JP7828056B2 - 口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤 - Google Patents
口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤Info
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Description
本発明は、例えば口腔内に適用されて使用される、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤に関する。
ヒトの口腔内には、様々な微生物が存在する。この種の微生物としては、う蝕（虫歯）を引き起こすう蝕原因菌、歯周病を引き起こす歯周病原因菌などが挙げられる。これらの細菌は、いずれも歯の表面や歯肉表面でバイオフィルムをそれぞれ形成することが知られている。いったんバイオフィルムが形成されると、形成されたバイオフィルムが各原因菌をさらに増殖させる温床となることから、う蝕や歯周病を防ぐためには、口腔内におけるバイオフィルム形成を抑制すること、又は、形成されたバイオフィルムを減少させることが望ましいと考えられている。
これに対して、口腔内のバイオフィルム形成を抑制したり、バイオフィルムを減少させたりできる口腔用製剤が知られている。
この種の口腔用製剤としては、例えば、（ａ）塩化セチルピリジニウムと、（ｂ）ケイヒ、チョウジ、及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種とを含有するものが知られている（特許文献１）。
特許文献１に記載の口腔用製剤は、口腔内に適用されることによって、う蝕原因菌及び歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制でき、また、形成されたバイオフィルムを減少できる。
この種の口腔用製剤としては、例えば、（ａ）塩化セチルピリジニウムと、（ｂ）ケイヒ、チョウジ、及びそれらの抽出物からなる群より選択される少なくとも１種とを含有するものが知られている（特許文献１）。
特許文献１に記載の口腔用製剤は、口腔内に適用されることによって、う蝕原因菌及び歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制でき、また、形成されたバイオフィルムを減少できる。
しかしながら、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤については、未だ十分に検討されていないことから、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる口腔用製剤が要望されている。
本発明は、上記問題点、要望点等に鑑み、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤を提供することを課題とする。
本発明に係る口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤は、多糖類繊維を含むことを特徴とする。
上記の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤によれば、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
上記の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤によれば、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
本発明に係る口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤においては、前記多糖類繊維がキチン繊維であることが好ましい。
これにより、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成をより抑制できる。
これにより、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成をより抑制できる。
本発明に係る口腔用製剤は、上記の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤を含むことを特徴とする。
上記の口腔用製剤によれば、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
上記の口腔用製剤によれば、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
本発明の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤及び口腔用製剤によれば、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
本発明に係る口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤（口腔用組成物）の一実施形態について以下に説明する。以下、これら両方をそれぞれ単に組成物ともいう。
