JP7842447B2 - 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 - Google Patents
生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法Info
- Publication number
- JP7842447B2 JP7842447B2 JP2022051118A JP2022051118A JP7842447B2 JP 7842447 B2 JP7842447 B2 JP 7842447B2 JP 2022051118 A JP2022051118 A JP 2022051118A JP 2022051118 A JP2022051118 A JP 2022051118A JP 7842447 B2 JP7842447 B2 JP 7842447B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- antibody
- amino acid
- tissue staining
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法に関する。
抗体は、抗原に対する高い特異性と結合能を有するため、基礎研究において免疫染色法、ＥＬＩＳＡ法及びウェスタンブロット法等に利用される。抗体を利用する免疫染色法は、ヒト及び非ヒト動物の含む幅広い標本に適用でき、複数の標的を比較的容易に標識できるため、適用範囲が広い。組織の透明化及び３次元（３Ｄ）画像化の方法の開発によって、免疫染色法は、組織全体及び個体全体等を対象とする体系的な３Ｄ観察及び解析にも使用される。
厚みのある標本内部への抗体の浸透を向上させるための方法がいくつかある。例えば、固定した組織の細孔を拡げる透過処理が、脱脂処理、脱水処理、緩い固定処理及びプロテアーゼによる部分的な分解等で試みられている。また、電気泳動及び圧力等の物理的な方法がアクリルアミドに包埋された試料に適用されている。
抗体の抗原への親和性が高すぎると、標本表面付近の抗原への抗体の結合の偏りによって、標本内部へ抗体が浸透しにくい。特に、厚みのある標本の組織を免疫染色する場合、染色対象の複雑な物理化学的環境のために、抗体が組織内部にあまり浸透しないことがある。これに対し、抗体の抗原への親和性を低下させるために、高い温度で結合反応を行う場合がある。しかし、抗体の熱安定性の面から、温度で制御できる範囲は限定される。
また、抗体の結合性を阻害する変性剤、例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びクアドロール等を添加することがある。例えば、特許文献１には、所定の濃度の尿素と免疫染色用抗体とを含む抗体組成物を、生物材料に接触させる免疫染色法が開示されている。
また、非特許文献１及び２には、免疫染色法として、メタノール処理又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処理した試料を、グリシン及びＤＭＳＯ等を含む透過溶液でインキュベートし、ブロッキング処理を施してから、ヘパリン、ＤＭＳＯ及びロバ血清等を含む溶液中で一次抗体と反応させ、続いて二次抗体と反応させるｉＤＩＳＣＯ法が開示されている。
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｒｅｎｉｅｒ、外５名、「ｉＤＩＳＣＯ：ａ ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｌａｂｅｌ ｌａｒｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｖｏｌｕｍｅ ｉｍａｇｉｎｇ．」、Ｃｅｌｌ、２０１４年、１５９、８９６－９１０
Ｎｉｃｏｌａｓ Ｒｅｎｉｅｒ、外１５名、「Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｂｒａｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｖｏｌｕｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅｓ．」、Ｃｅｌｌ、２０１６年、１６５、１７８９－１８０２
上記特許文献１に開示された抗体組成物のような変性剤は、抗体によっては効果がなく、濃度依存性の違い等があり、条件の検討が煩雑である。上記非特許文献１及び２に開示されたｉＤＩＳＣＯ法等の抗体の浸透を改善するための方法でも、十分な浸透効率は未だに達成されていない。抗体を使用する際、抗体の抗原認識能力を最大限に発揮するためには、抗原における抗体結合部位（エピトープ）のアミノ酸配列を把握したうえで、科学的根拠に基づき最適な反応条件を決定することが重要である。
４００万個以上の市販の抗体が現存する中、ほとんどの抗体についてはエピトープの詳細な情報が判明していない。研究に適した抗体を選択するには、いくつもの抗体を試す必要があり、さらにその抗体の使用条件の検討に時間を要する。科学的根拠に基づく抗原抗体反応の条件が統一化されていないため、同じ抗原に抗体を結合させても、研究室によって染色結果が異なるという問題が生じている。
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、抗体を組織に十分に浸透させることができる生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法を提供することを目的とする。
本発明の第１の観点に係る生体組織染色試薬は、
抗体による免疫染色の対象である生体組織中の抗原におけるエピトープの第１のアミノ酸配列と少なくとも４個のアミノ酸が一致する第２のアミノ酸配列を有し、競合して前記抗体に結合するペプチドを含む。
抗体による免疫染色の対象である生体組織中の抗原におけるエピトープの第１のアミノ酸配列と少なくとも４個のアミノ酸が一致する第２のアミノ酸配列を有し、競合して前記抗体に結合するペプチドを含む。
前記第２のアミノ酸配列は、
前記第１のアミノ酸配列と５個以上のアミノ酸が一致する、
こととしてもよい。
前記第１のアミノ酸配列と５個以上のアミノ酸が一致する、
こととしてもよい。
本発明の第２の観点に係る生体組織染色キットは、
上記本発明の第１の観点に係る生体組織染色試薬と、
前記抗体と、
を備える。
上記本発明の第１の観点に係る生体組織染色試薬と、
前記抗体と、
を備える。
本発明の第３の観点に係る生体組織染色方法は、
上記本発明の第１の観点に係る生体組織染色試薬及び前記抗体に、前記生体組織を暴露する暴露ステップを含む。
上記本発明の第１の観点に係る生体組織染色試薬及び前記抗体に、前記生体組織を暴露する暴露ステップを含む。
本発明によれば、抗体を組織に十分に浸透させることができる。
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態によって限定されるものではない。なお、本明細書において特に示さない限り、“％”は質量％を意味する。
本実施の形態に係る生体組織染色試薬は、抗体による免疫染色の対象である生体組織中の抗原におけるエピトープのアミノ酸配列（第１のアミノ酸配列、以下、単に“エピトープ配列”ともいう）と少なくとも４個のアミノ酸が一致するアミノ酸配列（第２のアミノ酸配列）を有するペプチドを含む。
生体組織染色試薬による免疫染色の対象となる生体組織は、例えば、動物由来のサンプル又は植物由来のサンプルである。当該動物としては、魚類、両生類、爬虫類、鳥類及び哺乳類等の動物が挙げられる。生体組織としては哺乳類の生体組織が好ましい。哺乳類は特に限定されず、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、マーモセット、イヌ、ネコ、フェレット、ブタ、ウシ、ウマ、サル、チンパンジー及びヒト等が挙げられる。
生体組織は、生きているヒトを除く個体そのものであってもよいし、多細胞生物の個体から得られる器官、組織、細胞塊又は細胞であってもよい。好ましくは、生体組織は、例えば、脳全体又は大脳半球等の脳の一部である。
生体組織は、特に顕微鏡観察のために固定化処理されたサンプルであってもよい。好ましくは、生体組織は、ホルムアルデヒド（ＦＡ）又はパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）等を用いて公知の方法で固定化される。固定化処理後に、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に浸漬する処理を行うことが好ましい。
生体組織は、例えば、蛍光性化学物質を注入した生体組織、蛍光性化学物質で染色を行った生体組織、蛍光タンパク質を発現した細胞を移植した生体組織及び蛍光タンパク質を発現した遺伝子改変動物の生体組織等であってもよい。
抗原は、生体組織中に発現し、かつ抗体の結合対象となるタンパク質である。抗原のエピトープ配列はＸ線結晶構造解析、水素重水素交換質量分析及びペプチドアレイを利用したエピトープマッピング解析等で同定することができる。好適には、エピトープ配列は、ペプチドセレクション法で同定される。ペプチドセレクション法とは、ランダム配列を有するＤＮＡライブラリを転写及び翻訳することで構築されたペプチドライブラリから、標的に結合するペプチドだけを獲得し、そのペプチドをコードする塩基配列を同定するシステムである。このシステムの重要な特徴として、獲得するペプチドの遺伝子情報が、細胞、ファージ、リボソーム又はピューロマイシンを介して保存されるという点がある。保存された遺伝情報の転写、翻訳及び標的への結合と回収という一連の流れが繰り返されることにより、標的に強く結合するペプチドの遺伝情報のみに収束する。
ペプチドセレクション法として、例えば、細胞表面提示法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法及びｍＲＮＡディスプレイ法が挙げられる。細胞表面提示法は、細胞を介して産生されたペプチドを細胞の表面に提示させることで細胞内部に遺伝情報を保存する。ファージディスプレイ法は、微生物を宿主とするファージの表面にペプチドを提示させてファージＤＮＡに遺伝情報を保存する。無細胞タンパク質合成系を利用したリボソームディスプレイ法及びｍＲＮＡディスプレイ法では、それぞれリボソーム及びピューロマイシンを介して遺伝情報が保存される。
