusaureus、Micrococci、Enterococci、Neisseria、Bacillussubtilis、Diphtheroid bacilli、Escherichia coli、Pseudomonasaeruginosa、Alcaligenes faecalis、Klebsiella、Enterobacteraerogenes、Citrobacter、Proteus vulgaris、Bacteriumanitratum、Candida albicans等が付着することが報告されており（奥山晴彦、皆川基編、「洗剤・洗浄の事典」、朝倉書店 (1990)）、斯かる細菌が増殖することにより、悪臭、いわゆる生乾き臭を発生させる。

従って、本発明の洗浄剤組成物は、硬質表面、洗濯品等の汚れを除去すると共に、微生物の繁殖を抑制し、不快臭の発生等を抑えることが可能であり、各種の住居用洗剤、例えば、風呂用洗剤、トイレ用洗剤、洗面所用洗剤、台所用洗剤、床用洗剤、窓ガラス用洗剤、車用洗剤、又は衣類用洗剤、洗顔剤、化粧料、コンタクトレンズ洗浄剤、歯磨剤、口腔洗浄剤、シャンプー等の毛髪洗浄剤、ペット用洗浄剤等として用いることができる。

実施例１ 大腸菌（Esherichia coli）に対する抗菌効果
（１）使用菌株、及び菌体懸濁液の調整
試験菌株としてEsherichia coli IFO3972を用いた。Trypticase Soy Broth (BECYON DICKINSON社製)５ｍＬを大型試験管に入れ、白金耳にて試験菌株を接種し、３７℃で１５時間振盪培養したものを前培養液とした。Trypticase Soy Broth ５０ｍＬを５００ｍＬ容 坂口フラスコに入れ、前培養液０．５ｍＬを接種し、３７℃で３時間振盪培養したものを対数増殖中期培養液とした。対数増殖中期培養液５ｍＬを遠心分離（８００×ｇ、１０分）することで菌体を集め、上清を棄てた。菌体を５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁し、再度遠心分離（８００×ｇ、１０分）を行い、菌体を集めた。菌体を１ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁したものを菌体懸濁液とし、６２０ｎｍの吸光度（ＯＤ６２０）を測定した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて菌体懸濁液を希釈し、ＯＤ６２０が０．２となるように調節することにより、細菌数１〜５×１０⁷／ｍＬの菌体懸濁液を得た。

（２）ヒスタチン溶液
ヒスタチンとして、株式会社ペプチド研究所製のＨｉｓｔａｔｉｎ５（Ｈｕｍａｎ）を使用し、０．０１ｗｔ/Ｖ％酢酸にて１ｍｇ／ｍＬに調製した。

（３）界面活性剤
α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、２−スルホ脂肪酸塩（α−ＳＦＥ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩（ＥＳ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（ＡＥ）、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル（ＡＰＥ）、アルキルポリグルコシド（ＡＧ）、アルキルベタインを使用した。ポリオキシエチレンアルキルエーテルとしてソフタノール７０Ｈ（株式会社日本触媒製）を使用した。それぞれの界面活性剤は０．０２９ｗｔ/Ｖ％（ｐＨ７．０）となるように調製した。

（４）抗菌性試験
あらかじめ３７℃に調整した６９μＬの界面活性剤または１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に１０μＬの０．０１ｗｔ/Ｖ％酢酸、２０μＬの各種菌体懸濁液、及び１μＬのTrypticase Soy Brothを加え緩やかに混合した（界面活性剤の最終濃度０．０２ｗｔ/Ｖ％）。３７℃で１５分間保温した後、３０μＬをサンプリングし冷却した１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液３ｍＬに懸濁・希釈することで反応を停止した。希釈液をＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」（日本製薬社製）に塗抹し、３７℃で１昼夜静置培養し寒天培地上に生じたコロニー数をカウントし、界面活性剤処理後の生菌数Ｍｄを算出した。

同様にあらかじめ３７℃に調整した６９μＬの界面活性剤または１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に１０μＬのヒスタチン溶液、２０μＬの各種菌体懸濁液、及び１μＬのTrypticase Soy Brothを加え緩やかに混合した（界面活性剤の最終濃度０．０２ｗｔ/Ｖ％、ヒスタチンの最終濃度１００μｇ／ｍＬ）。３７℃で１５分間保温した後、３０μＬをサンプリングし冷却した１５０ｍＭ ＮａＣｌ溶液３ｍＬに懸濁・希釈することで反応を停止した。希釈液をＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」（日本製薬社製）に塗抹し、３７℃で１昼夜静置培養し寒天培地上に生じたコロニー数をカウントし、界面活性剤及びヒスタチン処理後の生菌数Ｍｄｈを算出した。

