JP7843331B2

JP7843331B2 - 第ｘａ因子及び誘導体を調製するための組成物及び方法

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Publication number: JP7843331B2
Application number: JP2024181226A
Authority: JP
Inventors: ルーゲンミン
Original assignee: アレクシオンファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2024-10-16
Publication date: 2026-04-09
Anticipated expiration: 2040-08-05
Also published as: WO2021026254A2; EP4010379A2; EP4010379A4; LT4010379T; DK4010379T3; WO2021026254A3; US20220251534A1; JP2022543302A; JP7668783B2; CN114258405A; SI4010379T1; ES3033092T3; PT4010379T; EP4010379B1; HUE072201T2; FI4010379T3; EP4541887A3; US12398387B2; EP4541887A2; JP2024180602A

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年８月８日に提出された米国仮特許出願第６２／８８４，６５２号明細書及び２０２０年３月１７日に提出された米国仮特許出願第６２／９９０，８８５号明細書の、米国特許法第１１９（ｅ）条の下での利益を主張し、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本開示に援用される。

組換え第Ｘａ因子（ｆＸａ）及びアンデキサネットアルファなどのその誘導体は、宿主哺乳動物細胞株から作製することができる。アンデキサネットアルファ（又は単にアンデキサネット）は、リバロキサバン又はアピキサバンにより治療されている患者について、致命的な又はコントロールできない出血により抗凝固の打ち消しが必要とされる場合に米国及び欧州において承認された医薬品である。リバロキサバン及びアピキサバンは、ベトリキサバン及びエドキサバン並びに低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）も含む抗凝固（抗凝血）薬のグループである第Ｘａ因子阻害剤である。アンデキサネットは、第Ｘａ因子（ｆＸａ）の修飾組換え誘導体である。アンデキサネットは、デコイ分子として作用し、阻害剤に結合し、ｆＸａのその阻害を再現し、従ってｆＸａの通常の凝固活性を回復させる。

第Ｘａ因子及びアンデキサネットは、２本の鎖間のジスルフィド結合によって連結される２本の鎖を有する。組換え天然型ｆＸａは、通常、第１に不活性型前駆体第Ｘ因子（ｆＸ）の発現、その後、生理的酵素（例えば、ＦＶＩＩａ／ＴＦ、ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ）又は非生理的活性化因子（例えば、ＲＶＶ－Ｘ）により、発現されたｆＸをｆＸａに活性化する第２のステップによって作製される。ｆＸとｆＸａとの間の違いは、ｆＸ重鎖のＮ末端の活性化ペプチド（ＡＰ）の５２アミノ酸残基の除去にある。典型的な産生細胞株、例えばＣＨＯ細胞は、ＡＰを処理し、除去することができないため、活性化ステップは、不活性型ｆＸを天然型ｆＸａに変換するために必要である。

対照的に、アンデキサネットは、収集された細胞培養液から直接精製することができる完全に処理された機能的な分子として直接発現される。これは、重鎖及び軽鎖間において、ＣＨＯ細胞によって処理することができる－ＲＫＲＲＫＲ－リンカーを形成するために、－ＲＫＲ－トリペプチドにより天然型ｆＸ中のＡＰ配列を置き換えることによって実現される。

本開示は、２本鎖活性化第Ｘａ因子タンパク質又はその誘導体を調製するための組成物及び方法を提供する。活性化ペプチド（ＡＰ）が第Ｘａ因子タンパク質又は誘導体の重鎖のＣ末端部に融合される場合、結果として生じるタンパク質は、より効率的に発現され得、及び重鎖への活性化ペプチド（ＡＰ）の付加は、タンパク質の活性に影響を及ぼさないことが発見されている。対照的に、タンパク質の他の部分に活性化ペプチドを追加することは、発現を増強するのに有用でない（例えば、軽鎖のＣ末端に付加される場合）か、又はさらに製造に課題を与える（例えば、重鎖のＮ末端に付加される場合）。さらに、ＦＸ重鎖のＣ末端２０アミノ酸残基（ベータペプチド）の除去が第Ｘ因子のタンパク質発現に悪影響を与えないという一般的な知識に反して（例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉｅｔａｌ，ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ２０１５；１３：１４６８－７４及びＦｅｒｒａｒｅｓｅｅｔａｌ．，ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｓ．２０１９，１７３：４－１１を参照されたい）、そのような大きい切り詰めがｆＸａ及び誘導体の効率的な発現のために所望されないことが本明細書において発見されている。さらに驚くべきことに、ＦＸａ及びその誘導体のＣ末端にＡＰを融合させることにより、タンパク質発現に対するＣ末端切り詰めの影響をなくすことができる。

一実施形態において、本開示は、タンパク質であって、
ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ－Ｌ２－ＡＰ（Ｉ）
（式中、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、
Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、及び
ＡＰは、活性化ペプチドを含む）
の式（Ｉ）のアミノ酸配列を含み、Ｌ１がプロテアーゼによって処理される場合、ジスルフィド架橋によって接続される別々の鎖上にＬＣ及びＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能であり、２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質を提供する。

別の実施形態において、タンパク質であって、
ＨＳＡ－Ｌ２－ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ（ＩＩ）
（式中、
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体であり、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、及び
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む）
の式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含み、Ｌ１がプロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上にＬＣ及びＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能であり、２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質が提供される。

別の実施形態において、タンパク質であって、
ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ－Ｌ２－ＨＳＡ（ＩＩＩ）
（式中、
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体であり、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、及び
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む）
の式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含み、Ｌ１がプロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上にＬＣ及びＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能であり、２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質が提供される。

いくつかの実施形態において、ＬＣは、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、不在である。

いくつかの実施形態において、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む第１の断片及び第１の断片のＣ末端側にあり、且つ活性化ペプチドを含む第２の断片を含む重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である２本鎖ポリペプチドも提供される。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含む第１の断片及び配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む第２の断片を含む軽鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能であり、軽鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、２本鎖ポリペプチドも提供される。

ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドでトランスフェクトされる細胞及び方法も、いくつかの実施形態において、２本鎖ポリペプチドを調製するために提供される。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
タンパク質であって、
ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ－Ｌ２－ＡＰ（Ｉ）
（式中、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、
Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、及び
ＡＰは、活性化ペプチドを含む）
の式（Ｉ）のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ１が前記プロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上に前記ＬＣ及び前記ＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能であり、前記２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質。
（項目２）
前記プロテアーゼは、フューリンである、項目１に記載のタンパク質。
（項目３）
前記Ｌ１は、ＲＫＲ又はＲＫＲＲＫＲ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、項目２に記載のタンパク質。
（項目４）
Ｌ２は、長さが０～５０アミノ酸残基である、項目１～３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目５）
Ｌ２の前記アミノ酸残基の少なくとも５０％は、Ｇｌｙ又はＳｅｒである、項目４に記載のタンパク質。
（項目６）
前記活性化ペプチドは、グリコシル化部位を含む、項目１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目７）
前記活性化ペプチドは、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子若しくはプロテインＣの活性化ペプチドであるか、又は第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子若しくはプロテインＣの活性化ペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目８）
前記活性化ペプチドは、配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目９）
前記ＬＣのＮ末端側にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をさらに含む、項目１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１０）
前記ＨＳＡは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、項目９に記載のタンパク質。
（項目１１）
ＬＣは、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、項目９に記載のタンパク質。
（項目１２）
前記産生された２本鎖ポリペプチドは、野生型ｆＸａと比較して、集まってプロトロンビン複合体になる低下した能力を有する、項目１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１３）
配列番号２のアミノ酸残基６～３９を含まない、項目１～１２のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１４）
前記ＬＣは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号６に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のタンパク質。
（項目１５）
前記産生された２本鎖ポリペプチドは、野生型ヒト第Ｘａ因子と比較して低下した触媒活性を有する、項目１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１６）
前記ＨＣは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１７）
前記ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１８）
配列番号２のアミノ酸残基４３６～４４８を含まない、項目１～１７のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目１９）
配列番号２のアミノ酸残基４３４～４４８を含まない、項目１～１８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２０）
タンパク質であって、
ＨＳＡ－Ｌ２－ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ（ＩＩ）
（式中、
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は前記ＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体であり、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、及び
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む）
の式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ１が前記プロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上に前記ＬＣ及び前記ＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能である、前記２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質。
（項目２１）
前記ＨＳＡは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２２）
ＬＣは、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、項目２０に記載のタンパク質。
（項目２３）
Ｌ２は、不在である、項目２２に記載のタンパク質。
（項目２４）
前記プロテアーゼは、フューリンである、項目２２又は２３に記載のタンパク質。
（項目２５）
前記Ｌ１は、ＲＫＲ又はＲＫＲＲＫＲ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、項目２４に記載のタンパク質。
（項目２６）
前記ＨＣのＣ末端側に融合された活性化ペプチド（ＡＰ）をさらに含む、項目２０～２５のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目２７）
前記活性化ペプチドは、グリコシル化部位を含む、項目２６に記載のタンパク質。
（項目２８）
前記活性化ペプチドは、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子若しくはプロテインＣの活性化ペプチドであるか、又は第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子若しくはプロテインＣの活性化ペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、項目２６又は２７に記載のタンパク質。
（項目２９）
前記活性化ペプチドは、配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２８に記載のタンパク質。
（項目３０）
前記ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２０～２９のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３１）
前記産生された２本鎖ポリペプチドは、野生型ヒト第Ｘａ因子と比較して低下した触媒活性を有する、項目２０～３０のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３２）
前記ＨＣは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３１に記載のタンパク質。
（項目３３）
前記ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、項目３２に記載のタンパク質。
（項目３４）
シグナル又はシグナル／プロペプチドをさらに含む、項目１～３３のいずれか一項に記載のタンパク質。
（項目３５）
前記シグナル又はシグナル／プロペプチドは、配列番号３４～３７からなる群から選択される、項目３４に記載のタンパク質。
（項目３６）
配列番号２５のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（項目３７）
配列番号２６のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（項目３８）
配列番号４２のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（項目３９）
配列番号４３のアミノ酸配列を含むタンパク質。
（項目４０）
項目１～３９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目４１）
項目４０に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
（項目４２）
前記プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目４１に記載の細胞。
（項目４３）
タンパク質を調製する方法であって、項目４１又は４２に記載の細胞を培養することと、培養物から２本鎖タンパク質を回収することとを含む方法。
（項目４４）
配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む第１の断片及び前記第１の断片のＣ末端側にあり、且つ活性化ペプチドを含む第２の断片を含む重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である２本鎖ポリペプチド。
（項目４５）
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は前記ＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を含む第１の断片及び配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む第２の断片を含む軽鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能であり、前記軽鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、２本鎖ポリペプチド。
（項目４６）
項目１～３９のいずれか一項に記載のタンパク質を前記プロテアーゼで処理することによって得ることができる２本鎖ポリペプチド。

構築物Ｃ０１～Ｃ１４の構造を示す。Ｃ０５、Ｃ００７、Ｃ０８及びＣ１０についての発現及び活性試験の結果を示す。同上。同上。同上。基準としてアンデキサネット前駆体（ＡｎＸａ）、Ｃ０８及びＣ１０を使用する、Ｃ１２～Ｃ１４についての発現及び活性試験の結果を示す。

Ｉ．定義
範囲を含め、すべての数値的な指定、例えばｐＨ、温度、時間、濃度及び分子量は、０．１きざみで（＋）又は（－）に変動する近似値である。常に明示されるわけではないが、すべての数値的な指定の前に用語「約」が置かれることが理解されるべきである。常に明示されるわけではないが、本明細書に記載される試薬は、単なる例示であり、そのような試薬の均等物は、当技術分野において知られていることも理解されるべきである。

「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、区別なく使用され、最も広い意味で２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体又はペプチド模倣薬といった化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結され得る。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えばエステル、エーテル等によって連結され得る。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限は設定されない。本明細書において使用されるように、「アミノ酸」という用語は、天然型及び／若しくは非天然型又は合成アミノ酸を指し、グリシン並びにＤ及びＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体並びにペプチド模倣薬を含む。天然に発生するアミノ酸の１文字及び３文字の略語を下記に示す。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、オリゴペプチドと一般に呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、ポリペプチド又はタンパク質と一般に呼ばれる。

「第Ｘａ因子」、又は「ｆＸａ」、又は「ｆＸａタンパク質」は、不活性型第Ｘ因子（ｆＸ）から産生される、血液凝固経路におけるセリンプロテアーゼを指す。第Ｘａ因子は、内因系Ｘａｓｅとして知られている複合体におけるその補因子、第ＶＩＩＩａ因子と共に第ＩＸａ因子によるか、又は外因系Ｘａｓｅとして知られている複合体におけるその補因子、組織因子と共に第ＶＩＩａ因子によるかのいずれかで活性化される。ｆＸａは、第Ｖａ因子と膜結合プロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロンビナーゼ複合体においてプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する有効成分となる。トロンビンは、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒する酵素であり、これは、最終的に血餅形成を導く。従って、ｆＸａの生物学的活性は、ときに本明細書において「プロコアグラント活性」と称される。

第Ｘａ因子は、２本の鎖間の１つのジスルフィド結合によって連結される２本鎖の分子である。軽鎖（ＬＣ）は、１３９アミノ酸（配列番号２のアミノ酸１～１３９）残基を有し、短い芳香族スタック（ＡＳ）（配列番号２のアミノ酸４０～４５）を含むγ－カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）リッチドメイン（配列番号２のアミノ酸１～４５）、その後に続く２つの上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメイン（ＥＧＦ１：配列番号２のアミノ酸４６～８４、ＥＧＦ２：アミノ酸８５～１２８）を含有する。

活性化前の重鎖（ＨＣ）は、３０６アミノ酸を有し、５２アミノ酸活性化ペプチド（ＡＰ：配列番号２のアミノ酸１４３～１９４）、その後に続く触媒ドメイン（配列番号２のアミノ酸１９５～４４８）を含有する。キモトリプシン番号でのＨ５７－Ｄ１０２－Ｓ１９５に対する触媒三残基均等物は、ｆＸ配列（配列番号２）においてＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２及びＳｅｒ３７９に位置する（配列番号２のアミノ酸２３６、２８２及び３７９）。重鎖は、セリンプロテアーゼ、トリプシン様活性部位及びグリコシル化されるＮ末端活性化ペプチドを含有する。重鎖は、少なくとも３つの形態、α、β及びγを有し、これらは、重鎖におけるＣ末端ペプチドの切断により異なる。