特に好ましいペプチドセレクション法は、ｍＲＮＡディスプレイ法である。ｍＲＮＡディスプレイ法の中でも、ＤＥＣＯＤＥ法（国際公開第２０１８／１６８９９９号）が特に好ましい。ＤＥＣＯＤＥ法では、（ｉ）ＤＮＡから転写反応によって、ＲＮＡ分子を取得する。当該ＤＮＡは、プロモーター領域及びプロモーター領域の下流にペプチドをコードする領域を含み、かつアンチセンス鎖の５’末端側に少なくとも１個の２’－修飾ヌクレオシド誘導体を含む。続いて、（ｉｉ）ＲＮＡの３’末端に、スプリントポリヌクレオチドを用いて、ピューロマイシン等のペプチド受容分子を結合する。そして、（ｉｉｉ）ペプチド受容分子が結合しているＲＮＡを翻訳することによって、ＲＮＡとＲＮＡにコードされているペプチドとがペプチド受容分子を介して連結しているＲＮＡとペプチドとの複合体を合成する。さらに、（ｉｖ）ＲＮＡとペプチドとの複合体から複合体を選抜する。
工程（ｉｖ）では、ペプチドを介して抗体に結合する複合体が選抜される。工程（ｉ）～（ｉｖ）を繰り返すことで、抗体に結合するペプチドをコードする遺伝子情報、すなわちＤＮＡをＤＮＡライブラリから濃縮できる。
ペプチドセレクション法で得られたＤＮＡの塩基配列がコードするアミノ酸配列が抗体に結合するエピトープ配列である。次世代シーケンサー等によって、ペプチドセレクションで得られたＤＮＡに関して、１万～数十億リード数、数百万～数億リード数、数十万～数千万リード数又は数十万～数百万リード数で塩基配列を決定することで、当該塩基配列がコードするアミノ酸配列が収集される。
本実施の形態に係る生体組織染色試薬に含まれるペプチドは、例えば、４～２５個、５～２２個、６～１７個、７～１６個、８～１５個又は１０～２２個のアミノ酸からなる。当該ペプチドは、エピトープ配列と完全一致のアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ペプチドのアミノ酸配列は、エピトープ配列と完全一致のアミノ酸配列からなる。
抗体による抗原認識は、約５個のアミノ酸に依存すると言われており、直鎖のアミノ酸配列の場合では１０個のアミノ酸程度に収まることが多い。そこで、本実施の形態に係る生体組織染色試薬に含まれるペプチドのアミノ酸配列は、ペプチドが抗体に結合する限り、エピトープ配列と完全一致でなくてもよい。例えば、ペプチドのアミノ酸配列は、エピトープ配列と少なくとも４個のアミノ酸が一致するアミノ酸配列を含んでもよい。また、当該ペプチドは、エピトープ配列と少なくとも４個のアミノ酸が一致するアミノ酸配列からなってもよい。ここで、“アミノ酸が一致する”とは、ペプチドのアミノ酸配列とエピトープ配列とを公知の方法でアライメントした場合に、アミノ酸の位置と種類とが一致することをいう。４個のアミノ酸は、アミノ酸配列において連続する４個のアミノ酸であってもよいし、連続しない４個のアミノ酸配列であってもよい。
好適には、ペプチドのアミノ酸配列は、エピトープ配列と５個以上のアミノ酸が一致する。５個以上のアミノ酸は、アミノ酸配列において連続する５個以上のアミノ酸であってもよいし、連続しない５個以上のアミノ酸配列であってもよい。例えば、ペプチドのアミノ酸配列は、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸がエピトープ配列のアミノ酸配列と一致する。
本実施の形態に係るペプチドは、そのアミノ酸配列に基づいて公知のペプチド合成法によって製造できる。ペプチド合成法としては、固相合成法及び液相合成法のいずれであってもよい。固相合成法及び液相合成法では、反応性カルボキシル基を有する原料と、反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ等の活性エステルを用いた方法、あるいはカルボジイミド等のカップリング剤を用いた方法等のペプチド合成において通常の方法により縮合させればよい。生成する縮合物が保護基を有する場合、当該保護基を除去することによってペプチドが得られる。
本実施の形態に係るペプチドは、修飾されてもよい。ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）はアミノ基（ＮＨ２－）であっても、アセチル基（ＣＨ３ＣＯ－）等の修飾を有してもよい。ペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）はカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）であっても、アミド基等の修飾を有してもよい。ペプチドのアミノ酸残基が、リン酸基及び糖鎖等の修飾を有してもよい。
本実施の形態に係るペプチドは、塩（酸付加塩又は塩基塩）であってもよい。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸及び過塩素酸等の無機塩、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸及びトリフルオロ酢酸等の有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム及びリチウム等のアルカリ金属塩、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
本実施の形態に係るペプチドは、溶媒和物であってもよい。溶媒和物としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール及びジメトキシエタン等の溶媒和物が挙げられる。なお、本実施の形態における“ペプチド”は、上記の修飾されたペプチド、ペプチドの塩及びペプチドの溶媒和物を包含する。すなわち、本実施の形態に係る生体組織染色試薬は、上述の修飾されたペプチド、ペプチドの塩又はペプチドの溶媒和物を含んでもよい。
ペプチドが抗体に結合するか否かは、ＥＬＩＳＡ（競合法）等の公知の方法で確認できる。競合法では、例えば、抗原に対して、当該抗原に結合する抗体とペプチドとを反応させて、未反応の抗体及びペプチドを除去し、抗体に結合する標識された二次抗体を反応させることで、抗原に結合した抗体を定量することができる。ペプチド非存在下で抗原に結合した抗体量と、ペプチド存在下で抗原に結合した抗体量とを比較することで、抗原に競合して抗体に結合したペプチドを定量することができる。
続いて、本実施の形態に係る生体組織染色試薬の使用方法として、生体組織染色試薬を使用する生体組織染色方法について説明する。当該生体組織染色方法は、本実施の形態に係る生体組織染色試薬及び上記抗体に、生体組織を暴露する暴露ステップを含む。暴露ステップは、上記生体組織染色試薬の存在下で組織を抗体に暴露する点を除いて、抗体を用いた従来の組織免疫染色において組織を抗体に暴露する際の条件と同様に行えばよい。
抗体は、例えば、免疫染色用抗体、又はハイブリドーマ培養上清、脾内免疫を行なった動物の腹水、抗血清、抗血漿若しくは鳥類の卵の漿液に由来する免疫グロブリンである。当該生体組織染色試薬は、蛍光色素等の色素で標識した一次抗体、又は一次抗体と色素で標識したＦａｂ断片抗体との複合体を使用する１ステップでの免疫染色に使用されるのが好ましい。抗体としては、例えば、下記実施例で使用された抗ＮｅｕＮ抗体及び抗ＴＨ抗体が挙げられる。抗体を標識する色素としては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）色素、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）及びＣｙ色素等の色素が挙げられる。
より具体的には、暴露ステップでは、固定した組織に所定の前処理を施し、抗体及び上記ペプチドを含む免疫染色バッファー中でインキュベートすればよい。インキュベートの温度は、特に限定されず２３～４０℃又は２８～３８℃である。抗体及びペプチドに組織を暴露する時間は組織内部まで抗体が浸透する時間であれば特に限定されず、１日～８週間、２日～７週間、３日～６週間、４日～５週間又は１～４週間である。
免疫染色バッファーにおける抗体及びペプチドの濃度は、抗原に対する抗体の親和性及び染色対象等に応じて適宜設定される。免疫染色バッファーにおけるペプチドの濃度は、例えば、１ｎＭ～１０μＭ、１０ｎＭ～１０μＭ又は１００ｎＭ～５μＭである。
本実施の形態に係る生体組織染色試薬によれば、ペプチドが抗原に競合して抗体に結合するため、抗体の抗原に対する親和性を制御することができる。抗体の抗原に対する親和性を抑えることで、組織の外側付近における抗原への抗体の結合を抑制して、抗体が組織内部に十分に浸透させることができる。
別の実施の形態では、上記生体組織染色試薬と、上記抗体と、を備える生体組織染色キットが提供される。当該生体組織染色キットは、抗体の非特異的結合を防止するために使用されるスキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィッシュゼラチン、ウマ血清、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びカゼイン等のブロッキング試薬を備えてもよい。また、当該生体組織染色キットは、抗体の生体組織への浸透を促進させる添加剤をさらに含んでもよい。例えば、添加剤は抗体の生体組織への浸透を促進させる化合物である。添加剤としては、例えば、尿素、尿素誘導体、芳香族アミン、脂肪族アミド類、ニコチンアミド類、スルファミド類、スルホン酸塩、アミノアルコール、アルコール、スルフィン酸類、チオ尿素類及びカルボン酸類等の化合物が挙げられる。
本実施の形態に係る生体組織染色試薬は、下記実施例に示すように、既存の３Ｄ透明化染色方法に組み込みが可能である。なお、本実施の形態に係る生体組織染色試薬及び生体組織染色方法は、３Ｄ染色はもちろんのこと、組織切片を染色する、いわゆる２Ｄ染色にも適用できる。
