JP7821779B2 - 抗体を使用した細胞表面ｍｉｃａ及びｍｉｃｂの検出 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年８月１０日に出願された米国仮出願第６３／０６３，４７５号明細書の利益を主張し、それは、任意の図面を含めて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０２１年８月４日に作出され、１９ＫＢサイズの「ＭＩＣＡ４＿ＳＴ２５」という名称のファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

本発明は、パラフィン包埋された組織試料において関心対象のタンパク質を検出するための研究及び診断ツールに関する。本発明は、特に腫瘍組織中でポリペプチドを検出するためにそのツールを使用する方法にも関する。

ＭＩＣＡ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ａ）及びＭＩＣＢ（主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連鎖Ｂ）は、感染した細胞及び腫瘍細胞上でストレスシグナルにより誘導される膜貫通タンパク質である。ＭＩＣＡは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上及びγδＴ細胞の下位集団上で発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄのリガンドである（ナチュラルキラー群２、メンバーＤ）。ＭＩＣＡとＮＫＧ２Ｄとの間の相互作用は、標的細胞の溶解を媒介するエフェクター細胞の活性化につながる。しかし、ＭＩＣＡタンパク質は、腫瘍微小環境におけるメタロプロテアーゼによりシェディングを受け、可溶性ＭＩＣＡは、多量であり、様々な癌を有する患者からの末梢リンパ球上でのＮＫＧ２Ｄ下方調整と相関する。可溶性ＭＩＣＡに加えて、膜結合ＭＩＣＡは、ＮＫＧ２Ｄの下方調整でも非常に有効である。これらの機序により、腫瘍が免疫系による制御から逃れることが可能になる。

多くの腫瘍タイプは、ＭＩＣＡを発現及び／又はシェディングすることが報告されている。腫瘍は、ＭＩＣＢを発現することも報告されている。検出又は診断での使用のための抗体は、一般に、細胞結合ＭＩＣＡではなく、可溶性（シェディングされる）ＭＩＣＡの検出に焦点が当てられている。しかし、抗体に基づく方法による細胞結合ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの評価も有用であり得る。これは、これらの転写物を調節する複雑な過程のため、ＭＩＣＡ／Ｂ ｍＲＮＡの定量が細胞表面で発現される対応するタンパク質の量を予測するものではないことから、細胞結合ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの評価がタンパク質の直接的な検出により行われることが好ましいためである（非特許文献１）。

癌細胞を標的とし、且つ例えば従来の化学療法剤の典型的な副作用を回避するなどのために免疫系をより特異的に活用することが可能である、癌の処置の新しい方法が必要とされている。腫瘍環境をより詳細に理解するために、腫瘍組織及び／若しくは腫瘍末梢又はそうでなければ近くの組織に存在する関心対象のタンパク質を検出することが望ましい場合が多い。これは、例えば、凍結組織試料を使用して行われ得る。これは、研究において有用であるだけではなく、例えば組織（例えば、腫瘍環境）が処置（例えば、免疫療法）の標的であるタンパク質の存在を特徴とするか否かを検出することにより、何れのタイプの処置を使用するべきかに関する判断でも役立ち得る。この情報は、タンパク質及び／又はそれを発現する細胞の活性を調整可能である処置を選択するために有効であり得る。

凍結組織に加えて、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン）固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料として保存されている組織試料からもマーカーが検出され得る。脱パラフィン処理後、スライドは、特異的なタンパク質の発現を検出するために、例えば免疫組織化学的方法が可能となる。この方法は、腫瘍組織試料において腫瘍抗原を検出するために日常的に使用されている。残念ながら、ＦＦＰＥ切片において効果的且つ特異的に機能するモノクローナル抗体を見つけることは、不可能であることが多い。これは、タンパク質の構造に対するホルマリン固定の影響によるものであると考えられる。組み換えタンパク質又は細胞に対して特異的であると記載される抗体により結合されるエピトープは、ＦＦＰＥにおいて使用されるとき、多くの場合に他のタンパク質上に存在し、抗体が非特異的となる。他の場合、ホルマリン固定によってネイティブ細胞タンパク質上の多くのエピトープが破壊され、これにより、組み換えタンパク質又は細胞を使用して同定された抗体は、ＦＦＰＥ切片の染色に対して無効となる。結果として、多くの受容体は、パラフィン包埋切片において特異性をもって結合するリガンドの生成に適していない（例えば、ホルマリン固定後に利用可能なままである特異的なエピトープがない）。

Ｒａｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１３ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；３１：４１３－４４１

例えば、一定の患者に対して最も適切である処置を同定するための改善された診断方法及びツールが必要とされている。

本発明は、とりわけ、組織試料、特にＦＦＰＥ組織試料における細胞表面ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢタンパク質の試験、検出及び／又は監視に関する。本開示は、ヒト腫瘍試料においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢタンパク質を検出する方法の開発から生じる。特に膜又は細胞表面発現のみを考慮した場合に存在し得るようなより低いレベルを含め、ＦＦＰＥ組織試料において低レベルのＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００８及びＭＩＣＢを検出可能である非常に特異的な試験方法の開発を通したものである。本出願人は、ＦＦＰＥ組織試料におけるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ（例えば、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの組み合わせ）に対する多くの腫瘍の染色を提供する。低レベルのタンパク質の検出能を必要とする、ＦＦＰＥ試料での染色、特に膜又は細胞表面の染色は、枯渇性抗ＭＩＣＡ剤での処置に適切な腫瘍を同定するために特に有用であり得る。

本抗体は、ＦＦＰＥプロトコルにおいてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに対する特異性を保持し、特に、これらは、ホルマリン固定後に存在し続け、特異的なままである、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチド上に存在するエピトープに結合する。さらに、ＭＩＣＡポリペプチド上のエピトープは、ヒト集団、ＭＩＣＡ＊００１及び＊００８において、高い優勢ＭＩＣＡアレルの両方に対してホルマリン固定後に存在し続け、特異的なままである。本抗体は、ＩＨＣプロトコルにおける抗原検出の高い特異性を可能にした。その表面で抗体結合標的抗原を保有する細胞（標的抗原に対する治療用抗体とともに予め温置された標的抗原を発現する細胞）から作製されたパラフィン包埋された細胞ペレットを使用する抗体作製法の使用を通して、本発明者らは、複数のＭＩＣＡアレル及びさらにＭＩＣＢを認識可能でありながら、ＦＦＰＥ材料において抗原特異的なエピトープを認識する抗体を得た。得られた診断抗体は、患者からのＦＦＰＥ試料における標的抗原の一貫した検出のための、ユニバーサル単抗体に基づく組成物、キット、系又は方法として機能し得る。組織試料でのＭＩＣＡの検出のためにさらなる複数のアレル特異的な抗体を使用する必要なく、試薬が使用され得る。ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢのレベルが比較的低いＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現腫瘍を検出するために、試薬が使用され得る。腫瘍組織における悪性細胞は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを発現し得るため、試薬は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの少なくとも１つについて陽性である腫瘍を検出するための感度上昇をもたらし得、さらにＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ剤（例えば、ＮＫＧ２Ａタンパク質又は断片、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体）の両方に結合する治療薬での処置から恩恵を受け得る対象を同定する能力の向上をもたらし得る。腫瘍細胞の細胞表面又は細胞膜でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを検出するために、試薬が使用され得る（例えば、サイトゾルタンパク質も評価に含まれる場合と比較して、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢのレベルがより低い場合）。試薬は、複数のＭＩＣＡアレル（例えば、ヒト集団において最も一般的なＭＩＣＡアレルの２つ以上、例えばＭＩＣＡ＊００１及び＊００８など）を認識し得るＭＩＣＡアレル特異的な治療用抗体及びＭＩＣＡアレル汎特異的な治療用抗体を含む、何れかの適切な抗ＭＩＣＡ抗体で処置され得る個体を選択又は同定するために使用され得る。

ホルムアルデヒド固定（例えば、ホルマリン固定、パラホルムアルデヒド固定）され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織は、他の免疫学的方法を超える２つの大きい長所：（１）組織が特別な取り扱いを必要としないこと；及び（２）細胞学的及び構築上の特性がよく認識され、組織病理学的な解釈の改善が可能になることを提供する。本明細書の実施例において、細胞表面で異なるＭＩＣＡアレルを保有する細胞、細胞表面でＭＩＣＢを保有する細胞及び合わせた発現の異なるレベルでＭＩＣＡ又はＭＩＣＢポリペプチドを保有する細胞をそれぞれ別個にホルマリン固定し、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料として調製した。これらの試料の使用の結果、ヒト集団にわたり単一試薬として有用であり、且つＦＦＰＥ試料における細胞、例えば腫瘍細胞の表面又はより一般的には腫瘍組織中の細胞の表面での、組み合わされたＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現のより低いレベルを検出するためにさらに適切である、ヒトＦＦＰＥ組織試料におけるＭＩＣＡの染色及び試験での使用のための抗ＭＩＣＡ抗体が発見された。ヒトドナーからの様々な腫瘍組織において、得られた抗体を試験し、ＦＦＰＥ組織切片における標的抗原の検出において優れた性能を保持することが分かった。示されるように、ＦＦＰＥ試料中の細胞での組み合わされたＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現のより低いレベルを一貫して検出可能でなかった対照抗体と比較した場合、本開示の抗体は、対照抗体を使用して細胞表面でのＭＩＣＡ又はＭＩＣＢについて試験で陰性になった腫瘍タイプに対して、細胞表面でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性（膜染色）であるものとして組織試料を同定可能であった。従って、本抗体は、個体からのＦＦＰＥ試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性腫瘍のより広い範囲の検出を可能にする長所を有し、これによりＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに標的化された薬剤（例えば、抗ＭＩＣＡ及び／又は抗ＭＩＣＢ枯渇剤）でのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性腫瘍を有する個体の処置が可能になる。

一実施形態では、本開示は、パラフィン包埋された組織においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製する方法を提供し、この方法は、ａ）複数の候補抗体を提供するステップと；ｂ）パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞によって発現されるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に（例えば、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢポリペプチドを発現しない、パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞と比較して）結合する、前記複数からの抗体を調製又は選択するステップとを含む。

一実施形態では、本開示は、パラフィン包埋された組織においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製する方法を提供し、この方法は、
ａ）細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドを発現する（例えば、ＭＩＣＢポリペプチドを発現しない）細胞を提供し、このような細胞からパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｂ）細胞であって、その表面でＭＩＣＢポリペプチドを発現する（例えば、ＭＩＣＡポリペプチドを発現しない）細胞を提供し、このような細胞からパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｃ）複数の候補抗体を提供し、（ｉ）ステップａ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＡポリペプチドに結合し、（ｉｉ）ステップｂ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合し、任意選択的に、ＭＩＣＡポリペプチド及びＭＩＣＢポリペプチドの発現を欠く細胞から調製されたパラフィン包埋された細胞試料に結合しない、前記複数からの抗体を調製又は選択するするステップと
を含む。

一実施形態では、本開示は、パラフィン包埋された組織においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製する方法を提供し、この方法は、
ａ）細胞であって、その表面でＭＩＣＡ（例えば、ＭＩＣＡ＊００１又はＭＩＣＡ＊００８）ポリペプチドの第１のアレルを発現する（例えば、唯一のＭＩＣＡポリペプチドとして前記第１のアレルを発現し、ＭＩＣＢポリペプチドを発現しない）細胞を提供し、このような細胞からパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｂ）細胞であって、その表面上で第１のアレルと同じではないＭＩＣＡの第２のアレルを発現する細胞（例えば、唯一のＭＩＣＡポリペプチドとして第２のアレルを発現し、ＭＩＣＢポリペプチドを発現しない細胞）を提供し、このような細胞からパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｃ）細胞であって、その表面でＭＩＣＢポリペプチドを発現する（例えば、ＭＩＣＡポリペプチドを発現しない）細胞を提供し、このような細胞からパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｄ）複数の候補抗体を提供し、（ｉ）ステップａ）のパラフィン包埋された細胞試料において第１のＭＩＣＡアレルポリペプチドに結合し、（ｉｉ）ステップｂ）のパラフィン包埋された細胞試料において第２のＭＩＣＡアレルポリペプチドに結合し、（ｉｉｉ）ステップｃ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合し、任意選択的に、第１及び第２のＭＩＣＡアレルポリペプチド並びにＭＩＣＢポリペプチドの発現を欠く細胞から調製されたパラフィン包埋された細胞試料に結合しない、前記複数の抗体からの抗体を調製又は選択するステップと
をを含む。任意選択的に、ステップ（ｄ）は、複数の候補抗体を提供し、任意選択的に、ＭＩＣＡ＊００１ポリペプチド、ＭＩＣＡ＊００１ポリペプチド及びＭＩＣＢポリペプチドの発現を欠く細胞から調製されたパラフィン包埋された細胞試料に結合することなく、（ｉ）ステップａ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドに結合し、（ｉｉ）ステップｂ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドに結合し、（ｉｉｉ）ステップｃ）のパラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合する、前記複数の抗体からの抗体を調製又は選択することを含む。

一態様では、本開示の抗体を作製する方法によって得られる、パラフィン包埋組織においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体又は抗体断片が提供される。一態様では、本開示の抗体を作製する方法によって得られる抗体を使用して、ホルマリン処理及び／又はパラフィン包埋された組織試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞）を検出する方法が提供される。

一態様では、ホルマリン処理及び／又はパラフィン包埋された組織試料、任意選択的に腫瘍又は腫瘍に隣接する組織試料、任意選択的に治療剤（例えば、化学療法剤）で前処置を受けた個体からの試料において、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞）を検出する方法が提供され、この方法は、ａ）組織試料を抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体（例えば、本開示の診断抗体）と接触させるステップと；ｂ）組織試料において結合される抗体の存在を検出するステップとを含む。ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢが検出される場合、試料は、ＭＩＣＡ／Ｂ（例えば、ＭＩＣＡ発現細胞、ＭＩＣＢ発現腫瘍細胞、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現細胞）を含むと判断され得る。

一実施形態では、本開示は、ヒト腫瘍からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞（例えば、その表面又は細胞膜でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを発現する細胞）を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドと特異的に結合可能である抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。

何れかの実施形態では、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能である抗体は、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合可能であり、且つ／又はそれを染色可能であることを特徴とし得；任意選択的に、本抗体又は抗体断片は、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合可能であり、且つ／又はそれを染色可能であり、任意選択的に、さらに、本抗体又は抗体断片は、低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）の抗体のそれぞれにおいて、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合可能であり、且つ／又はそれを染色可能である。任意選択的に、本抗体又は抗体断片は、パラフィン包埋されたＢｘＰＣ－３細胞と一貫して結合可能であり、且つ／又はそれを染色可能であり、例えば、結合及び／又は染色は、試験が複数回（例えば１０回、２０回、１００回又はそれを超える）反復される場合に各回で観察される。