ヒト第Ｘ因子（「ｆＸ」）をコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、「ＮＭ＿０００５０４」に見出すことができる。ｆＸの対応するアミノ酸配列及びドメイン構造は、Ｌｅｙｔｕｓｅｔａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８６，２５：５０９８－５１０２に記載されている。成熟ｆＸのドメイン構造は、Ｖｅｎｋａｔｅｓｗａｒｌｕ，Ｄ．ｅｔａｌ，ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２００２，８２：１１９０－１２０６にも記載されている。重鎖の最初の５２残基の触媒による切断と同時に、ｆＸは、ｆＸａ（配列番号３）に活性化される。ＦＸａは、翻訳後にグルタミン酸残基がガンマ－カルボキシルグルタミン酸になる軽鎖及び重鎖を含有する。軽鎖の最初の４５アミノ酸残基は、１１の翻訳後修飾γ－カルボキシグルタミン酸残基（Ｇｌａ）を含有するため、Ｇｌａドメインと呼ばれる。Ｇｌａドメインは、短い（６アミノ酸残基）芳香族スタック配列も含有する。キモトリプシン消化は、１～４４残基を選択的に除去し、ＧｌａドメインのないｆＸａをもたらす。ｆＸａのセリンプロテアーゼ触媒ドメインは、Ｃ末端の重鎖に位置する。ｆＸａの重鎖は、トロンビン、トリプシン及び活性化プロテインＣなどの他のセリンプロテアーゼに対して非常に相同性である。

「天然型ｆＸａ」又は「野生型ｆＸａ」は、血漿中に天然に存在するか、又はその本来の無修飾の形態で単離されるｆＸａを指し、ｆＸａは、プロトロンビンを活性化する生物学的活性を処理し、そのため、血餅の形成を促進する。この用語は、組織サンプルから単離される天然に発生するポリペプチド及び組換えで産生されるｆＸａを含む。「活性型ｆＸａ」は、プロトロンビンを活性化する生物学的活性を有するｆＸａを指す。「活性型ｆＸａ」は、プロコアグラント活性を保持する天然型ｆＸａ又は修飾ｆＸａであり得る。

「ｆＸａ誘導体」、又は「修飾ｆＸａ」、又は「第Ｘａ因子タンパク質の誘導体」は、修飾されているが、それでもなお直接又は間接的に第Ｘａ因子阻害剤に結合することができるｆＸａタンパク質を指す。

誘導体は、修飾活性部位及び／又は修飾Ｇｌａドメインを有し得る。追加の修飾も想定される。そのような修飾は、１つ以上の以下の手段で作製され得ることが想定される：配列からの１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上の異なるアミノ酸残基による１つ以上のアミノ酸残基の置換及び／或いは１つ以上のアミノ酸側鎖又はその「Ｃ」若しくは「Ｎ」末端の操作。

用語「活性部位」は、化学反応が生じる酵素又は抗体の一部を指す。「修飾活性部位」は、化学反応性又は特異性が増加又は減少した活性部位を提供するために構造的に修飾された活性部位である。活性部位は、実際の部位だけでなく、活性部位を含有するドメインも含むことが想定される。活性部位の例は、２３５～４８８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘ因子の触媒ドメイン及び１９５～４８８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインを含むが、これらに限定されない。キモトリプシン番号でのＨ５７－Ｄ１０２－Ｓ１９５に対する触媒三残基均等物は、Ｈｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２及びＳｅｒ３７９に位置する。修飾活性部位の例は、個々の又は組み合わせの触媒三残基を含むが、これらに限定されない。ある修飾は、修飾活性部位Ｓｅｒ３７９Ａｌａを有するｆＸａ誘導体に関する。追加の例は、Ａｒｇ３０６、Ｇｌｕ３１０、Ａｒｇ３４７、Ｌｙｓ３５１、Ｌｙｓ４１４又はＡｒｇ４２４位での少なくとも１つのアミノ酸置換による、１９５～４４８アミノ酸残基を含むヒト第Ｘａ因子の触媒ドメインに対する修飾を含む。

用語「第Ｘａ因子阻害剤」又は「第Ｘａ因子の阻害剤」は、インビトロ及び／又はインビボにおいてプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する凝固因子Ｘａの活性を直接又は間接的に阻害することができる化合物を指す。既知のｆＸａ阻害剤の例は、限定を伴うことなく、エドキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、ビオチン化イドラパリヌクス、エノキサパリン、フラグミン、ＮＡＰ－５、ｒＮＡＰｃ２、組織因子経路阻害剤、ＤＸ－９０６５ａ（例えば、Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔａｌ，ＪＰｈａｒｍａｃｏｌＥｘｐＴｈｅｒ．１９９６２７６（３）：１０３０－８に記載されている）、ＹＭ－６０８２８（例えば、Ｔａｎｉｕｃｈｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ，ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．１９９８７９（３）：５４３－８に記載されている）、ＹＭ－１５０（例えば、Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｂ．Ｉ．ｅｔ．ａｌ，Ｂｌｏｏｄ２００５；１０６（１１），Ａｂｓｔｒａｃｔ１８６５に記載されている）、アピキサバン、リバロキサバン、ＰＤ－３４８２９２（例えば、ＰｉｐｅｌｉｎｅＩｎｓｉｇｈｔ：Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ－ＲｅａｃｈｉｎｇｔｈｅＵｎｔｒｅａｔｅｄＰｒｏｐｈｙｌａｘｉｓＭａｒｋｅｔ，２００７に記載されている）、オタミキサバン、ラザキサバン（ＤＰＣ９０６）、ＢＡＹ５９－７９３９（例えば、Ｔｕｒｐｉｅ，Ａ．Ｇ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００５，３（１１）：２４７９－８６に記載されている）、エドキサバン（例えば、ＨｙｌｅｋＥＭ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＩｎｖｅｓｔＤｒｕｇｓ２００７８（９）：７７８－７８３に記載されている）、ＬＹ５１７７１７（例えば、Ａｇｎｅｌｌｉ，Ｇ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．２００７５（４）：７４６－５３に記載されている）、ＧＳＫ９１３８９３、ベトリキサバン及びその誘導体を含む。低分子量ヘパリン（「ＬＭＷＨ」）も第Ｘａ因子阻害剤とみなされる。

一実施形態において、本発明の誘導体は、直接又は間接的に第Ｘａ因子阻害剤に結合する。用語「結合すること」、「結合する」、「認識」又は「認識する」は、本明細書において使用されるように、例えばハイブリダイゼーションアッセイを使用して検出され得る、分子間の相互作用を含むことを意味する。この用語は、分子間の「結合」相互作用を含むことも意味する。相互作用は、例えば、本質的に、タンパク質－タンパク質、タンパク質－核酸、タンパク質－小分子又は小分子－核酸であり得る。結合は、「直接的」又は「間接的」であり得る。「直接的な」結合は、分子間の直接の物理的接触を含む。分子間の「間接的な」結合は、同時に１つ以上の中間分子との直接の物理的接触を有する分子を含む。例えば、本発明の誘導体は、低分子量ヘパリン及び第Ｘａ因子の他の間接的な阻害剤に間接的に結合し、実質的に中和することが想定される。この結合は、相互作用している分子を含む「複合体」の形成をもたらすことがある。「複合体」は、共有結合性又は非共有結合性の結合、相互作用又は力によって互いに合わされた２つ以上の分子の結合を指す。