なお、上記生体組織染色キットは、取扱説明書又は指示書をさらに備えてもよい。取扱説明書又は指示書には、例えば、生体組織染色試薬の組成、上述の生体組織染色方法に係るプロトコルが記載される。また、上記の生体組織染色試薬は、上記の成分以外にｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、防腐剤及び組織の乾燥抑制剤等のその他の添加物を含んでもよい。当該添加物は、生体組織染色試薬とは別に生体組織染色キットに含まれていてもよい。
なお、生体組織染色キットは、成分等の特定の材料を内包する容器を備えた包装である。生体組織染色キットは、その複数の構成要素を同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。取扱説明書又は指示書は、紙又は磁気テープ、コンピュータで読み取り可能なディスク、テープ若しくはＣＤ－ＲＯＭ等の電子媒体等の記録媒体に記録されてもよい。生体組織染色キットは、希釈剤、溶媒、洗浄液又はその他の試薬を内包した容器を備えていてもよい。さらに、生体組織染色キットは、キットの用途を実現するための手順を実行するために必要な器具及び試薬を備えていてもよい。
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって限定されるものではない。
試験例１：抗ＮｅｕＮ抗体に対するエピトープペプチドによる競合阻害
抗ＮｅｕＮ抗体（クローン名Ａ６０）のエピトープを決定するために次のようにＤＥＣＯＤＥ法を実施した。抗体の抗原認識は、約５アミノ酸と言われており、直鎖のアミノ酸配列の場合、１０アミノ酸程度に収まることが多いため、１２アミノ酸がランダム化されるように、テンプレートＤＮＡライブラリを作成した。なお、コドンをＮＮＫ（Ｇ／Ｔ）とランダム化し、ＤＮＡテンプレートではランダムシーケンス中に終止コドンがＵＡＧ（Ａｍｂｅｒ）のみとなるよう設計した。セレクションの１ラウンド目におけるライブラリサイズが１．５×１０１３となるよう、５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ中に、０．０５μＭのテンプレートＤＮＡライブラリが含まれるよう調製した。テンプレートＤＮＡの塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(NNK)nTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACCで、ｎ＝１２とした。なお、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかであって、ＫはＴ又はＧである。ｎ＝１でＫがＴの場合のテンプレートＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
抗ＮｅｕＮ抗体（クローン名Ａ６０）のエピトープを決定するために次のようにＤＥＣＯＤＥ法を実施した。抗体の抗原認識は、約５アミノ酸と言われており、直鎖のアミノ酸配列の場合、１０アミノ酸程度に収まることが多いため、１２アミノ酸がランダム化されるように、テンプレートＤＮＡライブラリを作成した。なお、コドンをＮＮＫ（Ｇ／Ｔ）とランダム化し、ＤＮＡテンプレートではランダムシーケンス中に終止コドンがＵＡＧ（Ａｍｂｅｒ）のみとなるよう設計した。セレクションの１ラウンド目におけるライブラリサイズが１．５×１０１３となるよう、５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ中に、０．０５μＭのテンプレートＤＮＡライブラリが含まれるよう調製した。テンプレートＤＮＡの塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG(NNK)nTGCGGCAGCGGCAGCGGCAGCTACTTTGATCCGCCGACCで、ｎ＝１２とした。なお、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣのいずれかであって、ＫはＴ又はＧである。ｎ＝１でＫがＴの場合のテンプレートＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。
（テンプレートＤＮＡの増幅）
表１に示す５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、テンプレートＤＮＡライブラリを増幅させた。調製したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃（１０秒間）、５８℃（１０秒間）、７５℃（３０秒間）の温度変化を４サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。なお、フォワードプライマー（Ｐ１）の塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG（配列番号２）である。リバースプライマー（Ｐ２（抗原）ＯＭｅ）の塩基配列は、ggTCGGCGGATCAAAGTAG（配列番号３）である。
表１に示す５００μＬスケールのＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、テンプレートＤＮＡライブラリを増幅させた。調製したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃（１０秒間）、５８℃（１０秒間）、７５℃（３０秒間）の温度変化を４サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。なお、フォワードプライマー（Ｐ１）の塩基配列は、CCTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATG（配列番号２）である。リバースプライマー（Ｐ２（抗原）ＯＭｅ）の塩基配列は、ggTCGGCGGATCAAAGTAG（配列番号３）である。
（テンプレートＤＮＡライブラリの転写及びＰｕ－ＤＮＡの連結）
５００μＬのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファーと５００μＬのテンプレートＤＮＡとを混合し、１０００μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５μＬ）で転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファー（ＴＣ ｍｉｘ）の組成は、終濃度４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓである。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で４０分間、転写反応させた後、７２℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを失活させた。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリが産生されたことを確認した。
５００μＬのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファーと５００μＬのテンプレートＤＮＡとを混合し、１０００μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（５μＬ）で転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ用バッファー（ＴＣ ｍｉｘ）の組成は、終濃度４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、５ｍＭ ＤＴＴ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓである。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で４０分間、転写反応させた後、７２℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを失活させた。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリが産生されたことを確認した。
続いて、終濃度５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＡＴＰのバッファー条件下で、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔを５μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ（5’-[PHO]CTCCCGCCCCCCGTCC[SpC18]5CC[Puromycin]、５’末端からスペーサーまでの塩基配列を配列番号４に示す）、５μＭ スプリントＤＮＡ（5’-GGGCGGGAGGGTCGGCGGATCAA（配列番号５））と混合し、５００μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅとした。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、７５℃で３０秒間放置し、一定勾配１℃／１５秒間で２５℃まで温度を下げてｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ 、Ｓｐｌｉｎｔ ＤＮＡの三者をアニーリングした。そこへ、３５ＵのＴ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間、連結反応を促進させた後、４℃で放置した。得られた転写産物を７Ｍ 尿素を含む１０％アクリルアミドゲルで電気泳動（１８０Ｖ、４０分間）し、ｍＲＮＡライブラリがＰｕ－ＤＮＡと連結したことを確認した。得られたＰｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを、ＲＮＡ精製試薬キットＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製し、濃度を決定した。
（カスタムＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍによる無細胞翻訳）
Ｐｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを無細胞翻訳系（ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）により翻訳し、ペプチドライブラリを獲得した。２．４μＬの０．６μＭ ｌｉｇａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ、０．５μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ、６μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ及び３μＬのＳｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて１１．９μＬのＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。ＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間反応させた。
Ｐｕ－ＤＮＡ連結ｍＲＮＡライブラリを無細胞翻訳系（ＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ）により翻訳し、ペプチドライブラリを獲得した。２．４μＬの０．６μＭ ｌｉｇａｔｅｄ ｓａｍｐｌｅ、０．５μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ、６μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ａ及び３μＬのＳｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒを加えて１１．９μＬのＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。ＰＵＲＥ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間反応させた。
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂの組成を表２に示す。なお、Ｓｔｏｃｋ ｂｕｆｆｅｒの組成は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ及び３０％グリセロールである。
ｆａｃｔｏｒ ｍｉｘの組成を表３に示す。
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ａの組成を表４に示す。
ＮＴＰ ｃｒａｔｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｉｘｔｕｒｅの組成を表５に示す。
ＰＵＲＥ ｂｕｆｆｅｒの組成を表６に示す。
（抗体固定化ビーズの調製）
抗体はｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁気ビーズに固定化させた。ビーズは使用前に５００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０（商標））で洗浄した。ビーズ ２．５μＬに対して、抗体を１μＬ加え、３０分間振とうしてビーズと抗体とを結合させた。
抗体はｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁気ビーズに固定化させた。ビーズは使用前に５００μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０（商標））で洗浄した。ビーズ ２．５μＬに対して、抗体を１μＬ加え、３０分間振とうしてビーズと抗体とを結合させた。
（抗体固定化ビーズへのペプチドライブラリの結合反応）
抗体固定化ビーズに対して、翻訳後産物１１．９μＬとｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５μＬを加え、３０分間振とうして、ペプチドライブラリを抗体固定化ビーズに結合させた（ポジティブセレクション）。上清を除いてビーズを回収し、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１０回洗って抗体に特異的に結合するペプチドライブラリを得た。
抗体固定化ビーズに対して、翻訳後産物１１．９μＬとｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び１０ｍＭ ＥＤＴＡ）２５μＬを加え、３０分間振とうして、ペプチドライブラリを抗体固定化ビーズに結合させた（ポジティブセレクション）。上清を除いてビーズを回収し、ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒで１０回洗って抗体に特異的に結合するペプチドライブラリを得た。
（逆転写）
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁気ビーズ上に存在するｍＲＮＡをＰｒｏｔｏ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅにより逆転写しｃＤＮＡとした。最終的に４４．５μＬスケールの逆転写反応となるように、ビーズに対し、４０μＬのＲＴ ｍｉｘ、４．２５μＬのＲＴ（－）（５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び７５ｍＭ ＫＣｌ）及び０．２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩを混合し、３７℃で４０分間、逆転写反応をさせた。ＲＴ ｍｉｘは、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．２μＭ ＲＴ－Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐ２＿ｖｅｒ２、GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号６））を含むＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ｂｕｆｆｅｒである。
ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ磁気ビーズ上に存在するｍＲＮＡをＰｒｏｔｏ ＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅにより逆転写しｃＤＮＡとした。最終的に４４．５μＬスケールの逆転写反応となるように、ビーズに対し、４０μＬのＲＴ ｍｉｘ、４．２５μＬのＲＴ（－）（５０ｍＭ ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び７５ｍＭ ＫＣｌ）及び０．２５μＬのＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩを混合し、３７℃で４０分間、逆転写反応をさせた。ＲＴ ｍｉｘは、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１０ｍＭ ＤＴＴ及び０．２μＭ ＲＴ－Ｐｒｉｍｅｒ（Ｐ２＿ｖｅｒ２、GGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号６））を含むＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ｂｕｆｆｅｒである。
（溶出）
リン酸バッファー１０μＬにて、抗体を固定化した磁気ビーズを９５℃で３分間保持し、ペプチドライブラリを抽出した。溶出後上清を回収し、２０μＬのｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒでビーズを洗って、その上清をさらに回収した。
リン酸バッファー１０μＬにて、抗体を固定化した磁気ビーズを９５℃で３分間保持し、ペプチドライブラリを抽出した。溶出後上清を回収し、２０μＬのｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒでビーズを洗って、その上清をさらに回収した。
（ｑＰＣＲによる回収されたｃＤＮＡ量の定量）
回収されたペプチドに連結したｃＤＮＡを、ｑＰＣＲで定量し、次のラウンドにおけるＰＣＲ増幅の最適なサイクルを決定した。表７に示すｑＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを３８４ウェルの各ウェルに７μＬ分注し、０．５μＬのｃＤＮＡを各ウェルに添加した。プレートを９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で１分間の後、９５℃（１０秒間）及び６０℃（３０秒間）の２ステップを４０サイクル繰り返して反応させ、ｃＤＮＡを増幅した。リバースプライマー（Ｐ２（抗原））の塩基配列はGGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号７）である。
回収されたペプチドに連結したｃＤＮＡを、ｑＰＣＲで定量し、次のラウンドにおけるＰＣＲ増幅の最適なサイクルを決定した。表７に示すｑＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅを３８４ウェルの各ウェルに７μＬ分注し、０．５μＬのｃＤＮＡを各ウェルに添加した。プレートを９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃で１分間の後、９５℃（１０秒間）及び６０℃（３０秒間）の２ステップを４０サイクル繰り返して反応させ、ｃＤＮＡを増幅した。リバースプライマー（Ｐ２（抗原））の塩基配列はGGTCGGCGGATCAAAGTAGCTGCCGCTGCCGCTGCCGCA（配列番号７）である。