本実施形態の組成物は、多糖類繊維を含む。そのため、本実施形態の組成物は、口腔内に適用された後に、う蝕原因菌および歯周病菌のバイオフィルム形成を抑制できる。従って、殺菌剤を併用しなくても、う蝕原因菌及び歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制できる。よって、う蝕及び歯周病を予防することができる。
う蝕原因菌としては、例えば、Streptococcus mutans（S.m菌）、Streptococcus sobrinusなどが挙げられる。
歯周病菌としては、例えば、Porphyromonas gingivalis（P.g菌）、Tannerella forsythensis（T.f菌）、Treponema denticola（T.d菌）、Fusobacterium nucleatum（F.n菌）などが挙げられる。
その他、口腔内においてバイオフィルムを形成し得る細菌であって、口腔内疾病への関与が疑われる細菌としては、例えば、Streptococcus sanguinis（S.s菌）、Actinomyces naeslundii（A.n菌）、Actinomyces viscosus（A.v菌）などが挙げられる。
歯周病菌としては、例えば、Porphyromonas gingivalis（P.g菌）、Tannerella forsythensis（T.f菌）、Treponema denticola（T.d菌）、Fusobacterium nucleatum（F.n菌）などが挙げられる。
その他、口腔内においてバイオフィルムを形成し得る細菌であって、口腔内疾病への関与が疑われる細菌としては、例えば、Streptococcus sanguinis（S.s菌）、Actinomyces naeslundii（A.n菌）、Actinomyces viscosus（A.v菌）などが挙げられる。
本実施形態の組成物に含まれる多糖類繊維は、多糖類で形成された繊維状物を含む。斯かる繊維状物は、通常、水不溶性であるため、水を含む溶媒に分散し得る。多糖類繊維は、複数の繊維状物で形成され、各繊維状物では、束になった複数の糖鎖が、繊維状物の繊維長方向に延びている。
各繊維状物の太さは、通常、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
各繊維状物の太さは、通常、１ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
上記の多糖類繊維としては、キチン繊維、セルロース繊維などが挙げられる。キチン繊維としては、αキチンの繊維状物を含むαキチン繊維、βキチンの繊維状物を含むβキチン繊維が挙げられる。
上記の多糖類繊維は、う蝕原因菌のバイオフィルム形成をより十分に抑制できるという点で、αキチン繊維又はセルロース繊維であることが好ましい。また、上記の多糖類繊維は、歯周病原因菌のバイオフィルム形成をより十分に抑制できるという点で、αキチン繊維であることが好ましい。
上記の多糖類繊維は、う蝕原因菌のバイオフィルム形成をより十分に抑制できるという点で、αキチン繊維又はセルロース繊維であることが好ましい。また、上記の多糖類繊維は、歯周病原因菌のバイオフィルム形成をより十分に抑制できるという点で、αキチン繊維であることが好ましい。
αキチン繊維は、例えば甲殻類の外骨格（殻）から得ることができる。αキチン繊維は、複数の繊維状物で形成され、各繊維状物では、ポリβ－１，４－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの複数の糖鎖が、繊維状物の繊維長方向に延びつつ繊維径方向に隣り合っている。αキチン繊維の繊維状物では、隣り合うポリβ－１，４－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの糖鎖のβ－１，４結合の向きが、糖鎖長方向において互いに逆向きである。
αキチン繊維としては、市販されている製品を用いることができる。αキチン繊維を含む市販品として、例えば、製品名「ＢｉＮＦｉ－ｓ（ビンフィス）キチン」（スギノマシン社製）、製品名「キチンナノファイバー」（ＧＳアライアンス社製）などを採用できる。
βキチン繊維は、例えばイカの中骨（軟骨）から得ることができる。βキチン繊維は、複数の繊維状物で形成され、各繊維状物では、ポリβ－１，４－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの複数の糖鎖が、繊維状物の繊維長方向に延びつつ繊維径方向に隣り合っている。βキチン繊維の繊維状物では、上記の隣り合う糖鎖のβ－１，４結合の向きが、糖鎖長方向において互いに同じ向きである。
βキチン繊維としては、市販されている製品を用いることができる。βキチン繊維を含む市販品として、例えば、原料名「βキチンナノファイバー液（βキチンＮＦ）」（ヤヱガキ醗酵技研社製）を用いることができる。などを採用できる。
セルロース繊維は、例えば木材パルプから得ることができる。セルロース繊維は、例えば木材パルプに対して、水中で解繊処理を施すことによって得られる。解繊処理方法としては、高圧ホモジナイザー法、マイクロフルイダイザー法、ボールミル粉砕法などが採用される。