ｆＸａの阻害剤の活性を「中和する」、「打ち消す」若しくは「反作用する」又は同様の語句は、ｆＸａ阻害剤の第Ｘａ因子阻害機能又は抗凝固機能を阻害又は遮断することを指す。そのような語句は、インビトロ及び／又はインビボにおけるｆＸａ阻害剤活性の機能の部分的な阻害若しくは遮断又はほとんど若しくはすべての阻害若しくは遮断を指す。これらの用語は、ｆＸａ阻害剤依存性の薬理学的又は代替マーカーの少なくとも約２０％の中和作用も指す。マーカーの例は、ＩＮＲ、ＰＲ、ａＰＴＴ、ＡＣＴ、抗ｆＸａユニット、トロンビン生成（ＴｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎＴＧＡ）、トロンボエラストグラフィ、ＣＡＴ（自動較正トロンボグラム）及び他の同様のものを含むが、これらに限定されない。

「組成物」は、活性剤及びアジュバントなどの不活性（例えば、検出可能な作用物質若しくはラベル）又は活性な別の化合物又は組成物の組み合わせを意味することを意図する。

「医薬組成物」は、不活性又は活性なキャリアと活性剤との組み合わせを含み、組成物をインビトロ、インビボ又はエクスビボにおいて診断又は治療上の使用に適したものにすることを意図する。

本明細書において使用されるように、用語「その均等物」は、基準タンパク質、ポリペプチド又は核酸を指す場合、最小限の相同性のみを有するが、それでもなお所望の機能性を維持するものを意図する。本明細書において言及される任意の修飾タンパク質は、その均等物も含むことが想定される。例えば、相同性は、少なくとも７５％の相同性、代わりに少なくとも８０％、又は代わりに少なくとも８５％、又は代わりに少なくとも９０％、又は代わりに少なくとも９５％、又は代わりに９８％の相同性パーセントであり得、基準ポリペプチド又はタンパク質に対して実質的に均等な生物学的活性を呈することができる。ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）が別の配列に対して一定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％又は９５％）の「配列同一性」を有することは、アラインメントされた場合、そのパーセンテージの塩基（又はアミノ酸）が、２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。ｆＸａ（又は関連するセリンプロテアーゼ）の重鎖のみが使用される場合、全体的な相同性は、例えば、６５％又は５０％など、７５％よりも低いことができるが、所望の機能性が残っていることに留意すべきである。

ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域（又はポリペプチド若しくはポリペプチド領域）が別の配列に対して一定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％）の「配列同一性」を有することは、アラインメントされた場合、そのパーセンテージの塩基（又はアミノ酸）が、２つの配列を比較した際に同じであることを意味する。

ＩＩ．第Ｘａ因子及び誘導体の調製
アンデキサネットアルファ又は単にアンデキサネットは、リバロキサバン又はアピキサバンにより治療されている患者について、致命的な又はコントロールできない出血により抗凝固の打ち消しが必要とされる場合に米国及び欧州において承認された修飾第Ｘａ因子ポリペプチドである。ｒ－Ａｎｔｉｄｏｔｅとも称され、アンデキサネットの構造及び活性は、米国特許第８，１５３，５９０号明細書に記載されている。

アンデキサネットは、処理された２本鎖ポリペプチド、－ＲＫＲＲＫＲ－（配列番号７）リンカーの切断後の配列番号４の処理産物である。アンデキサネットは、配列番号５によって示され、これは、軽鎖（配列番号６）及び重鎖（配列番号８）を含む。軽鎖及び重鎖は、軽鎖のシステイン９８（Ｃｙｓ９８）と重鎖のシステイン１０８（Ｃｙｓ１０８）との間の単一のジスルフィド結合により接続される。野生型ｆＸａのように、一定の産生単位で、アンデキサネットは、翻訳後修飾を受け、あるアミノ酸残基、例えば軽鎖のＳｅｒ５６、Ｓｅｒ７２、Ｓｅｒ７６及びＴｈｒ８２並びに重鎖のＴｈｒ２４９にグリコシル化を、且つ軽鎖のＡｓｐ２９に修飾残基（３Ｒ）－３－ヒドロキシＡｓｐをもたらす。さらに、鎖間のジスルフィド結合に加えて、軽鎖のシステイン１６及び２７、２１及び３６、３８及び４７、５５及び６６、６２及び７５並びに７７及び９０間と、重鎖のシステイン７及び１２、２７及び４３、１５６及び１７０並びに１８１及び２０９間とに鎖内ジスルフィド結合が形成されることがある。

アンデキサネットの前駆体（配列番号４）は、野生型ｆＸａと比較して３つの突然変異を含有する。第１の突然変異は、ｆＸのＧｌａドメインにおける６～３９ａａの欠失である。第２の突然変異は、－ＲＫＲ－による活性化ペプチド配列１４３～１９４ａａの置き換えである。これは、軽鎖及び重鎖を接続する－ＲＫＲＲＫＲ－（配列番号７）リンカーを産生する。分泌と同時に、このリンカーは、切断され、２本鎖ポリペプチド（アンデキサネット）をもたらす。第３の突然変異は、活性部位残基Ｓ３７９のＡｌａ残基への突然変異である。

これらの構造的な変化により、アンデキサネットは、ｆＸａが集まってプロトロンビナーゼ複合体になる際に競合せず、触媒活性が低下しているか又はない。従って、アンデキサネットは、本来の凝固メカニズムに干渉することなく、循環しているｆＸａ阻害剤を捕捉することができる。ＥＧＦ－１又はＥＧＦ－２ドメイン中に欠失をさらに有するものを含め、同様の解毒薬も開示されている。

配列番号４は、アンデキサネットを産生するために宿主細胞において発現される前駆体タンパク質であり、これは、－ＲＫＲＲＫＲ－リンカー（配列番号７）を標的にする内在性又はスーパートランスフェクトフューリンタンパク質によって消化することができる。野生型ｆＸ由来の活性化ペプチド（ＡＰ）は、人工－ＲＫＲＲＫＲ－リンカーと置き換えられたように、必要でないと考えられていた。

しかしながら、ＡＰの包含は、処理された２本鎖産物の発現を増加させ得ることが本明細書において発見された。しかし、重鎖のＮ末端におけるものなど、前駆体タンパク質におけるＡＰの包含は、製造に課題を与える。タンパク質製造は、典型的には、ＣＨＯ細胞により行われ、ＣＨＯ細胞は、ＡＰと重鎖のＮ末端との間の切断部位－ＬＴＲ－について、第Ｘ因子を天然に処理する酵素活性を有さない（配列番号２）。そのため、ｆＸａ誘導体は、－ＲＫＲ－及び－ＲＫＲＲＫＲ－（配列番号７）リンカーを認識する、ＣＨＯ細胞中の内在性フューリン又は同時にトランスフェクトされたフューリンプロテアーゼによって切断することができる特定のリンカーを含む。