（回収されたＤＮＡのＰＣＲによる増幅）
表８に示すＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅに増幅したテンプレートＤＮＡ２０μＬを添加し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｃＤＮＡライブラリを増幅させた。調整したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにおいて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、５８℃、７５℃の温度変化をｑＰＣＲで決定したサイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。１％アガロースゲルで泳動して増幅を確認することで、最適サイクル数（Ｎ）を決定した。決定したＰＣＲ条件で増幅したテンプレートＤＮＡライブラリを１％アガロースゲルで泳動して確認した。十分な増幅を確認後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製した。
表８に示すＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅに増幅したテンプレートＤＮＡ２０μＬを添加し、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによりｃＤＮＡライブラリを増幅させた。調整したＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅをサーマルサイクラーにおいて９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、５８℃、７５℃の温度変化をｑＰＣＲで決定したサイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅した。１％アガロースゲルで泳動して増幅を確認することで、最適サイクル数（Ｎ）を決定した。決定したＰＣＲ条件で増幅したテンプレートＤＮＡライブラリを１％アガロースゲルで泳動して確認した。十分な増幅を確認後、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ（商標） ＸＰで精製した。
（２ラウンド目の転写）
１０μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリ０．１μＭを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅには５ｍＭ ＮＴＰｓ、５μＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＭｇＣｌ２を加えた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間、転写反応させた後、７５℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを失活させた。
１０μＬスケールのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製し、増幅したＤＮＡライブラリ０．１μＭを５０ｍＵ／ｕＬ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写した。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅには５ｍＭ ＮＴＰｓ、５μＭ ＤＴＴ、２０μＭ ＭｇＣｌ２を加えた。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを３７℃で１時間、転写反応させた後、７５℃で５分間放置し、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを失活させた。
（２ラウンド目のｍＲＮＡとＰｕ－ＤＮＡ連結）
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ産物５μＭに１ｍＭ ＡＴＰｓ、１０μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ、１０μＭ スプリントＤＮＡを混合し、１×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ で８μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、一定勾配で１５分間かけて２５℃まで温度を下げ、ｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ及びＳｐｌｉｔ ＤＮＡをアニーリングした。Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間反応させた。
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ産物５μＭに１ｍＭ ＡＴＰｓ、１０μＭ Ｐｕ－ＤＮＡ、１０μＭ スプリントＤＮＡを混合し、１×ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ で８μＬスケールのＬｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを調製した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを９５℃で１分間温めた後、一定勾配で１５分間かけて２５℃まで温度を下げ、ｍＲＮＡ、Ｐｕ－ＤＮＡ及びＳｐｌｉｔ ＤＮＡをアニーリングした。Ｔ４ ｌｉｇａｓｅを加え、３７℃で１時間反応させた。
抗ＮｅｕＮ抗体（クローン名Ａ６０）を上記のビーズに固定化して、ＤＥＣＯＤＥ法を実行した。ＤＥＣＯＤＥ法でスクリーニングしたペプチドのｃＤＮＡについて、次世代シーケンサーであるＨｉＳｅｑ３０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）で１抗体につき１００万リードほど塩基配列を決定した。得られた塩基配列をアミノ酸に変換して、マウス及びヒトの全タンパク質データベース（ＵｎｉＰｒｏｔから取得）と照合して特異的なアミノ酸配列についてクラスタリングを行い、モチーフを作成した。置換スコア関数にはＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを用いた。ただし、本研究では進化的なアミノ酸置換の生じにくさを考慮しないため、負の値は０とした行列を使った。
抗ＮｅｕＮ抗体について得られたモチーフは、ＮｅｕＮの一部に一致していた。抗ＮｅｕＮ抗体が結合するエピトープを含むアミノ酸配列をQPYPPAQYPPP（配列番号８）に決定した。
抗ＮｅｕＮ抗体に対するＤＥＣＯＤＥ法で決定したエピトープペプチドの競合阻害を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１２週齢、オス）の脳破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＮｅｕＮ抗体（５ｎＭ）とペプチドとを混合した液を入れた。当該ペプチドは、ＤＥＣＯＤＥ法で決定した配列番号８にアミノ酸配列が示されるペプチド（以下“ＮｅｕＮ抗原ペプチド”とする）又は抗原ペプチドの連続する２アミノ酸をアラニンに置換した配列番号９に示すアミノ酸配列（QPYAAAQYPPP）からなるペプチド（以下“ＮｅｕＮ変異ペプチド”とする）である。ＮｅｕＮ抗原ペプチド及びＮｅｕＮ変異ペプチドは、１０２４ｎＭから１／２倍ずつ段階希釈してサンプルを調製した。
ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した後、ＨＲＰが結合した２次抗体を加えた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）を含むＰＢＳで１２回洗浄した後、各ウェルに基質を加えて発色させ、１Ｍ硫酸で反応を止め、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
（結果）
ＮｅｕＮ抗原ペプチド又はＮｅｕＮ変異ペプチド存在下での吸光度を図１に示す。ＮｅｕＮ抗原ペプチドは濃度依存的に抗ＮｅｕＮ抗体に結合して、抗ＮｅｕＮ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
ＮｅｕＮ抗原ペプチド又はＮｅｕＮ変異ペプチド存在下での吸光度を図１に示す。ＮｅｕＮ抗原ペプチドは濃度依存的に抗ＮｅｕＮ抗体に結合して、抗ＮｅｕＮ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
試験例２：抗ＮｅｕＮ抗体に対する置換ペプチドによる競合阻害
エピトープペプチドによる阻害に影響するアミノ酸配列上の位置を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１２週齢、オス）の脳破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＮｅｕＮ抗体（６．７ｎＭ）と５００ｎＭから１／５倍ずつ段階希釈したＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチドとを混合した液を入れた。ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドは、抗ＮｅｕＮ抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列を含むＮｅｕＮのアミノ酸配列の一部である。ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＮｅｕＮに係るアラニン置換ペプチドとは、ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列のいずれか１アミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された、配列番号１１～２４にアミノ酸配列が示されるペプチドである。なお、ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド及びＮｅｕＮに係るアラニン置換ペプチドのＮ末端はいずれもビオチンで修飾されている。