セルロース繊維としては、市販されている製品を用いることができる。セルロース繊維を含む市販品として、例えば、製品名「レオクリスタ」（第一工業製薬社製）、製品名「セレンピアシリーズ」（日本製紙社製）、「ＥＬＬＥＸシリーズ」（大王製紙社製）、製品名「ＡＵＲＯＶＩＳＣＯシリーズ」（王子ホールディングス社製）などを採用できる。
セルロース繊維としては、市販されている製品を用いることができる。セルロース繊維を含む市販品として、例えば、製品名「レオクリスタ」（第一工業製薬社製）、製品名「セレンピアシリーズ」（日本製紙社製）、「ＥＬＬＥＸシリーズ」（大王製紙社製）、製品名「ＡＵＲＯＶＩＳＣＯシリーズ」（王子ホールディングス社製）などを採用できる。
上記の多糖類繊維は、繊維状物が組成物中で分散しているものであれば、表面処理された繊維状物を含むものであってもよく、繊維状物が部分的に化学修飾されたものであってもよい。
例えば、上記の多糖類繊維は、加水分解処理によって繊維状物の表面が加水分解処理されてキトサンになったαキチン繊維であってもよい。また、上記の多糖類繊維は、例えば、繊維状物に含まれるグルコース単位の２位、３位、６位の炭素に結合した－ＯＨ基が部分的に化学修飾されたセルロース繊維であってもよい。
例えば、上記の多糖類繊維は、加水分解処理によって繊維状物の表面が加水分解処理されてキトサンになったαキチン繊維であってもよい。また、上記の多糖類繊維は、例えば、繊維状物に含まれるグルコース単位の２位、３位、６位の炭素に結合した－ＯＨ基が部分的に化学修飾されたセルロース繊維であってもよい。
上記の多糖類繊維は、例えば０．００１質量％以上５．０００質量％以下（固形物換算値）組成物に含まれる。
本実施形態の組成物は、多糖類繊維を含むため、口腔内のう蝕原因菌又は歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制できる。
詳しくは、バイオフィルムは、口腔内の細菌が作り出す成分（多糖類など）で形成される。バイオフィルムは、歯の表面や歯と歯肉との間に形成され、細菌がさらに増殖するための温床となる。バイオフィルムが形成されるための成分に対して、上記の多糖類繊維が作用することで、バイオフィルムの形成が阻害されると考えられる。これにより、本実施形態の組成物は、口腔内に適用された後に、う蝕原因菌又は歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制できる。
また、上記の多糖類繊維の存在下におけるバイオフィルム形成は、上記の多糖類繊維によって抑制されることから、歯などに対するバイオフィルムの付着力が弱くなると考えられる。従って、上記の多糖類繊維の存在下でいったんバイオフォルムが形成されても、そのバイオフィルムは、弱いブラッシングやうがい時の水流によって、比較的容易に取り除かれ得る。よって、細菌がさらに増殖するための温床を減少させることができる。
さらには、上記の多糖類繊維の存在下で形成されたバイオフィルムは、殺菌剤を浸透しやすくなっていると考えられる。よって、口腔内に適用された殺菌剤の殺菌作用を高めることができると考えられる。
以上の理由により、上記の多糖類繊維によれば、う蝕及び歯周病を予防することができる。
詳しくは、バイオフィルムは、口腔内の細菌が作り出す成分（多糖類など）で形成される。バイオフィルムは、歯の表面や歯と歯肉との間に形成され、細菌がさらに増殖するための温床となる。バイオフィルムが形成されるための成分に対して、上記の多糖類繊維が作用することで、バイオフィルムの形成が阻害されると考えられる。これにより、本実施形態の組成物は、口腔内に適用された後に、う蝕原因菌又は歯周病菌の各バイオフィルム形成を抑制できる。
また、上記の多糖類繊維の存在下におけるバイオフィルム形成は、上記の多糖類繊維によって抑制されることから、歯などに対するバイオフィルムの付着力が弱くなると考えられる。従って、上記の多糖類繊維の存在下でいったんバイオフォルムが形成されても、そのバイオフィルムは、弱いブラッシングやうがい時の水流によって、比較的容易に取り除かれ得る。よって、細菌がさらに増殖するための温床を減少させることができる。
さらには、上記の多糖類繊維の存在下で形成されたバイオフィルムは、殺菌剤を浸透しやすくなっていると考えられる。よって、口腔内に適用された殺菌剤の殺菌作用を高めることができると考えられる。
以上の理由により、上記の多糖類繊維によれば、う蝕及び歯周病を予防することができる。
本実施形態の組成物は、う蝕原因菌や歯周病菌を殺菌するための殺菌剤を含まなくても、う蝕原因菌や歯周病菌のバイオフィルム形成を抑制できる。
一方で、本実施形態の組成物は、殺菌剤を含んでもよい。本実施形態の組成物が多糖類繊維（特にβキチン繊維）と殺菌剤とを含むことによって、殺菌剤による殺菌作用を向上させることができる。
一方で、本実施形態の組成物は、殺菌剤を含んでもよい。本実施形態の組成物が多糖類繊維（特にβキチン繊維）と殺菌剤とを含むことによって、殺菌剤による殺菌作用を向上させることができる。
殺菌剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンゼトニウム、イソプロピルメチルフェノール（ＩＰＭＰ）、グルコン酸クロルヘキシジンなどが挙げられる。