これに関連して、ＡＰがフューリン認識可能リンカーを通してタンパク質に付加される場合（例えば、Ｃ０４～Ｃ０６）、フューリンがリンカーを処理するのが早すぎることがあり、発現を増加させる目的を挫折させることが発見された。加えて、フューリン認識可能リンカーが適切に処理されなかった場合、処理された２本鎖分子は、不活性であり得る。他方では、ＡＰは、切断されないように軽鎖に融合される場合（例えば、Ｃ０７）、タンパク質発現を増加させる能力を有さなかった。ＡＰは、切断されないように重鎖のＣ末端部に融合された場合にのみ、タンパク質発現及び機能的活性を増加させることにおいて最大の効果を有した。

重鎖の１３又は１５Ｃ末端アミノ酸残基（それぞれＤｅｌｔａＨＣ－１３及びＤｅｌｔａＨＣ－１５）の欠失は、タンパク質の発現又は活性に対して有意な影響を有さないことがさらに発見された。対照的に、ＨＣのＣ末端からの２０Ｃ末端アミノ酸残基の欠失（ＤｅｌｔａＨＣ－２０）は、タンパク質の発現を有意に低下させた。これは、例えば、Ｂｒａｎｃｈｉｎｉｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓａｎｄＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，１３：１４６８－１４７４（２０１５）において実証されるように、２０アミノ酸残基まで天然型ＦＸを切り詰めても第Ｘ因子発現に有意に影響を及ぼさなかったという一般的な知識からみて予想外であった。さらに驚くべきことに、ＦＸａ及び誘導体のＣ末端にＡＰを融合させることにより、タンパク質発現に対するＣ末端切り詰めの影響をなくすことができた。

本開示の一実施形態に従い、そのため、式（Ｉ）：
ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ－Ｌ２－ＡＰ（Ｉ）
の配列を含む前駆体タンパク質が提供される。

ここで、ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質断片又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドなどの生物学的均等物を示す。ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むタンパク質断片又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドなどの生物学的均等物を示す。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、ベータペプチド（ＲＧＬＰＫＡＫＳＨＡＰＥＶＩＴＳＳＰＬＫ、配列番号３８）の少なくとも最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸残基を含む。

Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むタンパク質リンカーを示す。プロテアーゼは、いくつかの実施形態において、フューリンであり得る。Ｌ２は、他方では、ヌル（換言すれば任意選択）又はペプチドリンカーであり得る。しかしながら、Ｌ２がリンカーである場合、Ｌ２は、プロテアーゼによって処理され得ない。そのため、タンパク質がプロテアーゼとインキューベートされる場合、プロテアーゼは、タンパク質を消化し、２本鎖ポリペプチドを作製することができ、一方は、ＬＣを含み、他方は、ＨＣ－Ｌ２－ＡＰを含む。いくつかの実施形態において、産生された２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である。

興味深いことに、実験の第１のセットにおいて、ＡＰの発現増強効果は、発現タンパク質の発現又は安定性を増強するために一般に使用されるタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で観察されなかった。実施例２のＣ１０を参照されたい。しかしながら、さらなる実験（実施例３）において、軽鎖のＮ末端にＨＳＡが融合された２つの前駆体構築物、Ｃ１３及びＣ１４は、非常に改善された発現及び活性を呈した。従って、Ｇｌａドメインの全欠失（Ｃ１０は、Ｇｌａドメインの部分的な欠失を有した）は、ＨＳＡの効果を増強したことが想定される。換言すれば、ＨＳＡがＥＧＦ１ドメインに直接融合された場合、ＨＳＡの発現増強効果は、より顕著であった。

本開示の別の実施形態に従い、そのため、式（ＩＩ）：
ＨＳＡ－Ｌ２－ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ（ＩＩ）
の配列を含む前駆体タンパク質が提供される。

別の実施形態において、式（ＩＩＩ）：
ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ－Ｌ２－ＨＳＡ（ＩＩＩ）
の配列を含む前駆体タンパク質も提供される。

ここで、ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はＨＳＡに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する変異体を示し、Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、Ｌ２は、不在であるか、又はプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含み、及びＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む。式（ＩＩ）のタンパク質は、Ｌ１がプロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上にＬＣ及びＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生し、２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である。いくつかの実施形態において、ＬＣは、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、不在である。

いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のタンパク質は、軽鎖のＮ末端部又は重鎖のＣ末端部に融合されたＨＳＡをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）のタンパク質は、重鎖のＣ末端部に融合されたＡＰをさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、式（ＩＩＩ）のタンパク質は、軽鎖のＮ末端部に融合されたＡＰをさらに含むことができる。

いくつかの実施形態において、本開示の任意のタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ断片に融合され得る。結晶性断片領域（Ｆｃ領域）は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体のテール領域である。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２本の重鎖の第２及び第３の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片から構成される。

いくつかの実施形態において、使用されるＦｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４などのＩｇＧのＦｃ断片である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ断片は、ＣＨ２及びＣＨ３領域の他にＣＨ１領域をさらに含む。例となるＦｃ断片配列は、表２４、配列番号４６において提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３４～３６又は４５などのシグナルペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片の１本の鎖のみがｆＸａ誘導体に融合される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ断片の両方の鎖がｆＸａ誘導体に融合される。

用語「フューリン」又は「対塩基性アミノ酸切断酵素」は、本明細書において使用されるように、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２５６０（ヒト）、ＮＰ＿００１０７４９２３（マウス）又はＮＰ＿０６２２０４（ラット）の代表的なフューリン配列のいずれかと実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。フューリンをコードする適したｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２５６９（ヒト）、ＮＭ＿００１０８１４５４（マウス）又はＮＭ＿０１９３３１（ラット）で提供される。特定の態様において、フューリンは、ヒトフューリンを指す。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、ヒトの血液中に見出される血清アルブミンである。ＨＳＡは、血清タンパク質の約半分を構成する。ＨＳＡは、肝臓で産生され、水に可溶性である。アルブミンは、他の機能の中でも、ホルモン、脂肪酸及び他の化合物を運搬し、ｐＨを調節し、膠質浸透圧を維持する。アルブミンは、プレプロアルブミンとして肝臓で合成され、これは、新生タンパク質が粗面小胞体から放出される前に除去されるＮ末端ペプチドを有する。この産物、プロアルブミンは、次に、ゴルジ小胞中で切断され、分泌型アルブミンを産生する。ＨＳＡは、天然型配列を有するか、又は本明細書において試験されるように、天然型ＨＳＡ中の遊離システインを除去するために単一のＣｙｓ３４Ｓｅｒ突然変異（配列番号１５）を有することができる。

ＡＰは、活性化ペプチドを含むタンパク質断片を示す。「活性化ペプチド」は、タンパク質に共有結合又は非共有結合で付加され、活性化ペプチドが除去されるまでそのタンパク質を不活性な状態に維持するペプチドである。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、４つ以上のグリコシル化部位を含む。Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＴｈｒなどのアミノ酸残基は、適したグリコシル化部位であることが知られている。いくつかの実施形態において、ＡＰは、長さが１０～１００アミノ酸残基（又は代わりに長さが１０～８０、１５～７０、２０～６０又は１０～５０アミノ酸残基）であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０グリコシル化部位を含む。

活性化ペプチドは、第ＩＸ因子（ｆＩＸ）、第Ｘ因子（ｆＸ）、第ＸＩＩＩ因子（ｆＸＩＩＩＩ）、第ＩＩ因子（プロトロンビン）及びプロテインＣの前駆体などの野生型タンパク質中に存在する。それらのそれぞれの配列を表６に示す。

いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０のアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１２、３１、３２、３３、３９若しくは４０に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号１２に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号１２に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号３１に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号３２に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号３３に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号３９に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、配列番号４０に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、１、２又は３つのアミノ酸追加、欠失及び／又は置換を有する、配列番号４０に由来するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、活性化ペプチドは、長さが１０～１００アミノ酸残基（又は代わりに長さが１０～８０、１５～７０、２０～６０又は１０～５０アミノ酸残基）であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０グリコシル化部位を含む。

いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、フューリンであるが、他のプロテアーゼ、例えばＰＣ５などの他のプロタンパク質コンベルターゼ又はＦＸａ及びトロンビンなどの凝固酵素も本開示の範囲内にある。フューリンに適したペプチドリンカーの例は、－ＲＫＲ－及び－ＲＫＲＲＫＲ－（配列番号７）を含む。

述べられるように、いくつかの実施形態において、Ｌ２は、不在（ヌル）である。いくつかの実施形態において、Ｌ２は、長さが１～５０（又は１～４０、１～３０、１～２５、１～２０、５～４０、１０～３０、１５～３５）アミノ酸残基のペプチドリンカーである。ペプチドリンカーは、好ましくは、可動性であり、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％のＧｌｙ及び／又はＳｅｒを有するものなどである。

産生された２本鎖ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、ｆＸａ因子阻害剤をベースとする抗凝固治療に対する解毒薬として使用するのに適している。いくつかの実施形態において、２本鎖ポリペプチドは、ｆＸａが集まってプロトロンビナーゼ複合体になる際に競合することができないか、集まってプロトロンビン複合体になる低下した能力を有するか、又は集まってプロトロンビン複合体になることができない。集まってプロトロンビン複合体になるには、機能的なＧｌａドメインを必要とする。いくつかの実施形態において、ＬＣは、配列番号２のアミノ酸６～３９を含まないなど、Ｇｌａドメインの実質的な部分を含まない。いくつかの実施形態において、ＬＣは、配列番号２のアミノ酸１～４５を含まない。

いくつかの実施形態において、ＬＣは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、或いは配列番号６に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＬＣは、野生型ｆＸａの全軽鎖配列（すなわち配列番号３のアミノ酸残基１～１３９）或いは野生型ｆＸａの完全長軽鎖配列に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

産生された２本鎖ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、野生型ヒト第Ｘａ因子と比較して低下した触媒活性を有する。これは、例えば、重鎖における１つ以上の活性部位、例えばＨｉｓ２３６、Ａｓｐ２８２及びＳｅｒ３７９（配列番号２のアミノ酸２３６、２８２及び３７９）の突然変異によって達成することができる。

いくつかの実施形態において、ＨＣは、少なくとも、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、或いは配列番号１０に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣは、少なくとも、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、或いは配列番号１１に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＣは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、或いは配列番号７に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、ＨＣは、野生型ｆＸａの全重鎖配列（すなわち配列番号３のアミノ酸残基１４０～３９３）を含むか、或いは野生型ｆＸａの完全長重鎖配列に対して少なくとも８５％又は代わりに少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、タンパク質（又はＨＣ）は、重鎖の１３Ｃ末端アミノ酸残基（配列番号２の４３６～４４８）を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質（又はＨＣ）は、重鎖の１５Ｃ末端アミノ酸残基（配列番号２の４３４～４４８）を含まない。

タンパク質配列の非限定的な例は、配列番号２５及び２６を含む。

いくつかの実施形態において、シグナルペプチド（又はプロペプチドと組み合わせた）は、タンパク質のＮ末端部に含まれる。例となるシグナル／プロペプチドを表７に示す。

開示される前駆体タンパク質は、示される欠失を除いて、野生型ｆＸと同じアミノ酸残基を有することができる。好ましい実施形態において、配列番号４に示されるＳｅｒ３７９Ａｌａ置換などの特定のアミノ酸置換が導入され、ｆＸａ阻害剤に対して有効な解毒薬の産生を導く。いくつかの実施形態において、前駆体タンパク質は、Ｌ１及びＬ２が消化される場合、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能な２本鎖ポリペプチドを産生することが可能である。アミノ酸置換が導入される場合、いくつかの実施形態において、消化された２本鎖ポリペプチドは、ｆＸａが集まってプロトロンビナーゼ複合体になる際に競合することができないか、集まってプロトロンビン複合体になる低下した能力を有するか、若しくは集まってプロトロンビナーゼ複合体になることができず、且つ／又は野生型ヒト第Ｘａ因子と比較して低下した触媒活性を有する。

いくつかの実施形態において、本開示の前駆体タンパク質を処理することによって得ることができる２本鎖ポリペプチドも提供される。一実施形態において、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１３に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む軽鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するペプチドを含む第１の断片及び第１の断片のＣ末端側にあり、且つ活性化ペプチドを含む第２の断片を含む重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である２本鎖ポリペプチドが提供される。そのような２本鎖ポリペプチドの例を下記の表８及び９に提供する。

ポリヌクレオチド及び宿主細胞
本開示は、開示されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び１つ以上のポリペプチドを含有する宿主細胞も提供する。一態様において、ポリペプチドは、発現され、細胞表面に（細胞外に）存在する。本発明のポリペプチドを含有する適した細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、マウス細胞、ラット細胞、ヒツジ細胞、サル細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されない原核細胞及び真核細胞を含む。細菌細胞の例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ）及びストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｄｏｎｉｉ）を含む。細胞は、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＲｏｃｋｖｉｌｌｅＭａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）などの民間のベンダーから購入することができるか、又は当技術分野において知られている方法を使用して分離株から培養することができる。適した真核細胞の例は、２９３ＴＨＥＫ細胞並びにハムスター細胞株ＣＨＯ、ＢＨＫ－２１；ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｃ１２７と命名されたマウス細胞株、サル細胞株ＣＯＳ、Ｖｅｒｏ；並びにヒト細胞株ＨｅＬａ、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌから市販で入手可能）、Ｕ－９３７及びＨｅｐＧ２を含むが、これらに限定されない。昆虫細胞の非限定的な例は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）を含む。発現に有用な酵母の例は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属を含むが、これらに限定されない。米国特許第４，８１２，４０５号明細書；米国特許第４，８１８，７００号明細書；米国特許第４，９２９，５５５号明細書；米国特許第５，７３６，３８３号明細書；米国特許第５，９５５，３４９号明細書；米国特許第５，８８８，７６８号明細書及び米国特許第６，２５８，５５９号明細書を参照されたい。

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、フューリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドでさらにトランスフェクトされる。

種特異性に加えて、細胞は、ニューロンなどの任意の特定の組織型のもの又は代わりにニューロン細胞に分化することができるか若しくはできない幹細胞などの体性若しくは胚性幹細胞、例えば胚性幹細胞、脂肪幹細胞、ニューロン幹細胞及び血液幹細胞であり得る。幹細胞は、哺乳動物などのヒト又は動物を起源とするものであり得る。

本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに理解され、実施例は、本発明の純粋な例示であることが意図される。本発明は、例示される実施形態によって範囲を限定されるものではなく、実施形態は、本発明の単一の態様を例証するものにすぎないことが意図される。機能的に均等であるいかなる方法も本発明の範囲内にある。本発明の種々の修飾形態は、本明細書に記載される修飾形態に加えて、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾形態は、添付の特許請求の範囲内に入る。