エピトープペプチドによる阻害に影響するアミノ酸配列上の位置を検討した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウス（１２週齢、オス）の脳破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＮｅｕＮ抗体（６．７ｎＭ）と５００ｎＭから１／５倍ずつ段階希釈したＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチドとを混合した液を入れた。ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドは、抗ＮｅｕＮ抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列を含むＮｅｕＮのアミノ酸配列の一部である。ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。ＮｅｕＮに係るアラニン置換ペプチドとは、ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列のいずれか１アミノ酸がアラニン又はグリシンに置換された、配列番号１１～２４にアミノ酸配列が示されるペプチドである。なお、ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド及びＮｅｕＮに係るアラニン置換ペプチドのＮ末端はいずれもビオチンで修飾されている。
ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）を含むＰＢＳで４回洗浄した後、ＨＲＰが結合した２次抗体を加えた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（商標）を含むＰＢＳで１２回洗浄した後、各ウェルに基質を加えて発色させ、１Ｍ硫酸で反応を止め、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
（結果）
ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチド存在下での吸光度を図２に示す。１個のアミノ酸置換を有するアラニン置換ペプチドでも濃度依存的に抗ＮｅｕＮ抗体に結合して、抗ＮｅｕＮ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
ＮｅｕＮ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチド存在下での吸光度を図２に示す。１個のアミノ酸置換を有するアラニン置換ペプチドでも濃度依存的に抗ＮｅｕＮ抗体に結合して、抗ＮｅｕＮ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
試験例３：抗ＴＨ抗体に対するエピトープペプチドによる競合阻害
抗ＮｅｕＮ抗体に代えて抗ＴＨ抗体（クローン名ＥＰ１５３２Ｙ）を上記のビーズに固定化して、上述のＤＥＣＯＤＥ法を実行した。
抗ＮｅｕＮ抗体に代えて抗ＴＨ抗体（クローン名ＥＰ１５３２Ｙ）を上記のビーズに固定化して、上述のＤＥＣＯＤＥ法を実行した。
抗ＴＨ抗体について得られたモチーフは、ＴＨの一部に一致していた。抗ＴＨ抗体が結合するエピトープを含むアミノ酸配列をSPHTIRRSLEGVQDEL（配列番号２５）に決定した。
抗ＴＨ抗体に対するＤＥＣＯＤＥ法で決定したエピトープペプチドの競合阻害を検討した。ＧＳＴタグが付加されたＴＨを発現させた大腸菌の破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＴＨ抗体（５ｎＭ）とペプチド２種とを混合した液を入れた。ペプチド２種とは、ＤＥＣＯＤＥ法で決定した配列番号２５にアミノ酸配列を示すペプチド（以下“ＴＨ抗原ペプチド”とする）と、抗原ペプチドの連続する２アミノ酸をアラニンに置換した配列番号２６に示すアミノ酸配列（SPHTIRRSLAAVQDEL）からなるペプチド（以下“ＴＨ変異ペプチド”とする）である。ＴＨ抗原ペプチド及びＴＨ変異ペプチドは、１０２４ｎＭから１／２倍ずつ段階希釈してサンプルを調製した。以降は、試験例１と同様に２次抗体及び基質を各ウェルに加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
（結果）
ＴＨ抗原ペプチド又はＴＨ変異ペプチド存在下での吸光度を図３に示す。ＴＨ抗原ペプチドは濃度依存的に抗ＴＨ抗体に結合して、抗ＴＨ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
ＴＨ抗原ペプチド又はＴＨ変異ペプチド存在下での吸光度を図３に示す。ＴＨ抗原ペプチドは濃度依存的に抗ＴＨ抗体に結合して、抗ＴＨ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。
試験例４：抗ＴＨ抗体に対する変異ペプチドによる競合阻害
エピトープペプチドによる阻害に影響するアミノ酸配列上の位置を検討した。ＧＳＴタグが付加されたＴＨを発現させた大腸菌の破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＴＨ抗体（５ｎＭ）と６２５ｎＭから１／５倍ずつ段階希釈したＴＨ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチドとを混合した液を入れた。ＴＨ＿ＷＴペプチドは、抗ＴＨ抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列を含むＴＨのアミノ酸配列の一部である。ＴＨ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。ＴＨに係るアラニン置換ペプチドとは、ＴＨ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列のいずれか１アミノ酸がアラニンに置換された、配列番号２８～４１にアミノ酸配列が示されるペプチドである。なお、ＴＨ＿ＷＴペプチド及びＴＨに係るアラニン置換ペプチドのＮ末端はいずれもビオチンで修飾されている。以降は、試験例２と同様に２次抗体及び基質を各ウェルに加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
エピトープペプチドによる阻害に影響するアミノ酸配列上の位置を検討した。ＧＳＴタグが付加されたＴＨを発現させた大腸菌の破砕液を固定した後ブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに、抗ＴＨ抗体（５ｎＭ）と６２５ｎＭから１／５倍ずつ段階希釈したＴＨ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチドとを混合した液を入れた。ＴＨ＿ＷＴペプチドは、抗ＴＨ抗体が結合するエピトープのアミノ酸配列を含むＴＨのアミノ酸配列の一部である。ＴＨ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列を配列番号２７に示す。ＴＨに係るアラニン置換ペプチドとは、ＴＨ＿ＷＴペプチドのアミノ酸配列のいずれか１アミノ酸がアラニンに置換された、配列番号２８～４１にアミノ酸配列が示されるペプチドである。なお、ＴＨ＿ＷＴペプチド及びＴＨに係るアラニン置換ペプチドのＮ末端はいずれもビオチンで修飾されている。以降は、試験例２と同様に２次抗体及び基質を各ウェルに加え、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。
（結果）
ＴＨ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチド存在下での吸光度を図４に示す。１個のアミノ酸置換を有するアラニン置換ペプチドでも濃度依存的に抗ＴＨ抗体に結合して、抗ＴＨ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。特定の位置のアミノ酸の置換によって、アラニン置換ペプチドの抗ＴＨ抗体への結合親和性が低下した。
ＴＨ＿ＷＴペプチド又はアラニン置換ペプチド存在下での吸光度を図４に示す。１個のアミノ酸置換を有するアラニン置換ペプチドでも濃度依存的に抗ＴＨ抗体に結合して、抗ＴＨ抗体の抗原への結合を阻害することが示された。特定の位置のアミノ酸の置換によって、アラニン置換ペプチドの抗ＴＨ抗体への結合親和性が低下した。
以下の実施例で使用する脱脂処理、染色剤染色用緩衝液及び免疫染色用緩衝液の組成を以下に示す。
ＣＵＢＩＣ－Ｌ：
１０質量％ Ｎ－ブチルジエタノールアミン（東京化成工業社製 ＃Ｂ０７２５）
１０質量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク社製 ＃１２９６７－４５）
超純水
免疫染色バッファー：
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製 ＃１７５１４－１５）
０．５Ｍ ＮａＣｌ（ナカライテスク社製 ＃３１３１９－４５）
１０質量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク社製 ＃１２９６７－４５）
０．５％ ＮａＮ３(和光純薬社製 ＃１９７－１１０９１)
ＣＵＢＩＣ－Ｒ：
４５質量％ アンチピリン（東京化成工業社製 ＃Ｂ１８７６）
３０質量％ ニコチンアミド（東京化成工業社製 ＃Ｎ００７８）
１質量％ Ｎ－ブチルジエタノールアミン（東京化成工業社製 ＃Ｂ０７２５）
超純水
ＣＵＢＩＣ－Ｌ：
１０質量％ Ｎ－ブチルジエタノールアミン（東京化成工業社製 ＃Ｂ０７２５）