(結果)
ＡＯＳ、α−ＳＦＥ、ＥＳ、ＡＥ、ＡＰＥ、アルキルベタインにおいてＭｄｈの値がＭｄを大きく下回り（図１）ヒスタチンを添加することにより抗菌効果を示すことが明らかとなった。

実施例２ 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）に対する抗菌効果
（１）使用菌株、及び菌体懸濁液の調整
試験菌株としてKlebsiella pneumoniae ATCC13883を用いた。Trypticase Soy Broth (BECYON DICKINSON社製)５ｍＬを大型試験管に入れ、白金耳にて試験菌株を接種し、３７℃で１５時間振盪培養したものを前培養液とした。Trypticase Soy Broth ５０ｍＬを５００ｍＬ容 坂口フラスコに入れ、前培養液０．５ｍＬを接種し、３７℃で３時間振盪培養したものを対数増殖中期培養液とした。対数増殖中期培養液５ｍＬを遠心分離（８００×ｇ、１０分）することで菌体を集め、上清を棄てた。菌体を５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁し、再度遠心分離（８００×ｇ、１０分）を行い、菌体を集めた。菌体を１ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁したものを菌体懸濁液とし、６２０ｎｍの吸光度（ＯＤ６２０）を測定した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて菌体懸濁液を希釈し、ＯＤ６２０が２．０となるように調節することにより、細菌数１〜５×１０⁷／ｍＬの菌体懸濁液を得た。

以下、実施例１と同様にヒスタチン溶液、界面活性剤を調整し、大腸菌（Esherichia coli）に変えて肺炎桿菌（Klebsiellapneumoniae）で抗菌性試験を行った。

(結果)
α−ＳＦＥ、ＡＥ、アルキルベタインにおいてＭｄｈの値がＭｄを大きく下回り（図２）ヒスタチンを添加することにより抗菌効果を示すことが明らかとなった。

実施例３ 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する抗菌効果
（１）使用菌株、及び菌体懸濁液の調整
試験菌株としてStaphylococcus aureus IFO13276を用いた。Trypticase Soy Broth (BECYON DICKINSON社製)５ｍＬを大型試験管に入れ、白金耳にて試験菌株を接種し、３７℃で１５時間振盪培養したものを前培養液とした。Trypticase Soy Broth ５０ｍＬを５００ｍＬ容 坂口フラスコに入れ、前培養液０．５ｍＬを接種し、３７℃で３時間振盪培養したものを対数増殖中期培養液とした。対数増殖中期培養液５ｍＬを遠心分離（８００×ｇ、１０分）することで菌体を集め、上清を棄てた。菌体を５ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁し、再度遠心分離（８００×ｇ、１０分）を行い、菌体を集めた。菌体を１ｍＬの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて懸濁したものを菌体懸濁液とし、６２０ｎｍの吸光度（ＯＤ６２０）を測定した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）にて菌体懸濁液を希釈し、ＯＤ６２０が０．２となるように調節することにより、細菌数１〜５×１０⁷／ｍＬの菌体懸濁液を得た。

以下、実施例１と同様にヒスタチン溶液、界面活性剤を調整し、大腸菌（Esherichia coli）に変えて黄色ブドウ球菌（Staphylococcusaureus）で抗菌性試験を行った。

（結果）
ＡＥにおいてＭｄｈの値がＭｄを大きく下回り（図３）ヒスタチンを添加することにより抗菌効果を示すことが明らかとなった。

図１は大腸菌に対する抗菌効果を示す図である。 図２は肺炎桿菌に対する抗菌効果を示す図である。 図３は黄色ブドウ球菌に対する抗菌効果を示す図である。

Claims (1)

1. （１）ヒスタチン５ならびに（２）１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するα−オレフィンスルホン酸塩、１０〜２０の炭素原子を１分子中に有する２−スルホ脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均１〜２０モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、炭素数８〜２０のアルキル基を少なくとも１つ有するアルキルベタイン又はそれらの組合せを含有し、大腸菌に対して抗菌活性を示すか、又は
   （１）ヒスタチン５ならびに（２）１０〜２０の炭素原子を１分子中に有する２−スルホ脂肪酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均０．５〜８モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子中に平均１〜２０モルのエチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、炭素数８〜２０のアルキル基を少なくとも１つ有するアルキルベタイン又はそれらの組合せを含有し、肺炎桿菌に対して抗菌活性を示す
   抗菌剤組成物。

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