実施例１．発現ベクターの調製
本実施例により、第Ｘａ因子阻害剤を中和するために使用することができる、アンデキサネットを含む第Ｘａ因子誘導体を産生するために使用することができる、前駆体タンパク質をコード化するポリヌクレオチド構築物を生成した。前駆体タンパク質配列は、表１０～２０に示され、図１に示され、Ｃ０１～Ｃ１１と称される。

アンデキサネットの前駆体（配列番号４）と比較して、Ｃ０１（配列番号１８）は、重鎖の２０Ｃ末端アミノ酸残基の欠失を含有した。同様に、Ｃ０２（配列番号１９）及びＣ０３（配列番号２０）は、それぞれ１３及び１５Ｃ末端アミノ酸残基の欠失を含有した。

Ｃ０３を基準として、第Ｘａ因子活性化ペプチド（ＡＰ）を前駆体Ｃ０４（配列番号２１）中に追加して戻した。野生型ｆＸと異なり、フューリンによる処理を促進するために、－ＲＫＲＲＫＲ－リンカーをＡＰと重鎖との間に置いた（野生型ｆＸと同様に、－ＲＫＲ－リンカーも軽鎖とＡＰとの間にあった）。Ｃ末端の切り詰めを有していないが、軽鎖のＮ末端１１アミノ酸が除去されたこの前駆体の別のバージョン、Ｃ０５（配列番号２２）も調製した。Ｎ末端１１アミノ酸の切り詰め及びＣ末端１５アミノ酸の切り詰めの両方を含有したさらに別の前駆体、Ｃ０６（配列番号２３）も調製した。Ｃ０７（配列番号２４）において、軽鎖とＡＰとの間の天然の－ＲＫＲ－リンカーを除去した。

前駆体Ｃ０８（配列番号２５）及びＣ０９（配列番号２６）において、ＡＰを重鎖のＣ末端側に置いた。ＡＰは、Ｃ０８では重鎖に直接に融合し、Ｃ０９では人工リンカー（－ＫＳＳ（ＧＳＳ）_９ＧＳＳ－、配列番号１４）を通して融合した。

前駆体Ｃ１０（配列番号２７）及びＣ１１（配列番号２８）において、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、配列番号１５）をＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合し、ＨＳＡは、天然型配列又は天然型ＨＳＡ中の遊離システインを除去するために単一のＣｙｓ３４Ｓｅｒ突然変異（配列番号１５）を有する配列を有し得る。Ｃ１０において、重鎖は、インタクトであり、Ｃ１１において、重鎖は、Ｃ末端に１５アミノ酸の切り詰めを有した。

これらの前駆体タンパク質（適したシグナルペプチドを有する）をコード化するポリヌクレオチドを新規に合成した。これらのポリヌクレオチド配列の検証後、ポリヌクレオチド配列を、哺乳動物宿主細胞へのトランスフェクションに適した発現ベクターにライゲーションした。例となる発現ベクターは、ＡＢ１ベクターであった。使用した別の発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．３ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。

発現ベクターは、宿主細胞ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－Ｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＧ４４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又はＣＨＯ－Ｍにトランスフェクトした。トランスフェクションは、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯトランスフェクションキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）又は試薬及びエレクトロポレーター（Ｍａｘｃｙｔｅ）によるエレクトロポレーションを使用して、製品の推奨に従って実行した。

トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を振盪フラスコ中で培養し、経時的なタンパク質発現をモニターした。タンパク質発現は、安定した細胞選択のために抗生物質をあらかじめ使用することなく一時的にモニターした。タンパク質発現は、安定したＣＨＯ細胞プールを使用してさらにモニターした。安定したプールを増殖させ、細胞バンクを調製し、液体窒素中に保存した。安定したプールによるタンパク質発現は、細胞バンクのバイアルを解凍することにより、一過性発現と同様に進めた。

ｆＸａ誘導体の重鎖及び軽鎖を接続するリンカーの処理を改善するために、ヒトフューリンタンパク質をコードする第２のポリヌクレオチド配列を特定のサンプル中に同時にトランスフェクトした。フューリン構築物は、別々のベクターを使用して導入した。安定した細胞産生のため、安定した細胞プールは、安定したプール（親プール）を生成するために、ｆＸａ誘導体及びＧ－４１８を有するｐｃＤＮＡ３．３を使用して最初に選択した（０～１５００μｇ／ｍＬ）。親プールは、フューリンを有する第２のベクターでさらにトランスフェクトした（スーパートランスフェクション）。スーパートランスフェクトしたプールは、抗生物質を使用してさらに選択し、細胞バンクのために調製する。

細胞培養中のタンパク質発現レベルは、ＥＬＩＳＡ（ＦＸ－ＥＩＡ、ＥｎｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって測定し、ＦＸ／ＦＸａ重鎖及び軽鎖に対するモノクローナル抗体を使用してウエスタンブロットによって特徴付けた。アンデキサネットは、標準曲線を作成するために使用した。収集した細胞培養液中のタンパク質は、機能的なタンパク質を捕えるためにＳＴＩ－樹脂を使用するアフィニティーベースの方法によって精製した。

実施例２．発現レベル及び活性の試験
本実施例は、実施例１において調製したｆＸａ誘導体の発現レベル及び活性について試験した。

アンデキサネット（ＡｎＸａ）前駆体（配列番号４）及びＣ０１～Ｃ０３の発現及び機能的活性は、一過性トランスフェクション（フューリンによる同時トランスフェクション）において試験した。条件は、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅによる化学的トランスフェクション、続いて２４時間後、３７℃、８％ＣＯ_２、１３５ｒｐｍでエンハンサー及びフィードの追加を含む。結果を下記の表に示す。

これらの構築物の安定したプールを生成した。全細胞培養容積は、３０ｍＬであった。細胞は、生存率＞９７％に細胞が完全に回復するまで３日毎に継代した。力価についての条件は、以下の通りとした：３２℃、５％ＣＯ_２、１３５ｒｐｍ；１、４、７、１０日目にフィードの追加。結果を下記の表に示す。

以下の表は、細胞をフューリンでさらにトランスフェクトした場合の試験結果を示す。

結果は、一過性及び安定した発現において、Ｃ０１が低レベルの発現を有したが、Ｃ０２及びＣ０３がアンデキサネット前駆体と同様に機能することを示した。そのため、重鎖からの１３又は１５Ｃ末端残基の切り詰めは、タンパク質発現又は活性に影響を与えなかったが、２０末端残基の欠失は、有意な悪影響を有した。

Ｃ０１～Ｃ０３と比較して、Ｃ０４～Ｃ１１は、第Ｘ因子活性化ペプチド（ＡＰ）又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をさらに含んだ。野生型第Ｘ因子が活性化されると、ＡＰが除去される。アンデキサネットの産生において、ＡＰは、構築物の一部ではなかった。下記の結果に示されるように、ＡＰの包含は、タンパク質発現を有意に増加させた。さらに、ＡＰを重鎖のＣ末端部に融合した場合（軽鎖とは対照的に）、構築物は、最も機能的に活性な産物をもたらした（Ｃ０８及びＣ０９）。ＨＳＡへの融合も発現及び活性を増加させることにおいて有用であったが、影響は、ＡＰと比較してそれほど顕著ではなかった。

上記の結果に基づいて、Ｃ０５、Ｃ０７、Ｃ０８及びＣ１０をそれらの発現及び機能的活性についてさらに検討した。図２Ａ～２Ｄに示されるように、フューリンによる構築物の同時トランスフェクションは、ほとんどの場合に機能的なタンパク質の力価を増加させることを促進した。しかしながら、Ｃ０５、Ｃ０７、Ｃ０８及びＣ１０の中でも、Ｃ０８のみが高い発現レベル及び機能的活性の両方を保持した。

さらに、下記の表に示されるように、５％フューリンによるＣ０８の同時トランスフェクションは、ＥＬＩＳＡ及び機能的定量分析からの両方の計算値において最も高いピコグラム／細胞／日（ＰＣＤ）約１．９をもたらした。

実施例３．追加の構築物の調製及び試験
実施例２における試験結果に基づいて、本実施例は、配列を下記の表に提供する少数の追加の構築物を調製し、試験した。

これらの構築物のドメイン構造は、図１にも示される。Ｃ１２は、Ｃ０８と比較して、インタクトな重鎖及びＥＧＦ２と重鎖との間に挿入される追加のＡＰを有する。Ｃ１３は、Ｃ１０に類似しているが、Ｎ末端が切り詰められた軽鎖を有する。最後に、Ｃ１４は、Ｎ末端のＨＳＡ（Ｃ１４のように）及びＣ末端のＡＰ（Ｃ０８のように）の両方を含んだ。

これらの構築物の発現レベル及び活性は、コントロールとしてのアンデキサネット前駆体（ＡｎＸａ）、Ｃ１０及びＣ１２と共に測定した。結果を下記の表に示し、図３にプロットする。

軽鎖のＥＧＦ１ドメインに直接融合されたＨＳＡを有するＣ１３及び重鎖のＣ末端にＡＰドメインをさらに含むＣ１４は、最も高い発現及び活性を呈した。興味深いことに、Ｃ１０とＣ１３との間の唯一の差は、Ｃ１０がＧｌａ－ドメイン由来の特定のアミノ酸（Ａ１～Ｋ１１）をさらに含むことであったが、Ｃ１０の発現の方が著しく低く、ＨＳＡとＥＧＦ１ドメインと間の直接の融合が有益であることを示唆した。さらに、Ｃ１２の結果は、軽鎖と重鎖との間に追加のＡＰを追加することが必要ではないことを示唆する。

本実施例は、構築物において軽鎖のＮ末端にＨＳＡを融合させること及び重鎖のＣ末端にＡＰドメインを融合させることの利益をさらに実証するものである。

実施例４．Ｆｃ融合物の調製及び試験
本実施例は、Ｆｃ断片及びＦｃ断片とアンデキサネットなどの第Ｘａ因子誘導体との間の融合物について試験した。

２つの融合構築物は、表２５及び２６に示されるように調製し、表２４のＦｃ断片及び２つの異なるシグナルペプチドを含んだ。

これらの構築物の発現は、一過性トランスフェクションにおいて試験した。条件は、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅによる化学的トランスフェクション、続いて２４時間後、３７℃、８％ＣＯ_２、１３５ｒｐｍでエンハンサー及びフィードの追加を含む。下記の結果に示されるように、ｆＸａのシグナルペプチド（構築物Ｆ０１）は、融合タンパク質の発現を増加させることを促進した。

本発明は、上記の実施形態と共に記載されたが、前述の説明及び実施例は、本発明を例証するものであり、本発明の範囲を限定しないことが意図されることが理解されるべきである。本発明の範囲内にある他の態様、利点及び変更形態は、当業者に明らかであろう。

Claims

タンパク質であって、
ＨＳＡ－Ｌ２－ＬＣ－Ｌ１－ＨＣ（ＩＩ）
（式中、
ＨＳＡは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または前記ＨＳＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体であり、
Ｌ１は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーであり、
Ｌ２は、不在であるか、またはプロテアーゼによって処理され得ないペプチドリンカーであり、
ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む第Ｘａ因子の軽鎖を含み、
ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む第Ｘａ因子の重鎖を含む）
の式（ＩＩ）のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ１が前記プロテアーゼによって処理される場合、別々の鎖上に前記ＬＣ及び前記ＨＣを含む２本鎖ポリペプチドを産生することが可能であり、前記２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、タンパク質。
前記ＨＳＡは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
ＬＣは、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、請求項１に記載のタンパク質。
Ｌ２は、不在である、請求項３に記載のタンパク質。
前記プロテアーゼは、フューリンである、請求項３または４に記載のタンパク質。
前記Ｌ１は、ＲＫＲ又はＲＫＲＲＫＲ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のタンパク質。
前記ＨＣのＣ末端側に融合された活性化ペプチド（ＡＰ）をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記活性化ペプチドは、グリコシル化部位を含む、請求項７に記載のタンパク質。
前記活性化ペプチドは、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子もしくはプロテインＣの活性化ペプチドであるか、または第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＩＩ因子もしくはプロテインＣの活性化ペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項７または８に記載のタンパク質。
前記活性化ペプチドは、配列番号１２、３１、３２、３３、３９もしくは４０のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１２、３１、３２、３３、３９もしくは４０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のタンパク質。
前記ＬＣは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記産生された２本鎖ポリペプチドは、野生型ヒト第Ｘａ因子と比較して低下した触媒活性を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記ＨＣは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のタンパク質。
前記ＨＣは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載のタンパク質。
シグナルまたはシグナル／プロペプチドをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
前記シグナルまたはシグナル／プロペプチドは、配列番号３４～３７からなる群から選択される、請求項１５に記載のタンパク質。
配列番号４２のアミノ酸配列を含むタンパク質であって、配列番号４２のアミノ酸５８６～６７９が前記タンパク質のＬＣに対応し、配列番号４２のアミノ酸６８０～６８５が前記タンパク質のＬ１に対応し、配列番号４２のアミノ酸６８６～９３９が前記タンパク質のＨＣに対応する、タンパク質。
請求項１～１７のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１９に記載の細胞。
タンパク質を調製する方法であって、請求項１９または２０に記載の細胞を培養することと、培養物から２本鎖タンパク質を回収することとを含む、方法。
（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または前記ＨＳＡに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する変異体を含む第１の断片、および配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む第２の断片を含む第Ｘａ因子の軽鎖であって、前記第１の断片が前記第２の断片のＮ末端に融合されている、第Ｘａ因子の軽鎖と、
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を有するペプチドまたは配列番号１１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するペプチドを含む第Ｘａ因子の重鎖とを含む２本鎖ポリペプチドであって、
前記２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能であり、前記軽鎖は、配列番号２のアミノ酸残基１～４５を含まない、２本鎖ポリペプチド。
請求項１～１７のいずれか一項に記載のタンパク質をプロテアーゼで処理することを含む２本鎖ポリペプチドを産生する方法であって、前記プロテアーゼは、前記タンパク質の前記Ｌ１を処理して別々の鎖上に前記ＬＣおよびＨＣを含む前記２本鎖ポリペプチドを産生し、前記２本鎖ポリペプチドは、第Ｘａ因子阻害剤に結合することが可能である、方法。