１０質量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク社製 ＃１２９６７－４５）
超純水
免疫染色バッファー：
１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製 ＃１７５１４－１５）
０．５Ｍ ＮａＣｌ（ナカライテスク社製 ＃３１３１９－４５）
１０質量％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ナカライテスク社製 ＃１２９６７－４５）
０．５％ ＮａＮ３(和光純薬社製 ＃１９７－１１０９１)
ＣＵＢＩＣ－Ｒ：
４５質量％ アンチピリン（東京化成工業社製 ＃Ｂ１８７６）
３０質量％ ニコチンアミド（東京化成工業社製 ＃Ｎ００７８）
１質量％ Ｎ－ブチルジエタノールアミン（東京化成工業社製 ＃Ｂ０７２５）
超純水
実施例１：抗ＮｅｕＮ抗体の浸透への効果の検討
Ｂ６Ｎマウス（８週齢、オス）を還流固定して脳を取り出し４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ） １０ｍＬに２４時間入れ保存した。その後、５０％ ＣＵＢＩＣ－Ｌ １０ｍＬに置換し、３７℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。１００％ ＣＵＢＩＣ－Ｌ １０ｍＬに置換し、３７℃で４８時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を２回繰り返した。ＰＢＳ １０ｍＬに置換し、３７℃で２時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を３回繰り返した。免疫染色バッファー １５ｍＬに置換し、３７℃で１．５時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。２×免疫染色バッファー ３０μＬ、抗ＮｅｕＮ抗体（クローン名Ａ６０） ７．５ｎｇ（５０ｐｍｏｌ）、Ａｌｅｘａ ５９４ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂ ７．５ｎｇ及び試験例１に係るＮｅｕＮ抗原ペプチド又はＮｅｕＮ変異ペプチド ５０ｐｍｏｌ、２５０ｐｍｏｌ若しくは５００ｐｍｏｌを混合し水を加えて６０μＬにメスアップした後、３７℃で１時間インキュベートした。その後、混合液に２２０μＬの２×免疫染色バッファーと２２０μＬの水とを加え混合し、免疫染色バッファーで液置換した脳を入れて３７℃で５日間インキュベートした。１０％ｔｒｉｔｏｎを含む０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、３７℃で３０分間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を２回繰り返した。さらに０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、３７℃で１時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作した。その後、１％ホルムアルデヒドを含む０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、２５℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。さらに、０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、２５℃で２時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。５０％ ＣＵＢＩＣ－Ｒ １０ｍＬに置換し、３７℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。さらに、１００％ ＣＵＢＩＣ－Ｒ １０ｍＬに置換し、３７℃で４８時間、２０ｒｐｍで前後に揺らし、２％アガロースを含むＣＵＢＩＣ－Ｒで作成したゲルに包埋し、ライトシート顕微鏡で観察した。
Ｂ６Ｎマウス（８週齢、オス）を還流固定して脳を取り出し４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ） １０ｍＬに２４時間入れ保存した。その後、５０％ ＣＵＢＩＣ－Ｌ １０ｍＬに置換し、３７℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。１００％ ＣＵＢＩＣ－Ｌ １０ｍＬに置換し、３７℃で４８時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を２回繰り返した。ＰＢＳ １０ｍＬに置換し、３７℃で２時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を３回繰り返した。免疫染色バッファー １５ｍＬに置換し、３７℃で１．５時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。２×免疫染色バッファー ３０μＬ、抗ＮｅｕＮ抗体（クローン名Ａ６０） ７．５ｎｇ（５０ｐｍｏｌ）、Ａｌｅｘａ ５９４ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂ ７．５ｎｇ及び試験例１に係るＮｅｕＮ抗原ペプチド又はＮｅｕＮ変異ペプチド ５０ｐｍｏｌ、２５０ｐｍｏｌ若しくは５００ｐｍｏｌを混合し水を加えて６０μＬにメスアップした後、３７℃で１時間インキュベートした。その後、混合液に２２０μＬの２×免疫染色バッファーと２２０μＬの水とを加え混合し、免疫染色バッファーで液置換した脳を入れて３７℃で５日間インキュベートした。１０％ｔｒｉｔｏｎを含む０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、３７℃で３０分間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作を２回繰り返した。さらに０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、３７℃で１時間、２０ｒｐｍで前後に揺らす操作した。その後、１％ホルムアルデヒドを含む０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、２５℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。さらに、０．１ＭＰＢ １０ｍＬに置換し、２５℃で２時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。５０％ ＣＵＢＩＣ－Ｒ １０ｍＬに置換し、３７℃で２４時間、２０ｒｐｍで前後に揺らした。さらに、１００％ ＣＵＢＩＣ－Ｒ １０ｍＬに置換し、３７℃で４８時間、２０ｒｐｍで前後に揺らし、２％アガロースを含むＣＵＢＩＣ－Ｒで作成したゲルに包埋し、ライトシート顕微鏡で観察した。
（結果）
ライトシート顕微鏡で撮像した脳の画像を図５に示す。左端の図に示すＡ－Ｂの領域を各画像で選択し、輝度値をＡからの距離に対してプロットしたところ、図６に示すように、ＮｅｕＮ抗原ペプチド非存在下では抗ＮｅｕＮ抗体が脳、特に小脳の外側付近に集積しているのに対し、ＮｅｕＮ抗原ペプチド存在下ではＮｅｕＮ抗原ペプチドの濃度依存的に外側付近での集積が緩和され、脳の内側に抗ＮｅｕＮ抗体が浸透していた。一方、図７に示すように、ＮｅｕＮ変異ペプチドの場合は、ＮｅｕＮ変異ペプチド存在下でも、脳の外側付近における抗ＮｅｕＮ抗体の集積が緩和されなかった。
ライトシート顕微鏡で撮像した脳の画像を図５に示す。左端の図に示すＡ－Ｂの領域を各画像で選択し、輝度値をＡからの距離に対してプロットしたところ、図６に示すように、ＮｅｕＮ抗原ペプチド非存在下では抗ＮｅｕＮ抗体が脳、特に小脳の外側付近に集積しているのに対し、ＮｅｕＮ抗原ペプチド存在下ではＮｅｕＮ抗原ペプチドの濃度依存的に外側付近での集積が緩和され、脳の内側に抗ＮｅｕＮ抗体が浸透していた。一方、図７に示すように、ＮｅｕＮ変異ペプチドの場合は、ＮｅｕＮ変異ペプチド存在下でも、脳の外側付近における抗ＮｅｕＮ抗体の集積が緩和されなかった。
実施例２：抗ＴＨ抗体の浸透への効果の検討
抗体として抗ＴＨ抗体（クローン名ＥＰ１５３２Ｙ） ５ｎｇ（３３ｐｍｏｌ）を使用し、Ａｌｅｘａ ５９４ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂの使用量を５ｎｇとし、ＮｅｕＮ抗原ペプチドを試験例３に係るＴＨ抗原ペプチドとした点を除いて実施例１と同様の操作を行った。なお、ＴＨ抗原ペプチドの使用量は、３３ｐｍｏｌ、３３０ｐｍｏｌ又は３３００ｐｍｏｌとした。
抗体として抗ＴＨ抗体（クローン名ＥＰ１５３２Ｙ） ５ｎｇ（３３ｐｍｏｌ）を使用し、Ａｌｅｘａ ５９４ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ Ｆａｂの使用量を５ｎｇとし、ＮｅｕＮ抗原ペプチドを試験例３に係るＴＨ抗原ペプチドとした点を除いて実施例１と同様の操作を行った。なお、ＴＨ抗原ペプチドの使用量は、３３ｐｍｏｌ、３３０ｐｍｏｌ又は３３００ｐｍｏｌとした。
（結果）
ライトシート顕微鏡で撮像した脳の画像を図８に示す。左端の図に示すＡ－Ｂ及びＣ－Ｄの領域を各画像で選択し、輝度値をＡ又はＣからの距離に対してプロットした図をそれぞれ図９及び図１０に示す。図９及び図１０に示されたように、ＴＨ抗原ペプチド存在下では、抗ＴＨ抗体の脳の外側付近への集積がＴＨ抗原ペプチドの濃度依存的に緩和され、脳の内側に抗ＴＨ抗体が浸透していた。
ライトシート顕微鏡で撮像した脳の画像を図８に示す。左端の図に示すＡ－Ｂ及びＣ－Ｄの領域を各画像で選択し、輝度値をＡ又はＣからの距離に対してプロットした図をそれぞれ図９及び図１０に示す。図９及び図１０に示されたように、ＴＨ抗原ペプチド存在下では、抗ＴＨ抗体の脳の外側付近への集積がＴＨ抗原ペプチドの濃度依存的に緩和され、脳の内側に抗ＴＨ抗体が浸透していた。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