一実施形態では、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体は、抗体１２Ｃ９、その重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体又は前述の何れかの機能保存的変異体である。

一実施形態では、本抗体は、パラフィン包埋された細胞試料（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを発現するパラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞）においてヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドへの結合について、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。

一態様では、ヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド（例えば、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ発現細胞の試料中のＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド）に特異的に結合可能な抗体又は抗体断片が提供され、この抗体又は抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

一実施形態では、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体若しくは抗体断片又はそれらの機能保存的変異体が提供される。

一態様では、ヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド（例えば、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ発現細胞の試料中のＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド）に特異的に結合可能な抗体又は抗体断片が提供され、この抗体又は抗体断片は、配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含む。一実施形態では、本抗体又は抗体断片は、検出可能部分にコンジュゲート又は共有結合されている。一実施形態では、本抗体又は抗体断片は、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ発現細胞の試料においてＭＩＣＡポリペプチドに結合し、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、ＭＩＣＡ陰性及びＭＩＣＢ陰性であり、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されている細胞に結合しない。

何れかの実施形態では、抗体又は抗体断片は、ヒトＭＩＣＡ＊００４ポリペプチド及び／又はヒトＭＩＣＡ＊００７ポリペプチドに結合可能であることをさらに特徴とし得、例えば、本抗体又は抗体断片は、パラフィン包埋された細胞試料においてＭＩＣＡ＊００４及び／又はＭＩＣＡ＊００７ポリペプチドに結合する。

何れかの実施形態では、ＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞の検出は、
・細胞（例えば、腫瘍細胞、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞）を含む生体試料を（例えば、生検として、細胞ペレットとして）得るステップと；
・試料を固定し、パラフィン中に包埋し、薄切し、且つ脱パラフィン処理し、及び任意選択的に試料をスライドに移すステップと；
・ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体に前記切片を接触させるステップと；
・結合する抗体の存在を切片内で検出するステップと
を含む。

他の実施形態では、抗体を作製するか又は産生させる方法が提供される。他の実施形態では、本明細書に開示される特性を有するパラフィン包埋された細胞試料において抗原に結合するモノクローナル抗体（診断抗体）及び診断抗体と同じ標的抗原に特異的に結合可能な第２の抗体（例えば、治療用抗体）を含むキットが提供される。特定の実施形態では、免疫組織化学アッセイにおける（ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体及び抗体断片を含むが、限定されない）、診断方法における（例えば、治療用抗体での処置のために個体を選択するためのコンパニオン診断での使用を含むが、限定されない）、予後診断方法における、患者監視方法における、本明細書に開示される特性を有するモノクローナル抗体の使用が提供される。

定義
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、「含む」という語と組み合わせて使用されるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は、１つ以上を意味し得る。

「含む」が使用される場合、これは、任意選択的に「から基本的になる」により、より任意選択的に「からなる」によって置き換えられ得る。

本明細書で使用される場合、「パラフィン包埋された試料」（又はパラフィン包埋された「細胞」、「細胞ペレット」、「スライド」又は「組織」）は、固定され、パラフィン中に包埋され、薄切され、脱パラフィン処理され、且つスライドに移された、生物から又はインビトロの細胞培養物から採取された細胞又は組織を指す。固定及びパラフィン包埋が、例えば使用される固定及び包埋方法に関して、従ったプロトコルに関してなど、多くの態様において変動し得る一般的な実施であること及び本発明の目的のために、組織の固定（ホルマリン処理によるものなど）、パラフィン又は同等の物質中での包埋、薄切及びスライドへの移動を含む限り、あらゆるこのような改変方法が包含されることが認識されるであろう。

「生体試料」又は「試料」という用語は、本明細書で使用される場合、体液（例えば血清、リンパ、血液）、細胞試料又は組織試料（例えば骨髄又は組織生検、例えば皮膚、乳房、肺、結腸、卵巣、胃など、粘膜組織、例えば腸、腸の粘膜固有層など）を含むが、限定されない。

「抗体」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、具体的に、全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二特異性抗体）及び所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片及び誘導体を含む。抗体の産生に関連する様々な技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）で提供される。「抗体断片」は、全長抗体の一部、例えばその抗原－結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）３、Ｆｖ（一般的には抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメイン）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（一般的にはＶＨ及びＣＨ１ドメイン）及びｄＡｂ（一般的にはＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ及びＶ－ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９－５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；及び抗体断片から形成される多特異性抗体断片及び１つ以上の単離ＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、ここで単離ＣＤＲ又は抗原結合残基又はポリペプチドは、一緒に会合又は連結されて機能的抗体断片を形成する。例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３，１１２６－１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書において、様々なタイプの抗体断片が記載されるか又は概説されている。

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）からのアミノ酸残基及び／又は「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインにおける２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１－９１７）からの残基を含む。一般的には、この領域におけるアミノ酸残基の番号付与は、前出のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に記載の方法により行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるものとしての可変ドメイン残基番号付与」及び「Ｋａｂａｔに従い」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの番号付与系を指す。Ｋａｂａｔ番号付与系を使用して、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はそこへの挿入に対応するより少ない又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入された残基（例えばＫａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付与は、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付与された配列との抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。抗体又はそれらの変異体のＣＤＲを指すための何れかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用されるような用語の範囲内であるものである。一般に使用される番号付与スキームにより定められるようなＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として下の表１で示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して特定のＣＤＲを何れの残基が含むかを日常的に決定し得る。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲとして定義される領域を除外した抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより分離される連続領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに細かく分けられ得る。

本明細書で定義される場合、「定常領域」は、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによりコードされる抗体由来の定常領域を意味する。「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」は、本明細書で使用される場合、カッパ（Ｃカッパ）又はラムダ（Ｃラムダ）軽鎖によりコードされる抗体の領域を意味する。定常軽鎖は、一般に、単一ドメインを含み、本明細書で定義される場合、Ｃカッパ又はＣラムダの位置１０８～２１４を指し、番号付与はＥＵインデックスに従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」は、本明細書で使用される場合、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＥとして定義するための、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロン遺伝子によりコードされる抗体の領域を意味する。全長ＩｇＧ抗体に対して、定常重鎖は、本明細書で定義される場合、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端を指し、従って、１１８～４４７の位置を含み、番号付与はＥＵインデックスに従う。

「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」は、本明細書で使用される場合、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、孤立したこの領域又はポリペプチド、多特異性ポリペプチド又はＡＢＤ若しくは本明細書で概説されるような何らかの他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。

「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、本明細書で使用される場合、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を意味し、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は、当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の総括については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。

「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」又は「Ｆｖ領域」は、本明細書で使用される場合、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。

「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」は、本明細書で使用される場合、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを排除する抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン及びＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン及びこれらのドメインに対するフレキシブルヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）及びＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界が変動し得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６、Ｐ２３０又はＡ２３１を含むものと定義され、番号付与はＥＵインデックスに従う。Ｆｃは、下記のように、孤立したこの領域又はＦｃポリペプチドの関連でのこの領域を指し得る。「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃポリペプチドは、抗体、Ｆｃ融合物及びＦｃ断片を含むが、限定されない。

「可変領域」は、本明細書で使用される場合、それぞれ軽鎖（カッパ及びラムダを含む）及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構築するＶＬ（Ｖカッパ（ＶＫ）及びＶラムダを含む）及び／又はＶＨ遺伝子の何れかにより実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域を意味する。軽鎖又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域で中断される「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、例えば、Ｋａｂａｔによって（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）及びＣｈｏｔｈｉａなどにおいて、正確に定められている。構成物軽鎖及び重鎖の合わせたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置し、アラインする役割を果たし、これらは、主に抗原への結合に関与する。

ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞に関して「枯渇させる」という用語は、試料において又は対象において存在するＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞の数に負の影響を与えるように、死滅させ得るか、除去し得るか、溶解させ得るか又はこのような死滅、除去若しくは溶解を誘導し得る、工程、方法又は薬剤を意味する。薬剤は、例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに結合し、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞に対してＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）を指示する抗体を含み得るか、又は薬剤は、ＭＩＣＡに結合し、且つ細胞へのその細胞傷害剤の送達によるＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞の死を直接引き起こす抗体薬物複合物であり得る。

「免疫複合物」及び「抗体複合物」という用語は、交換可能に使用され、抗原結合剤、例えば抗体結合タンパク質又は別の部分（例えば、細胞傷害剤）にコンジュゲートされる抗体を指す。細胞傷害剤にコンジュゲートされる抗原結合剤を含む免疫複合物は、「抗体薬物複合物」又は「ＡＤＣ」とも呼ばれ得る。

「薬剤」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生体物質から生じる抽出物を示すために本明細書で使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。

「特異的に結合する」という用語は、タンパク質の組み換え形態、その中のエピトープ又は単離標的細胞の表面に存在するネイティブタンパク質の何れかを使用して評価した場合、抗体又はポリペプチドが、好ましくは結合パートナー、例えばＭＩＣＡ及びＭＩＣＢへの競合的結合アッセイにおいて結合し得ることを意味する。特異的な結合を決定するための競合的結合アッセイ及び他の方法は、さらに以下に記載され、当技術分野で周知である。

抗体又はポリペプチドが特定のモノクローナル抗体「と競合する」と言われる場合、これは、抗体又はポリペプチドが、パラフィン包埋された細胞ペレットにおいて、適切な標的分子又は表面発現標的分子、例えば細胞によって発現されるＭＩＣＡを使用した結合アッセイにおいてモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、結合アッセイにおいて試験抗体がＭＩＣＡポリペプチド又はＭＩＣＡ発現細胞への１２Ｃ９の結合を減少させる場合、この抗体は１２Ｃ９と競合すると言われる。

「機能保存的変異体」は、アミノ酸を同様の特性（例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するアミノ酸で置き換えることを含むが、限定されない、タンパク質又は酵素中のある種のアミノ酸残基がポリペプチドの全体的な立体構造及び機能を変化させることなく改変されている変異体である。保存されるように示されるこれら以外のアミノ酸は、同様の機能の何れか２つのタンパク質間のパーセントタンパク質又はアミノ酸配列類似性が変動し得るようにタンパク質において異なり得、例えばＣｌｕｓｔｅｒ法などによりアライメントスキームに従って決定した場合に７０％～９９％であり得、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定した場合、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％及びさらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドも含み、比較されるネイティブ又は親タンパク質（例えば重鎖若しくは軽鎖又はその可変領域）と同じ又は実質的に類似の特性又は機能を有する。

「親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、エピトープへの抗体又はポリペプチドの結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］として定められる解離定数ＫＤ（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は、抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は、未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は、未結合抗原のモル濃度である）により与えられる。親和性定数ＫＡは、１／ＫＤにより定められる。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）において見られ得、参考文献は、参照により本明細書に全体的に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある好ましい標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングの使用である（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によるなど）。

「エピトープ」という用語は、抗原決定基を指し、抗体又はポリペプチドが結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に遮断されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば抗体又は受容体と合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で近接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定められる。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、分子の折り畳みによって互いに対して近接するようにされる、全てが近接せず、従ってアミノ酸の直鎖状配列の個々の部分に相当する、アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定められる（二次、三次及び／又は四次構造）。立体構造エピトープは、三次元構造に依存する。従って「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。

「アミノ酸修飾」という用語は、本明細書では、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を意味する。本明細書のアミノ酸修飾の例は、置換である。本明細書の「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を意味する。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」は、タンパク質配列におけるある位置でのアミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを意味する。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、位置５０のチロシンがトリプトファンで置き換えられる親ポリペプチドの変異体を指す。ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的にはネイティブ又は「親」ポリペプチド、と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ネイティブアミノ酸配列内のある位置で１つ以上のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を保持し得る。

「保存的」アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ－分岐状側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

「同一性」又は「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用されるとき、２つ以上のアミノ酸残基列の間の一致数により決定される場合の、ポリペプチド間の配列の関係性の程度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により対処されるギャップアライメント（必要に応じて）を伴う２つ以上の配列のより小さいものの間の、同一である一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載のものが挙げられるが、限定されない。

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）から公開されている。同一性を決定するために、周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも使用し得る。

「単離された」分子は、それが属する分子のクラスに関してそれが見出される組成物中の主な種である分子である（すなわち、これは、組成物中の分子タイプの少なくとも約５０％を構成し、一般的には、組成物中の、分子の種、例えばペプチドの少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超えるものを構成する）。一般に、ポリペプチドの組成物は、組成物中の全ての本ペプチド種又は提案される使用との関連で少なくとも実質的に活性のあるペプチド種に関して、ポリペプチドに対して９８％、９８％又は９９％の均一性を示す。

本明細書に関連して、「処置」又は「処置すること」は、文脈により矛盾がない限り、疾患若しくは障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する所見を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒させるか又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する所見が同定されていない患者の「処置」は、予防的又は予防治療であり、一方で疾患若しくは障害の症状又は臨床的に関連する所見が同定されている患者の「処置」は、一般に、予防的又は予防治療を構成しない。

この明細書全体内で、抗ＭＩＣＡ結合剤（例えば、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体）に関して「癌の処置」などに言及する場合には常に、以下の意味がある：（ａ）好ましくは本明細書で特定されるような用量（量）で、癌の処置を可能にする用量（治療有効量）で、このような処置を必要とする、個体、哺乳動物、特にヒトに、（好ましくは薬学的に許容可能な担体物質中の）抗ＭＩＣＡ結合剤を（少なくとも１つの処置に対して）投与するステップを含む、癌の処置の方法；（ｂ）癌の処置のための抗ＭＩＣＡ結合剤又は（特にヒトにおける）前記処置での使用のための抗ＭＩＣＡ結合剤の使用；（ｃ）癌の処置のための医薬調製物の製造のための抗ＭＩＣＡ結合剤の使用、抗ＭＩＣＡ結合剤を薬学的に許容可能な担体又は癌の処置に適切である抗ＭＩＣＡ結合剤の有効用量を含む医薬調製物を混合することを含む、癌の処置のための医薬調製物の製造のために抗ＭＩＣＡ結合剤を使用する方法；又は（ｄ）本出願が提出される国において特許権を取得するために許容される主題に従う、ａ）、ｂ）及びｃ）の何れかの組み合わせ。

ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢを検出するための抗体
ＭＩＣＡ（ＰＥＲＢ１１．１）は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｑ２９９８３を参照されたい）、その遺伝子及びｃＤＮＡ並びにその遺伝子産物又はその天然バリアントを指す。ＭＩＣＡ遺伝子及びタンパク質の命名は、異なるアレルについての配列のアクセッション番号への参照と一緒に、Ｆｒｉｇｏｕｌ Ａ．ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ－Ｐ．Ｒｅｃｅｎｔ Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ．，３（２００５）：９５－１４５ ＩＳＢＮ：８１－７７３６－２４４－５に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子及びタンパク質配列は、タンパク質及びＤＮＡレベルにおける多型を含み、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＵＫ及びＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）により維持されるｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌからも利用可能である。

ＭＩＣＡのアミノ酸配列は、Ｂａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：６２５９－６２６３及びＢａｈｒａｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４４：８０－８１に最初に記載され、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外α１、α２及びα３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。ＭＩＣＡの多型をさらに定義するため、Ｐｅｔｅｒｓｄｏｒｆ ｅｔ ａｌ．（１９９９）は、共通の及び希少なＨＬＡ遺伝子型を有する２７５個体の中でそのアレルを試験した。ヒトＭＩＣＡの細胞外α１、α２及びα３ドメインのアミノ酸配列を配列番号１～５に示す。完全ＭＩＣＡ配列は、２３アミノ酸のリーダー配列並びに膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをさらに含む。ＭＩＣＡ＊００１のアミノ酸配列を配列番号１に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６０に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００４のアミノ酸配列を配列番号２に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６３に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００７のアミノ酸配列を配列番号３に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６６に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊００８のアミノ酸配列を配列番号４に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４１０６７に対応する。ヒトＭＩＣＡアレルＭＩＣＡ＊０１９のアミノ酸配列を配列番号５に示し、それはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２７００８に対応する。

ＭＩＣＢ（ＰＥＲＢ１１．２としても知られる。）は、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂを指す（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｑ２９９８０を参照されたい）。代表的なヒトＭＩＣＢポリペプチドのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＩ１８７４７（配列番号６）で示される。

ＭＩＣＡは、ある細胞中で構成的に発現される一方、低レベルのＭＩＣＡ発現は、通常、宿主免疫細胞の攻撃を生じさせない。しかしながら、ＭＩＣＡは、急速に増殖する細胞、例えば、腫瘍細胞上で上方調節される。全てのＮＫＧ２ＤリガンドのＭＩＣＡは最も高度に発現され、それは広範な腫瘍タイプ（例えば、一般の癌種、膀胱癌、黒色腫、肺癌、肝細胞癌、膠芽細胞腫、前立腺癌、一般の血液悪性腫瘍、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ球性白血病にわたり見出されている。近年、Ｔｓｕｂｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）（ＥＭＢＯ Ｊ：１－１３）は、Ｏ－グリカン分枝酵素、コア２β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２ＧｎＴ）がＭＩＣＡ発現腫瘍細胞中で活性であること及び腫瘍細胞からのＭＩＣＡがコア２Ｏ－グリカン（Ｎ－アセチルガラクトサミンに連結しているＮ－アセチルグルコサミン分枝を含むＯ－グリカン）を含有することを報告した。

Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：７２７－７２９，１９９９は、ＮＫＧ２Ｄについてのストレス誘導性リガンドとしてのＭＩＣＡについての役割を提供した。本明細書において使用される「ＭＩＣＡ」は、ＭＩＣＡ遺伝子の任意のバリアント、誘導体若しくはアイソフォーム又はそれらが指すコードされるタンパク質を含む任意のＭＩＣＡポリペプチドを指す。ＭＩＣＡ遺伝子は多型性であり、細胞外アルファ－１、アルファ－２及びアルファ－３ドメイン中の多数のバリアントアミノ酸の特有の分布を示す。種々のアレルバリアントは、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ）について報告されており、それらのそれぞれは、それぞれの用語、例として、例えば、ヒトＭＩＣＡポリペプチドＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００２、ＭＩＣＡ＊００４、ＭＩＣＡ＊００５、ＭＩＣＡ＊００６、ＭＩＣＡ＊００７、ＭＩＣＡ＊００８、ＭＩＣＡ＊００９、ＭＩＣＡ＊０１０、ＭＩＣＡ＊０１１、ＭＩＣＡ＊０１２、ＭＩＣＡ＊０１３、ＭＩＣＡ＊０１４、ＭＩＣＡ＊０１５、ＭＩＣＡ＊０１６、ＭＩＣＡ＊０１７、ＭＩＣＡ＊０１８、ＭＩＣＡ＊０１９、ＭＩＣＡ＊０２０、ＭＩＣＡ＊０２２、ＭＩＣＡ＊０２３、ＭＩＣＡ＊０２４、ＭＩＣＡ＊０２５、ＭＩＣＡ＊０２６、ＭＩＣＡ＊０２７、ＭＩＣＡ＊０２８、ＭＩＣＡ＊０２９、ＭＩＣＡ＊０３０、ＭＩＣＡ＊０３１、ＭＩＣＡ＊０３２、ＭＩＣＡ＊０３３、ＭＩＣＡ＊０３４、ＭＩＣＡ＊０３５、ＭＩＣＡ＊０３６、ＭＩＣＡ＊０３７、ＭＩＣＡ＊０３８、ＭＩＣＡ＊０３９、ＭＩＣＡ＊０４０、ＭＩＣＡ＊０４１、ＭＩＣＡ＊０４２、ＭＩＣＡ＊０４３、ＭＩＣＡ＊０４４、ＭＩＣＡ＊０４５、ＭＩＣＡ＊０４６、ＭＩＣＡ＊０４７、ＭＩＣＡ＊０４８、ＭＩＣＡ＊０４９、ＭＩＣＡ＊０５０、ＭＩＣＡ＊０５１、ＭＩＣＡ＊０５２、ＭＩＣＡ＊０５３、ＭＩＣＡ＊０５４、ＭＩＣＡ＊０５５、ＭＩＣＡ＊０５６及びさらにアレルＭＩＣＡ＊０５７～ＭＩＣＡ＊０８７により包含される。

本明細書において使用される「ＮＫＧ２Ｄ」及び特に記載のない限り又は文脈により矛盾がない限り、用語「ｈＮＫＧ２Ｄ」、「ＮＫＧ２－Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２Ｓ２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１」又は「ＫＬＲＫ１」は、ヒトキラー細胞活性化受容体遺伝子、そのｃＤＮＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７３６０）及びその遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３１３８６）又はその天然バリアントを指す。ＮＫ及びＴ細胞中で、ｈＮＫＧ２Ｄは、タンパク質、例えば、ＤＡＰ１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）とヘテロダイマー又はより高次の複合体を形成し得る。本明細書においてｈＮＫＧ２Ｄに起因する任意の活性、例えば、細胞活性化、抗体認識などは、ヘテロダイマーの形態のｈＮＫＧ２Ｄ、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ－ＤＡＰ１０又はそれらの２つの（及び／又は他の）成分とのより高次の複合体にも起因し得る。

ＮＫＧ２Ｄとの複合体中のＭＩＣＡの三次元構造は、決定されている（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；２：４４３－４５１；コード１ｈｙｒ及びＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ（Ｋａａｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２：Ｄ２０８－Ｄ２１０）を参照されたい）。ＭＩＣＡがＮＫＧ２Ｄホモダイマーとの複合体中に存在する場合、ＭＩＣＡα２の残基６３～７３（ＩＧＭＴ番号付与）が配列され、ほぼ２つのへリックスのターンを付与する。ＮＫＧ２Ｄの２つのモノマーは、ＭＩＣＡとの相互作用に等しく寄与し、それぞれのＮＫＧ２Ｄモノマー中の７つの位置がＭＩＣＡα１又はα２へリックスドメインの１つと相互作用する。

本開示の抗体（例えば診断抗体）は、ヒトＭＩＣＡ（ＭＩＣＡ＊００１及びＭＩＣＡ＊００８、任意選択的にさらにＭＩＣＡ＊００４、ＭＩＣＡ＊００７及び／又はＭＩＣＡ＊０１９を含む）及びＭＩＣＢに、特にパラフィン包埋された組織切片などの固定試料において、特異的に結合する。本抗体は、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現細胞を含む生体試料（例えばＦＦＰＥ切片）におけるそれらの標的抗原に特異的に結合し得る。

本抗体は、任意選択的に、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００１発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドに結合する、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００８発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ陰性細胞（例えばＲａｊｉ細胞）に結合しない、抗体又は抗体断片として特徴づけられ得る。何れかの実施形態では、本抗体又は抗体断片は、任意選択的に、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００２発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００２ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片としてさらに特徴づけられ得る。何れかの実施形態では、本抗体又は抗体断片は、任意選択的に、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００７発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００７ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片としてさらに特徴づけられ得る。何れかの実施形態では、本抗体又は抗体断片は、任意選択的に、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００４発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００４ポリペプチドに結合する抗体又は抗体断片としてさらに特徴づけられ得る。

本明細書に記載のように、パラフィン包埋された組織切片中でＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに特異的に結合するための抗体の能力により、多くの適用に対して、特に、診断又は治療目的のためにＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞（例えば、腫瘍細胞、腫瘍進行に寄与する細胞、宿主免疫系による制御又は溶解からの腫瘍の回避に寄与する細胞）及びＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞のレベル又は分布を検出するために、抗体が有用になる。特定の実施形態では、本抗体は、個体、例えば癌若しくは腫瘍を有する個体から採取された試料（例えば、生検）における腫瘍組織中又は腫瘍組織付近で、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞の存在又はレベルを決定するために使用される。任意選択的に、さらに、一実施形態では、細胞（例えば、腫瘍細胞）膜でのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの存在が評価され、且つ／又は組織試料において検出される。任意選択的に、さらに、一実施形態では、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢが組織試料において検出される場合、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞が存在すると判断される。任意選択的に、別の実施形態では、組織試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢが検出される場合（任意選択的に、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ染色の所定レベルが検出される場合）、その個体は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに結合する治療用抗体、例えば枯渇性の抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗体、での処置に適切であると判断される。任意選択的に、一実施形態では、個体は、（例えば進行中又は以前の治療コースで）標的抗原に結合する治療用抗体で処置されたことがある。

ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに対する抗体の結合の検出は、多くの方法の何れかで行われ得る。例えば、本抗体は、検出可能部分、例えば発光化合物、例えば蛍光部分若しくは放射性化合物、金、ビオチン（アビジンへの続く増幅された結合を可能にする、例えばアビジン－ＡＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）若しくはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素で直接標識され得る。代わりに、試料中での標的抗原への抗体の結合は、例えば一次抗標的抗原抗体に結合し、且つそれ自体が好ましくはホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素で標識された二次抗体を使用することにより、間接的に評価され得るが、しかし、何れかの適切な方法を使用して二次抗体が標識され得るか又は検出され得ることが認識されるであろう。好ましい実施形態では、二次抗体により提供されるシグナルを増強させるために、増幅系が使用され、例えば二次抗体が、ＨＲＰ又はＡＰなどの検出可能な化合物又は酵素の多くのコピーに結合されるポリマー（例えばデキストラン）に結合されるＥｎＶｉｓｉｏｎ系がある（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｉｅｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４９（９）：１０６７－１０７１；Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４９，６２３－６３０を参照されたい）。

一態様では、本開示は、ＦＦＰＥ試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを検出し得る抗体を作製する方法を提供する。抗体を生じさせるための免疫原としてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ又は１つ以上のその免疫原性断片を使用し得、この抗体は、本明細書に記載のようなパラフィン包埋された試料において標的抗原ポリペプチド内でエピトープを認識し得る。好ましくは、認識されるエピトープは細胞表面上に存在し、すなわち、これらは、細胞の外側に存在する抗体にとって接近可能である。一態様では、このエピトープは、抗体１２Ｃ９により、パラフィン包埋された細胞ペレット試料において特異的に認識されるエピトープである。一態様では、抗体は、パラフィン包埋された細胞ペレット試料において、抗体１２Ｃ９により特異的に認識されるエピトープに対する結合について抗体１２Ｃ９と競合する。さらに、異なる以前の治療を受けていたか又は受けていたものであり得る、特に標的抗原ポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ、ＭＩＣＡ＊００１及びＭＩＣＡ＊００８及びさらにＭＩＣＢ）に対する治療用抗体で処置されていたか又は受けていたものであり得るヒト個体の集団において最大の効力及び幅でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに結合させるために、ＭＩＣＡ内で抗体１２Ｃ９により認識されるエピトープに対して、同じエピトープを認識するか又は１２Ｃ９と結合について競合する抗体が使用され得る。

本抗体は、当技術分野で公知であり、例えば本明細書の実施例２で示されるような様々な技術により作製され得る。一般的には、これらは、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００８及びＭＩＣＢポリペプチド）、好ましくはヒトポリペプチドを含む免疫原での非ヒト動物、好ましくはマウスの免疫付与により作製される。ポリペプチドは、ヒトポリペプチドの全長配列又はその断片若しくは誘導体、典型的には、免疫原性断片、すなわちＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞の表面上で露出されるエピトープ、好ましくは１２Ｃ９抗体により認識されるエピトープを含むポリペプチドの一部を含み得る。そのような断片は、典型的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７つの連続アミノ酸、いっそうより好ましくは、その少なくとも約１０の連続アミノ酸を含有する。断片は、典型的には、本質的に、受容体の細胞外ドメインに由来する。一実施形態において、免疫原は、野生型ヒトＭＩＣＡポリペプチド又はその断片を含む。具体的な実施形態において、免疫原は、任意選択的に、治療又は溶解されるインタクトな細胞、特にインタクトなヒト細胞を含む。

非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化するステップは、マウス中での抗体の産生を刺激する当技術分野において周知の任意の様式で実施することができる（例えば、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。免疫原は、任意選択的に、アジュバント、例えば完全又は不完全フロイントアジュバントを有する緩衝液中で懸濁又は溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプ及びアジュバントの量を測定する方法は、当業者に周知であり、本発明を決して限定するものではない。これらのパラメーターは、異なる免疫原について異なり得るが、容易に解明される。

同様に、抗体の産生を刺激するために十分な免疫化の局在及び頻度も、当技術分野において周知である。典型的な免疫プロトコルにおいて、非ヒト動物に１日目及び約１週間後に再度、抗原を腹腔内注射する。この後、約２０日目に、任意選択的にアジュバント、例えば不完全フロイントアジュバントによる抗原のリコール注射を行う。リコール注射は静脈内で実施し、数日間連続して繰り返すことができる。この後、４０日目、典型的にはアジュバントを用いずに静脈内又は腹腔内の何れかでブースター注射を行う。このプロトコルは、約４０日後、抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の産生をもたらす。免疫化において使用される抗原に指向される抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコルを使用することもできる。

代替的実施形態において、非免疫化非ヒト哺乳動物からのリンパ球を単離し、インビトロで成長させ、次いで細胞培養物中で免疫原に曝露させる。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合ステップを実施する。

脾細胞は、免疫化非ヒト哺乳動物から単離され得、続いてそれらの脾細胞を不死化細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを形成する。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は、当技術分野において周知であり、典型的には、麻酔された非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出し、それを小片に切断し、脾細胞を脾膜から細胞濾過器のナイロンメッシュを介して適切な緩衝液中に搾出して単一の細胞懸濁液を産生することを含む。細胞を洗浄し、遠心分離し、いかなる赤血球も溶解する緩衝液中で再懸濁させる。溶液を再び遠心分離し、最終的にペレット中の残留リンパ球を新たな緩衝液中で再懸濁させる。

リンパ球は、単離され、単一の細胞懸濁液中で存在する場合、不死細胞系と融合させることができる。これは、典型的には、マウス骨髄腫細胞系であるが、ハイブリドーマの作出に有用な多数の他の不死細胞系は当技術分野において公知である。好ましいネズミ骨髄腫系としては、限定されるものではないが、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＭＯＰＣ－２１及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．から入手可能なＸ６３ Ａｇ８６５３及びＳＰ－２細胞に由来するものが挙げられる。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られたハイブリドーマを、未融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する選択培地中で成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、それらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を妨害する。

ハイブリドーマは、典型的には、マクロファージのフィーダー層上で成長させる。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物のリッターメイトからのものであり、典型的には、ハイブリドーマをプレーティングする数日前に不完全フロイントアジュバントなどによりプライミングする。融合方法は、Ｇｏｄｉｎｇ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”ｐｐ．５９－１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

細胞は、コロニー形成及び抗体産生に十分な時間、選択培地中で成長させておく。これは通常、約７～約１４日間である。

固定及びパラフィン包埋されたＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞ペレット上でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに特異的に結合する抗体の作製のために、ハイブリドーマコロニーをアッセイし得、任意選択的にハイブリドーマは、固定されたパラフィン包埋ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞ペレットへの結合において抗体１２Ｃ９と競合することについてアッセイされる。１つ以上の別個のコロニーが存在するか否かを決定するために、所望の抗体産生について陽性のウェルを試験する。複数のコロニーが存在する場合、所望の抗体を産生するコロニーを単一の細胞のみが生じさせたことを確認するために細胞を再クローン化し、増殖させ得る。標的抗原（例えば、ＭＩＣＡ）を天然には発現しない細胞を、標的抗原を発現するようにし（例えば、標的抗原を発現する核酸での遺伝子移入による）、細胞ペレットとして調製し、ホルマリン固定し、パラフィン中で包埋し、薄切し、脱パラフィン処理し、且つスライドに移し得る。標的抗原を発現しない対照細胞（例えば標的抗原で遺伝子移入されていない上記と同じ細胞）を陰性対照として使用し得る。

所望のモノクローナル抗体を産生することが確認されているハイブリドーマは、適切な培地、例えばＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ－１６４０中でより大量に成長させることができる。代わりに、ハイブリドーマ細胞は、動物中で腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。モノクローナル抗体（又は腹水）を含有する成長培地は、所望のモノクローナル抗体を産生するために十分に成長させた後、細胞から分離し、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ若しくはプロテインＧ－セファロース又は固体支持体、例えば、アガロース若しくはセファロースビーズに結合している抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーにより達成する（全ては、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１８－１０３７－４６，Ｅｄｉｔｉｏｎ ＡＣに記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。結合抗体は、典型的には、抗体含有画分の即時中和を伴う低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシン又は酢酸緩衝液）の使用により、プロテインＡ／プロテインＧカラムから溶出させる。これらの画分は、必要に応じてプール、透析及び濃縮する。

外見上単一のコロニーを有する陽性のウェルを、典型的には、再クローニング及び再アッセイして１つのモノクローナル抗体のみが検出及び産生されていることを確保する。

抗体は、例えば、（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４、その全開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるとおり、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択により産生することもできる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、ライブラリを作製し得る。

代替的な実施形態によれば、ハイブリドーマを最初に、標的抗原ポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ）に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイし得、抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主細胞への遺伝子移入のための適切な発現ベクターに配置する。次に、抗体又はそれらの変異体、例えば抗体の機能的断片、その抗体の抗原認識部分を含むキメラ抗体又は検出可能部分を含むバージョンなどの組み換え産生のために宿主細胞を使用する。次に、固定及びパラフィン包埋されたＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞ペレット上でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに特異的に結合する抗体の産生について組み換え産生された抗体をアッセイし得、任意選択的に、固定されパラフィン包埋されたＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞ペレットへの結合における抗体１２Ｃ９との競合についてハイブリドーマをアッセイする。

ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに結合する、特にＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（又は１２Ｃ９が結合するその上のエピトープ）への結合についてモノクローナル抗体１２Ｃ９と競合する１つ以上の抗体の同定は、本明細書に記載の方法又は何れかの他の適切な方法に従い、抗体競合が評価され得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイの何れか１つを使用して、容易に決定され得る。

特定の実施形態では、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗原試料（例えば、パラフィン包埋されたＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞ペレット試料）への適用前にある時間にわたり、様々な量の試験抗体と対照抗体（例えば、１２Ｃ９）を予め混合する（例えば、約１：１０又は約１：１００）。他の実施形態では、対照及び様々な量の試験抗体は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗原試料への曝露中に単純に混合され得る。遊離抗体から結合抗体を（例えば未結合の抗体を除去するための分離又は洗浄技術を使用することにより）、且つ試験抗体から１２Ｃ９を（例えば、種特異的な又はアイソタイプ特異的な二次抗体を使用するか、又は検出可能な標識で１２Ｃ９を特異的に標識することにより）区別し得る限り、試験抗体が抗原への１２Ｃ９の結合を減少させるか否かを決定し得、これにより試験抗体が抗原への結合について１２Ｃ９と競合することが示される。完全に無関連な抗体の不存在下での（標識）対照抗体の結合は、高値の対照として機能し得る。低値の対照は、標識（１２Ｃ９）抗体を全く同一のタイプ（１２Ｃ９）の未標識抗体と温置することにより得ることができ、この場合、競合が生じ、標識抗体の結合を低減させる。試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性における有意な低減は、標識（１２Ｃ９）抗体と「交差反応する」試験抗体を示す。１２Ｃ９のＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢへの結合を、少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％又はより好ましくは少なくとも約７０％（例えば、約６５～１００％）だけ低減させる任意の試験抗体を、約１：１０～約１：１００の１２Ｃ９：試験抗体の任意の比において、１２Ｃ９と競合する抗体であるとみなす。好ましくは、そのような試験抗体は、１２Ｃ９のＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗原への結合を、少なくとも約９０％（例えば、約９５％）だけ低減させる。

脊椎動物又は細胞（又は例えば、候補抗体のライブラリの作製、任意選択的に抗体に対する核酸若しくはアミノ酸配列のライブラリ）における免疫付与及び抗体の作製時、主張されるような抗体を単離するために、特定の選択ステップを実施し得る。この点で、特定の実施形態では、本発明は、（ａ）抗体のライブラリを提供し及び／又はＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを含む免疫原で非ヒト哺乳動物に免疫付与し、前記免疫付与された動物から抗体を調製することと；（ｂ）パラフィン包埋された細胞ペレット、例えばＦＦＰＥ細胞ペレットにおいて前記ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能なステップ（ａ）からの抗体を選択することとを含む、このような抗体を作製する方法にも関する。

本発明のモノクローナル抗体、例えば抗体１２Ｃ９をコードするＤＮＡは、慣用の手順を使用して（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定することができる。ＤＮＡは、単離したら、発現ベクター中に配置することができ、次いでそれを他で免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞中に形質移入して組み換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他箇所において記載されるとおり、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的の何れかのため、例えば、抗体をヒト化するため、断片若しくは誘導体を産生するか、又は例えば抗原結合部位中の抗体の配列を改変するために改変して抗体の結合特異性を最適化することができる。

本開示は、さらに固定前に他の抗ＭＩＣＡ抗体（例えば中和抗体）とともに細胞を温置するときを含め、ホルマリン処理後に存在するＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢエピトープを明らかにする、ホルムアルデヒド処理し、パラフィン中に包埋した細胞ペレット（ＦＦＰＥ細胞ペレット）に基づくスクリーニング法を提供する。従って、一態様では、本開示は、パラフィン包埋された細胞ペレット（及び分析前に脱パラフィン処理）として保存された試料において、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド発現細胞（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを発現するようにされた細胞）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。任意選択的に、本抗体は、パラフィン包埋された細胞ペレットにおいてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞（ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢの何れも発現しない細胞）に結合しないことをさらに特徴とする。任意選択的に、本抗体は、パラフィン包埋された組織切片においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド発現細胞への結合をさらに特徴とする。

一態様では、本開示は、ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体（例えば第１の抗体）を提供し、前記抗体（例えば、第１の抗体）は、ホルムアルデヒド（例えば、ホルマリン、パラホルムアルデヒド）を使用して処理されている（又は固定されている）生体試料において前記ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する。ホルムアルデヒド固定は、特に、その後、脱パラフィン処理され、関心対象のマーカー、例えばＭＩＣＡの存在について分析され得る、パラフィン包埋組織切片の調製において使用され得る。

一態様では、パラフィン中で保存されている細胞、例えばパラフィン包埋された細胞ペレットとして保存されている細胞によって発現されるヒトＭＩＣＡポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。任意選択的に、この細胞をペレット化し、ホルムアルデヒド処理し（例えば、ホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド）、次いでパラフィン包埋する。任意選択的に、ヒトＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞は、抗体結合及び分析前に脱パラフィン処理された生体試料中にある。

一態様では、本抗体は、ＦＦＰＥ細胞ペレット試料において、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ上、任意選択的にＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００８及びＭＩＣＢ上に存在する抗原決定基に結合する。一態様では、本抗体は、実質的に抗体１２Ｃ９と同じエピトープ又は決定基と結合するか、又はＦＦＰＥ細胞ペレット試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ上のこのようなエピトープへの結合について１２Ｃ９と競合する。一実施形態では、本抗体は、抗体１２Ｃ９が結合するエピトープ中の少なくとも１つの残基と少なくとも部分的に重複するか又はそれを含むＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢのエピトープに結合する。本抗体が結合する残基は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドの表面上、任意選択的にさらに細胞の表面上で発現されるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドの表面上、任意選択的にさらにパラフィン包埋された細胞ペレットとして保存されている細胞の表面上で発現されたＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドの表面上に存在するものとして特定され得る。

抗体１２Ｃ９の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号７として挙げられ、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８として挙げられる。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体１２Ｃ９と同じエピトープ又は決定基と基本的に結合し；任意選択的に、本抗体は、抗体１２Ｃ９の超可変領域を含む。本明細書の実施形態の何れかでは、抗体１２Ｃ９は、アミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列を特徴とし得る。一実施形態では、本モノクローナル抗体は、１２Ｃ９のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、１２Ｃ９の重鎖可変領域又はそれらの機能保存的変異体を含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、１２Ｃ９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。１２Ｃ９の可変軽鎖可変領域又はその機能保存的変異体をさらに含むモノクローナル抗体も提供される。一実施形態によれば、本モノクローナル抗体は、１２Ｃ９の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。任意選択的に、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲの何れか１つ以上は、１、２、３、４又は５つ又はそれを超えるアミノ酸修飾（例えば置換、挿入又は欠失）を含有し得る。任意選択的に、抗体１２Ｃ９の抗原結合領域の一部又は全てを含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域の何れかが、例えばエフェクター機能（ヒトＦｃγ受容体への結合）を調整する（例えば低下させる）ために又は関心対象の部分（例えば、検出可能部分）のコンジュゲーションをもたらすためのアミノ酸置換を任意選択的にさらに含む、ＩｇＧタイプの免疫グロブリン定常領域、任意選択的にヒト定常領域、任意選択的にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４アイソタイプに融合される抗体が提供される。

一態様では、抗ＭＩＣＡ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性）を有する重鎖可変領域を含む。

一態様では、抗ＭＩＣＡ抗体は、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域に対して少なくとも約８０％の配列同一性（例えば少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又はそれを超える同一性）を有する軽鎖可変領域を含む。

一態様では、本抗体は、アミノ酸配列：ＧＹＹＭＮ（配列番号９）又はその少なくとも４個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得る）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＴＩＮＰＹＹＧＳＳＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１０）又はその少なくとも４、５、６、７、８、９又は１０個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得る）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＶＤＧＤＨＧＹＦＤＹ（配列番号１１）又はその少なくとも４、５又は６個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得る）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＧＮＴＹＬＨ（配列番号１２）又はその少なくとも４、５、６、７、８、９又は１０個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得る）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＫＶＳＴＲＦＳ（配列番号１３）又はその少なくとも４、５又は６個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により置換され得る）を含むＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＳＱＳＴＨＶＰＦＴ（配列番号１４）又はその少なくとも４、５、６、７又は８個の連続アミノ酸の配列（任意選択的にこれらのアミノ酸の１つ以上が異なるアミノ酸により欠失させられ得るか又は置換され得る）を含むＬＣＤＲ３領域を含む。

特定の重鎖、軽鎖、可変領域、フレームワーク及び／又はＣＤＲ配列は、配列修飾、例えば置換（１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超える配列修飾）を含み得る。一実施形態では、アミノ酸配列は、１、２、３個又はそれを超えるアミノ酸置換を含み、置換される残基は、ヒト起源の配列において存在する残基である。一実施形態では、置換は保存的修飾である。保存的配列改変は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴に有意に影響せず、変化もさせないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変としては、アミノ酸置換、付加及び欠失が挙げられる。改変は、当技術分野において公知の標準的技術、例えば、部位特異的突然変異導入及びＰＣＲ媒介突然変異導入により本発明の抗体中に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、アミノ酸残基を、類似の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えるものである。規定のアミノ酸配列は、１、２、３、４つ以上のアミノ酸挿入、欠失又は置換を含み得る。置換を行う場合、好ましい置換は、保存的改変である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基により置き換えることができるか、又は変化された抗体は、保持された機能（すなわち本明細書に記載の特性）について本明細書に記載のアッセイを使用して試験することができる。

一実施形態では、本発明の抗体は、それらの結合及び／又は機能特性を保持する抗体断片である。本発明の抗体の断片及び誘導体（特に記載がなく又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本出願において使用される用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」により包含される）、好ましくは１２Ｃ９様抗体は、当技術分野において公知の技術により産生することができる。「断片」は、インタクト抗体の一部、一般に抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；連続アミノ酸残基の１つの不断配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書において「単鎖抗体断片」又は「単鎖ポリペプチド」と称される）、例として、限定されるものではないが、（１）単鎖Ｆｖ分子、（２）会合重鎖部分を有さない、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する単鎖ポリペプチド又は軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、及び（３）会合軽鎖部分を有さない、１つの重鎖可変領域のみを含有する単鎖ポリペプチド又は重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを有するその断片；並びに抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体又は抗体断片は、検出可能部分に抗体又は抗体断片をコンジュゲート又は共有結合させることによって誘導体化される。

ＦＦＰＥ試料の調製及び染色
本抗体は、固定された組織又は細胞試料中に存在するポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチド）に効率的に及び特異的に結合可能である特定の特性を有する。このような組織調製物を調製する及び使用する様々な方法が当技術分野で周知であり、調製の何れかの適切な方法又はタイプを使用し得る。本抗体は、治療用（例えば機能中和）抗体が固定時又は固定前に存在した試料においてそれらの標的抗原にさらに結合可能である。

個体からの生体試料中のＦＦＰＥ材料は、一般的に、組織である。ＦＦＰＥ組織は、切開又は生検により検体動物（例えばヒト個体）から最初に分離される組織片である。次いで、この組織は、その崩壊又は分解を防ぎ、且つ組織学的、病理学的又は細胞学的研究用の顕微鏡下でそれを明白に調べることができるようにするために固定される。固定は、染色し、顕微鏡下でそれを調べる目的で、組織を固定化し、死滅させ、保存する工程である。固定後の処理により、組織に染色試薬が透過するようになり、それらがある位置で安定化され、ロックされるようにその巨大分子を架橋する。次に、この固定された組織をワックス中に包埋して、薄切し、ヘマトキシリン及びエオシン染色で染色できるようにする。その後、顕微鏡下で抗体による染色を調べるために薄切することにより、ミクロトーム処理を行う。

例えば、異なる適切な固定した細胞又は組織標本とともに本抗体を使用し得、異なる特定の固定又は包埋方法が使用されることが認識されるであろう。例えば、最も一般的なホルムアルデヒドに基づく固定手順は、ホルマリン（例えば１０％）を伴う一方で、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）、ブアン溶液（ホルマリン／ピクリン酸）、アルコール、亜鉛ベースの溶液（一例について、例えば、その全体において開示全体が本明細書に組み込まれるＬｙｋｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，１－１０を参照されたい）及び他（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＨＯＰＥ法、Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ１９７，Ｎｕｍｂｅｒ １２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００１，ｐｐ．８２３－８２６（４）を参照されたい）などの代替的な方法がある。同様に、パラフィンが好ましい一方で、例えば、ポリエステルワックス、ポリエチレングリコールに基づく処方、グリコールメタクリラート、ＪＢ－４プラスチックなど、他の材料も包埋のために使用し得る。組織調製物を調製する及び使用する方法の概説としては、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；１６０（２）：４４９－４５７；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣＳＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；２００８；Ｒｅｎｓｈａｗ（２００７），Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ；Ｂａｎｃｒｏｆｔ（２００７）Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；及び国際公開第０６０７４３９２号パンフレットを参照されたい）。

本発明の一実施形態では、ＦＦＰＥ組織は、腫瘍組織又は腫瘍隣接組織、例えばヒト腫瘍組織である。腫瘍は、例えば頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌又はメラノーマの腫瘍であり得る。

本抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗体）は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドの検出のためにＦＦＰＥ材料とともに温置される。温置ステップという用語は、材料、抗体及び／又は抗原の種類に依存する別個の期間、ＦＦＰＥ材料と本発明の抗体との接触を伴う。温置の工程は、様々な他のパラメーター、例えば検出感度にも依存し、最適化は当業者にとって公知の通常の手順に従う。化学溶液の添加及び／又は物理的手順の適用、例えば熱の影響により、試料中の標的構造の到達性を改善し得る。特異的な温置生成物が温置の結果として形成される。

形成される抗体／抗原複合体の検出のための適切な試験は、当業者にとって公知であるか、又は通常のこととして容易に設計され得る。多くの異なるタイプのアッセイが知られており、その例を下で示す。

例えば、調べようとする試料（組織又は細胞）は、体液、腫瘍組織からの又は健康な組織からの生検及び切片（例えば、厚さ３ｍｍ以下）により得て、ホルマリン又は同等の固定方法（上記を参照されたい）を使用して固定し得る。固定の時間は、適用に依存するが、数時間～２４時間又はそれを超える範囲であり得る。固定後、パラフィン（又は同等の材料）中に組織を包埋し、非常に薄い切片（例えば５ミクロン）になるようにミクロトームで切り、次いで好ましくはコーティングされたスライド上に載せる。次に、スライドを乾燥、例えば風乾させる。

スライド上で固定され、包埋された組織切片を乾燥させ、無期限に保管し得る。免疫組織化学のために、スライドを脱パラフィン処理し、次いで再水和する。例えば、これらは、最初にキシレン、次にエタノール入りのキシレンで、次に水中のエタノールのパーセンテージを漸減させる、一連の洗浄に供される。

抗体染色前に、固定中に形成し、エピトープを遮蔽し得るメタン架橋を破壊するために、例えば酵素性又は加熱に基づく、抗原賦活化ステップに組織を供し得る。好ましい実施形態では、１０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６の沸騰中での処置が使用される。

スライドを再水和し、抗原賦活化を理想的に行ったら、これらを一次抗体とともに温置し得る。最初に、スライドを例えばＴＢＳで洗浄し、次いで例えば血清／ＢＳＡでのブロッキングステップ後、本抗体を適用し得る。本抗体の濃度は、その形態（例えば精製）、その親和性、使用される組織試料に依存するが、適切な濃度は、例えば１～１０μｇ／ｍｌである。一実施形態では、使用される濃度は１０μｇ／ｍｌである。温置時間は、同様に変動し得るが、一晩温置が一般的に適切である。例えばＴＢＳ中でのポスト抗体洗浄ステップ後、次に抗体結合の検出のためにスライドを処理する。

使用される検出方法は、使用される抗体、組織などに依存し、例えば一次抗体にコンジュゲートされるか又は検出可能な二次抗体の使用を通した発光又はそうでなければ可視的若しくは検出可能部分の検出を伴い得る。抗体検出の方法は当技術分野で周知であり、例えばＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １，１９８８）；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．ＣＳＨ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；２００８；Ｒｅｎｓｈａｗ（２００７），Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｅｒｉｅｓ；Ｂａｎｃｒｏｆｔ（２００７）Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；国際公開第０６０７４３９２号パンフレットで教示され；これらのそれぞれの開示全体がその全体において本明細書に組み込まれる。

多くの直接的又は間接的検出方法が既知であり、使用に適合させ得る。直接的な標識は、抗体に連結された、蛍光又は発光タグ、金属、色素、放射性核種などを含む。ヨウ素－１２５（１２５Ｉ）で標識される抗体が使用され得る。タンパク質に特異的な化学発光抗体を使用した化学発光アッセイは、タンパク質レベルの高感度の非放射活性検出に適切である。蛍光色素で標識される抗体も適切である。蛍光色素の例としては、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｒ－フィコシアニン、Ｂ－フィコエリスリン、Ｒ－フィコエリスリン、ローダミン、テキサスレッド及びリサミンが挙げられるが、限定されない。

間接的な標識としては、当技術分野で周知である様々な酵素、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどが挙げられる。抗ＭＩＣＡ抗体と酵素との共有結合は、グルタルアルデヒドとのカップリングなど、異なる方法により行われ得る。酵素及び抗体の両方とも、遊離アミノ基を介してグルタルアルデヒドと連結され、ネットワーク化された酵素の副産物及び抗体が除去される。別の方法では、酵素は、ペルオキシダーゼなどの糖タンパク質である場合、糖残基を介して抗体にカップリングされる。酵素は、過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化され、抗体のアミノ基で直接連結される。炭水化物を含有する他の酵素もこのように抗体にカップリングされ得る。酵素カップリングは、サクシニミジル６－（Ｎ－マレイミド）ヘキサノアートなどのヘテロ二官能性リンカーを使用して、β－ガラクトシダーゼなどの酵素の遊離チオール基と抗体のアミノ基を連結することによっても行われ得る。例えば、４５０ｎｍで検出可能である過酸化水素の存在において可溶性の生成物を生じさせる発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに、ホースラディッシュ－ペルオキシダーゼ検出系を使用し得る。例えば４０５ｎｍで容易に検出可能である可溶性の生成物を生じさせる発色性の基質ｐ－ニトロフェニルホスファートとともに、アルカリホスファターゼ検出系を使用し得る。同様に、４１０ｎｍで検出可能な可溶性の生成物を生じさせる発色性の基質ｏ－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノキシド（ＯＮＰＧ）とともに、β－ガラクトシダーゼ検出系を使用し得る。尿素－ブロモクレゾールパープルなどの基質とともに、ウレアーゼ検出系を使用し得る。

一実施形態では、一次抗体の結合は、標識された二次抗体、好ましくはＨＲＰ又はＡＰなどの酵素に共有結合された二次抗体への結合により検出される。特に好ましい実施形態では、抗体検出の増幅のための多くの方法の何れかを使用して、二次抗体の結合により生成されるシグナルを増幅させる。例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ法を使用し得（例えば、米国特許第５，５４３，３３２号明細書及び欧州特許第５９４，７７２号明細書；Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４９，６２３－６３０；Ｗｉｅｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ４９（９）：１０６７－１０７１を参照されたく；その全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる）、ここで、二次抗体は、ＡＰ又はＨＲＰの多数のコピーにそれ自体連結されるポリマー（例えばデキストラン）に連結される。

一例において、ホルマリン固定されパラフィン包埋されたブロックを５μｍの厚さの切片にスライスし、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ又はＢｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｌｔｒａ ａｕｔｏｍａｔｏｎ（Ｖｅｎｔａｎａ）上で免疫染色を行う。細胞コンディショニング１での前処理後、２μｇ／ｍＬ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒ上での染色のために）又は６．６μｇ／ｍＬ（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ Ｕｌｔｒａ上での染色のために）の抗ＭＩＣＡ／Ｂ一次抗体又はマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照とともに、３７℃で１時間、切片を温置する。次に、ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｍｐ ＨＱ（商標）キット又はＵｌｔｒａＶｉｅｗ（商標）キットを使用したシグナル増幅を行う。３，３－ジアミノベンジジンでの顕色後、ヘマトキシリン及び青味剤で対比染色し、切片を洗浄し、脱水し、透明化し、カバースリップを載せる。最後に、スライドスキャナー（Ｓ６０ Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ（商標）Ｈａｍａｍａｔｓｕ又はＰａｎｎｏｒａｍｉｃ ｓｃａｎ ＩＩ，３ＤＨｉｓｔｅｃｈ（商標））上で、染色した切片をスキャンする。腫瘍細胞上のＭＩＣＡ／Ｂ発現を決定する訓練された病理学者が、染色を解釈し、スコア化する。ＭＩＣＡ／Ｂ陽性腫瘍細胞の指定パーセンテージ（例えば１％、５％、１０％など）を超える試料をＭＩＣＡ／Ｂ陽性とみなす。

組成物及び診断、予後診断及び治療での使用
本開示の抗体は、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢポリペプチドを発現しない組織又は細胞上で非特異的な染色なく、ＦＦＰＥとして調製された生体試料内で、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ（例えばヒト集団におけるＭＩＣＡの複数の最も優勢なアレルを含み、少なくともＭＩＣＡ＊００１及びＭＩＣＡ＊００８アレルを含む）の検出で特に有効である。従って、本抗体は、疾患における試験、評価、診断、予後及び／又は監視での使用に対する長所を有し、ここでＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド及び／又はＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞の検出及び／又は局在確認は興味深い。例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織がＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現腫瘍細胞）を特徴とする患者は、腫瘍進行に対する好ましくない予後を有し得る。このような患者は、例えば免疫療法、化学療法及び特定の組み合わせ処置を含め、例えば、それらの予後及び／又はＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現プロファイルに適している治療剤及びレジメンでの処置から恩恵を受け得る。

従って、対象において癌を検出する、診断する又は監視する方法が提供され、この方法は、（例えばインビトロで）腫瘍細胞を本開示の抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体又は抗体断片と接触させるステップと、腫瘍関連ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するステップとを含む。関連する実施形態では、診断方法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）を含む。特定の実施形態では、腫瘍試料が化学的に固定され、且つ／又はパラフィン包埋される。当業者は、このようなＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ検出剤が、エフェクター、マーカー又はレポーターで標識され得るか又は会合させられ得、多くの標準的なイメージング技術の何れか１つを使用して検出され得ることをさらに認識する。他の実施形態では、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体は、直接標識されず、検出可能である二次薬剤（例えば、標識された抗マウス抗体）を使用して検出される。特定の実施形態では、本開示は、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ組成物の何れか及び本発明の検出方法を使用して個体を診断し、アウトカムに基づいて治療コースを個別化することを含む、治療剤（例えば、化学療法、免疫療法）の投与のために個体を同定するか又は選択する方法を提供する。

一実施形態では、本開示は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌又はメラノーマを有する個体からの試料においてＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。切片内での結合された抗体の検出時、任意選択的に、切片内の抗体による細胞膜（細胞表面）染色の検出時、個体は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性である腫瘍を有すると判断され得るか又はみなされ得る。

一実施形態では、本開示は、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌を有する個体からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。切片内での結合された抗体の検出時、任意選択的に、切片内の抗体による細胞膜（細胞表面）染色の検出時、個体は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性である腫瘍を有すると判断され得るか又はそのようにみなされ得る。

一実施形態では、本開示は、ヒト腫瘍からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞（例えば、その表面又は細胞膜でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢを発現する細胞）を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。

一実施形態では、本開示は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌又はメラノーマを有する個体からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された腫瘍組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。

一実施形態では、本開示は、ヒト腫瘍からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋されたペレットとして調製されている細胞の表面上でヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。

一実施形態では、本開示は、ヒト腫瘍からの試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されている細胞の表面上でヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合するその能力について評価された（又は特異的に結合すると判定された）抗体と接触させることと；切片内における結合された抗体の存在を検出し、任意選択的に抗体による細胞膜（細胞表面）染色をさらに検出することとを含む。

一実施形態では、本開示は、腫瘍を有する個体からの腫瘍組織試料においてＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞を検出する方法を提供し、この方法は、
（ａ）個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を提供し、この試料を、パラフィン包埋された細胞ペレットでのＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ陰性細胞に結合せず、インビトロで、パラフィン包埋された細胞ペレットにおいてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞に結合可能なモノクローナル抗体と接触させることと、
（ｂ）この抗体が腫瘍細胞の表面に結合するか否かを評価することと
を含み、その抗体が腫瘍細胞の表面に結合するという判定は、腫瘍がＭＩＣＡ／Ｂ発現細胞に対して陽性であり、且つ／又は枯渇抗ＭＩＣＡ剤での処理に適切であることを示す。

何れかの実施形態では、ＦＦＰＥ組織は、抗癌処置（例えば、化学療法剤）、任意選択的にＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現癌細胞を上方制御可能であることが知られる抗癌処置で前処置を受けた個体から得られる腫瘍又は腫瘍隣接組織であり得る。特定の化学療法剤又は他の処置は、腫瘍細胞上でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現（及び任意選択的にさらなるＮＫＧ２Ｄリガンド）を誘導し得る及び／又は増加させ得ることが示されている。これは、イオン化及びＵＶ放射線、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼの阻害剤、クロマチン調整処置、抗代謝剤（例えば、３－ブロモピルベートなどのピルベートのハロゲン化類似体）並びにＨＤＡＣ阻害剤トリコスタチンＡ及びバルプロ酸などのアポトーシス誘導剤を含む周知の化学療法を含む。例示的な薬剤は、ＤＮＡ損傷応答経路を活性化させるもの、例えばＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）若しくはＡＴＲ（ＡＴＭ－及びＲａｄ３関連）タンパク質キナーゼ若しくはＣＨＫ１又はさらにＣＨＫ２若しくはｐ５３を活性化させるものである。後者の例としては、イオン化放射、ＤＮＡ複製の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤及びクロマチン改変剤又は処理、例として、ＨＤＡＣ阻害剤が挙げられる。ＮＫＧ２Ｄリガンドを上方調節する組成物は、Ｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３６（７０５４）：１１８６－９０にさらに記載されている。さらなる化学療法剤としては、アルキル化剤、細胞毒性抗生物質、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、植物誘導体、ＲＮＡ／ＤＮＡ代謝拮抗剤及び抗有糸分裂剤が挙げられる。好ましい例としては、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、トランスプラチン、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート又は上記の任意のアナログ若しくは誘導体バリアントを挙げることができる。抗癌処置での前処置を受けた及び腫瘍細胞上でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現がある個体は、抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗体での処置に適切であると判断され得る。

一実施形態では、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢが検出される場合、ＦＦＰＥ組織は、抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗体での処置に対する候補である個体で得られた腫瘍又は腫瘍隣接組織であり得る。

一実施形態では、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢが検出される場合、ＦＦＰＥ組織は、抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ抗体での処置を受けた、例えばこのような抗体での治療コースを受けたか又は受けている、個体から得られた腫瘍又は腫瘍隣接組織であり得る。

本開示は、治療介入を施すためにＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現腫瘍を有する個体を選択する方法をさらに提供する。治療介入の例は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに結合する抗体、任意選択的にＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞の枯渇を引き起こす抗体を含む。一例において、治療介入は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの免疫抑制効果を緩和するか又は軽減する薬剤（例えば、ＭＩＣＡに結合する抗体）、例えば可溶性ＭＩＣＡポリペプチドにより誘発されるＮＫ及び／又はＣＤ８ Ｔ細胞の表面でのＮＫＧ２Ｄの下方調整を緩和するか又は軽減する薬剤である。個体がＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性である腫瘍を有すると判断されるか又はみなされる場合、本開示の方法は、任意選択的に、ＦＦＰＥ試料においてヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢに特異的に結合可能な抗体を使用して、ＦＦＰＥ試料での染色、任意選択的に細胞膜（細胞表面）染色により判断されるとき、例えば個体がＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現腫瘍を有すると判定される場合、治療介入で個体を処置するステップを含むものとしてさらに特定され得る。

何れかの実施形態では、本抗体は、ＭＩＣＡの何れのアレルが個体によって発現されるかを判断又は評価するさらなるステップ又は前ステップなしに使用され得る。何れかの実施形態では、本抗体は、ヒト集団にわたり使用され得る。

本明細書に記載の抗体は、好ましくはインビトロで、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞、例えば腫瘍細胞の存在を検出するために使用され得る。このような方法は、一般的に、本開示による抗体と個体からの生体試料（例えばＦＦＰＥ試料、脱パラフィン処理）を接触させ、本抗体と生体試料との間の免疫学的反応から生じる免疫学的複合体の形成を検出することを伴う。複合体は、本開示による抗体を標識することによって直接的に、又は本発明による抗体の存在を明らかにする分子（二次抗体、ストレプトアビジン／ビオチンタグなど）を付加することにより間接的に、検出され得る。例えば、標識付加は、本抗体を放射性又は蛍光タグとカップリングすることによって遂行され得る。これらの方法は当業者にとって周知である。従って、本発明は、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）の存在を検出するため、任意選択的に、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞が存在する病態の存在を検出するため、任意選択的にインビボ又はインビトロで癌又は他の病態の特徴評価をするために使用され得る診断組成物を調製するための、本開示による抗体の使用にも関する。

いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、癌進行を予測するために有用である。癌予後、癌又は癌進行に対する予後診断は、以下の何れか１つ以上の予報又は予測（それに対する予後）を提供することを含む：癌に罹患し易いか又は癌と診断された対象の生存期間、無再発生存期間、癌に罹患し易いか又は癌と診断された対象の無進行生存期間、癌に罹患し易いか又は癌と診断された対象又は対象群における処置に対する奏効率及び／又は奏効期間、奏効の程度又は対象での処置後の生存率。代表的な生存エンドポイントとしては、例えばＴＴＰ（無増悪期間）、ＰＦＳ（無増悪生存期間）、ＤＯＲ（奏効期間）及びＯＳ（全生存期間）が挙げられる。一般に、疾患進行及び応答は、標準的な腫瘍応答基準の慣習に従い、例えばＥｉｓｅｎｈａｕｅｒ，ＥＡ，ｅｔ ａｌ，Ｎｅｗ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ：Ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１），Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００９：４５：２２８－２４７により詳述されるような“Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ”（ＲＥＣＩＳＴ）ｖ１．１に従い、判定され得、この開示は、本明細書に参照により組み込まれる。

ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ陽性腫瘍を診断し、癌進行を予測し、且つ／又は癌を有する個体に対して治療レジメンを個別化することは、例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織試料での陽性染色ＭＩＣＡ細胞のパーセントの測定に基づき得る。これに関して、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体で調べた場合に固定されたＩＨＣ試料における陽性染色細胞の特定のパーセンテージを示す患者は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ＋とみなされ、本明細書での教示に従う処置のために選択される。このような実施形態では、パーセント陽性細胞として測定される場合、１％を超える、５％を超える、１０％を超える、２０％を超える、３０％を超える、４０％を超える又は５０％を超える陽性細胞染色を示す腫瘍試料は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ＋として分類され得る。特定の態様では、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ＋腫瘍は、パーセント陽性として測定される場合、構成物である細胞の＞５０％でＭＩＣＡ及び／ＭＩＣＢを発現する。

他の実施形態では、患者診断及び／又は選択は、特定の強度でのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ陽性細胞染色のパーセントで予測され得る。例として、２＋強度以上を示す細胞が、＞１０％、任意選択的に＞２０％の腫瘍は、化学療法又は免疫治療剤での処置に適切であるとみなされ得る。他の実施形態では、例えば本明細書で開示されるように、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体で染色し、標準的ＩＨＣプロトコルに従って調べたとき、腫瘍細胞の＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％又は＞５０％が１＋強度以上を示す場合、患者は、化学療法剤又は免疫治療剤での処置に対する候補である。他の特定の実施形態では、例えば本明細書で開示されるように、抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体で染色し、標準的ＩＨＣプロトコルに従って調べたとき、腫瘍細胞の＞１０％、＞２０％、＞３０％、＞４０％又は＞５０％が２＋強度以上を示す場合、個体は、化学療法剤又は免疫治療剤での処置に適切である。

いくつかの態様では、腫瘍における又は腫瘍周辺でのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド及び／又はＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞を評価するために、癌を有する個体からの組織試料（例えば、腫瘍又は腫瘍隣接組織試料）を、本明細書で開示される抗体を使用して特徴評価又は評価し得る。

一実施形態では、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞を特徴とする癌又は腫瘍（又はこのような癌又は腫瘍を有する個体）は、化学療法剤又は免疫治療剤（例えば枯渇抗ＭＩＣＡ及び／又は－ＭＩＣＢ抗体）での処置に適切である（例えば、そのような処置から利益を得る）ものとして同定され得る。

一実施形態では、本開示は、癌の、診断、予後診断、監視及び／又は特徴評価を必要とする個体における、癌の、診断、予後診断、監視及び／又は特徴評価のためのインビトロ方法を提供し、この方法は、個体からのパラフィン包埋された腫瘍又は腫瘍隣接試料を提供することと、固定された組織試料においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を使用して試料、任意選択的にパラフィン包埋された組織試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現細胞）を検出することとを含み、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドの検出は、個体が化学療法剤又は抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ治療剤での処置に適している（例えば、そのような処置から利益を得る）ことを示す。抗ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ治療剤は、例えばヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに結合する薬剤であり得、任意選択的に、この薬剤は、枯渇剤、例えば、国際公開第２０１３／１１７６４７号パンフレット、同第２０１３／０４９５２７号パンフレット、同第２０１４／０４０９０３号パンフレット、同第２０１５／０８５２１０号パンフレット、同第２０１８／２１７６８８号パンフレット（例えば７Ｃ６抗体）、同第２０１８／０８１６４８号パンフレット及び同第２０１９／１８３５５１号パンフレット（例えば１Ｄ５抗体）において開示される既知の抗体の何れかの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を有する、抗ＭＩＣＡ抗体（又はその機能保存的変異体）であり、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。このような薬剤は、検出可能な及び／又は高レベルのＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現を特徴とする腫瘍又は腫瘍組織を有する個体を処置するために有用であり得る。

一実施形態では、本開示は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、メラノーマ、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行う方法を提供し、この方法は、
ａ）個体からのホルマリン処理及び／又はパラフィン包埋された腫瘍組織試料（又は腫瘍細胞試料）において、任意選択的に細胞の表面（例えば、膜ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ染色）でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することと、
ｂ）腫瘍試料（又は腫瘍細胞）が、任意選択的に参照レベルと比較して上昇しているレベルで、ＭＩＣＡポリペプチド（例えば、ＭＩＣＡ発現細胞）を含むという判定時、抗癌剤、任意選択的にヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体又は化学療法剤を個体に投与することと
を含む。一実施形態では、個体は、化学療法剤での前処置（ステップ（ａ）前）を受けている。ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドの検出は、本開示の抗体を使用して行われ得る。

何れかの態様では、抗体を使用して試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することは、個体からの生体試料（例えば、脱パラフィン処理された、ＦＦＰＥ試料）を本抗体と接触させるステップと、本抗体と生体試料との間での免疫学的反応から生じる免疫学的複合体の形成を検出するステップとを含み得る。

ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢの検出のための、本開示による抗体を含む、例えば癌に対する、診断又は予後診断キットも提供される。任意選択的に、本キットは、診断又は予後診断としての使用のための、本発明の抗体及び非ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体（例えば１、２、３、４、５、１０又はそれを超える抗体）を含む。前記キットは、生物学的（例えば、腫瘍組織）試料と、抗体、特に前記抗体の検出を可能にする試薬との間の免疫学的反応から生じる免疫学的複合体を検出する手段をさらに含み得る。

本方法は、一連の癌、例えば頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、メラノーマ、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌の、試験、評価、診断、予後診断及び／又は監視において有用であり得る。

実施形態：
１．ヒトＭＩＣＡポリペプチド及びヒトＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体又は抗体断片であって、配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与に従って決定される、抗体又は抗体断片。

２．ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体又は抗体断片であって、このような結合は、このようなＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを発現し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されている細胞の試料中におけるものであり、抗体又は抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、任意選択的に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、任意選択的に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、抗体又は抗体断片。

３．検出可能部分にコンジュゲート又は共有結合されている、実施形態１又は２に記載の抗体又は抗体断片。

４．パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ発現細胞の試料においてＭＩＣＡポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない、上記実施形態の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

５．パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００１発現細胞の試料においてＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００８発現細胞の試料においてＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドにさらに結合する、上記実施形態の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

６．パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない、上記実施形態の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

７．パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合し；任意選択的に、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能であり、任意選択的に、さらに、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能である、上記実施形態の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

８．配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与に従って決定される、実施形態２～７の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

９．パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞（例えば、ＭＩＣＡ発現細胞）によって発現されるヒトＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する、上記実施形態の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片。

１０．ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された試料を提供することと、実施形態１～９の抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含むインビトロ方法。

１１．ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された試料を提供することと、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００１発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドに結合し、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００８発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含むインビトロ方法。

１２．抗体又は抗体断片は、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合し；任意選択的に、前記抗体又は抗体断片は、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能であり、任意選択的に、さらに、前記抗体又は抗体断片は、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能である、実施形態１１に記載の方法。

１３．抗体又は抗体断片は、実施形態１～９に記載の抗体又は抗体断片である、実施形態１１又は１２に記載の方法。

１４．前記抗体又は抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体；パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞によって発現されるヒトＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する抗体又は抗体断片；又は配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む前記抗体又は抗体断片の機能保存的変異体である、実施形態１１又は１２に記載の方法。

１５．ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するステップは、前記試料を前記抗体又は抗体断片と接触させることと、前記抗体又は抗体断片と前記試料との間の免疫反応から生じる免疫複合体の形成を検出することとを含む、実施形態１０～１４の何れか１つに記載の方法。

１６．ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するステップは、前記試料を前記抗体又は抗体断片と接触させることと、前記抗体又は抗体断片と前記試料との間の免疫反応から生じる細胞膜での免疫複合体の形成を検出することとを含む、実施形態１０～１４の何れか１つに記載の方法。

１７．前記試料は、腫瘍組織である、実施形態１０～１６の何れか１つに記載の方法。

１８．前記個体は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、メラノーマ、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌を有する、実施形態１０～１７の何れか１つに記載の方法。

１９．前記個体は、抗ＭＩＣＡ抗体又は抗体断片での処置を受けたことがあるか、受けているか又はその処置に対する候補である個体である、実施形態１０～１８の何れか１つに記載の方法。

２０．前記個体は、化学療法剤での前処置を受けたことがある個体である、実施形態１０～１９の何れか１つに記載の方法。

２１．前記パラフィン包埋された組織試料は、固定され、パラフィン中に包埋され、薄切され、脱パラフィン処理され、且つスライドに移されている、上記実施形態の何れか１つに記載の方法又は組成物。

２２．ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドは、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体に特異的に結合する二次抗体を使用して検出される、上記実施形態の何れか１つに記載の方法又は組成物。

２３．化学療法剤での前処置を受けたことがある個体においてＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現を評価するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された腫瘍又は腫瘍隣接組織試料を提供することと、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００１発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドに結合し、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ＊００８発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞に結合しない抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することとを含み、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドの検出は、前記個体が治療剤での処置に適切であることを示し、任意選択的に、前記治療剤は、ヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体である、インビトロ方法。

２４．治療剤での処置に対する腫瘍を有する個体の適切性を評価するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された腫瘍又は腫瘍隣接組織試料を提供することと、実施形態１～９に記載の抗体若しくは抗体断片又は実施形態１０～２２の何れか１つに記載の方法を使用して、前記試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することとを含み、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドの検出は、前記個体が治療剤での処置に対して適切であることを示し、任意選択的に、前記治療剤は、ヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体である、インビトロ方法。

２５．ヒトＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体を前記個体に投与するステップをさらに含む、実施形態２３～２４に記載の方法。

２６．前記個体は、腫瘍細胞によるＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢ発現の上方制御を引き起こすことが可能であることが知られる放射性又は化学療法剤で前処置を受けたことがある、実施形態１０～２５に記載の方法。

２７．癌を有する個体における癌の進行を予測する方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を提供することと、実施形態９～２１の何れか１つに記載の方法に従って又は実施形態１～９の何れか１つに記載の抗体若しくは抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含む方法。

２８．前記試料においてのＭＩＣＡポリペプチドの検出（又は参照値と比較したこのようなＭＩＣＡ発現細胞のより多数の検出）は、前記対象が癌進行に対する好ましくない予後を有することを示す、実施形態２７に記載の方法。

２９．抗体を使用して前記試料において細胞を検出することは、
・細胞を含む生体試料を（例えば、生検として）得ることと；
・前記試料を固定し、パラフィン中で包埋し、薄切し、且つ脱パラフィン処理し、及び任意選択的に前記試料をスライドに移すことと；
・前記切片を前記抗体と接触させることと；
・前記切片内における結合された抗体の存在を検出することと
を含む、実施形態１０～２８の何れか１つに記載の方法。

３０．実施形態１～９の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片を含むキットであって、任意選択的に、実施形態１～９の何れか１つに記載の抗体を特異的に認識する標識された二次抗体をさらに含むキット。

３１．実施形態１～９の何れか１つに記載の抗体又は抗体断片と、治療剤、任意選択的に枯渇及び／又は中和させる抗ＭＩＣＡ抗体とを含むキット。

３２．実施形態１～９に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸又は核酸のセット。

３３．実施形態１～９に記載の抗体を産生するか、又は実施形態３２に記載の核酸を含むハイブリドーマ又は組み換え宿主細胞。

３４．パラフィン包埋された組織においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞を提供し、細胞であって、その表面でＭＩＣＢポリペプチドを発現する細胞を提供し、且つ細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドもＭＩＣＢポリペプチドも発現しない細胞を提供し、及び前記細胞のそれぞれについて、個別のパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｂ）複数の候補抗体を提供するステップと；
ｃ）その表面でＭＩＣＡもＭＩＣＢも発現しない、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞に結合することなく、ＭＩＣＡを発現する、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞及びＭＩＣＢを発現する、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞に結合する、前記複数からの抗体を調製又は選択するステップと
を含む方法。

３５．選択された抗体の誘導体を作製するステップをさらに含む、実施形態３４に記載の方法。

３６．誘導体の作製は、前記抗体を検出可能部分にコンジュゲート又は共有結合させることを含む、実施形態３５に記載の方法。

３７．前記ＭＩＣＡポリペプチドは、ＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドである、実施形態３４～３６に記載の方法。

３８．ａ）細胞であって、その表面でＭＩＣＡ＊００１ポリペプチドを発現する細胞を提供し、細胞であって、その表面でＭＩＣＡ＊００８ポリペプチドを発現する細胞を提供し、細胞であって、その表面でＭＩＣＢポリペプチドを発現する細胞を提供し、且つ細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドもＭＩＣＢポリペプチドも発現しない細胞を提供し、及び前記細胞のそれぞれについて、個別のパラフィン包埋された細胞試料を調製することと；
ｂ）候補抗体又は複数の候補抗体を提供することと；
ｃ）その表面でＭＩＣＡもＭＩＣＢも発現しない、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞に結合することなく、ＭＩＣＡ＊００１を発現する、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞、ＭＩＣＡ＊００８を発現する、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞及びＭＩＣＢを発現する、ステップａ）のパラフィン包埋された細胞への結合について、候補抗体を試験するか、又はそれに結合する、前記複数の候補抗体からの抗体を調製若しくは選択することと
を含む、実施形態３４～３７に記載の方法。

３９．実施形態３４～３８に記載の方法に従って得られるか又は作製される抗体。

４０．ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出する方法での使用、任意選択的に実施形態１０～２９の何れか１つに記載の方法での使用のための、実施形態３４～３９に記載の方法に従って得られるか又は作製される抗体。

本発明のさらなる態様及び長所は、実験セクション後に開示し、これは、例示としてみなされるべきものであり、本出願の範囲を限定しない。
本開示は例えば以下を提供する。
［項１］
ヒトＭＩＣＡポリペプチド及びヒトＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体又は抗体断片であって、配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与に従って決定される、抗体又は抗体断片。
［項２］
ヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体又は抗体断片であって、前記結合は、前記ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを発現し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されている細胞の試料中におけるものであり、前記抗体又は抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、任意選択的に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、任意選択的に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、抗体又は抗体断片。
［項３］
検出可能部分にコンジュゲート又は共有結合されている、項１又は２に記載の抗体又は抗体断片。
［項４］
パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ発現細胞の試料においてＭＩＣＡポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない、項１～３の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項５］
パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ^＊００１発現細胞の試料においてＭＩＣＡ^＊００１ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ^＊００８発現細胞の試料においてＭＩＣＡ^＊００８ポリペプチドにさらに結合する、項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項６］
パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない、項１～５の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項７］
パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合し；任意選択的に、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能であり、任意選択的に、さらに、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能である、項１～６の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項８］
配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与に従って決定される、項２～７の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項９］
パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞（例えば、ＭＩＣＡ発現細胞）によって発現されるヒトＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する、項１～８の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
［項１０］
ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された試料を提供することと、項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含むインビトロ方法。
［項１１］
ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された試料を提供することと、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ^＊００１発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ^＊００１ポリペプチドに結合し、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ^＊００８発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＡ^＊００８ポリペプチドに結合し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＢ発現細胞の試料においてヒトＭＩＣＢポリペプチドに結合するが、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ陰性細胞、任意選択的にＲａｊｉ細胞に結合しない抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含むインビトロ方法。
［項１２］
抗体又は抗体断片は、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合し；任意選択的に、前記抗体又は抗体断片は、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能であり、任意選択的に、さらに、前記抗体又は抗体断片は、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能である、項１１に記載の方法。
［項１３］
抗体又は抗体断片は、項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片である、項１１又は１２に記載の方法。
［項１４］
前記抗体又は抗体断片は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体；パラフィン包埋された細胞試料として調製された細胞によって発現されるヒトＭＩＣＡポリペプチドへの結合について、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する抗体若しくは抗体断片；又は配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体若しくは抗体断片の機能保存的変異体である、項１１又は１２に記載の方法。
［項１５］
ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出する前記ステップは、前記試料を前記抗体又は抗体断片と接触させることと、前記抗体又は抗体断片と前記試料との間の免疫学的反応から生じる免疫学的複合体の形成を検出することとを含む、項１０～１４の何れか一項に記載の方法。
［項１６］
前記試料は、腫瘍組織である、項１０～１５の何れか一項に記載の方法。
［項１７］
前記個体は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、メラノーマ、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌を有する、項１０～１６の何れか一項に記載の方法。
［項１８］
前記個体は、抗ＭＩＣＡ抗体又は抗体断片での処置を受けたことがあるか、受けているか又はその処置に対する候補である個体である、項１０～１７の何れか一項に記載の方法。
［項１９］
前記個体は、化学療法剤での前処置を受けたことがある個体である、項１０～１８の何れか一項に記載の方法。
［項２０］
前記パラフィン包埋された組織試料は、固定され、パラフィン中に包埋され、薄切され、脱パラフィン処理され、且つスライドに移されている、項１～１９の何れか一項に記載の方法又は組成物。
［項２１］
ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドは、ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドに結合する抗体に特異的に結合する二次抗体を使用して検出される、項１～２０の何れか一項に記載の方法又は組成物。
［項２２］
癌を有する個体における癌の進行を予測する方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された腫瘍組織試料を提供することと、項９～２１の何れか一項に記載の方法に従って又は項１～９の何れか一項に記載の抗体若しくは抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡポリペプチドを検出することとを含む方法。
［項２３］
抗体を使用して前記試料において細胞を検出することは、
・細胞を含む生体試料を（例えば、生検として）得ることと；
・前記試料を固定し、パラフィン中に包埋し、薄切し、且つ脱パラフィン処理し、及び任意選択的に前記試料をスライドに移すことと；
・前記切片を前記抗体と接触させることと；
・前記切片内における結合された抗体の存在を検出することと
を含む、項１０～２２の何れか一項に記載の方法。
［項２４］
項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含むキットであって、任意選択的に、項１～９の何れか一項に記載の抗体を特異的に認識する標識された二次抗体をさらに含むキット。
［項２５］
項１～９の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸又は核酸のセット。
［項２６］
項１～９の何れか一項に記載の抗体を産生するか、又は項２５に記載の核酸を含むハイブリドーマ又は組み換え宿主細胞。
［項２７］
パラフィン包埋された組織においてヒトＭＩＣＡ及びＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を作製する方法であって、
ａ）細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドを発現する細胞を提供し、細胞であって、その表面でＭＩＣＢポリペプチドを発現する細胞を提供し、且つ細胞であって、その表面でＭＩＣＡポリペプチドもＭＩＣＢポリペプチドも発現しない細胞を提供し、及び前記細胞のそれぞれについて、個別のパラフィン包埋された細胞試料を調製するステップと；
ｂ）複数の候補抗体を提供するステップと；
ｃ）その表面でＭＩＣＡもＭＩＣＢも発現しない、ステップａ）の前記パラフィン包埋された細胞に結合することなく、ＭＩＣＡを発現する、ステップａ）の前記パラフィン包埋された細胞及びＭＩＣＢを発現する、ステップａ）の前記パラフィン包埋された細胞に結合する、前記複数からの抗体を調製又は選択するステップと
を含む方法。

実施例１：ＦＦＰＥ試料におけるＢＡＭＯ１抗体の性能
ＭＩＣＡ及びその近縁ＭＩＣＢは、ＮＫ細胞活性化受容体ＮＫＧ２Ｄの非常に多型性のリガンドである。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢは、感染及び腫瘍形質転換などの細胞性ストレスによって細胞表面で誘導される。実際に、ＭＩＣＡは、乳房、結直腸及び肺を含む、いくつかの高度に蔓延している固形腫瘍上で特異的に発現される。抗ＭＩＣＡ／Ｂ治療用抗体に対する治療指標を特定するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）により異なるＦＦＰＥ腫瘍試料においてＭＩＣＡ／Ｂの発現を評価する必要があった。腫瘍における陽性細胞のパーセンテージ並びに細胞質又は膜発現のレベルは、抗ＭＩＣＡ／Ｂ治療用抗体に対する適切な指標を同定するのに役立つ。

この試験の目的は、利用可能な抗体を使用してＭＩＣＡ／Ｂ手動免疫染色の感度の改善を試みるために、異なるアプローチを試験することであった。抗体ＢＡＭＯ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）は、ヒト膵臓のホルマリン固定及びパラフィン包埋された組織切片においてＭＩＣＡを検出可能であるものとして記載されており、試験のために選択した。

ＭＩＣＡ／Ｂ染色感度の改善を評価するために、ＭＩＣＡ／Ｂの発現が低レベルである細胞株を選択した。実際に、ＩＨＣによって低い発現でも検出することは、課題であった。ＦＦＰＥ切片でのＭＩＣＡ／Ｂ検出のための抗体を評価するために、ＭＩＣＡ／Ｂ陽性及び陰性細胞を凍結融解し、培養し、次いでＩＨＣ染色のために、固定し、パラフィン中に包埋した。表３は使用した細胞をまとめる。

以前のフローサイトメトリー表現型決定試験により、本発明者らは、ＭＩＣＡ／Ｂの発現が低レベルである異なる細胞株を予め選択することが可能になった。選択を確認するために、これらの細胞上でのＭＩＣＡ／Ｂ発現レベルをフローサイトメトリーにより再び評価した。ＢｘＰＣ－３、Ｈｓ ７００Ｔ、ＨＴ－２９及びＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞は全て、比較的低レベルでＭＩＣＡ／Ｂを発現した。

フローサイトメトリーによって細胞表現型（ＭＩＣＡ／Ｂ陽性）を確認した後、細胞を固定し、ＩＨＣ染色のためにパラフィン中に包埋した。

結果から、ＢＡＭＯ１抗体を使用してＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞においてＭＩＣＡ／Ｂ発現が明らかに検出されたことが示された。Ｈｓ７００Ｔ及びＨＴ－２９細胞において、染色は陽性であったが、全ての細胞ではなかった。ＭＩＣＡ／Ｂ発現は、ＢＡＭＯ１抗体を用いてＢｘＰＣ－３細胞では検出されなかった。フローサイトメトリーによりＭＩＣＡ／Ｂ発現が検出されたものの、いくつかの細胞株は、ＩＨＣによってＭＩＣＡ／Ｂ染色を全く示さなかった。これは、最初のプロトコルが、ＭＩＣＡ／Ｂの低発現レベルを検出するために十分に感度が高くなかったことを示唆した。従って、ＭＩＣＡ／Ｂ染色感度の改善を試験するために、これらの細胞を選択した。

ＭＩＣＡ／Ｂ ＩＨＣ染色を最適化するためにいくつかの条件を試験し、以下の条件を試験した。
・洗浄ステップ：流動対浴槽
・初回温置の前対後での内因性ペルオキシダーゼの遮断
・ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）温置：５分対２０分
・チラミド系増幅（ＴＳＡ）
・Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸキット（一次と二次ＨＲＰ抗体との間のリンカー）

ＴＳＡを使用して、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞上、ＢｘＰＣ－３細胞上及び比較的程度は低いが、ＨＴ－２９細胞上でＭＩＣＡ／Ｂ発現が検出された。残念ながら、これらの結果は、再現性がなく（特に反復される実験にわたり染色が不一致であったＢｘＰＣ３細胞に対して）、染色強度は依然として低かった。

ＭＩＣＡ／Ｂ細胞表面発現の定量的な決定を得るために、ＱＩＦＩＫＩＴを使用した。選択された細胞株上でＱｉｆｉｋｉｔを用いて４回の実験を行った。異なる細胞株の細胞表面上で見出された抗原数は、異なる実験で同等であった。表２で示されるデータは、４回の実験の代表である。細胞表面抗原性部位に基づいて、選択された細胞を分類し得る：Ｍｉａ ＰａＣａ－２＞ＢｘＰＣ３＞Ｈｓ７００Ｔ＞ＨＴ－２９。注目すべきことに、ＱＩＦＩＫＩＴは、細胞表面抗原のみを評価し、細胞質抗原は評価しない。ＢＡＭＯ１はＩＨＣによりＢｘＰＣ３を一貫して検出可能ではなかったため、本発明者らは、Ｈｓ７００Ｔ細胞が恐らくＢｘＰＣ－３よりも細胞質ＭＩＣＡ／Ｂを発現するため、抗体ＢＡＭＯ１を使用したＩＨＣにより、Ｈｓ７００Ｔ細胞が検出されたという仮説を立て得る。

ホルマリン固定及びパラフィン包埋された試料上でＢＡＭＯ１を使用したＭＩＣＡ／Ｂ ＩＨＣ染色は最適化され得ない。さらに、この抗体は、細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂタンパク質が少数である細胞を一貫して染色することを可能にしないため、これは、ＦＦＰＥ試料でのＩＨＣによるＭＩＣＡ／Ｂ発現の検出に対して問題があるものとみなした。

実施例２：ＦＦＰＥ試料における細胞表面ＭＩＣＡ／Ｂが少ない細胞を染色する抗体の同定
ＦＦＰＥ試料でのＩＨＣに対する利用可能な満足できる抗体がなかったため、マウスに免疫付与し、ＭＩＣＡ／Ｂ発現が低い細胞を一貫して及び特異的に染色し得る抗体を同定するためにスクリーニングを行った。

簡潔に述べると、３種類のタンパク質（ＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００８及びＭＩＣＢ）で免疫付与した５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを使用して免疫付与を行った。Ｃ１Ｒｎｅｏ、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレットを使用することにより、ＩＨＣによって５匹の異なる動物からの血清を試験した。融合のために３匹の動物を選択したが、それは、これらの動物由来の血清が、強い染色強度で多数のＭＩＣＡ／Ｂ細胞を染色することを可能にしたからであった。ハイブリドーマ培養及び選択後、ＦＦＰＥ細胞ペレット（Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の混合物）上で、２種類の抗原賦活化条件（ｐＨ６及び８）を伴うマニュアルプロトコール及びＲａｊｉ、ＢｘＰＣ－３、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット上で、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ ａｕｔｏｍａｔｏｎ及びＣＣ１又はＣＣ２前処理を用いた自動化プロトコルを使用して、ＩＨＣによって５０８検体の上清（非希釈）を試験した。以下で実験をさらに詳述する。

異なる細胞株を凍結融解し、継代培養した。１０％非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ－グルタミン、１％非必須アミノ酸及び１％ピルビン酸ナトリウムを補充したＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭＩ）（Ｇｉｂｃｏ）中でＲａｊｉ、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ、ＢｘＰＣ－３、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢを培養した。懸濁液中でＲａｊｉ、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢを増殖させた。ＢｘＰＣ－３は、接着細胞であり、ＰＢＳ－ＥＤＴＡ ２ｍＭを使用して剥離した。ジェネテシン１．８ｍｇ／ｍｌを用いてＣ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢを選択した。培養終了時及びＲａｊｉ細胞の場合には６回の継代後、ＢＸＰＣ３の場合には７又は８回の継代後、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏの場合には２回の継代後、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１の場合には２回の継代後、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８の場合には３又は継代後及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢの場合には３又は４回の継代後、細胞をホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。

包埋前に、抗ＭＩＣＡ／ＢモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ；クローン１９Ｅ９、国際公開第２０１３／１１７６４７号パンフレットを参照されたい）（ＰＥコンジュゲート）、抗ＭＩＣＡモノクローナルＡｂ（ｍＡｂ；クローン２０Ｃ６、国際公開第２０１３／１１７６４７号パンフレットを参照されたい）（ＰＥコンジュゲート）及び市販の抗ＭＩＣＢモノクローナル（ｍＡｂ；２３６５１１ Ｒ＆Ｄ）（ＰＥコンジュゲート）で細胞を染色し、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ発現を評価するためにフローサイトメトリーによって分析した。Ｒａｊｉ細胞上でＭＩＣＡ／Ｂ発現は観察されず、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏでは内因性ＭＩＣＡ／Ｂ発現は非常に低かった。ＢｘＰＣ－３細胞上で低ＭＩＣＡ発現が観察された。最終的に、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１及びＣ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８細胞は、ＭＩＣＡ陽性及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞はＭＩＣＢ陽性が強く見られた。

この試験で使用された細胞株の特徴を以下のようにまとめる。
－Ｒａｊｉ細胞（生物：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ヒト／細胞タイプ：Ｂリンパ球／組織：リンパ芽球／疾患：バーキットリンパ腫／起源：ＡＴＣＣ）、ＭＩＣＡ／Ｂ発現なし
－Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ細胞（生物：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）、ヒト／細胞タイプ：Ｂリンパ芽球；エプスタインーバーウイルス形質転換／組織：末梢血リンパ腫／ＡＴＣＣ ｒｅｆ．ＣＲＬ－２３６９）、ＭＩＣＡ／Ｂの非常に低い内因性発現
－ＢｘＰＣ－３細胞（生物：ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ヒト／組織：膵臓／疾患：腺癌リンパ腫／ＡＴＣＣ ｒｅｆ．ＣＲＬ－１６８７）、低い内因性ＭＩＣＡ発現
－Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１細胞：ヒトＭＩＣＡ＊００１を遺伝子移入したＣ１Ｒ－ｎｅｏ細胞（高いＭＩＣＡ＊００１発現レベル）
－Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８細胞：ヒトＭＩＣＡ＊００８を遺伝子移入したＣ１Ｒ－ｎｅｏ細胞（高いＭＩＣＡ＊００８発現レベル）
－Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ：ヒトＭＩＣＢ＊００２を遺伝子移入したＣ１Ｒ－ｎｅｏ細胞（高いＭＩＣＢ発現レベル）

フローサイトメトリーによる表現型決定と並行して、細胞株をホルマリン中で固定し、パラフィン中に包埋した。簡潔に述べると、２０ｘ１０６～４０ｘ１０６個の細胞をホルマリン４％で１時間固定した。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、Ｈｉｓｔｏｇｅｌ中で再懸濁した。細胞ペレットを脱水し、パラフィン中に包埋した。各細胞株に対して、いくつかのＦＦＰＥ細胞ペレットを作製した。細胞（Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８（１５．１０６個の細胞）及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ（１５．１０６個の細胞））の混合物もパラフィン中に包埋した。ＦＦＰＥ細胞ペレットを薄切し、ＩＨＣによりＭＩＣＡ／Ｂ染色を行った。簡潔に述べると、５μｍの厚さの切片を温置して脱パラフィン処理し、抗原再生ステップに供し、免疫又は非免疫血清、ハイブリドーマ上清、鎖組み合わせＡｂ又は精製及び市販Ａｂとともに温置し、続いてシグナル増幅ステップを行った。最終的に、３、３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して酵素性顕色を行った。マウス血清を用いたＩＨＣ染色について、以下の基準を使用してペレット切片での染色された細胞のパーセンテージ並びに強度スコアに起因すると考えることにより、染色の解釈を行った：「－」：陰性染色；「＋」：弱い陽性染色；「＋＋」：中程度の強度のＩＨＣシグナル及び「＋＋＋」：強い陽性染色。

ＭＩＣＡ／Ｂ組み換えタンパク質（ＭＩＣＡ＊００１、ＭＩＣＡ＊００８及びＭＩＣＢ）の混合物（２回の腹腔内注射）を使用して、５匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対して最初に免疫付与し、ＩＨＣによって血清を試験した。３種類の異なる希釈率（１／１０００、１／５０００及び１／１００００）及び３種類の異なる抗原賦活化条件（ｐＨ６、ｐＨ８及びｐＨ９）で、Ｃ１Ｒ ｎｅｏ細胞及びＣ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレットの混合物においてＩＨＣにより、免疫前血清及び免疫血清を試験した。

免疫前血清を使用した場合に染色は見られなかった。血清を１／５０００又は１／１００００に希釈した場合、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢの混合物では得られた染色が弱く、不均一であったため、免疫反応を増強するために３回目の腹腔内注射を行うことを決定した。この３回目の注射後にＩＨＣによって５匹のマウスからの血清を再び試験し、本発明者らは、３回目の注射後に全体的なより強い反応性を観察した。３匹のマウスからの血清により、最良の結果が得られた（染色強度が強いＣ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ染色細胞数がより多い）。比較において、別のマウスからの血清は、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の染色強度がより低く；別のマウスでは、１／５０００及び１／１００００で使用した場合、染色されたＣ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８細胞の数がより少なく、１／５０００及び１／１００００を使用した場合、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の染色が得られなかった。最終追加免疫のために、最良の結果を与えた３匹のマウスを選択した（ミックスＭＩＣＡ／Ｂ組み換えタンパク質の静脈内注射）。動物を安楽死させ、それらの脾臓を摘出し、骨髄腫細胞との融合のための細胞の供給源として使用した。メチルセルロース半固体培地での培養後、ハイブリドーマコロニーを採取し、２７枚の異なる９６ウェルプレートで培養した。次に、マウスＩｇＧ分泌ハイブリドーマのみを選択するために、ＥＬＩＳＡを行った。この試験に続いて、別のＥＬＩＳＡを行い、抗ｔａｇハイブリドーマを排除するために前に同定された陽性ハイブリドーマ（ＩｇＧ分泌）を試験した。終了時、５０８個のハイブリドーマを維持し、増幅させ、１．５ｍＬの上清／ハイブリドーマを生成させた。

異なる抗原アンマスキング条件（ｐＨ６、ｐＨ８）を使用して、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット切片の混合物においてＩＨＣによって最初に上清を試験した。５０８検体の上清の中で、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の混合物において最良の結果を与えるものとして（強い陽性及び均一な染色）４６検体（それらの中で１１検体がｐＨ６及びｐＨ８の両方に対して陽性）を選択した。

ＣＣ１又はＣＣ２前処理を用いて、Ｖｅｎｔａｎａ上でＣ１Ｒ－ｎｅｏ、ＢｘＰＣ－３、ＣＲ１ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８及びＣ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット切片においてＩＨＣにより、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の混合物上で染色を与えた４６検体の上清を再び試験した。それらは、試験した全ての陽性細胞上で最強の染色を与え、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ細胞では染色がないか又は弱かったため、マウスγ１（ｇａｍｍａ１）鎖（ｍＩｇＧ１アイソタイプ）を伴うマウス抗体として、上清の６つの検体の上清（１２Ｃ９を含む）を選択し、作製した。

並行した６６検体の上清において、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８＋Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ細胞の混合物における部分的に陽性のものをＶｅｎｔａｎａ上でＲａｊｉ、ＢｘＰＣ－３、ＣＲ１ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット切片において再び試験した。これらが最強の染色を与え、ＭＩＣＡ又はＭＩＣＢに特異的であったため、３検体の上清を選択し、作製した（１検体はＭＩＣＡ特異的であり、２検体はＭＩＣＢ特異的であった）。

一過性の遺伝子移入後、ＣＣ１ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ １（ＣＣ１）又はＲｉｂｏＣＣ（ＣＣ２）前処置条件を使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｌｔｒａ ａｕｔｏｍａｔｏｎ上で、Ｒａｊｉ、ＢｘＰＣ－３、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット切片においてＩＨＣにより選択され、試験された各抗体に対して、異なる再編成を得た。６つの抗体が試験した細胞全てにおいて陽性染色を与え、Ｒａｊｉ細胞では染色はなかった。これらの抗体をマウスγ１（ガンマ１）鎖（ｍＩｇＧ１アイソタイプ）を伴うマウス抗体として選択し、作製した。

ＣＣ１又はＣＣ２前処理条件を使用して、Ｖｅｎｔａｎａ ａｕｔｏｍａｔｏｎ上で、３つの異なる濃度（１、５及び１０μｇ／ｍＬ）で、Ｒａｊｉ、ＢｘＰＣ－３、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００１、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＡ＊００８、Ｃ１Ｒ ＭＩＣＢ ＦＦＰＥ細胞ペレット切片においてＩＨＣにより、作製及び精製した抗体を試験した。

試験した３つの抗体（１２Ｃ９を含む）は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ遺伝子移入細胞において強い膜染色を与え、Ｒａｊｉ細胞では染色はなかった。試験した染色条件を用いて、抗体のうちの２つは、低濃度（１μｇ／ｍＬ）においてＢｘＰＣ－３上で染色を示さないか又は染色が非常に弱く、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）では染色が不均一であった。１２Ｃ９のみが、試験した３つの濃度でＢｘＰＣ－３ ＦＦＰＥ細胞ペレット選択を染色する能力を示した。

１２Ｃ９の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を以下に示す（Ｋａｂａｔ ＣＤＲ下線）。

１２Ｃ９の重鎖可変領域（ＶＨ）：

１２Ｃ９の軽鎖可変領域（ＶＬ）：

Claims (14)

1. ヒトＭＩＣＡポリペプチド及びヒトＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能な抗体又は抗体断片であって、配列番号７の重鎖可変領域配列の３つのＣＤＲと、配列番号８の軽鎖可変領域配列の３つのＣＤＲとを含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付与に従って決定される、抗体又は抗体断片。
2. 前記抗体又は抗体断片が、ヒトＭＩＣＡ及びヒトＭＩＣＢポリペプチドに特異的に結合可能であり、前記結合が、前記ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを発現し、且つパラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されている細胞の試料中におけるものである、請求項１に記載の抗体又は抗体断片。
3. 検出可能部分にコンジュゲート又は共有結合されている、請求項１又は２に記載の抗体又は抗体断片。
4. パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞に結合し；任意選択的に、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能であり、さらに、前記抗体が低濃度（１μｇ／ｍＬ）、中程度の濃度（５μｇ／ｍＬ）及び高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で提供される場合、パラフィン包埋された細胞ペレットとして調製されているＢｘＰＣ－３細胞を染色可能である、請求項１～３の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片。
5. ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出するインビトロ方法であって、前記個体からのパラフィン包埋された試料を提供することと、請求項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を使用して、前記試料においてＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することとを含むインビトロ方法。
6. ＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを検出することが、前記試料を前記抗体又は抗体断片と接触させることと、前記抗体又は抗体断片と前記試料との間の免疫学的反応から生じる免疫学的複合体の形成を検出することとを含む、請求項５に記載の方法。
7. ヒト個体からの試料内でＭＩＣＡ及び／又はＭＩＣＢポリペプチドを発現する細胞を検出するインビトロ方法であって、
   ・細胞を含む生体試料を得ることと；
   ・前記試料を固定し、パラフィン中に包埋し、薄切し、且つ脱パラフィン処理し、及び任意選択的に得られた切片をスライドに移すことと；
   ・得られた切片を請求項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片と接触させることと；
   ・前記切片内における結合された抗体又は抗体断片の存在を検出することと
   を含む、方法。
8. 結合された抗体又は抗体断片の存在を検出することが、前記抗体又は抗体断片と前記切片との間の免疫学的反応から生じる免疫学的複合体の形成を検出することとを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記試料が腫瘍組織である、および前記個体は、頭頸部扁平上皮癌、肺癌、中皮腫、乳癌、エストロゲン陽性乳癌、エストロゲン陰性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、前立腺癌、メラノーマ、尿路上皮癌、膵臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）又は子宮内膜癌を有する、請求項５～８の何れか一項に記載の方法。
10. 前記試料が、固定され、パラフィン中に包埋され、薄切され、脱パラフィン処理され、且つスライドに移されている、請求項５～９の何れか一項に記載の方法。
11. 前記抗体または抗体断片を、前記抗体または抗体断片に特異的に結合する二次抗体を使用して検出することを含む、請求項５～１０の何れか一項に記載の方法。
12. 請求項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片を含むキットであって、任意選択的に、請求項１～４の何れか一項に記載の抗体を特異的に認識する標識された二次抗体をさらに含むキット。
13. 請求項１～４の何れか一項に記載の抗体又は抗体断片をコードする核酸又は核酸のセット。
14. 請求項１～４の何れか一項に記載の抗体を産生するか、又は請求項１３に記載の核酸又は核酸のセットを含む組み換え宿主細胞。