本実施形態の組成物は、通常、水を含む。本実施形態の組成物は、上述した成分以外にも、一般的な化粧料や皮膚外用剤等に配合される成分を含んでもよい。本実施形態の組成物が含み得る成分としては、例えば、ジプロピレングリコール、グリセリン、ペンチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジグリセリン等の多価アルコール類が挙げられる。また、例えば、防腐剤、抗酸化剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、紫外線散乱剤、ビタミン類、酵素等の成分が挙げられる。本実施形態の組成物は、医薬部外品原料規格、化粧品種別配合成分規格、化粧品原料基準、日本薬局方、食品添加物公定書規格等に記載の成分で構成される。
本実施形態の組成物の性状は、特に限定されないが、例えば、液状、ガム状、固体状である。
本実施形態の組成物は、上述した多糖類繊維と、その他の成分とを一般的な方法によって混合撹拌することによって製造できる。
本実施形態の上記組成物は、例えば、口腔内に適用されて使用される。上記の組成物は、例えば、口腔内の粘膜に適用されることが可能な口腔用製剤である。上記の組成物は、薬事法上の化粧料、医薬部外品、医薬品等の分類には特に拘束されず、様々な分野に適用される。
本実施形態の上記組成物は、例えば洗口液、歯磨き剤、うがい薬、口臭予防剤、ガムや飴などの食品などの用途で使用される。
本実施形態の上記組成物は、例えば洗口液、歯磨き剤、うがい薬、口臭予防剤、ガムや飴などの食品などの用途で使用される。
本実施形態の上記組成物は、例えば、ヒトの口腔内に適用されてもよく、ヒト以外の動物（家畜やペットなど）の口腔内に適用されてもよい。
本発明の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤（口腔用組成物）は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示の実施形態に限定されるものではない。また、本発明では、一般の口腔用組成物等において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
以下に示す多糖類繊維含有液を用いて各種の試験を実施した。
＜試験用の試料（多糖類繊維を含有する液）＞
・セルロース繊維含有液 製品名「レオクリスタ」（第一工業製薬社製）
固形分濃度２質量％／２０％濃度に希釈（５倍希釈）した液（固形分０．４質量％）を試験液として使用
・αキチン繊維含有液 市販品 固形分１．５質量％含有液
・βキチン繊維含有液 固形分１．６質量％含有液
原料名「βキチンナノファイバー液（βキチンＮＦ）」（ヤヱガキ醗酵技研社製）
イカ中骨に対してアルカリ処理及び酸処理を施して得られたβキチンの粉末を水に分散させた。この分散液同士を高圧で衝突させる処理によって得られた、太さ２～８ｎｍの繊維状物を含む分散液。
＜試験用の試料（多糖類繊維を含有する液）＞
・セルロース繊維含有液 製品名「レオクリスタ」（第一工業製薬社製）
固形分濃度２質量％／２０％濃度に希釈（５倍希釈）した液（固形分０．４質量％）を試験液として使用
・αキチン繊維含有液 市販品 固形分１．５質量％含有液
・βキチン繊維含有液 固形分１．６質量％含有液
原料名「βキチンナノファイバー液（βキチンＮＦ）」（ヤヱガキ醗酵技研社製）
イカ中骨に対してアルカリ処理及び酸処理を施して得られたβキチンの粉末を水に分散させた。この分散液同士を高圧で衝突させる処理によって得られた、太さ２～８ｎｍの繊維状物を含む分散液。
＜試験１＞う蝕原因菌のバイオフィルム形成
［試験液Ａの調製］
上記の多糖類繊維の各試料を、０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、１０質量％から２倍希釈系列で０．０８質量％濃度まで濃度調整した（１０濃度）。
［細菌含有液Ｂの調製］
う蝕原因菌として、以下の（ア）及び（イ）を使用した。（ア）は製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から購入し、（イ）は理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から購入した。
（ア） Streptococcus mutans ： NBRC 13955
（イ） Streptococcus sanguinis ： JCM 5708
ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、上記の試験菌を３７℃で嫌気的に定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を等量混合し、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度になるようにＴＳＢ培地によって濃度調整し、う蝕原因菌含有液（細菌含有液Ｂ）を調製した。
［バイオフィルムの形成／定量］
１．９６ｗｅｌｌマイクロプレート（製品名「ＩＷＡＫＩ」ポリスチレン製）に、０．２質量％濃度スクロース添加ＴＳＢ培地を用いて調整したナノファイバーを含む試験液Ａを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ分注した（１０質量％から２倍希釈系列で０．０８質量％まで１０濃度(各濃度 ｎ＝４)）。
２．上記の細菌含有液Ｂを各ｗｅｌｌに１０μＬずつ接種した。
３．ナノファイバーを含まない０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ培地をコントロールとした。
４．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、ｗｅｌｌの底にう蝕原因菌のバイオフィルム(以下ＢＦ)を形成させた。
５．ＢＦの形成が完了した後、滅菌水を用いて洗浄しｗｅｌｌを乾燥させた。
６．０．１質量％（ｗ/ｖ）のクリスタルバイオレット溶液１００μＬを各ｗｅｌｌに加えて３０分間染色処理を行った。
７．染色処理が終了したプレートを滅菌水で３回洗浄した。
８．各ｗｅｌｌにエタノール１００μＬを加えて、バイオフィルム中のクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定した。
［試験液Ａの調製］
上記の多糖類繊維の各試料を、０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、１０質量％から２倍希釈系列で０．０８質量％濃度まで濃度調整した（１０濃度）。
［細菌含有液Ｂの調製］
う蝕原因菌として、以下の（ア）及び（イ）を使用した。（ア）は製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から購入し、（イ）は理化学研究所 微生物材料開発室（ＪＣＭ）から購入した。
（ア） Streptococcus mutans ： NBRC 13955
（イ） Streptococcus sanguinis ： JCM 5708
ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、上記の試験菌を３７℃で嫌気的に定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を等量混合し、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度になるようにＴＳＢ培地によって濃度調整し、う蝕原因菌含有液（細菌含有液Ｂ）を調製した。
［バイオフィルムの形成／定量］
１．９６ｗｅｌｌマイクロプレート（製品名「ＩＷＡＫＩ」ポリスチレン製）に、０．２質量％濃度スクロース添加ＴＳＢ培地を用いて調整したナノファイバーを含む試験液Ａを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ分注した（１０質量％から２倍希釈系列で０．０８質量％まで１０濃度(各濃度 ｎ＝４)）。
２．上記の細菌含有液Ｂを各ｗｅｌｌに１０μＬずつ接種した。
３．ナノファイバーを含まない０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ培地をコントロールとした。
４．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、ｗｅｌｌの底にう蝕原因菌のバイオフィルム(以下ＢＦ)を形成させた。
５．ＢＦの形成が完了した後、滅菌水を用いて洗浄しｗｅｌｌを乾燥させた。
６．０．１質量％（ｗ/ｖ）のクリスタルバイオレット溶液１００μＬを各ｗｅｌｌに加えて３０分間染色処理を行った。
７．染色処理が終了したプレートを滅菌水で３回洗浄した。
８．各ｗｅｌｌにエタノール１００μＬを加えて、バイオフィルム中のクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定した。
試験１の結果を図１Ａ～図１Ｃにそれぞれ示す。図１Ａ～図１Ｃから把握されるように、セルロース繊維、αキチン繊維、及び、βキチン繊維は、いずれもう蝕原因菌のバイオフィルム形成を抑制できた。なお、βキチン繊維の存在下又は非存在下で培養されたあとのう蝕原因菌のバイオフィルムの様子を光学顕微鏡で観察したときの写真を図５においてそれぞれ示す。
＜試験２＞歯周病原因菌のバイオフィルム形成
［試験液Ｃの調製］
上記の多糖類繊維の各試料を、ＢＨＩ ＨＭ（注）培地を用いて、１０質量％濃度から２倍希釈で０．３質量％濃度まで濃度調整した（６濃度）。
注）ＢＨＩ ＨＭ
・ヘミン（シグマアルドリッチ社製）：５ｍｇ／１Ｌ ＢＨＩブロス
・メナジオン（和光純薬工業社製）：１ｍｇ／１Ｌ ＢＨＩブロス
［細菌含有液Ｄの調製］
以下の歯周病原因菌を理化学研究所 微生物材料開発室 （ＪＣＭ）から購入した。
（ウ） Porphyromonas gingivalis （P.g菌） ： JCM 8525
（エ） Fusobacterium nucleatum （F.n菌） ： JCM 8532
（オ） Actinomyces naeslundii （A.n菌） ： JCM 8349
（カ） Actinomyces viscosus （A.v菌） ： JCM 8351
上記（ウ）～（カ）の各菌を、ヘミン及びメナジオンを含むＢＨＩ液体培地（ＢＨＩ ＨＭ）により３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を等量混合し、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度になるようにＢＨＩ ＨＭ培地で濃度調整し、歯周病原因細菌含有液とした。
［バイオフィルムの形成／定量］
１．９６ｗｅｌｌマイクロプレート（製品名「ＩＷＡＫＩ」ポリスチレン製）に、ＢＨＩ ＨＭ培地を用いて調製した、ナノファイバーを含む試験液Ｃを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ分注した（１０質量％から２倍希釈系列で０．３質量％まで６濃度(各濃度ｎ＝８)）。
２．上記の細菌含有液Ｄを各ｗｅｌｌに１０μＬずつ接種した。
３．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、ｗｅｌｌの底に歯周病原因菌のバイオフィルム(以下ＢＦ)を形成させた。
４．ＢＦの形成が完了した後、滅菌水を用いて洗浄しｗｅｌｌを乾燥させた。
５．０．１％（ｗ/ｖ）のクリスタルバイオレット溶液１００μＬを各ｗｅｌｌに加えて３０分間染色処理を行った。
６．染色処理が終了したプレートを滅菌水で３回洗浄した。
７．各ｗｅｌｌにエタノール１００μＬを加えて、バイオフィルム中のクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定した。
［試験液Ｃの調製］
上記の多糖類繊維の各試料を、ＢＨＩ ＨＭ（注）培地を用いて、１０質量％濃度から２倍希釈で０．３質量％濃度まで濃度調整した（６濃度）。
注）ＢＨＩ ＨＭ
・ヘミン（シグマアルドリッチ社製）：５ｍｇ／１Ｌ ＢＨＩブロス
・メナジオン（和光純薬工業社製）：１ｍｇ／１Ｌ ＢＨＩブロス
［細菌含有液Ｄの調製］
以下の歯周病原因菌を理化学研究所 微生物材料開発室 （ＪＣＭ）から購入した。
（ウ） Porphyromonas gingivalis （P.g菌） ： JCM 8525
（エ） Fusobacterium nucleatum （F.n菌） ： JCM 8532
（オ） Actinomyces naeslundii （A.n菌） ： JCM 8349
（カ） Actinomyces viscosus （A.v菌） ： JCM 8351
上記（ウ）～（カ）の各菌を、ヘミン及びメナジオンを含むＢＨＩ液体培地（ＢＨＩ ＨＭ）により３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を等量混合し、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度になるようにＢＨＩ ＨＭ培地で濃度調整し、歯周病原因細菌含有液とした。
［バイオフィルムの形成／定量］
１．９６ｗｅｌｌマイクロプレート（製品名「ＩＷＡＫＩ」ポリスチレン製）に、ＢＨＩ ＨＭ培地を用いて調製した、ナノファイバーを含む試験液Ｃを各ｗｅｌｌに１００μＬずつ分注した（１０質量％から２倍希釈系列で０．３質量％まで６濃度(各濃度ｎ＝８)）。
２．上記の細菌含有液Ｄを各ｗｅｌｌに１０μＬずつ接種した。
３．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、ｗｅｌｌの底に歯周病原因菌のバイオフィルム(以下ＢＦ)を形成させた。
４．ＢＦの形成が完了した後、滅菌水を用いて洗浄しｗｅｌｌを乾燥させた。
５．０．１％（ｗ/ｖ）のクリスタルバイオレット溶液１００μＬを各ｗｅｌｌに加えて３０分間染色処理を行った。
６．染色処理が終了したプレートを滅菌水で３回洗浄した。
７．各ｗｅｌｌにエタノール１００μＬを加えて、バイオフィルム中のクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度（ＯＤ５７０）を測定した。
試験２の結果を図２Ａ～図２Ｃにそれぞれ示す。図２Ａ～図２Ｃから把握されるように、セルロース繊維、αキチン繊維、及び、βキチン繊維は、いずれも歯周病原因菌のバイオフィルム形成を抑制できた。特に、αキチン繊維は、歯周病原因菌のバイオフィルム形成をより十分に抑制できた。
＜試験３＞アパタイトペレット上におけるう蝕原因菌のバイオフィルム形成
［試験液Ｆの調製］
上記のβキチン繊維の試料を、０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、８質量％濃度から２倍希釈で０．１２５質量％濃度まで濃度調整した（７濃度）。
以下のう蝕原因菌（ア）を製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から購入した。
（ア） Streptococcus mutans ： NBRC 13955
［細菌含有液Ｇの調製］
上記（ア）の試験菌を、ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、３７℃で嫌気的に定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度になるようにＴＳＢ培地で濃度調整し、う蝕原因細菌含有液とした。
ＢＦ付着担体： ＨＯＹＡ Technosurgical アパタイトペッレット
１０×１０×２ｍｍ ＡＰＰ－１００ Lot No.09823310（以下ＡＰ板と記載する）
［バイオフィルムの形成／定量］
１．２４ｗｅｌｌのマイクロプレート内に、上記アパタイトペレットをセットし、Tryptone soya broth（日本ベクトン・デッキンソン社製）に０．２質量％スクロース添加した培地を用いて調製した、試験液Ｆ（βキチン繊維を含有）を各ｗｅｌｌに５００μＬずつ分注した。
２．上記の細菌含有液Ｇを各ｗｅｌｌに５０μＬずつ接種した。
３．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、アパタイトペッレット上にう蝕原因菌のバイオフィルムを形成させた。
［ＡＴＰ量測定］
１．ＢＦが剥がれないように注意しながら、培養処理後のアパタイトペッレットをＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて洗浄し、付着力の弱い菌を除去した。
２．洗浄が終了したアパタイトペレットを５０ｍＬ容の遠沈管に移した。
３．アパタイトペレット入り遠沈管に、１ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（０．０５ｗ／ｖ％ トリプシン－０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）ＷＡＫＯ ２０２－１６９３１）＋滅菌済みガラスビーズを添加し、ミキサー撹拌してアパタイトペレット上のＢＦを溶液内に移した。
４．超音波処理によってＢＦを破砕処理した。
５．破砕処理が終了した遠沈管にＡＴＰ抽出試薬を添加し、細胞外ＡＴＰを除去し、細胞外ＡＴＰ消去処理が終了した試料を測定用試験管に移した。
６．抽出試薬を添加して撹拌した後、発光試薬を添加した。
７．ＡＴＰ発光量を測定した。
８．このＡＴＰ発光量はバイオフィルム形成量に相当する。
［試験液Ｆの調製］
上記のβキチン繊維の試料を、０．２質量％スクロース添加ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、８質量％濃度から２倍希釈で０．１２５質量％濃度まで濃度調整した（７濃度）。
以下のう蝕原因菌（ア）を製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から購入した。
（ア） Streptococcus mutans ： NBRC 13955
［細菌含有液Ｇの調製］
上記（ア）の試験菌を、ＴＳＢ（Tryptone Soya Broth）培地を用いて、３７℃で嫌気的に定常状態に達するまで前培養した。この前培養菌を、１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度になるようにＴＳＢ培地で濃度調整し、う蝕原因細菌含有液とした。
ＢＦ付着担体： ＨＯＹＡ Technosurgical アパタイトペッレット
１０×１０×２ｍｍ ＡＰＰ－１００ Lot No.09823310（以下ＡＰ板と記載する）
［バイオフィルムの形成／定量］
１．２４ｗｅｌｌのマイクロプレート内に、上記アパタイトペレットをセットし、Tryptone soya broth（日本ベクトン・デッキンソン社製）に０．２質量％スクロース添加した培地を用いて調製した、試験液Ｆ（βキチン繊維を含有）を各ｗｅｌｌに５００μＬずつ分注した。
２．上記の細菌含有液Ｇを各ｗｅｌｌに５０μＬずつ接種した。
３．３７℃、嫌気的条件下（三菱化学社製 アネロパックケンキ使用）で２４時間培養し、アパタイトペッレット上にう蝕原因菌のバイオフィルムを形成させた。
［ＡＴＰ量測定］
１．ＢＦが剥がれないように注意しながら、培養処理後のアパタイトペッレットをＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて洗浄し、付着力の弱い菌を除去した。
２．洗浄が終了したアパタイトペレットを５０ｍＬ容の遠沈管に移した。
３．アパタイトペレット入り遠沈管に、１ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（０．０５ｗ／ｖ％ トリプシン－０．５３ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液（フェノールレッド含有）ＷＡＫＯ ２０２－１６９３１）＋滅菌済みガラスビーズを添加し、ミキサー撹拌してアパタイトペレット上のＢＦを溶液内に移した。
４．超音波処理によってＢＦを破砕処理した。
５．破砕処理が終了した遠沈管にＡＴＰ抽出試薬を添加し、細胞外ＡＴＰを除去し、細胞外ＡＴＰ消去処理が終了した試料を測定用試験管に移した。
６．抽出試薬を添加して撹拌した後、発光試薬を添加した。
７．ＡＴＰ発光量を測定した。
８．このＡＴＰ発光量はバイオフィルム形成量に相当する。
結果を表１及び図３に示す。表１及び図３から把握されるように、多糖類繊維（βキチン繊維）によって、う蝕原因菌のバイオフィルム形成が抑制された。
＜試験４＞βキチン繊維の配合による殺菌効果
通常の培地で培養したう蝕原因菌（ＢＦ形成が進んだ状態）、及び、βキチン繊維を添加して培養したう蝕原因菌（ＢＦの形成が阻害された状態）のそれぞれで殺菌試験を行った。
［検討した殺菌剤］
・塩化ベンザルコニウム
・塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）
［培養培地］ ＴＳＢ培地
［操作方法］
１）下記の培地でう蝕原因菌（ミュータンス菌）を２４時間培養し試験菌を用意した。
Ａ） ＴＳＢ培地
Ｂ） ＴＳＢ培地＋βキチン繊維含有液添加 （０．１質量％添加）
２）塩化ベンゼトニウムを０．０５質量％に濃度調整した検体に、上記Ａ)もしくはＢ)の培地で培養した試験菌を接種し、１０秒、３０秒、６０秒で反応を止めて各時間でのＡＴＰ量を測定した。
３）ＣＰＣを０．００２５質量％に濃度調整した検体でも同様の操作によってＡＴＰ量を測定した。
通常の培地で培養したう蝕原因菌（ＢＦ形成が進んだ状態）、及び、βキチン繊維を添加して培養したう蝕原因菌（ＢＦの形成が阻害された状態）のそれぞれで殺菌試験を行った。
［検討した殺菌剤］
・塩化ベンザルコニウム
・塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）
［培養培地］ ＴＳＢ培地
［操作方法］
１）下記の培地でう蝕原因菌（ミュータンス菌）を２４時間培養し試験菌を用意した。
Ａ） ＴＳＢ培地
Ｂ） ＴＳＢ培地＋βキチン繊維含有液添加 （０．１質量％添加）
２）塩化ベンゼトニウムを０．０５質量％に濃度調整した検体に、上記Ａ)もしくはＢ)の培地で培養した試験菌を接種し、１０秒、３０秒、６０秒で反応を止めて各時間でのＡＴＰ量を測定した。
３）ＣＰＣを０．００２５質量％に濃度調整した検体でも同様の操作によってＡＴＰ量を測定した。
ＴＳＢ培地で培養してう蝕原因菌のＢＦが形成された場合と、多糖類繊維の配合によってう蝕原因菌のＢＦ形成が阻害された場合とでは、後者において、より速やかに殺菌作用が発揮された（図４Ａ及び図４Ｂを参照）。
＜試験５＞多糖類繊維の殺菌効果の有無
ＢＦの形成阻害の作用が、殺菌作用によって発揮されているか否かを確認するために、試料のＭＩＣ値（最小発育阻止濃度）を確認した。
ＢＦの形成阻害の作用が、殺菌作用によって発揮されているか否かを確認するために、試料のＭＩＣ値（最小発育阻止濃度）を確認した。
結果を表２に示す。表２から認識されるように、上記の各多糖類繊維は２０質量％濃度であっても、各試験菌の増殖を阻害しない（殺菌作用をほぼ有しない）ことがわかった。
本発明の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤は、例えば、健常な歯及び歯肉の状態を維持させるために、口腔内に適用されて使用される。また、本発明の口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤は、例えば、う蝕又は歯肉炎などによって悪化した口腔内の状態を改善させるために、歯や歯肉などに塗布されて使用される。
Claims (2)
- ０．００１質量％以上５．０００質量％以下の多糖類繊維を含み、前記多糖類繊維がβキチン繊維である、口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤。
- ０．００１質量％以上５．０００質量％以下の多糖類繊維を含み、前記多糖類繊維がβキチン繊維である、口腔用製剤。
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| JP2021097464A JP7828056B2 (ja) | 2021-06-10 | 2021-06-10 | 口腔内病原細菌のバイオフィルム形成抑制剤、及び、口腔用製剤 |
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| JP2020092969A (ja) * | 2018-12-14 | 2020-06-18 | サミー株式会社 | 弾球遊技機 |
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| JPS60142923A (ja) * | 1983-12-28 | 1985-07-29 | Lion Corp | 歯周病薬 |
| JPH0772123B2 (ja) * | 1984-12-25 | 1995-08-02 | ライオン株式会社 | 歯垢形成抑制剤組成物 |
| JPH0764715B2 (ja) * | 1986-07-04 | 1995-07-12 | ライオン株式会社 | 義歯洗浄剤組成物 |
| EP3068365B1 (en) * | 2013-11-14 | 2018-06-27 | Unilever PLC, a company registered in England and Wales under company no. 41424 of | Oral care compositions |
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|---|---|---|---|---|
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| 瀬尾寛，キチン・キトサンの生理活性と研究動向，ＳＥＮ’ＩＧＡＫＫＡＩＳＨＩ（繊維と工業），(2007), vol.63, no.2，P2-6 |
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