本発明は、生体組織の染色に好適である。
Claims (4)
- 抗体による免疫染色の対象である生体組織中の抗原におけるエピトープの第１のアミノ酸配列と少なくとも４個のアミノ酸が一致する第２のアミノ酸配列を有し、競合して前記抗体に結合するペプチドを含む、
生体組織染色試薬。 - 前記第２のアミノ酸配列は、
前記第１のアミノ酸配列と５個以上のアミノ酸が一致する、
請求項１に記載の生体組織染色試薬。 - 請求項１又は２に記載の生体組織染色試薬と、
前記抗体と、
を備える、生体組織染色キット。 - 請求項１又は２に記載の生体組織染色試薬及び前記抗体に、前記生体組織を暴露する暴露ステップを含む、
生体組織染色方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022051118A JP7842447B2 (ja) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022051118A JP7842447B2 (ja) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023144231A JP2023144231A (ja) | 2023-10-11 |
| JP7842447B2 true JP7842447B2 (ja) | 2026-04-08 |
Family
ID=88252904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022051118A Active JP7842447B2 (ja) | 2022-03-28 | 2022-03-28 | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7842447B2 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006040958A1 (ja) | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Toagosei Co., Ltd. | リウマチ性多発筋痛症抗体エピトープペプチド及びリウマチ性多発筋痛症の検査試薬 |
| WO2021039716A1 (ja) | 2019-08-30 | 2021-03-04 | 株式会社ＣＵＢＩＣＳｔａｒｓ | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 |
| JP2021145604A (ja) | 2020-03-19 | 2021-09-27 | 株式会社CUBICStars | タンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラム |
-
2022
- 2022-03-28 JP JP2022051118A patent/JP7842447B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006040958A1 (ja) | 2004-10-12 | 2006-04-20 | Toagosei Co., Ltd. | リウマチ性多発筋痛症抗体エピトープペプチド及びリウマチ性多発筋痛症の検査試薬 |
| WO2021039716A1 (ja) | 2019-08-30 | 2021-03-04 | 株式会社ＣＵＢＩＣＳｔａｒｓ | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 |
| JP2021145604A (ja) | 2020-03-19 | 2021-09-27 | 株式会社CUBICStars | タンパク質結合部位情報取得装置、タンパク質結合部位情報取得装置の作動方法及びプログラム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023144231A (ja) | 2023-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN114555810B (zh) | 用于蛋白质和肽测序的方法和组合物 | |
| JP4719403B2 (ja) | 機能的タンパク質アレイ | |
| CN101512016B (zh) | 可检测的核酸标签 | |
| CN115244185A (zh) | 使用探针对连接的原位rna分析 | |
| JP6293742B2 (ja) | デザイナーモノヌクレオソーム（ｄｅｓｉｇｎｅｒｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ）のＤＮＡバーコード化ならびにクロマチンリーダー、ライター、イレーサーおよびそのモジュレーターをプロファイリングするためのクロマチンアレイライブラリー | |
| US20210079445A1 (en) | Multi Component Detection | |
| US10132801B2 (en) | Method for screening new drug candidate inhibiting target protein-protein interaction for development of first-in-class drug | |
| WO2014165770A1 (en) | Single-base resolution sequencing of 5-formylcytosine (5fc) and 5-carboxylcytosine (5cac) | |
| CN102459642A (zh) | 采用可检测蛋白质的细胞测定法 | |
| Lue et al. | Site-specific immobilization of biotinylated proteins for protein microarray analysis | |
| CN114127281A (zh) | 邻近相互作用分析 | |
| JP7842447B2 (ja) | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 | |
| JP2022528465A (ja) | 対称性ジメチル化アルギニン分析物に対する抗体及びその用途 | |
| JP4414138B2 (ja) | 蛍光染料を通した分子のエピトープの免疫検出及び分子の相互作用の検出のための方法 | |
| JP2006517397A (ja) | タンパク質アレイ、及びその使用方法 | |
| EP2558858B1 (en) | Reagents and methods for phosphorylation/dephosphorylation analyses | |
| Kim et al. | Direct profiling the post-translational modification codes of a single protein immobilized on a surface using Cu-free click chemistry | |
| Zhang et al. | Identification of protein precursor for thyroid hormone synthesis in basal chordate ascidian Styela clava | |
| CA2785359A1 (en) | Protein display | |
| JP5419138B2 (ja) | 検出対象物の検出方法およびそれに用いる検出用キット | |
| EP1882047A2 (en) | Compositions, methods and kits for real-time nucleic acid analysis in live cells | |
| CN1955738B (zh) | 一种鲆鲽鱼类受精卵微管骨架免疫荧光染色观察方法 | |
| US7670787B2 (en) | Protein forming complex with c-Fos protein, nucleic acid encoding the same and method of using the same | |
| JP7849883B2 (ja) | 生体分子構造検出用プローブ、生体分子構造検出用キット、及び生体分子構造の検出方法 | |
| Patnaik et al. | Activin receptor type IIB in rohu (Labeo rohita): molecular characterization, tissue distribution and immunohistochemical localization during different stages of gonadal maturation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20250115 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20251104 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20251203 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20260127 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20260225 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20260317 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20260319 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7842447 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |