JP7807366B2 - 改良された治療濃度域をもつサポニン誘導体 - Google Patents

改良された治療濃度域をもつサポニン誘導体

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Description

本発明は、トリテルペンアグリコンと第１の糖鎖および／または第２の糖鎖とを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、かつ：誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造と；および／または前記第１の糖鎖であって、これにおいて前記第１の糖鎖が、誘導体化されているカルボキシル基を含有する該第１の糖鎖と；および／または前記第２の糖鎖であって、これにおいて前記第２の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも１つのアセトキシ基を含有する、該第２の糖鎖とを含む、該サポニン誘導体に関する。本発明はまた、本発明のサポニン誘導体を含む第１の医薬組成物にも関する。加えて、本発明は、本発明の第１の医薬組成物と、抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含む第２の医薬組成物とを含む、医薬組合せ剤に関する。本発明はまた、医薬としての使用のため、または癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第１の医薬組成物または前記医薬組合せ剤にも関する。さらに本発明は、分子を細胞の外側から前記細胞内へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって、前記細胞を前記分子および本発明のサポニン誘導体と接触させることを含む、該方法に関する。
標的化腫瘍療法は、癌細胞の増殖および生存に関与する特定の遺伝子およびタンパク質を標的とするための薬剤を使用する、癌療法である。免疫毒素は、標的化部分として抗体を含有する標的化された毒素であって、腫瘍特異抗原に対する抗体の特異性を併せもち、それにより目的とする作用点に毒素を向かわせることを可能にし、かつ抗体依存性細胞介在性の細胞毒性および補体依存性の細胞毒性などの細胞殺傷機構を付加的に導入し得ることから、非常に有望である。この効果を示すためには、毒素が、インターナリゼーション後にサイトゾル中へ放出される必要がある。主な欠点は、ペイロードを担持する標的部分がしばしば充分にインターナライズされず、インターナリゼーション後に表面へ直接リサイクルされるか、またはリソゾーム内で分解され、それにより細胞サイトゾル内へのペイロードの充分な送達が妨げられることである。腫瘍細胞のための毒性ペイロード濃度を確保するため、および不充分なサイトゾル進入を克服するためには、高い血清レベルの標的化毒素が必要であり、しばしば、特に免疫原性および血管漏出症候群を含む重い副作用を生じる結果となる。それ故、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を用いて癌患者を治療する場合、充分に広い治療濃度域が尚重要である。
不充分なサイトゾル進入という欠点に対処するため、例えば、生合成経路の内在性細胞膜輸送複合体への毒素の方向転換、エンドソームの崩壊、エンドソーム膜の膜統合性の減衰、または細胞透過性ペプチドの使用に関連して、いくつかの戦略が開発された。
例えば、サポニンなどのグリコシル化されたトリテルペンは、腫瘍療法において、標的化された毒素のためのエンドソーム脱出促進剤、例えばリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）として作用することが見出された。サポニンの構造－活性関係の分析は、以下のコア構造要素の存在が、ＲＩＰの細胞毒性を強化するサポニンの能力にとり有益であるように見えることを示した（式（Ｉ）参照、Ｘ１＝ＨまたはＯＨ、およびＸ２＝多糖部分）：
－ グルクロン酸を含有する、Ｃ－３における分岐型三糖
－ Ｃ－４におけるアルデヒド
－ Ｃ－２８におけるカルボキシ基
－ アセチル基を含有する少なくとも４つの糖部分からなる、Ｃ－２８位に結合した多糖部分（Ｒ２）。
特に、トリテルペノイドサポニン、ＳＯ１８６１（式ＩＩ、時にはＳＰＴ００１とも称される）は、腫瘍細胞標的化毒素のエンドソーム脱出を促進するための強力な分子として同定された。促進剤の機構については、二重効果が仮定され：第１に、エンドソーム脱出の直接的な増加が、結果としてカスパーゼ依存的なアポトーシスを生じ、それが、第２に、リソゾーム媒介性の細胞死経路と組合され、これらは、リソゾーム膜の破壊に続くカテプシンおよび他の加水分解酵素の放出の後にトリガーされる。
エンドソーム脱出促進剤としてのサポニンの適用は、これらのサポニンが赤血球膜を破裂する能力を有するという認識に基づく。しかしながら、まさに同時に、サポニンの細胞破裂活性は、かかるサポニンを用いて患者が治療される場合、副作用（のリスク）に寄与し、それにより治療指数の制限の観点からの最適治療域に影響を及ぼす。実際、かかるサポニンの毒性は、細胞外的および／または細胞内的に、抗腫瘍療法を必要とする患者に投与される際の、例えば最適の投与計画並びに投与の経路および頻度が考慮される場合の関心ごとである。
トリテルペンバックボーン、五環性Ｃ３０テルペンスケルトン（サポゲニンまたはアグリコンとしても知られる）の構造、糖側鎖の数および長さ、並びにバックボーに結合された糖残基のタイプおよび結合変異体を含めて、サポニン自体の化学的組成の全ての特徴が、かかるサポニンの溶血指数および／または細胞毒性に寄与する。
サポニンは、細胞のエンドソームおよびサイトゾルが考慮される場合に、それ自体に標的特異性はなく、またサポニンは、同じ投与経路が考えられる場合であっても、予想通りにかつ最もしばしば、標的化毒素以外のカイネティクスで（ヒト）患者内に分布する。したがって、その必要がある患者に、例えばＡＤＣとサポニンとを含む治療的組合せ剤を適用した後、サポニン分子はあらゆる臓器中に見られ、特異性は標的化毒素によってのみ媒介されることが暗示される。サポニンの全身的分布には、標的細胞における特異的な蓄積と比較した場合、より高い濃度が好首尾の治療に必要である。したがって、適当な治療濃度域を達成するためには、修飾されたサポニンの毒性を、身体におけるサポニンの全身的適用の観点から、好首尾の適用のために充分に低くする必要がある。
それ故、例えばＡＤＣと一緒の、サポニンの同時投与が考慮される場合、治療指数を改善することが尚必要であり：ＡＤＣの細胞毒性効果の増強が考慮される場合、サポニンの細胞毒性をより良く制御（またはより良く：より低く）することと共に、同時に充分な効能を維持するために必要である。
驚いたことに本発明者らは、修飾サポニン、すなわち、
－ サポニンのアグリコンのＣ－３において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分；および／または
－ サポニンのアグリコンのＣ－４における修飾されたアルデヒド；および／または
－ サポニンのアグリコンのＣ－２８位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が；
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し、例えば毒素の細胞毒性またはＢＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に（いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが：修飾サポニンの同様のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して）活性を有し、および／または非修飾サポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合に低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのＩＣ５０値間の比率が増加することから、および／または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとのＩＣ５０値間の比率が増加することから、改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供する。
本発明の第１の態様は、トリテルペンアグリコンコア構造と、前記アグリコンコア構造に結合された、第１の糖鎖および第２の糖鎖の少なくとも１つとを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、これにおいて：
ｉ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか；または
ｉｉ． 前記サポニン誘導体が、前記第１の糖鎖を含み、これにおいて、前記第１の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか：または
ｉｉｉ． 前記サポニン誘導体が、前記第２の糖鎖を含み、これにおいて、前記第２の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基を含有するか；または
ｉｖ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の任意の組合せ、好ましくは誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つの任意の組合せを含み；
ここで、前記第１の糖鎖および前記第２の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、モノデスモシド系トリテルペングリコシドまたはビスデスモシド系トリテルペングリコシド、より好ましくはビスデスモシド系トリテルペングリコシドである、本発明のサポニン誘導体である。
本発明の第２の態様は、本発明の前記サポニン誘導体と、任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤とを含む、第１の医薬組成物に関する。
本発明の第３の態様は、医薬組合せ剤であって：
・ 本発明の前記第１の医薬組成物と；および
・ 抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤を含む、第２の医薬組成物と
を含む、該医薬組合せ剤に関する。
本発明の第４の態様は、第３の医薬組成物であって、本発明の前記サポニン誘導体を含み、かつさらに：抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－核酸コンジュゲート、または受容体－リガンド－核酸コンジュゲートの任意の１つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤を含む、該第３の医薬組成物に関する。
本発明の第５の態様は、医薬としての使用のための、本発明の前記第１の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第３の医薬組成物に関する。
本発明の第６の態様は、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第１の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第３の医薬組成物に関する。
本発明の第７の態様は、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは前記細胞のサイトゾル中へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって：
ａ） 細胞を提供する工程と；
ｂ） 工程ａ）において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と；
ｃ） 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と；
ｄ） 工程ａ）の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程ｂ）の前記分子および工程ｃ）の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
定義
用語「サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポゲニンである親油性のアグリコンコアと結合した、１つ以上の親水性グリコン部分を含む、一群の両親媒性グリコシドを指す。サポニンは、天然産でもよく、または合成品（すなわち、非天然産）であってもよい。用語「サポニン」は、天然産サポニン、天然産サポニンの誘導体、並びに化学的および／またはバイオテクノロジー的な合成経路を介しデノボで合成されたサポニンを包含する。
用語「修飾サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンの提供のための化学修飾に供される前の非誘導体化サポニンにおいて、アルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および／またはアセチル基のいずれかが既に存在した位置において、１つ以上の化学修飾を有するサポニン、すなわちサポニン誘導体を指す。例えば、修飾サポニンは、該修飾サポニンがベースとするサポニンにおける、アルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および／またはアセチル基の任意の１つ以上の化学修飾により提供され、すなわち、該サポニンが提供され、そしてアルデヒド基、カルボキシル基、アセタート基、および／またはアセチル基のいずれかが化学修飾され、それにより修飾サポニンが提供される。例えば、修飾サポニンの提供のために修飾されるサポニンは、天然産サポニンである。典型的には修飾サポニンは合成サポニンであり、典型的には修飾サポニンは天然サポニンの修飾物であり、したがって天然サポニンに由来するが、しかし修飾サポニンが天然の対応物を有し得るかまたは有し得ない合成サポニンに由来することも可能ではある。典型的には、修飾サポニンは、天然の対応物をもたない、すなわち修飾サポニンは、例えば草または樹木によって自然に生成されることはない。
用語「アグリコンコア構造」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、それに結合された１つまたは２つの炭水化物アンテナまたは糖鎖（グリカン）をもたない、サポニンのアグリコンコアを指す。例えば、キラ酸は、ＳＯ１８６１、ＱＳ－７、およびＱＳ２１のアグリコンコア構造である。典型的には、サポニンのグリカンは、単糖またはオリゴ糖、例えば直鎖または分岐グリカンである。
用語「ＱＳ２１」は、さらに特定しない限り、図４１に示された構造式をもつ、ＱＳ２１の異性体の任意の１つ、並びに図４１に示された全ての異性体などの、２つ以上の混合物を指す。当業者には理解されるように、ＱＳ２１を含む典型的な天然の抽出物は、ＱＳ２１の様々な異性体の混合物を含むであろう。しかしながら、精製または（半）合成経路を介して、単一の異性体を単離し得る。
用語「糖鎖」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、グリカン、炭水化物アンテナ、単一の糖部分（単糖）、または複数の糖部分を含有する鎖（オリゴ糖、多糖）のいずれかを指す。糖鎖は、糖部分のみで構成されてもよく、或いはまた４Ｅ－メトキシケイ皮酸、４Ｚ－メトキシケイ皮酸、および、例えばＱＳ－２１中に存在するような、
５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸の任意の１つなどの、さらなる部分を含んでもよい。
用語「化学的に修飾された」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、第２の化学基または第２の化学的部分を提供するようにする、第１の化学基または第１の化学的部分の化学修飾を指す。例は、カルボニル基の－（Ｈ）Ｃ－ＯＨ基への化学修飾、アセタート基のヒドロキシル基への化学修飾、そのアルデヒド基において化学反応によってＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）部分とコンジュゲートされたサポニンの提供などである。
用語「化学修飾されたアルデヒド基」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポニンのアルデヒド基が関与する、結果として新たな化学基による最初のアルデヒド基の置換を生じる化学反応によって得られた、化学反応生成物を指す。例として、サポニンの最初のアルデヒド基からの、－（Ｈ）Ｃ－ＯＨ基の形成がある。
用語「化学修飾されたカルボキシル基」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、サポニンのカルボキシル基、例えばグルクロン酸部分のカルボキシル基と、さらなる分子とが関与する、結果として新たな化学基による最初のカルボキシル基の置換を生じる化学反応によって得られた化学反応生成物を指す。例として、サポニンのグルクロン酸のカルボキシル基が関与する、サポニンと、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）、または１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）のいずれか１つとの間のコンジュゲートの形成がある。
糖鎖の名称という文脈における用語「Ａｐｉ／Ｘｙｌ－」または「Ａｐｉ－またはＸｙｌ－」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、アピオース（Ａｐｉ）部分を含むか、またはキシロース（Ｘｙｌ）部分を含む、いずれかの糖鎖を指す。
用語「修飾サポニンがベースとするサポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンを提供する目的で修飾されているサポニンを指す。典型的には、修飾サポニンがベースとするサポニンは、天然産サポニンであり、これが修飾サポニンの提供のための化学修飾に供される。
用語「サポニンをベースとする修飾サポニン」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾サポニンが提供されるようにする化学修飾工程に供されているサポニンを指し、これにおいて、修飾サポニンがそれから調製されたサポニンは、典型的には天然産サポニンである。
用語「オリゴヌクレオチド」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、中でも、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、単鎖分子または二本鎖分子として提供された、ＢＮＡなどの合成核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを含む、任意の天然または合成された一連の核酸を指す。
用語「抗体－薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、抗体、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、１つまたは複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ類のＶＨなどと、ヒト患者などの患者の細胞と接触された場合に治療効果を及ぼし得る任意の分子、例えば、医薬品有効成分、毒素、オリゴヌクレオチド、酵素、低分子薬剤化合物などとの、任意のコンジュゲートを指す。
用語「抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート」または「ＡＯＣ」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、抗体、例えばＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、１つまたは複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ラクダ類のＶＨなどと、ヒト患者などの患者の細胞と接触された場合に治療効果を及ぼし得る任意のオリゴヌクレオチド分子、例えば、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、単鎖分子または二本鎖分子として提供された、ＢＮＡなどの合成核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、短または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；サイレンシングＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを包含する、核酸の天然または合成された一連の核酸から選択されるオリゴヌクレオチドとの、任意のコンジュゲートを指す。
用語「エフェクター分子」または「エフェクター部分」は、例えば、共有コンジュゲートの部分としてのエフェクター分子について言及する場合、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、標的分子：タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、（リン）脂質、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、の任意の１つ以上に選択的に結合することができ、かつ、かかる１つ以上の標的分子の生物活性を調節する分子を指す。エフェクター分子は、例えば、薬物分子などの低分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、ゼノ核酸またはｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組合せの、任意の１つ以上から選択される分子である。したがって、例えば、エフェクター分子またはエフェクター部分は、標的分子：タンパク質、ペプチド、炭水化物、グリカンなどの糖、（リン）脂質、核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、の任意の１つ以上に選択的に結合することができ、かつ標的分子への結合に際し、かかる１つ以上の標的分子の生物活性を調節する、薬物分子などの低分子、タンパク質毒素などの毒素、ＢＮＡなどのオリゴヌクレオチド、ゼノ核酸またはｓｉＲＮＡ、酵素、ペプチド、タンパク質、またはそれらの任意の組合せの、任意の１つ以上から選択される分子または部分である。典型的には、エフェクター分子は、細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト細胞の内側において、例えば前記細胞のサイトゾル中で、生物学的効果を及ぼすことができる。それ故、典型的なエフェクター分子は、薬物分子、プラスミドＤＮＡ、毒素、例えば抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）によって含まれる毒素、オリゴヌクレオチド、例えばｓｉＲＮＡ、ＢＮＡ、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）によって含まれる核酸である。例えば、エフェクター分子は、酵素活性、遺伝子発現、または細胞シグナリングを増加または減少させ得るリガンドとして、作用し得る分子である。
用語「ＨＳＰ２７」は、細胞におけるＨＳＰ２７の発現をサイレンシングするＢＮＡ分子に関する。
用語「架橋型核酸」もしくは手短に言えば「ＢＮＡ」、または「ロック核酸」もしくは手短に言えば「ＬＮＡ」は、その通常の科学的意味を有し、かつ本明細書では、修飾されたＲＮＡヌクレオチドを指す。ＢＮＡはまた、「束縛されたＲＮＡ分子」または「アクセス不能ＲＮＡ分子」とも称される。ＢＮＡモノマーは、「固定された」Ｃ３’－ｅｎｄｏ糖パッカリングをもつ、五員、六員、またはさらに七員の架橋構造を含有し得る。架橋は、リボースの２’，４’－位置において合成的に取込まれ、２’，４’－ＢＮＡモノマーを生じる。ＢＮＡモノマーは、当該技術分野において既知の標準的なホスホロアミダイト化学を用いて、オリゴヌクレオチドポリマー構造内に取込まれ得る。ＢＮＡは、結合親和性及び安定性が増加した、構造的に堅いオリゴヌクレオチドである。
本明細書および特許請求の範囲における用語、第１、第２、第３などは、例えば、類似した要素、組成、組成物中の構成要素、または個別の方法工程の間を区別するために使用され、必ずしも順番または時系列順を記載するために使用されるものではない。この用語は、適当な状況下では交換可能であり、かつ本発明の実施形態は、他に特に指定しない限り、本明細書に記載または例示されたもの以外の順序で操作し得る。
本明細書に記載された実施形態は、他に特に指定しない限り、組合せてまた共同して操作し得る。
さらに、種々の実施形態は、「好ましい」または「例えば」または「例として」または「とりわけ」などと呼ばれていても、本発明の範囲を限定するものとしてよりもむしろ、本発明が実行され得る例示的な方法として解釈されるべきである。
特許請求の範囲において使用された用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、例えば、後段に列記された、要素または方法工程または組成物中の構成要素に限定されるものとして解釈されるべきではない；それは、他の要素または方法工程または組成物中の構成要素を除外しない。それは、述べられた特徴、整数、方法（工程）、または成分の存在を、表記された通りに特定するものとして解釈される必要はあるが、しかし１つ以上の他の特徴、整数、工程、または成分、またはそれらの群の存在また付加を排除するものではない。したがって、「工程ＡおよびＢを含む方法」という表現の範囲は、工程ＡおよびＢのみからなる方法に限定されるべきではなく、本発明に関してはむしろ、方法の工程の中でＡおよびＢが列挙されたに過ぎず、かつさらに特許請求の範囲は、これらの方法工程の同等物を含むものと解釈されるべきである。したがって、「成分ＡおよびＢを含む組成物」という表現の範囲は、成分ＡおよびＢのみからなる組成物に限定されるべきではなく、本発明に関してはむしろ、組成物の成分の中でＡおよびＢが列挙されたに過ぎず、かつさらに特許請求の範囲は、これらの成分の同等物を含むものと解釈されるべきである。
加えて、不定冠詞「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」による要素または成分への言及は、文脈が明らかに１つの、および唯一の要素または成分があることを要求しない限り、２つ以上の要素または成分が存在する可能性を排除しない。それ故不定冠詞「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。
分子３Ａの合成を示す図である。 分子６の合成を示す図である。 分子８の合成を示す図である。 分子９の合成を示す図である。 分子１０の合成を示す図である。 分子１１の合成を示す図である。 分子１２の合成を示す図である。 分子１４の合成を示す図である。 分子１５の合成を示す図である。 分子１６の合成を示す図である。 分子１８の合成を示す図である。 分子１９の合成を示す図である。 分子２０の合成を示す図である。 分子２１の合成を示す図である。 分子６のマスクロマトグラムを示す図である。 ＳＯ１８６１から出発する分子６の合成のマスクロマトグラムの詳細を示す図である。 分子６から出発する分子９のマスクロマトグラムの詳細を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、サポニン誘導体の溶血活性を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、サポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）におけるサポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、サポニン誘導体の溶血活性を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、サポニン誘導体の溶血活性を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、サポニン誘導体の溶血活性を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、ＥＧＦＲ発現細胞に対するサポニン誘導体の活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、非有効定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下での、ＥＧＦＲ発現細胞に対するサポニン誘導体の活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、サポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、サポニン誘導体の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、サポニン誘導体の溶血活性を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）における、濃度５ｐＭのセツキシマブ－サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）の存在下での、種々のＱＳサポニン分画のエンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）における、濃度５ｐＭのセツキシマブ－サポリンの存在下での、種々のＱＳサポニン分画の脱出促進活性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａ）におけるＱＳサポニン分画の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）におけるＱＳサポニン分画の毒性のＩＣ５０曲線を示す図である。 ヒト赤血球溶血アッセイにより測定された、ＱＳサポニン分画の溶血活性を示す図である。 分子２３の合成を示す図である。 分子２５の合成を示す図である。 分子２７の合成を示す図である。 分子２８の合成を示す図である。 分子２９の合成を示す図である。 ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（分子３０）を示す図である。 ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（分子３１）を示す図である。 ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子３２）を示す図である。 ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子３３）を示す図である。 ＱＳ２１異性体の構造を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：１修飾ＳＯ１８６１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：２修飾ＳＯ１８６１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：３修飾ＳＯ１８６１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：ＱＳサポニンのＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：ＱＳ２１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：修飾ＱＳ２１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：１修飾ＱＳ２１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 臨海ミセル濃度の測定：２修飾ＱＳ２１のＡＮＳ蛍光収率を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ＋１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、セツキシマブ－ジアンチン＋３００ｎＭおよび４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、セツキシマブ－サポニン＋３００ｎＭおよび１５００ｎＭ ＳＯ１８６１または４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ＋１０ｐＭ ＥＧＦジアンチンの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＥＧＦジアンチン＋１０ｎＭ、３００ｎＭ、および１５００ｎＭ ＳＯ１８６１の細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＥＧＦジアンチン＋３００ｎＭ、１５００ｎＭ ＳＯ１８６１または４８２９ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、トラスツズマブ－ジアンチン＋１５００ｎＭ ＳＯ１８６１または４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、トラスツズマブ－サポリン＋１５００ｎＭ ＳＯ１８６１または４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの細胞生存率アッセイ（ＭＴＳ）を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ＋１００ｎＭ ＨＳＰ２７ＢＮＡ、１００ｎＭ セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 Ａ４３１細胞における、セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡコンジュゲート（ＤＡＲ１．５またはＤＡＲ４）＋１００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨまたは４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 ＳＫ－ＢＲ－３細胞における、トラスツズマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡコンジュゲート（ＤＡＲ４．４）＋１００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨまたは４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 Ａ４３１細胞における、ＨＳＰ２７ＢＮＡ＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 Ａ２０５８細胞における、ＨＳＰ２７ＢＮＡ＋４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 ＳＫ－ＢＲ－３細胞における、ＨＳＰ２７ＢＮＡまたはＨＳＰ２７ＬＮＡ＋４８２９ｎＭ ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨの、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ遺伝子サイレンシング分析を示す図である。 分子２６の合成を示す図である。 ＥＭＣＨマレイミド基の、チオールとのマイケル付加反応の一般的な反応スキームを示す図である（Ｒ＝ＣＨ２－ＣＨ２－ＯＨである場合、図６０はブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール）の合成を記載する）。 （Ａ）ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの、および（Ｂ）ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノールの、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す図である。（Ａ）ＲＰモード：ｍ／ｚ ２１２４ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，サポニン－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ），ｍ／ｚ ２１０９ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ），ｍ／ｚ ２０９４ Ｄａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ）。（Ｂ）ＲＰモード：ｍ／ｚ ２１９３ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，サポニン－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール），ｍ／ｚ ２１８５ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール），ｍ／ｚ ２１７０ Ｄａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール）。 ｐＨ３のＨＣｌ中での加水分解の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す図である。 ｐＨ３のＨＣｌ中での加水分解の前（Ａ）および後（Ｂ）の、ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを示す図である。 非コンジュゲートサポニン媒介性のエンドソーム脱出および標的細胞殺傷増強を示す図である。Ａ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｂ）ＥＧＦジアンチンおよび定濃度のＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｄ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、種々のＱＳｍｉｘ（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｉａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニン混合物）で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。 非コンジュゲートサポニン媒介性のエンドソーム脱出および標的細胞殺傷増強を示す図である。Ａ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｂ）ＥＧＦジアンチンおよび定濃度のＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｄ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、種々のＱＳｍｉｘ（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｉａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニン混合物）で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。 非コンジュゲートサポニン媒介性のエンドソーム脱出および標的細胞殺傷増強を示す図である。Ａ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｂ）ＥＧＦジアンチンおよび定濃度のＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｄ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、種々のＱＳｍｉｘ（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｉａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニン混合物）で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。 非コンジュゲートサポニン媒介性のエンドソーム脱出および標的細胞殺傷増強を示す図である。Ａ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｂ）ＥＧＦジアンチンおよび定濃度のＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）またはＳＯ１９０４で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＧＥ１７４１で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。Ｄ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、種々のＱＳｍｉｘ（キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｉａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来のサポニン混合物）で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ活性を示す図である。本発明による、癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達および遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ、Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨで処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）、またはＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞の細胞生存率分析。Ｄ、Ｅ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３またはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）で処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）またはＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ活性を示す図である。本発明による、癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達および遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ、Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨで処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）、またはＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞の細胞生存率分析。Ｄ、Ｅ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３またはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）で処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）またはＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ活性を示す図である。本発明による、癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達および遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ、Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨで処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）、またはＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞の細胞生存率分析。Ｄ、Ｅ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３またはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）で処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）またはＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ活性を示す図である。本発明による、癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達および遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ、Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨで処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）、またはＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞の細胞生存率分析。Ｄ、Ｅ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３またはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）で処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）またはＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ活性を示す図である。本発明による、癌細胞におけるＥＧＦＲ標的化アンチセンスＢＮＡオリゴ送達および遺伝子サイレンシング。Ａ、Ｂ、Ｃ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨで処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）、またはＡ２０５８（ＥＧＦＲ－）細胞の細胞生存率分析。Ｄ、Ｅ）１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３またはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）で処理された、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋＋）またはＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞の細胞生存率分析。 非コンジュゲートＳＯ１８６１対ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（不安定なヒドラゾン結合）対ＳＯ１８６１－ＨＡＴＵ（またＳＯ１８６１－（Ｓ）（安定）およびＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵとも称される）を示す図である。ＥＧＦジアンチンの有り無しで、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵ（またＳＯ１８６１－（Ｓ）（Ｓ＝ＨＡＴＵ）とも称される）、およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＳＯ１８６１アグリコンコアとＥＭＣＨリンカーとの間のヒドラゾン結合はまた「不安定なリンカー」とも称される）で処理されたＨｅＬａ細胞（ＥＧＦＲ＋）の細胞生存率分析。
本発明は、特定の実施形態について記載されるが、しかし本発明はそれに制限されず、特許請求の範囲によってのみ制限される。
驚いたことに本発明者らは、修飾サポニン、すなわち、
－ サポニンのアグリコンのＣ－３において結合され、かつ修飾されたグルクロン酸を含有する、分岐型三糖部分；および／または
－ サポニンのアグリコンのＣ－４における修飾されたアルデヒド；および／または
－ サポニンのアグリコンのＣ－２８位において結合された多糖部分であり、かつ、前記多糖部分中に修飾されたアセトキシ基を含有する、該多糖部分、
を有するサポニン誘導体が；
前記サポニン誘導体と接触された細胞の細胞生存率が考慮される場合に低減された毒性を有し；修飾サポニンにおける前記の上述した基の１つまたは２つ（すなわち、アグリコンのアルデヒド基、前記アグリコンのＣ－３に結合された多糖鎖におけるグルクロン酸のカルボキシル基、およびアグリコンのＣ－２８において結合された多糖鎖におけるアセチル基：の１つまたは２つ）が誘導体化される場合、例えば毒素の細胞毒性またはＢＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの増強が考慮される場合に（いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが：修飾サポニンの類似のまたは改善されたエンドソーム脱出促進活性に関連して）活性を有し；および／または、非修飾のサポニンの毒性、活性、および溶血活性と比較した場合、低減された溶血活性を有することを見出した。それにより本発明者らは改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供するが、その理由は、該サポニン誘導体について、細胞毒性が天然産の対応物について測定された細胞毒性よりも低いこと、溶血活性がサポニン誘導体の天然産の対応物について測定された溶血活性よりも低いこと、また単一誘導体化サポニンについて、および二重誘導体化サポニンについて、細胞毒性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、ＩＣ５０値間の比率が同様かまたは増加することから、および／または、サポニン溶血活性と例えば毒素増強または遺伝子サイレンシングとの、ＩＣ５０値間の比率が同様かまたは増加することからである。例示的なサポニン誘導体の概要については、図１－１４，および３６－４０と組合せて、表Ａ２が参照され、また種々の細胞において測定された、細胞毒性、溶血活性、およびエンドソーム脱出促進活性（「活性」）の概要、並びに細胞毒性のＩＣ５０と活性のＩＣ５０との間の比率、および溶血活性のＩＣ５０と活性のＩＣ５０との間の比率の概要については、表Ａ５および表Ａ６が参照される。
本発明の第１の態様は、トリテルペンアグリコンコア構造（「アグリコンコア」とも称される）と、前記アグリコンコア構造に結合された、第１の糖鎖および第２の糖鎖の少なくとも１つとを含む、サポニンをベースとするサポニン誘導体であって、これにおいて：
ｉ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含むか；または
ｉｉ． 前記サポニン誘導体が、前記第１の糖鎖を含み、これにおいて、前記第１の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか：または
ｉｉｉ． 前記サポニン誘導体が、前記第２の糖鎖を含み、これにおいて、前記第２の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基を含有するか；または
ｉｖ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の任意の組合せ、好ましくは誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つの任意の組合せを含み；
これにおいて、前記第１の糖鎖および前記第２の糖鎖が、独立して、単糖、直鎖オリゴ糖、および分岐オリゴ糖から選択される、
該サポニン誘導体に関する。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、モノデスモシド系トリテルペングリコシドまたはビスデスモシド系トリテルペングリコシド、より好ましくはビスデスモシド系トリテルペングリコシドである、本発明のサポニン誘導体である。
驚いたことに、サポニンのアグリコンのＣ－２３におけるアルデヒド基、アグリコンのＣ－３における糖部分、すなわちグルクロン酸部分におけるカルボキシル基、およびサポニンのアグリコンコアのＣ－２８において結合された（オリゴ－）糖部分の糖単位におけるアセチル基の、任意の１つ、２つ、または３つの修飾（誘導体化）は、結果として、かかるサポニン誘導体が細胞、すなわち種々のタイプの細胞と接触された場合に細胞毒性を低減する。細胞毒性の低減は、本発明者らにより、表Ａ２、表Ａ３、並びに図１－１４、および３６－４０に列記された一連の種々のサポニン誘導体について確証された。それ故、低減された細胞毒性をもつこれらの一連のサポニン誘導体が提供されることは、本発明の一部であって、ここで細胞毒性の低減とは、非修飾の天然産サポニンの対応物について測定されたような細胞毒性に比較したものである。サポニン誘導体は、かかる天然産サポニンから形成され得る。典型的には、本発明のサポニン誘導体は、自然界に存在するＳＯ１８６１およびＱＳ－２１（異性体）などの、天然産の対応物に比較した場合、１つ、２つ、または３つの誘導体化を含む。細胞毒性の低減が考慮される場合、本明細書で上記に概説されたサポニン分子中の位置において１つ、２つ、または３つの修飾（誘導体化）を含むサポニン誘導体は、細胞毒性の低減されたサポニンが提供されるべき場合に、等しく好適である。さらに本発明者らは驚いたことに、多種多様な異なる修飾が、細胞毒性を低減すること、溶血活性を低減すること、および充分な程度のエンドソーム脱出促進活性を保持しかつ残すことに適していることを確証した。溶血活性が考慮される場合、細胞毒性の低下と同様に、サポニンの示された化学基の１つ、２つ、または３つが誘導体化される場合に、溶血活性は低減される。こうした誘導体化は、様々な性質のもの、例えば表Ａ２、表Ａ３、並びに図１－１４、および３６－４０に概説されたものでよい。還元によるアルデヒド基のヒドロキシル基への誘導体化のように小さい誘導体化と、およびＡＥＭによるグルクロン酸のカルボキシル基の誘導体化と組合された、ＥＭＣＨによるアルデヒド基の誘導体化のように大きい誘導体化との双方の誘導体化が、細胞毒性および溶血活性を低減する。いずれも天然産のサポニン対応物に比較した場合に、低減された細胞毒性という点で改善された細胞毒性をもち、かつ低減された溶血活性という点で改善された溶血活性を持つサポニンを提供するために、サポニンの３つの化学基の任意の１つ以上、例えば１つ、２つ、または３つが、異なるサイズおよび／または異なる化学的性質をもつ幅広く様々な化学基によって誘導体化され得ることは明らかである。
何ら理論に束縛されることを望むものではないが、サポニンのアグリコンのＣ－３原子におけるアルデヒド基が、ビスデスモシド系トリテルペングリコシド型のサポニンのエンドソーム脱出促進活性、すなわち、例えば、インビトロおよびインビボの双方において、かかるサポニンの存在下に細胞と接触された場合の、かかるサポニンの不在下に同じ用量が同じ細胞と接触された場合のかかる毒素の毒性に比較して増大された（タンパク質）毒素の毒性、に関係および／または寄与することが推定される。実際、本発明者らは、グルクロン酸単位中に誘導体化されたカルボキシル基、および／または多糖鎖中に誘導体化されたアセチル基をもち、かつアグリコン中に遊離のアルデヒド基を含有するサポニン誘導体が、エンドソーム脱出促進活性をもつことを確証した。これらの誘導体は、低減された溶血活性および低減された細胞毒性を有する。例えば、分子３Ａ、８、１１、１８、１９、および２８（表Ａ２、表Ａ３、表Ａ５、表Ａ６、図１、３、６、１１、１２、３９）のようなサポニン誘導体は、アグリコンコア中に遊離の非修飾アルデヒド基を有しており、実際、抗体がそれに結合する受容体を発現している種々の（腫瘍）細胞と接触される、抗体－薬物コンジュゲートの細胞毒性の増強が考慮される場合に活性を示す。それ故これらのサポニン誘導体は、本発明の明らかに想定される実施形態である。
驚いたことに、アグリコン中に誘導体化されたアルデヒド基をもち、サポニン誘導体が遊離のアルデヒド基を含まないようにしたサポニン誘導体でも、リガンド－毒素コンジュゲート、例えばＡＤＣの形態で（腫瘍）細胞へ提供されたエフェクター分子の細胞毒性（ ）、かつ前提条件として、Ｃ－２８における多糖鎖中のアセチル基およびＣ－２３における多糖鎖中のカルボキシル基のうちのゼロ個または１個だけが誘導体化される場合、なお特徴的なエンドソーム脱出促進活性を示す。例えば、表Ａ２、表Ａ３、および図２、４、５、８、９、１３、３８，および４０において分子６、９、１０、１４、１５、２０、２７、および２９として示された、修飾されたアルデヒド基をもち、かつゼロ個または単一のさらなる誘導体化をもつサポニン誘導体は、アグリコン中に誘導体化されたアルデヒド基をもつかかるサポニン誘導体の存在下に腫瘍細胞と接触される、エフェクター分子の細胞毒性を増強する能力をもつ。これらのサポニン誘導体は全て、低減された細胞毒性を示し、かつ低減された溶血活性を示し、かつそれ故に本発明の明らかに想定される実施形態である。
本発明者らはまた、ある修飾が、対応する非修飾のサポニンに比較した場合、増加された臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）をもたらすことも見出した。例えば、分子２、６、８、１０、１５、２７、および２８として示されたサポニン誘導体、好ましくは分子２、６、８、１０、および１５として示されたサポニン誘導体は、それらの対応する非誘導体化サポニンに比較した場合、増大されたＣＭＣをもち、かつそれ故に本発明の明らかに想定される実施形態である。何ら理論に束縛されることを望むものではないが、増大されたＣＭＣは、いくつかの理由で有利であると考えられる。例えば、遊離の分子は一般に、ミセル構造中に正しく並べられた分子よりもコンジュゲーション反応の影響を受けやすいことから、増大されたＣＭＣはその後のコンジュゲーション反応における修飾サポニンの使用を促進し得る。さらに、サポニン誘導体が生物学的機能（例えば、インビボ治療、またはエクスビボ法、またはインビトロ法において）を及ぼす必要がある場合、例えば、サポニン誘導体がそのまま使用される場合、またはそれらが担体もしくは別の実体から切断された後にインシトゥで放出される場合でも、非修飾のサポニンに比較して増大されたＣＭＣは有利であり、その理由は、遊離のサポニン分子が、これらのサポニン誘導体がミセル構造中に正しく並べられている場合よりも、その生物学的標的と相互作用するためにより容易に利用されやすいことからである。臨界ミセル濃度を超える（上回る）濃度においては、サポニンは単離（例えば、分取ＨＰＬＣを用いた）を邪魔するミセルを形成することから、増大されたＣＭＣはまた、サポニン誘導体の大量の生産および濃縮を促進するためにも有用であり得る。驚いたことに、本発明のサポニン誘導体については、観察された増大されたＣＭＣは、増大された細胞毒性または溶血活性とは関係しない。ＣＭＣと細胞毒性との間の相互関係は、例えば、α－ヘデリン（Ｈｅｄｅｒｉｎ）を基準点として、ＣＭＣは一般的な細胞毒性の増大と関係づけられ得る（ジギトニン（Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）の場合と同様に）が、しかし細胞毒性の減少にも全く同様に関係づけられること（グリチルリチン（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎ）およびヘデラコシド（Ｈｅｄｅｒａｃｏｓｉｄｅ）Ｃの場合と同様に）を示す、Ｇｒｏｏｔら（“Ｓａｐｏｎｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｌａｎｇｍｕｉｒ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｓｔｕｄｉｅｓ，ｈｅｍｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＣＯＭｓ（サポニンのモデル膜系との相互作用－ラングミュア単分子膜研究、溶血、およびＩＳＣＯＭの形成）”、「Ｐｌａｎｔａ ｍｅｄｉｃａ」、２０１６年、第８２巻、第１８号、Ｐ．１４９６－１５１２）の表２のデータから分かるように、予測可能ではなくかつ複雑である。さらに、分子２、６、１０、および１５として示されたサポニン誘導体については、増大されたＣＭＣはまた、対応する遊離のサポニンに比較して増大された比率：ＩＣ５０溶血／ＩＣ５０活性に関係づけられるため、これらのサポニン誘導体は本発明の特に好ましい実施形態である。
本発明者らはそれ故、細胞毒性が考慮される場合、および／または溶血活性が考慮される場合、および例えば毒素の増強、および／または対応する非誘導体化サポニンに比較して増大されたＣＭＣが考慮される場合に、改善された治療濃度域をもつサポニン誘導体を提供する。本発明のかかるサポニン誘導体は、とりわけ、例えば癌の予防または治療のための、例えばＡＤＣまたはＡＯＣを含む治療計画における適用のために適している。かかるサポニン誘導体の安全性は、細胞毒性および／または溶血活性が考慮される場合、とりわけ、かかるサポニン誘導体が、例えば、ＡＤＣを用いるかまたはＡＯＣを用いる治療を要する患者に投与される場合に改善される。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて前記サポニン誘導体が、前記第１の糖鎖を含み、ここで、前記第１の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し、および／またはこれにおいて、前記サポニン誘導体が、前記第２の糖鎖を含み、これにおいて、前記第２の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基（本明細書ではまた誘導体化されたアセタート基とも称される）を含み、好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第１の糖鎖と、誘導体化されている前記第２の糖鎖との双方を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第１の糖鎖と、誘導体化されている前記第２の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基または誘導体化されているアルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含み、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、誘導体化されている前記第１の糖鎖と、誘導体化されている前記第２の糖鎖との双方を含み、かつ前記サポニン誘導体が、アルデヒド基を含有するアグリコンコア構造を含む。同様に好ましいのは、天然産サポニンが考慮される場合、サポニン中のこれら３つの化学基の１つを未変更のまま残している、かかる誘導体化の２つの全ての他の可能な組合せである。さらに、サポニン中の化学基の１つ、２つ、または３つ、好ましくは１つまたは２つは、表Ａ２および表Ａ３に列記された誘導体化の任意の１つ以上によって誘導体化される。
一実施形態は、本発明によるサポニン誘導体であって、ここで、前記サポニン誘導体が：
２アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
１６アルファ－ヒドロキシオレアノール酸；
ヘデラゲニン（２３－ヒドロキシオレアノール酸）；
１６アルファ，２３－ジヒドロキシオレアノール酸；
ギプソゲニン；
キラ酸；
プロトアエスシゲニン－２１（２－メチルブタ－２－エノアート）－２２－アセタート；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１，２２－ビス（２－メチルブタ－２－エノアート）；
２３－オキソ－バリングトゲノールＣ－２１（２－メチルブタ－２－エノアート）－１６，２２－ジアセタート；
ジギトゲニン；
３，１６，２８－トリヒドロキシオレアナン－１２－エン；
ギプソゲニン酸；
および
それらの誘導体、
からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、
好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸およびギプソゲニンまたはそれらの誘導体から選択されるアグリコンコア構造を含み、より好ましくは、前記サポニン誘導体アグリコンコア構造が、キラ酸またはその誘導体である。本発明者らは今、改善されたサポニン誘導体が、トリテルペングリコシド型のサポニンをベースとして、かかる誘導体と接触された細胞の、低減された細胞毒性および低下された溶血に関して提供され得ることを見出したことから、本発明者らによってテストされたようなエンドソーム脱出促進活性をもつ任意のサポニン、例えば前述の実施形態のアグリコンを有しかつ表Ａ１に列記されたサポニンは、それ故基本的に改善可能である。毒素および例えばＢＮＡの増強が考慮される場合、活性を充分に高い程度に保持しながら、毒性を低下させることおよび溶血活性を低下させることは、単独または例えばＡＤＣもしくはＡＯＣと組合せたサポニン誘導体の治療濃度域の拡大が考慮される場合に、本発明者らによる重要な業績である。充分に高い用量の誘導体化されたサポニンが、例えば、それを必要とする癌患者のための腫瘍療法において適用可能である一方、サポニン誘導体によって及ぼされるかまたは誘導される、細胞毒性の副作用（のリスク）および望ましくない溶血活性（のリスク）は、天然のサポニンの対応物の適用に比較して低減される。本発明のサポニン誘導体の治療濃度域の改善は、例えば、細胞毒性または溶血活性のいずれかのＩＣ５０と、エンドソーム脱出促進活性のＩＣ５０との間の比率、並びに溶血活性、細胞毒性、および活性が列記されている表Ａ５および表Ａ６における例示的なサポニン誘導体について明らかである。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、前記サポニン誘導体が、キラ酸、ギプソゲニン、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、好ましくは、前記サポニン誘導体が、キラ酸、およびそれらの誘導体からなる群より選択されるアグリコンコア構造を含み、これにおいて、前記第１の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造のＣ３原子（「Ｃ－３原子」とも称される）またはＣ２８原子（「Ｃ－２８原子」とも称される）、好ましくはＣ３原子に結合され、および／またはこれにおいて、前記第２の糖鎖が、存在する場合、前記アグリコンコア構造のＣ２８原子に結合される。好ましいのは、アグリコンに結合された双方の糖鎖を有するサポニンをベースとするサポニン誘導体であるが、しかし一般に、エンドソーム脱出促進活性を示す任意のいずれのサポニンも、より低い細胞毒性、より低い溶血活性、および充分に高いエンドソーム脱出促進活性をもつ、単一、二重、または三重、好ましくは一重または二重誘導体化されたサポニンを提供するための、本発明による誘導体化に適している。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて前記第１の糖鎖が、存在する場合、以下（リストＳ１）の：
ＧｌｃＡ－，
Ｇｌｃ－，
Ｇａｌ－，
Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ－，
Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡ－，
Ｇｌｃ－（１→２）－［Ｇｌｃ－（１→４）］－ＧｌｃＡ－，
Ｇｌｃ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→２）－Ａｒａ－（１→３）－［Ｇａｌ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－Ｇｌｃ－（１→４）－Ｇａｌ－，
Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→２）］－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ａｒａ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｒｈａ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇｌｃ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｆｕｃ－（１→２）－Ｇａｌ－（１→２）－Ｆｕｃ－（１→２）－ＧｌｃＡ－，および
それらの誘導体から選択され、
および／または前記第２の糖鎖が、存在する場合、以下の（リストＳ２）：
Ｇｌｃ－，
Ｇａｌ－，
Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－，
Ｒｈａ－（１→２）－［Ａｒａ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－，
Ａｒａ－，
Ｘｙｌ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ１は４Ｅ－メトキシケイ皮酸であり、
Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ２－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ２は４Ｚ－メトキシケイ皮酸であり、
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－３，４－ｄｉ－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ３－（→４）］－３－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－ ここでＲ３は４Ｅ－メトキシケイ皮酸であり、
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
（Ａｒａ－またはＸｙｌ－）（１→３）－（Ａｒａ－またはＸｙｌ－）（１→４）－（Ｒｈａ－またはＦｕｃ－）（１→２）－［４－ＯＡｃ－（Ｒｈａ－またはＦｕｃ－）（１→４）］－（Ｒｈａ－またはＦｕｃ－），
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇａｌ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
Ａｒａ／Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ／Ｆｕｃ－（１→４）－［Ｇｌｃ／Ｇａｌ－（１→２）］－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ４－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ４は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ５－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ５は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４－ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３－ＯＡｃ－－Ｒｈａ－（１→３）］－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［３，４－ｄｉ－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
６－ＯＡｃ－Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）］－Ｒｈａ－（１→２）－Ｆｕｃ－，
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒｈａ－（１→３）］－４ＯＡｃ－Ｆｕｃ－，
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ６－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ６は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ｒｈａ－（１→２）－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ７－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ７は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ／Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－［Ｇｌｃ－（１→３）］－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ８－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ８は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ９－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ９は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１０－（→４）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ１０は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ａｐｉ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１１－（→３）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ１１は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり、
Ｘｙｌ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｒ１２－（→３）］－Ｆｕｃ－ ここでＲ１２は５－Ｏ－［５－Ｏ－Ａｒａ／Ａｐｉ－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタノイル］－３，５－ジヒドロキシ－６－メチル－オクタン酸）であり
Ｇｌｃ－（１→３）－［Ｇｌｃ－（１→６）］－Ｇａｌ－，および
それらの誘導体、から選択される。
典型的には、細胞がサポニンおよび毒素と接触されるとき、毒素の細胞毒性を増強するサポニンは、アグリコンに結合されたかかる単糖または多糖鎖の１つまたは２つを有する。好ましいのは、２つの糖鎖を含む誘導体化について選択されたサポニンである。エンドソーム脱出促進活性が充分に高い程度に保持されるべき場合に、かかるサポニンを、単一、二重、または三重誘導体化、好ましくは一重または二重誘導体化に供するために特に好ましいサポニンの概要は、表Ａ１に提供される。当然ながら、かかるサポニンの構造変異体は、かかるサポニンが例えば毒素、ＢＮＡなどに対してエンドソーム脱出促進活性を示す場合には、本発明による誘導体化に等しく好適である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が、前記第１の糖鎖を含み、かつ前記第２の糖鎖を含み、ここで前記第１の糖鎖が、２つ以上の糖部分を含み、前記第２の糖鎖が、２つ以上の糖部分を含み、かつこれにおいて、前記アグリコンコア構造がキラ酸またはギプソゲニンであり、ここで：
ｉ． 前記アグリコンコア構造のアルデヒド基が誘導体化されていること、
ｉｉ．前記第１の糖鎖が、誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有すること：および
ｉｉｉ．前記第２の糖鎖が、誘導体化されている少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基を含有すること、
の１つ、２つ、または３つ、好ましくは１つまたは２つである、本発明のサポニン誘導体である。
以下の要約は、適当な誘導体化を例示する：
本発明によれば、サポニンは３つの誘導体化を含んでなお充分に高いエンドソーム脱出促進活性を示し得る。とりわけ、細胞毒性および／または溶血活性の低減が、細胞内でのエフェクター分子、例えば毒素またはＢＮＡの効果および活性を、エフェクター分子および誘導体化されたサポニンと接触された腫瘍細胞において強化する能力の（潜在的なまたは見かけ上の）低減よりも大きい場合である。したがって、本発明はアグリコンのアルデヒド基が考慮される場合、存在する場合にはＣ－３における多糖中のグルクロン酸単位におけるカルボキシル基が考慮される場合、および存在する場合にはＣ－２８における多糖鎖中のアセチル基が考慮される場合に、１つ、２つ、または３つの誘導体化を含む、誘導体化されたサポニンを提供する。好ましいのは、１つまたは２つの修飾を有するサポニン誘導体である。毒素およびＢＮＡなどのエフェクター分子の、エンドソーム脱出を改善するために適するのは、例えば遊離のアルデヒド基をもち、かつ糖鎖中に１つまたは２つの誘導体化をもつサポニン誘導体である。先に述べた通り、誘導体化されたアルデヒド基を持つサポニン誘導体もまた、等しく好適である。誘導体化に際し、アグリコン中に遊離のアルデヒド基をもたないかかるサポニン誘導体は、なお充分かつ効率的なエンドソーム脱出促進活性を示す。何ら理論に束縛されることを望むものではないが、ヒト細胞などの（哺乳類）細胞のエンドソーム内およびリソゾーム内の酸性条件の結果として、アルデヒド基は、位置Ｃ－２３において誘導体化されたアグリコンを持つサポニン誘導体を提供するためのサポニンのアルデヒド基に最初に結合した部分のｐＨ駆動型の切断に際し、細胞の内側で再び形成され得る。エンドソームまたはリソゾーム内で再度形成され得る修飾されたアルデヒド基をもつサポニン誘導体の例は、ヒドラゾン結合を含むサポニン誘導体であり、該結合は、アルデヒドのカルボニル基と、例えば、アグリコンに結合された化学基中のヒドラジド部分、例えばＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）、またはマレイミド基に結合されてチオエーテル結合を形成するメルカプトエタノールをもつＥＭＣＨとの間に形成される。かかるサポニン誘導体の例は、図８および図９に提示され、かつ分子２および分子３として以下に表示される。
本発明のサポニン誘導体の一実施形態は、これにおいて前記サポニン誘導体が：キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ）樹皮サポニン、ジプサコシドＢ、サイコサポニンＡ、サイコサポニンＤ、マクラントイジンＡ、エスクレントシドＡ、フィトラッカゲニン、エシネート、ＡＳ６．２、ＮＰ－００５２３６、ＡＭＡ－１、ＡＭＲ、アルファ－ヘデリン（Ｈｅｄｅｒｉｎ）、ＮＰ－０１２６７２、ＮＰ－０１７７７７、ＮＰ－０１７７７８、ＮＰ－０１７７７４、ＮＰ－０１８１１０、ＮＰ－０１７７７２、ＮＰ－０１８１０９、ＮＰ－０１７８８８、ＮＰ－０１７８８９、ＮＰ－０１８１０８、ＳＡ１６４１、ＡＥ Ｘ５５、ＮＰ－０１７６７４、ＮＰ－０１７８１０、ＡＧ１，ＮＰ－００３８８１、ＮＰ－０１７６７６、ＮＰ－０１７６７７、ＮＰ－０１７７０６、ＮＰ－０１７７０５、ＮＰ－０１７７７３、ＮＰ－０１７７７５、ＳＡ１６５７、ＡＧ２、ＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１９０４、ＳＯ１８６２、ＱＳ－７，ＱＳ１８６１，ＱＳ－７ ａｐｉ、ＱＳ１８６２、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉｏ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌｏ、ベータ－エスシン（Ａｅｓｃｉｎ）、エスシンＩａ、茶種子（Ｔｅａｓｅｅｄ）サポニンＩ、茶種子サポニンＪ、アッサムサポニン（Ａｓｓａｍｓａｐｏｎｉｎ）Ｆ、ジギトニン、プリムラ酸（Ｐｒｉｍｕｌａ ａｃｉｄ）１、およびＡＳ６４Ｒ、ならびにそれらの立体異性体およびそれらの組合せ、からなる群より選択されるサポニンの誘導体であり、好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＱＳ－２１誘導体、ＳＯ１８６１誘導体、ＳＡ１６４１誘導体、およびＧＥ１７４１誘導体からなる群より選択され、さらに好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＱＳ－２１誘導体およびＳＯ１８６１誘導体からなる群より選択され、最も好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体である。これらのサポニンは、基本的に、本発明者らにより実証されたようなエンドソーム脱出促進活性を示すか、または、それらについてエンドソーム脱出促進活性が確立されているサポニンに構造的に非常に類似しているものである。これらのサポニンの構造は、表Ａ１に要約されている。
本発明のサポニン誘導体の一実施形態は、これにおいて前記サポニン誘導体が、分子１：
［式中、
前記第１の糖鎖Ａ１は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、Ａ１は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表し、より好ましくは、Ａ１は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表しかつＡ１は、グルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなり；
前記第２の糖鎖Ａ２は、水素、単糖、または直鎖もしくは分岐オリゴ糖を表し、好ましくは、Ａ２は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表し、より好ましくは、Ａ２は、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表しかつＡ２は、少なくとも１つのアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基、例えば１つ、２つ、３つ、または４つの、好ましくは１つのアセトキシ基を含有し、ここで、Ａ１およびＡ２の少なくとも１つは水素ではなく、好ましくはＡ１およびＡ２の双方がオリゴ糖鎖であり；
かつＲは、ギプソゲニン中の水素またはキラ酸中のヒドロキシルである］
によって表される、キラ酸サポニンまたはギプソゲニンサポニンの誘導体であり、
ここで、前記サポニン誘導体が、以下の誘導体化：
ｉ． キラ酸またはギプソゲニンの位置Ｃ２３におけるアルデヒド基が誘導体化されている；
ｉｉ． Ａ１が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表しかつＡ１がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなる場合、Ａ１のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されている；および
ｉｉｉ． Ａ２が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表しかつＡ２が少なくとも１つのアセトキシ基を有する場合、Ａ２の１つの糖部分または２つ以上の糖部分の、１つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が誘導体化されている、
の少なくとも１つが存在する分子１によって表されるサポニンに対応する。
一実施形態は、Ａ１が、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表しかつグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部からなり、かつこれにおいて、Ａ１のグルクロン酸部分のカルボキシル基が誘導体化されており、および／または、Ａ２が、本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表しかつＡ２が少なくとも１つのアセトキシ基を含有し、かつこれにおいて、Ａ２の少なくとも１つのアセトキシ基が誘導体化されている、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、分子１によって表される前記サポニンが、ビスデスモシド系トリテルペンサポニンである、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、前記サポニン誘導体が分子１によって表されるサポニンに対応し、ここで、以下の誘導体化：
ｉ． 前記キラ酸またはギプソゲニンの位置Ｃ２３における前記アルデヒド基が、
－ アルコールへの還元；
－ 好ましくはヒドラジドとの反応を介した、ヒドラゾン結合への変換、
によって誘導体化されている；
ｉｉ． Ａ１が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表しかつＡ１がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、Ａ１のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基がアミド結合への変換により、好ましくはアミンとの反応を介して誘導体化されている；および
ｉｉｉ． Ａ２が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表しかつＡ２が少なくとも１つのアセトキシ基を有する場合、Ａ２の１つの糖部分または２つ以上の糖部分の、１つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも１つが存在し、好ましくは１つまたは２つが存在し、より好ましくは１つが存在する、該サポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が分子１によって表されるサポニンに対応し、これにおいて、以下の誘導体化：
ｉ． キラ酸またはギプソゲニンの位置Ｃ２３におけるアルデヒド基が、
－ アルコールへの還元；
－ Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、それにより、サポニン－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、例えばＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨまたはＱＳ－２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを提供し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
－ Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてＢＭＰＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；または
－ Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、これにおいてＫＭＵＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
によって誘導体化される；
ｉｉ． Ａ１が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ１）を表しかつＡ１がグルクロン酸部分を含むかまたはグルクロン酸部分からなる場合、Ａ１のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）またはＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化され、それにより、サポニン－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、例えばＱＳ－２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤもしくはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、またはサポニン－Ｇｌｕ－ＡＥＭ、例えばＱＳ－２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭもしくはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭを提供する；および
ｉｉｉ． Ａ２が本発明の特定の実施形態について上記に定義されたような糖鎖（リストＳ２）を表しかつＡ２が少なくとも１つのアセトキシ基を有する場合、Ａ２の１つの糖部分または２つ以上の糖部分の、１つ以上の、好ましくは全てのアセトキシ基が、脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されている、
の少なくとも１つが存在し、好ましくは１つまたは２つが存在し、より好ましくは１つが存在する、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、 が、Ｇａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡであり、および／またはＡ２が、Ｇｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃであり、好ましくは、分子１によって表される前記サポニンが、３－Ｏ－ベータ－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－［ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）］－ベータ－Ｄ－グルクロノピラノシルキラ酸－２８－Ｏ－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル－（１→３）－ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→４）－アルファ－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→２）－［ベータ－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－４ＯＡｃ－ベータ－Ｄ－キノボピラノシル－（１→４）］－ベータ－Ｄ－フコピラノシドであり、より好ましくはＳＯ１８６１、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１および／またはＱＳ－２１、最も好ましくはＳＯ１８６１である、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が：ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン（Ｑｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎｉｎ）、サポニナム・アルバム（Ｓａｐｏｎｉｎｕｍ ａｌｂｕｍ）、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシドＡ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択され、好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体、ＧＥ１７４１誘導体、ＳＡ１６４１誘導体、ＱＳ－２１誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体またはＱＳ－２１誘導体であり、最も好ましくは、サポニン誘導体がＳＯ１８６１誘導体である、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むＳＯ１８６１誘導体であり、ここで前記単一誘導体化が、例えば、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）の、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基への結合によるか（図５９参照）、または（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）の、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基への結合による、ＳＯ１８６１のグルクロン酸の前記カルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体が；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３にアルデヒド基を含有する；分子２によって表されるＳＯ１８６１誘導体であり：
或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体が；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３にアルデヒド基を含有するＳＯ１８６１誘導体であって、ここでＥＭＣＨのマレイミド基がメルカプトエタノールによって誘導体化され、それによりチオエーテル結合を生じる該誘導体を表す；分子３によって表される、本発明のサポニン誘導体である：
分子２によって表されるサポニン誘導体は、遊離のスルフヒドリル基を含有するさらなる分子とのコンジュゲーション反応のための前駆体としての適用に適する。分子２として示されたサポニン誘導体のマレイミド基は、遊離のスルフヒドリル基などとチオエーテル結合を形成し得る。例えば、分子２のサポニン誘導体は、遊離のスルフヒドリル基をもつシステインなどの遊離のスルフヒドリル基を含有する、ペプチドまたはタンパク質に共有結合され得る。かかるタンパク質は、例えば抗体または、その結合フラグメントもしくは結合ドメイン、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、例えばＶＨＨ、例えばラクダ類ＶＨなどである。例えば、遊離のスルフヒドリル基をもつ抗体とのカップリング反応における、分子２のサポニン誘導体の適用は、抗体（または結合ドメインもしくはそのフラグメント）が、例えば腫瘍細胞上に存在する受容体などの、標的細胞表面分子への特異的結合のための抗体である場合、細胞および細胞内部へのサポニンの標的化送達のためのコンジュゲートを提供する。好ましくは、サポニン誘導体は、例えばＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ７１といった受容体などの腫瘍細胞特異表面分子への結合が可能な、抗体またはＶＨＨへ結合される。
一実施形態は、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むＳＯ１８６１誘導体ではないという前提条件付きであり、これにおいて前記単一誘導体化が、１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）の、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応による、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体が；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化された、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３においてアルデヒド基を含有するＳＯ１８６１誘導体を表す；分子２によって表される、本発明のサポニン誘導体である：
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体であって、これにおいて、
ｉ．前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
－ アルコールへの還元；
－ Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
－ Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでＢＭＰＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；または
－ Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでＫＭＵＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し；
ｉｉ． 前記第１の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）またはＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し；かつ
ｉｉｉ． 前記第２の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されているアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基を含有し；または
ｉｖ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つまたは３つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つの任意の組合せを含み；
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、ＥＭＣＨとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基が、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される。
一実施形態は、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第１の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有する、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１でありかつＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）とＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きである、本発明のサポニン誘導体である。
一実施形態は、前記サポニン誘導体の前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基がＥＭＣＨとの反応を介して誘導体化され、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１である場合には、前記グルクロン酸および前記アセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１でありかつＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基が、結合したＨＡＴＵにより誘導体化される場合には、前記アルデヒド基および前記アセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きである、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書において実施例Ｄ１と称された一実施形態は、前記サポニン誘導体がＳＡ１６４１ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体であり、これにおいて、前記アグリコンコア構造が変換によって、例えば式（Ａ１）の化合物との反応によるアミンへの還元的アミノ化によって、誘導体化されているアルデヒド基を含有する：
すなわち、本明細書において実施形態Ｄ１と称された一実施形態は、それが、ＳＡ１６４１と式（Ａ１）の化合物との間の反応の結果ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。したがって、実施形態Ｄ１は、それが、少なくとも１つのＳＡ１６４１分子の、式（Ａ１）の化合物に対する還元的アミノ化によるカップリングの結果ではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書において実施形態Ｄ２と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造がＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でチオ－ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつここで該サポニンには何ら他の誘導体化が存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造がＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でチオ－ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化されることを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ３と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここでＥＭＣＨのマレイミド基が：
・ メルカプトエタノール、
・ 少なくとも２－イミノチオランによって誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマー、
・ シアニン－３と、少なくとも２－イミノチオランによってさらに誘導体化されているエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーとのコンジュゲート、
・ 少なくとも２－イミノチオランによって誘導体化されているＧ４デンドロン、
・ シアニン－５と、少なくとも２－イミノチオランによってさらに誘導体化されているＧ４デンドロンとのコンジュゲート、
・ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および
・ 配列ＳＥＳＤＤＡＭＦＣＤＡＭＤＥＳＤＳＫ［配列番号：１］をもつペプチド、
の１つ、好ましくは全てから選択されるチオールとの、チオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。当業者には理解されるように、「Ｇ４デンドロン」という表現は、式（Ａ２）の化合物を意味するものと解釈されるべきである：
本明細書においてＤ４と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、カルボキシル基が、シアニン－３とエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーとからなる任意でさらに誘導体化されたコンジュゲートとの反応による、アミドへの変換によって誘導体化されており、かつこれにおいて、何ら他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、カルボキシル基が、シアニン－３とエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーとからなる任意でさらに誘導体化されたコンジュゲートとの反応による、アミドへの変換によって誘導体化されている、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ５と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、シアニン－３およびエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーからなるコンジュゲートとの反応による、アミンへの還元的アミノ化などの変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含み、かつこれにおいて、何ら他の誘導体化が該サポニンに存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、アグリコンコア構造が、シアニン－３およびエチレンジアミンコアを有するポリ（アミドアミン）デンドリマーからなるコンジュゲートとの反応による、アミンへの還元的アミノ化などの変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含むことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ６と称された一実施形態は、サポニン誘導体が毒素、マイクロＲＮＡ、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まないこと、好ましくは、サポニン誘導体が薬学的に活性のある物質、例えば毒素、薬物、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含まないことを特徴とし、より好ましくは、サポニン誘導体がエフェクター分子を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ７と称された一実施形態は、サポニン誘導体が：
・ ポリ－またはオリゴ（アミン）、例えばポリエチレンイミンおよびポリ（アミドアミン）、
・ ポリエチレングリコール、
・ ポリ－またはオリゴ（エステル）、例えばポリ（ラクチド）、
・ ポリ（ラクタム）、
・ ポリラクチド－ｃｏ－グリコリド共重合体、
・ 多－またはオリゴ糖、例えばシクロデキストリンおよびポリデキストロース、
・ ポリ－またはオリゴ（アミノ酸）、例えばタンパク質およびペプチド、および
・ 核酸およびそれらの類似体、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ（ロック核酸）、およびＰＮＡ（ペプチド核酸）；
からなる群より選択されるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とし、
好ましくは、サポニン誘導体が、ポリマー、オリゴマー、デンドリマー、デンドロナイズドポリマー、またはデンドロナイズドオリゴマーといった、構造的に規則正しい形態であるポリマーまたはオリゴマー構造を含まないか、またはそれが、ヒドロゲル、ミクロゲル、ナノゲル、安定化された重合体ミセル、またはリポソームといった、集合したポリマー構造であることを特徴とし、より好ましくは、サポニン誘導体がポリマーまたはオリゴマー構造を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ８と称された一実施形態は、サポニン誘導体が、一緒に結合された少なくとも２つの等しいかまたは同様の単位から、主としてまたは完全に構築された分子構造を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ９と称された一実施形態は、サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１とＮ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］－Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファート Ｎ－オキシド（ＨＡＴＵ）との反応生成物である、式（Ａ３）の化合物ではないことを特徴とし：
好ましくは、該サポニン誘導体が活性化されたエステルではないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。図５９参照。
本明細書においてＤ１０と称された一実施形態は、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、カルボキシル基がアミド結合またはエステル結合への変換により誘導体化されており、かつこれにおいて、サポニンには何ら他の誘導体化が存在しないことを特徴とし、好ましくは、サポニン誘導体がサポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、カルボキシル基がアミド結合またはエステル結合への変換により誘導体化されていることを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ１１と称された一実施形態は、サポニン誘導体がジアンチン部分を含まないことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ１２と称された好ましい一実施形態は、サポニン誘導体が単一のサポニン部分を含むことを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ１３と称された、好ましい一実施形態は、前記サポニン誘導体が２５００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは２３００ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは２１５０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有することを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。
本明細書においてＤ１４と称された、１つの好ましい実施形態は、サポニン誘導体が４００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは３００ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは２７０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有することを特徴とする、本発明のサポニン誘導体である。サポニン誘導体の分子量は、アグリコンコアと１つ（モノデスモシド系サポニンについて）または２つ（ビスデスモシド系サポニンについて）のグリコン（糖）鎖を除いたサポニン誘導体の分子量に相当する。当業者は、サポニン誘導体がその対応する非誘導体化サポニン（例えば、脱アセチル化により誘導体化されたＳＯ１８６１に相当する、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨの場合のように）よりも低い分子量をもつ場合、サポニン誘導体化は分子量に何ら増加をもたらすことはなく、それ故、サポニン誘導体化が実施形態Ｄ１４の、４００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは３００ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは２７０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量をもつことという要求に適合することを理解するであろう。
当業者には理解されるように、実施形態Ｄ１－Ｄ１４は、互いの中で、並びに本出願において記載された別の実施形態と組合されてよい。例えば、本発明の実施形態においては、実施形態Ｄ１－Ｄ１４の以下の組合せが提供される：
・ Ｄ１２、およびＤ１－Ｄ１１、Ｄ１３の１つ以上；
・ Ｄ１３、およびＤ１－Ｄ１２の１つ以上；
・ Ｄ１２、Ｄ１３、およびＤ１－Ｄ１１の１つ以上；
・ Ｄ１、Ｄ２、Ｄ１０、およびＤ１２；
・ Ｄ１、Ｄ３、Ｄ７、Ｄ９、および好ましくはＤ１３；または
・ Ｄ３、Ｄ９、Ｄ１２、およびＤ１３．
当業者には、実施形態Ｄ１－Ｄ１４のこれらの組合せが、再度本発明の別の実施形態、例えば、および好ましくは、実施形態Ｄ１４と組合され得ることが理解されよう。
特に好ましい実施形態は、実施形態Ｄ３、Ｄ９、Ｄ１２、および、Ｄ１３とＤ１４の一方または双方の組合せに対応する。言い換えれば、特に好ましい実施形態は、前記サポニン誘導体が単一のサポニン誘導体を含み、これにおいて前記サポニン誘導体が２５００ｇ／ｍｏｌ未満、好ましくは２３００ｇ／ｍｏｌ未満、より好ましくは２１５０ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有し、かつこれにおいて、前記サポニン誘導体が、
・ サポニン、特にＳＯ１８６１ではなく、これにおいて、前記アグリコンコア構造がＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されたアルデヒド基を含有し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノ－ルとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され、かつこれにおいて、好ましくは前記サポニンには何ら他の誘導体化が存在せず；かつ
・ ＳＯ１８６１とＮ－［（ジメチルアミノ）－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ－［４，５－ｂ］ピリジン－１－イルメチレン］Ｎ－メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスファート Ｎ－オキシド（ＨＡＴＵ）との反応生成物である活性化されたエステルではない、
本発明のサポニン誘導体である。
本発明の第２の態様は、本発明の前記サポニン誘導体と、任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤とを含む、第１の医薬組成物に関する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体、好ましくは薬学的に許容される希釈剤を含み、かつさらに：
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはＮａＣｌ；および／または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および／またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、前記第１の医薬組成物である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第１の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物が２５℃の温度において液体であり、かつ２－１１の範囲内、好ましくは４－９の範囲内、より好ましくは６－８の範囲内のｐＨを有する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第１の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物が２５℃の温度において液体であり、かつこれにおいて前記サポニン誘導体の濃度が１０－１２から１ｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは１０－９から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内、より好ましくは１０－６から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内である。
典型的には、かかる第１の医薬組成物は、例えばＡＤＣまたはＡＯＣと組合せた使用に適する。例えば、第１の医薬組成物は、ＡＤＣまたはＡＯＣの投与を必要とする患者に対し、ＡＤＣまたはＡＯＣが投与される前に、ＡＤＣまたはＡＯＣと一緒に、或いはＡＤＣまたはＡＯＣの投与の（直）後に、かかるＡＤＣまたはＡＯＣ療法を必要とする該患者に投与される。例えば、第１の医薬組成物はＡＤＣまたはＡＯＣを含む医薬組成物と混合され、そして得られた混合物の適当な用量が、ＡＤＣまたはＡＯＣ療法を必要とする該患者に投与される。本発明によれば、第１の医薬組成物によって含まれたサポニン誘導体は、サポニン誘導体とＡＤＣまたはＡＯＣとが腫瘍細胞のような標的細胞の内側に共存する場合、かかるＡＤＣまたはＡＯＣによって含まれるエフェクター分子の効能および効力を増強する。サポニン誘導体の影響下では、サポニン誘導体の不在下で同じ細胞がサポニン同じ用量のＡＤＣまたはＡＯＣと接触された場合に比較して、より高い程度までエフェクター分子が標的細胞のサイトゾル中に放出される。それ故、エフェクター分子が第１の医薬組成物のサポニン誘導体と一緒に標的細胞の内側に共存する場合、エフェクター分子を含むＡＤＣまたはＡＯＣが送達される細胞の内側においてサポニン誘導体の不在下で同じ効能を達成するのに必要な用量に比較して、より低いＡＤＣまたはＡＯＣ用量において同様の効能が得られる。
一実施形態は、本発明の第１の医薬組成物であり、これにおいて、前記サポニン誘導体が分子２によって表される前記サポニン誘導体であるか：
または単一誘導体化を含むＳＯ１８６１誘導体であり、ここで前記単一誘導体化は、ＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基の、１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）と、ＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基との反応による変換であり、或いは前記サポニン誘導体が分子３によって表されるサポニン誘導体である：
本発明の第３の態様は、
・ 本発明の前記第１の医薬組成物と；および
・ 抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤を含む、第２の医薬組成物と、
を含む医薬組合せ剤に関する。
本発明の第４の態様は、本発明の前記サポニン誘導体を含み、かつさらに：抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－核酸コンジュゲート、または受容体－リガンド－核酸コンジュゲートの任意の１つ以上を含み、かつ任意で、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤を含む、第３の医薬組成物に関する。
一実施形態は、本発明の前記医薬組合せ剤または前記第３の医薬組成物であって、これにおいて、前記第２の医薬組成物または前記第３の医薬組成物が、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含み、ここで、前記薬物は、例えばサポリンおよびジアンチンといった毒素であり、かつここで、前記オリゴヌクレオチドは、例えばｓｉＲＮＡ、ＢＮＡ，例えばアポリポタンパク質ＢまたはＨＳＰ２７の遺伝子サイレンシングである。
一実施形態は、本発明の前記医薬組合せ剤または前記第３の医薬組成物であって、これにおいて、前記サポニン誘導体は：ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナム・アルバム、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシド Ａ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択されるサポニン誘導体であり、好ましくは、前記サポニン誘導体は、ＳＯ１８６１誘導体、ＧＥ１７４１誘導体、ＳＡ１６４１誘導体、ＱＳ－２１誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体は、ＳＯ１８６１誘導体またはＱＳ－２１誘導体であり、より好ましくは、前記サポニン誘導体はＳＯ１８６１誘導体であり、なおより好ましいのは、分子２または分子３によって表される前記サポニン誘導体である。
一実施形態は、本発明の第３の医薬組成物であって、本発明のサポニン誘導体、好ましくは薬学的に許容される希釈剤を含み、かつさらに：
・ 薬学的に許容される塩、好ましくは薬学的に許容される無機塩、例えばアンモニウム、カルシウム、銅、鉄、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、ストロンチウム、または亜鉛塩、好ましくはＮａＣｌ；および／または
・ 薬学的に許容される緩衝系、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、ヒスチジン、乳酸塩、トロメタミン、グルコン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、および／またはケトグルタール酸塩含有緩衝系、
を含む、該医薬組成物である。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第３の医薬組成物であり、これにおいて、該組成物は２５℃の温度において液体であり、かつ２－１１の範囲内、好ましくは４－９の範囲内、より好ましくは６－８の範囲内のｐＨを有する。
一実施形態は、本発明のサポニン誘導体と、薬学的に許容される希釈剤、好ましくは水とを含む本発明の第３の医薬組成物であって、これにおいて、前記組成物は２５℃の温度において液体であり、かつこれにおいて、前記サポニン誘導体の濃度は１０－１２から１ｍｏｌ／ｌの範囲内、好ましくは１０－９から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内、より好ましくは１０－６から０．１ｍｏｌ／ｌの範囲内である。
本発明の第５の態様は、医薬としての使用のための、本発明の前記第１の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第３の医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、医薬としての使用のための、前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、前記第１の医薬組成物；前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記医薬組合せ剤；または前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記第３の医薬組成物が提供される。
本発明の別の態様においては、医薬としての使用のための、本明細書に記載されたような前記サポニン誘導体、好ましくはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵが提供される。
本発明の第６の態様は、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、本発明の前記第１の医薬組成物、本発明の前記医薬組合せ剤、または本発明の前記第３の医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、前記第１の医薬組成物；前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記医薬組合せ剤；または前記サポニン誘導体がＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる、本発明の前記第３の医薬組成物が提供される。
本発明の第７の態様は、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは前記細胞のサイトゾル中へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって：
ａ） 細胞を提供する工程と；
ｂ） 工程ａ）において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための分子を提供する工程と；
ｃ） 本発明のサポニン誘導体を提供する工程と；
ｄ） 工程ａ）の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程ｂ）の前記分子および工程ｃ）の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、該方法に関する。
一実施形態は、本発明の方法であって、これにおいて前記細胞が、ヒト細胞、例えばＴ－細胞、ＮＫ－細胞、腫瘍細胞であり、および／またはこれにおいて、工程ｂ）の前記分子が：抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つであり、ここで、前記薬物が、例えば毒素であり、かつこれにおいて、前記オリゴヌクレオチドが、例えばｓｉＲＮＡ、ＢＮＡであり、および／または前記サポニン誘導体が：ＳＯ１８６１、ＳＡ１６５７、ＧＥ１７４１、ＳＡ１６４１、ＱＳ－２１、ＱＳ－２１Ａ、ＱＳ－２１ Ａ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ａ－ｘｙｌ、ＱＳ－２１Ｂ、ＱＳ－２１ Ｂ－ａｐｉ、ＱＳ－２１ Ｂ－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ｘｙｌ、ＱＳ－７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ａｐｉ、ＱＳ－１７－ｘｙｌ、ＱＳ１８６１、ＱＳ１８６２、キラヤサポニン、サポニナム・アルバム、ＱＳ－１８、Ｑｕｉｌ－Ａ、Ｇｙｐ１、ギプソシド Ａ、ＡＧ１、ＡＧ２、ＳＯ１５４２、ＳＯ１５８４、ＳＯ１６５８、ＳＯ１６７４、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２、ＳＯ１９０４、の誘導体、それらの立体異性体およびそれらの組合せからなる群より選択され、好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体、ＧＥ１７４１誘導体、ＳＡ１６４１誘導体、ＱＳ－２１誘導体、およびそれらの組合せからなる群より選択され、より好ましくは、前記サポニン誘導体が、ＳＯ１８６１誘導体またはＱＳ－２１誘導体であり、最も好ましくは、サポニン誘導体はＳＯ１８６１誘導体であり；或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体が単一誘導体化を含むＳＯ１８６１誘導体であり、ここで前記単一誘導体化は、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基の、アミンとの反応を介したアミドへの変換であり、例えば、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）を、ＳＯ１８６１のグルクロン酸のカルボキシル基へ結合することによるか、または（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート（ＢＯＰ）を、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基へ結合することによるものであり、或いはこれにおいて前記サポニン誘導体は；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３においてアルデヒド基を含有する；分子２によって表されるＳＯ１８６１誘導体であり：
或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体は；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３においてアルデヒド基を含有するＳＯ１８６１誘導体であって、ここでＥＭＣＨのマレイミド基がメルカプトエタノールによって誘導体化され、それによりチオエーテル結合を生じる該誘導体を表す；分子３によって表されるＳＯ１８６１誘導体であり：
；或いは、前記サポニン誘導体は、単一誘導体化を含むＳＯ１８６１誘導体ではないという前提条件つきであり、ここで、前記単一誘導体化とは、１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）の、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応による、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて、前記サポニン誘導体は；Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されている、キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３においてアルデヒド基を含有する；分子２によって表されるＳＯ１８６１誘導体であり：
；或いはここで、前記サポニン誘導体が、誘導体であって、これにおいて、
ｉ．前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、
－ アルコールへの還元；
－ Ｎ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介した、ヒドラゾン結合への変換であり、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
－ Ｎ－［β－マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド（ＢＭＰＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでＢＭＰＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；または
－ Ｎ－［κ－マレイミドウンデカン酸］ヒドラジド（ＫＭＵＨ）との反応を介したヒドラゾン結合への変換であり、ここでＫＭＵＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化される；
によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し；
ｉｉ． 前記第１の糖鎖が、カルボキシル基、好ましくは、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）またはＮ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介したアミド結合への変換により誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し；かつ
ｉｉｉ． 前記第２の糖鎖が、脱アセチル化によるヒドロキシル基（ＨＯ－）への変換によって誘導体化されている、アセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）を含み；または
ｉｖ． 前記サポニン誘導体が、誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つまたは３つの任意の組合せ、好ましくは誘導体化ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の２つの任意の組合せを含む、該誘導体であり；
好ましくは、前記サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造は、ＥＭＣＨとの反応を介したヒドラゾン結合への変換によって誘導体化されているアルデヒド基を含有し、ここで、ＥＭＣＨのマレイミド基は、任意でメルカプトエタノールとのチオエーテル結合の形成により誘導体化され；或いはここで、該サポニン誘導体がアグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第１の糖鎖がカルボキシル基、好ましくは、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミド（ＡＥＭ）との反応を介したアミド結合への変換によって誘導体化されている、グルクロン酸部分のカルボキシル基を含有し；或いはここで、前記サポニン誘導体は、アグリコンコア構造中のアルデヒド基がＮ－ε－マレイミドカプロン酸ヒドラジド（ＥＭＣＨ）との反応を介したヒドラジド結合への変換によって誘導体化され、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きの、および前記サポニンがＳＯ１８６１でありかつＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基が１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）とＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基との反応によって誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きの、誘導体であり；或いはここで、前記サポニンが、サポニン誘導体のアグリコンコア構造中のアルデヒド基がＥＭＣＨとの反応を介して誘導体化されかつ前記サポニンがＳＯ１８６１である場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１でありかつＳＯ１８６１のグルクロン酸部分のカルボキシル基が、結合したＨＡＴＵにより誘導体化される場合には、アルデヒド基およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた誘導体化されるという条件付きの誘導体である、該方法である。
特定の実施形態においては、分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ、好ましくは、本明細書に記載の前記細胞のサイトゾル中へ、移行させるためのインビトロまたはエクスビボの方法が提供され、これにおいて、前記サポニン誘導体は、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを含み、好ましくはそれらからなる。
本発明は、いくつかの実施形態に関して記載されてきたが、当業者には、明細書を読むにあたり、かつ図面を調べるにあたり、それらの代替え物、変更形態、置換物、および同等物が明らかとなることが意図される。本発明は例示される実施形態にいかなる方法においても制限されない。変更は、添付の特許請求の範囲によって定義される範囲から離れることなく行われ得る。
本発明は、いくつかの例示的な実施形態を参照して記載されてきた。変更形態は可能であり、かつ添付の特許請求の範囲において定義された保護の範囲内に含まれる。本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、それらはいかなる方法においても本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
実施例および例示的な実施形態
材料：
ＳＯ１８６１、ＳＯ１８３２、ＳＯ１８６２（異性体）、およびＳＯ１９０４は、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ）から得られた未加工の植物抽出物から、Ａｎａｌｙｔｉｃｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＧｍｂＨにより単離および精製された。ＱＳ２１（純粋）、ＱＳ１８（分画）、ＱＳ１７（分画）、ＱＳ７（分画）、ＱＳ２１（分画）は、Ｄｅｓｅｒｔ Ｋｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｎｄｉｅｇｏから購入し、トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）は、薬局から購入した。ＥＧＦジアンチンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）より、標準的な手法によって製造された。セツキシマブ－サポニンコンジュゲートは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）より製造および購入された。トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ、エルマン試薬、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（２ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４－１２％ ビス－トリス プロテインゲル（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｌｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＮｕＰＡＧＥ（商標）ＭＥＳ ＳＤＳ ランニングバッファー（Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎｏｖｅｘ（商標）シャーププレステインドプロテインスタンダード（Ｓｈａｒｐ Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ＰａｇｅＢｌｕｅ（商標）タンパク質染色液（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ タンパク質アッセイキット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、セファデックスＧ５０Ｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、９９．６％、ＶＷＲ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－ヒスチジン（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄ－（＋）－トレハロース二水和物（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（ＴＷＥＥＮ２０、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、グアニジン塩酸塩（９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ－Ｎａ２、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、濾過滅菌フィルター０．２μｍおよび０．４５μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）Ｔ４およびＴ１５濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ＰＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、テトラ（エチレングリコール）スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、［Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ－テトラメチルウロニウム－ヘキサフルオロホスファート］（ＨＡＴＵ、９７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩（ＡＥＭ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｌ－システイン（９８．５％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、脱イオン水（ＤＩ）はＵｌｔｒａｐｕｒｅ Ｌａｂ Ｗａｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭｉｌｌｉＱ、Ｍｅｒｃｋ）から新たに採取した、ニッケル－ニトリロ三酢酸アガロース（Ｎｉ－ＮＴＡアガロース、Ｐｒｏｔｉｎｏ）、グリシン（９９．５％、ＶＷＲ）、５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸（エルマン試薬、ＤＴＮＢ、９８％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓ－アセチルメルカプトコハク酸無水物フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ試薬、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 重炭酸ナトリウム（９９．７％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、炭酸ナトリウム（９９．９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、セファデックスＧ－２５樹脂を用いたＰＤ ＭｉｎｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、０．５、２、５、および１０ｍＬのＺｅｂａ Ｓｐｉｎ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心式フィルターＴ４ １０ｋＤａ ＭＷＣＯ、Ｔ４ １００ｋＤａ ＭＷＣＯ、およびＴ１５（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｂｉｏｓｅｐ ｓ３０００ ａＳＥＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、Ｖｉｖａｃｅｌｌ限外濾過ユニット１０および３０ｋＤａ ＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）、Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）。
略号
ＡＥＭ：Ｎ－（２－アミノエチル）マレイミドトリフルオロ酢酸塩
ＡＭＰＤ：２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール
ＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＥＭＣＨ．ＴＦＡ：Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、トリフルオロ酢酸塩
ＨＡＴＵ：１－［ビス－（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート
Ｍｉｎ：分
ＮＭＭ：４－メチルモルホリン
ｒ、ｔ：保持時間
ＴＣＥＰ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
Ｔｅｍｐ：温度
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
分析法
ＬＣ－ＭＳ方法１
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．Ｐｕｍｐ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを備えたＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ，ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０－３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に応じた質量範囲 ｎｅｇまたはｎｅｇ／ｐｏｓ １５００－２４００または２０００－３０００の範囲内；ＥＬＳＤ：ガス圧４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ Ｃ１８，５０ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ 温度：６０℃、流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
生成物の極性に応じた勾配：
Ａｔ０＝２％Ａ、ｔ５．０ｍｉｎ＝５０％Ａ、ｔ６．０ｍｉｎ＝９８％Ａ
Ｂｔ０＝２％Ａ、ｔ５．０ｍｉｎ＝９８％Ａ、ｔ６．０ｍｉｎ＝９８％Ａ
ポストタイム：１．０ｍｉｎ；溶離液Ａ；アセトニトリル；溶離液Ｂ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
ＬＣ－ＭＳ方法２，２
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．Ｐｕｍｐ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを備えたＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ，ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０－３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に応じた質量範囲；ｐｏｓ／ｎｅｇ １００－８００またはｎｅｇ ２０００－３０００；ＥＬＳＤ：ガス圧４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ Ｃ１８、５０ｘ２．１ｍｍ、２．５μｍ 温度：２５℃、流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、勾配：ｔ０ｍｉｎ＝５％Ａ、ｔ２．０ｍｉｎ＝９８％Ａ、ｔ２．７ｍｉｎ＝９８％Ａ、ポストタイム：０．３ｍｉｎ；溶離液Ａ；アセトニトリル；溶離液Ｂ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
ＬＣ－ＭＳ方法３
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．Ｐｕｍｐ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを備えたＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ，ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０－３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に応じた質量範囲 ｐｏｓ／ｎｅｇ １０５－８００、５００－１２００または１５００－２５００；ＥＬＳＤ：ガス圧４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ Ｃ１８、５０ｘ２．１ｍｍ、２．５μｍ 温度：４０℃、流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、勾配：ｔ０ｍｉｎ＝５％Ａ、ｔ２．０ｍｉｎ＝９８％Ａ、ｔ２．７ｍｉｎ＝９８％Ａ、ポストタイム：０．３ｍｉｎ；溶離液Ａ；アセトニトリル中の０．１％ギ酸；溶離液Ｂ；水中の０．１％ギ酸。
ＬＣ－ＭＳ方法４
装置：Ｗａｔｅｒｓ ＩＣｌａｓｓ；Ｂｉｎ．Ｐｕｍｐ：ＵＰＩＢＳＭ、ＳＭ：ＳＯを備えたＵＰＩＳＭＦＴＮ；ＵＰＣＭＡ，ＰＤＡ：ＵＰＰＤＡＴＣ、２１０－３２０ｎｍ、ＳＱＤ：ＡＣＱ－ＳＱＤ２ ＥＳＩ、生成物の分子量に応じた質量範囲；ｐｏｓ／ｎｅｇ １００－８００またはｎｅｇ ２０００－３０００；ＥＬＳＤ：ガス圧４０ｐｓｉ、ドリフトチューブ温度：５０℃；カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８、５０ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ 温度：２５℃、流量：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、勾配：ｔ０ｍｉｎ＝５％Ａ、ｔ２．０ｍｉｎ＝９８％Ａ、ｔ２．７ｍｉｎ＝９８％Ａ、ポストタイム：０．３ｍｉｎ；溶離液Ａ；アセトニトリル；溶離液Ｂ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．５）。
分取法
分取ＭＰ－ＬＣ方法１
装置型：Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ（商標）ｐｒｅｐ ＭＰＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ Ｃ１８（１４５ｘ２５ｍｍ、１０μｍ）；流量：４０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：室温；溶離液Ａ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム（ｐＨ＝９．０）；溶離液Ｂ；９９％アセトニトリル＋水中の１％の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム；勾配：
Ａｔ０ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝１０％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝５０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ
Ｂｔ０ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝２０％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝６０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ；
検出ＵＶ：２１０、２３５、２５４ｎｍおよびＥＬＳＤ。
分取ＭＰ－ＬＣ方法２
装置型：Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ（商標）ｐｒｅｐ ＭＰＬＣ；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＬＵＮＡ Ｃ１８（３）（１５０ｘ２５ｍｍ、１０μｍ）；流量：４０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：室温；溶離液Ａ；水中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸；溶離液Ｂ；アセトニトリル中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸；勾配：
Ａｔ０ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝２０％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝６０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ
Ｂｔ０ｍｉｎ＝２％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝２％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝２％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝３０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ
Ｃｔ０ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝１０％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝５０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ
Ｄｔ０ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ２ｍｉｎ＝５％Ｂ、ｔ１７ｍｉｎ＝４０％Ｂ、ｔ１８ｍｉｎ＝１００％Ｂ、ｔ２３ｍｉｎ＝１００％Ｂ
；検出ＵＶ：２１０、２３５、２５４ｎｍおよびＥＬＳＤ。
分取ＬＣ－ＭＳ方法３
ＭＳ装置型：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ６１３０Ｂ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ；ＨＰＬＣ装置型：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２９０分取ＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ（商標）ＣＳＨ（Ｃ１８、１５０ｘ１９ｍｍ、１０μｍ）；流量：２５ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：室温；溶離液Ａ；１００％アセトニトリル；溶離液Ｂ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム ｐＨ＝９．０；勾配：
Ａｔ０＝２０％Ａ、ｔ２．５ｍｉｎ＝２０％Ａ、ｔ１１ｍｉｎ＝６０％Ａ、ｔ１３ｍｉｎ＝１００％Ａ、ｔ１７ｍｉｎ＝１００％Ａ、
Ｂｔ０＝５％Ａ、ｔ２．５ｍｉｎ＝５％Ａ、ｔ１１ｍｉｎ＝４０％Ａ、ｔ１３ｍｉｎ＝１００％Ａ、ｔ１７ｍｉｎ＝１００％Ａ
；検出：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）；検出：ＭＳＤ（ＥＳＩ ｐｏｓ／ｎｅｇ）質量範囲：１００－８００；ＤＡＤに基づく分画収集。
分取ＬＣ－ＭＳ方法４
ＭＳ装置型：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ６１３０Ｂ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ；ＨＰＬＣ装置型：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２９０分取ＬＣ；カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４、１５０ｘ１９ｍｍ、１０μｍ）；流量：２５ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度：室温；溶離液Ａ；１００％アセトニトリル；溶離液Ｂ；水中の１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム ｐＨ＝９．０；勾配：
Ａｔ０＝２％Ａ、ｔ２．５ｍｉｎ＝２％Ａ、ｔ１１ｍｉｎ＝３０％Ａ、ｔ１３ｍｉｎ＝１００％Ａ、ｔ１７ｍｉｎ＝１００％Ａ
Ｂｔ０＝１０％Ａ、ｔ２．５ｍｉｎ＝１０％Ａ、ｔ１１ｍｉｎ＝５０％Ａ、ｔ１３ｍｉｎ＝１００％Ａ、ｔ１７ｍｉｎ＝１００％Ａ
Ｃｔ０＝５％Ａ、ｔ２．５ｍｉｎ＝５％Ａ、ｔ１１ｍｉｎ＝４０％Ａ、ｔ１３ｍｉｎ＝１００％Ａ、ｔ１７ｍｉｎ＝１００％Ａ
；検出：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）；検出：ＭＳＤ（ＥＳＩ ｐｏｓ／ｎｅｇ）質量範囲：１００－８００；ＤＡＤに基づく分画収集
フラッシュクロマトグラフィー
Ｇｒａｃｅ Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ Ｘ２（登録商標）Ｃ－８１５Ｆｌａｓｈ；溶媒送達システム：オートプライミングを備えた３－ピストンポンプ、単回のランで４つまでの溶媒を用いた４つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン；最大ポンプ流量率２５０ｍＬ／ｍｉｎ；最大圧 ５０ｂａｒ（７２５ｐｓｉ）；検出：ＵＶ２００－４００ｎｍ、４つまでのＵＶシグナルと全ＵＶ範囲のスキャンの組合せ、ＥＬＳＤ；カラムサイズ：装置上で４－３３０ｇ、ルアー型、７５０ｇから３０００ｇまで、オプションのホルダー付き。
実施例１：サポニン誘導体の合成
以下の修飾されたＳＯ１８６１サポニン、すなわちサポニン誘導体は、表Ａ２に要約されるように、天然産ＳＯ１８６１をベースとして合成された：
以下のＳＯ１８６１誘導体の合成の記載については、表Ａ２および図面が参照される。
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（分子２）の合成；図６０、図６１Ａ参照
サポナリア・オフィキナリス由来のＳＯ１８６１（５９ｍｇ、３１．７μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ（３０１ｍｇ、８８８μｍｏｌ）を、スターラーを備えた丸型フラスコに入れ、１３ｍＬのメタノール中に溶解した。ＴＦＡ（４００μＬ、ｃａｔ．）を溶液に添加し、反応混合物をＲＣＴ Ｂマグネチックスタラー（ＩＫＡ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）上で、室温にて８００ｒｐｍで３時間攪拌した。３時間の攪拌後、混合物をＭｉｌｌｉＱ水またはＰＢＳのいずれかで希釈し、ＭＷＣＯ １ｋＤａの再生セルロース膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ７）を用いて、ＭｉｌｌｉＱ水またはＰＢＳのいずれかに対し、２４時間にわたり充分に透析した。透析後、溶液を凍結乾燥して白色粉末を得た。収率６２．４ｍｇ（９５％）。乾燥したアリコートをさらに、１Ｈ ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによるキャラクタリゼーションに使用した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－Ｄ４）（ＳＯ１８６１）：δ＝０．５０－５．５０（ｍ，サポニン トリテルペノイドおよび糖バックボーンプロトン），９．４３（１Ｈ，ｓ，サポニンのアルデヒドプロトン，Ｈａ）。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール－Ｄ４）（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ，ＰＢＳワークアップ）：δ＝０．５０－５．５０（ｍ，サポニン トリテルペノイドおよび糖バックボーンプロトン），６．７９（２ Ｈ，ｓ，マレイミド プロトン，Ｈｃ），７．６２－７．６８（１Ｈ，ｍ，ヒドラゾン プロトン，Ｈｂ）。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＲＰモード）：ｍ／ｚ ２１２４ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，サポニン－ＥＭＣＨ），ｍ／ｚ ２１０９ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，ＳＯ１８６１－ＡＬＤ－ＥＭＣＨ），ｍ／ｚ ２０９４ Ｄａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＳＯ１８６１－ＡＬＤ－ＥＭＣＨ）。図６１Ａ参照。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＲＮ ｍｏｄｅ）：ｍ／ｚ ２２７５ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２２４４ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２２２２ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２１７８ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２１４４ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２１２２ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２０９２ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，サポニンＥＭＣＨコンジュゲート），２０７０ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，ＳＯ１８６１－ＡＬＤ－ＥＭＣＨ），２０３８ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，ＳＯ１８３２－ＥＭＣＨ），１９３６ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，ＳＯ１７３０－ＥＭＣＨ），１８６１ Ｄａ（［Ｍ－Ｈ］－，ＳＯ１８６１）。ＳＯ１８６１－ＡＬＤ－ＥＭＣＨは分子２（化学式：Ｃ９３Ｈ１４３Ｎ３Ｏ４８，精密質量：２０６９．８８）によって表される：
ヒドラゾン結合のｐＨ依存性加水分解を検査するため、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨをＨＣｌ溶液中にｐＨ３において溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルを２つの異なる時点において記録した（図６２）。図６２Ａおよび６２Ｂに示したように、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの相当するｍ／ｚ２０７０のピークの明らかな減少傾向が、図６１Ｂにおいて見られる。ＳＯ１８６１は加水分解中に生成されることから、ｍ／ｚ２０７０Ｄａの減少傾向を伴ったｍ／ｚ１８６１Ｄａにおけるピークの上昇が記録された。これらの結果は、ヒドラゾン結合が加水分解に対し感受性であり、それがＳＯ１８６１に結合されている場合でも切断されることを示している。
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール（分子３；ブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）の合成；図６０、図６１Ｂ参照
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨのマレイミド基は、６．５－７．５のｐＨ範囲において実施された場合、チオールと、迅速かつ特異的なマイケル付加を行う。
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（０．１ｍｇ、４８ｎｍｏｌ）に対し、２００μＬのメルカプトエタノール（１８ｍｇ、２３０μｍｏｌ）を添加し、溶液をＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上で、室温にて８００ｒｐｍで１時間振とうした。１時間の振とう後、溶液をメタノールで希釈し、ＭＷＣＯ １ｋＤａの再生セルロース膜チューブ（Ｓｐａｃｔｒａ／Ｐｏｒ７）を用いて、メタノールに対し、４時間にわたり充分に透析した。透析後、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノールが与えられ（分子３）、アリコートを採取して、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによって分析した。
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ（ＲＰモード）：ｍ／ｚ ２１９３ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール），ｍ／ｚ ２１８５ Ｄａ（［Ｍ＋Ｋ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール），ｍ／ｚ ２１７０ Ｄａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋，ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール）。図６１Ｂ参照。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノールは分子３（化学式：Ｃ９５Ｈ１４９Ｎ３Ｏ４９Ｓ、精密質量：２１４７．９０）によって表される：
ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（分子３Ａ）の合成；図１参照
ＳＯ１８６１（２８．８ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）、ＡＭＰＤ（８．１１ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１７．６ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．００ｍＬ）およびＮＭＭ（８．４８μＬ、０．０７７ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に、生成物を分取ＬＣ－ＭＳ３を用いることにより再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２０．２ｍｇ、６７％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９３％（化学式：Ｃ８７Ｈ１３９ＮＯ４７、精密質量：１９４９，８５）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９４９［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．４５１Ｂ
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ（分子６）の合成；図２参照
ＳＯ１８６１（２０．０ｍｇ、１０．７μｍｏｌ）を、メタノール（１．００ｍＬ）中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム（４．０６ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ；ＮａＢＨ４）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。３０分後、反応混合物を水（０．５０ｍＬ）で希釈し、分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１５．９ｍｇ、７９％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９７％（化学式：Ｃ８３Ｈ１３２Ｏ４６、精密質量：１８６４，８０）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１８６５［Ｍ－１］１－（図１５および１６参照）
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．９５１Ｂ
ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（分子８）の合成；図３参照
ＳＯ１８６１（９．３０ｍｇ、４．９９μｍｏｌ）に対し、水（０．２５ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（２．００ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液およびメタノール（０．２５ｍＬ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（８．８６ｍｇ、９７％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９７％（化学式：Ｃ８１Ｈ１２８Ｏ４５、精密質量：１８２０，７７）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１８２０［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．８３１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子９）の合成；図４参照
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ（９．３７ｍｇ、５．０２μｍｏｌ、ＡＭＰＤ（２．６４ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（６．６６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（５．５２μＬ、０．０５０ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（６．３２ｍｇ、６４％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９５％（化学式：Ｃ８７Ｈ１４１ＮＯ４７、精密質量：１９５１，８７）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９５２［Ｍ－１］１－（図１７参照）
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．４５１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（分子１０）の合成；図５参照
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ（２６．８ｍｇ、０．０１４ｍｍ）に対し、水（０．５０ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（５．７４ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）の溶液およびメタノール（０．５０ｍＬ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２４．２ｍｇ、９２％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９８％（化学式：Ｃ８１Ｈ１３０Ｏ４５、精密質量：１８２２，７９）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１８２２［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．８１１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子１１）の合成；図６参照
ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（１４．３ｍｇ、７．８４μｍｏｌ）、ＡＭＰＤ（４．１２ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（１０．４ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（８．６２μＬ、０．０７８ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、最初の分取ＭＰ－ＬＣ２を、次いで分取ＭＰ－ＬＣ３を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（９．４７ｍｇ、６３％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９８％（化学式：Ｃ８５Ｈ１３７ＮＯ４６、精密質量：１９０７，８４）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９０８［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．３１１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子１２）の合成；図７参照
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（８．５７ｍｇ、４．７０μｍｏｌ）、ＡＭＰＤ（４２．５８ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（６．５７ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（５．１７μＬ、０．０４７ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、再び分取ＭＰ－ＬＣ２を用いて精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（７．２１ｍｇ、８０％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９７．８％（化学式：Ｃ８５Ｈ１３９ＮＯ４６、精密質量：１９０９，８６）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９１０［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．２１１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子１４）の合成；図８参照
ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（１０．６ｍｇ、５．４３μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ．ＴＦＡ（９．２２ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を、メタノール（超脱水、０．５０ｍＬ）中に溶解した。次に、ＴＦＡ（１．６６μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ１に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取ＭＰ－ＬＣ３を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２．６１ｍｇ、２２％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９５％（化学式：Ｃ９７Ｈ１５２Ｎ４Ｏ４９、精密質量：２１５６，９５）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１５６［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．６４１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（分子１５）の合成；図９参照
ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（９．０５ｍｇ、４．９７μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ．ＴＦＡ（８．４３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を、メタノール（超脱水、０．５０ｍＬ）中に溶解した。次に、ＴＦＡ（１．５２μＬ、０．０２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ１に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（６．５８ｍｇ、６５％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９７％（化学式：Ｃ９１Ｈ１４１Ｎ３Ｏ４７、精密質量：２０２７，８７）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０２８［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．９６１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（分子１６）の合成；図１０参照
ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（６．００ｍｇ、３．１４μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ．ＴＦＡ（５．３３ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を、メタノール（超脱水、０．５０ｍＬ）中に溶解した。次に、ＴＦＡ（０．９６μＬ、０．０１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ１に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取ＭＰ－ＬＣ３を用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールした。得られた溶液を、ギ酸を用いて中和し、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１．０４ｍｇ、１６％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９４％（化学式：Ｃ９５Ｈ１５０Ｎ４Ｏ４８、精密質量：２１１４，９４）
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１１５［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．５５１Ｂ
ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（分子１８）の合成；図１１参照
ＳＯ１８６１（１０．４ｍｇ、５．５８μｍｏｌ）、ＡＥＭ（７．１０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（６．３６ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．００ｍＬ）およびＮＭＭ（６．１３μＬ、０．０５６ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。
反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（７．８２ｍｇ、７１％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９５％（化学式：Ｃ８９Ｈ１３６Ｎ２Ｏ４７、精密質量：１９８４，８３）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９８５［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．６２１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｃ－ＯＨ）（分子１９）の合成；図１２参照
ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（９．０２ｍｇ、４．９５μｍｏｌ）、ＡＥＭ（７．１０ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（５．６５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（５．４４μＬ、０．０５０ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（７．１６ｍｇ、７４％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９６％（化学式：Ｃ８７Ｈ１３４Ｎ２Ｏ４６、精密質量：１９４２，８２）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９４４［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．４７１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）（分子２０）の合成；図１３参照
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ（９．３８ｍｇ、５．０３μｍｏｌ）、ＡＥＭ（６．３９ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（５．７３ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（５．５３μＬ、０．０５０ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（８．６３ｍｇ、８６％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９５％（化学式：Ｃ８９Ｈ１３８Ｎ２Ｏ４７、精密質量：１９８６，８５）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９８７［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．６２１Ｂ
ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（分子２１）の合成；図１４参照
ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（８．９２ｍｇ、４．８９μｍｏｌ）、ＡＥＭ（６．５４ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（５．６５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（５．３８μＬ、０．０４９ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２に供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（８．９２ｍｇ、９４％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝９７％（化学式：Ｃ８７Ｈ１３６Ｎ２Ｏ４６、精密質量：１９４４，８４）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９４４［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．４６１Ｂ
ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（分子２３）の合成；図３６参照
化学式：Ｃ９４Ｈ１５１Ｎ５Ｏ５０、精密質量：２１４９，９４
ＳＯ１８６１－Ｌ－ＮＨＳ（分子２５）の合成；図３７参照
ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（７．７１ｍｇ、３．５８μｍｏｌ）およびＤＢＣＯ－ＮＨＳ（２．８８ｍｇ、７．１７μｍｏｌ）を、脱水ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。３０分後、反応混合物をジエチルエーテル（４０ｍＬ）に対し滴下添加した。遠心分離（７８００ＲＰＭ、５ｍｉｎ）の後、上清をデカンテートし、ペレットをジエチルエーテル（２０ｍＬ）中に再懸濁して、再度遠心分離した。上清をデカンテートした後、残渣を水／アセトニトリル（３：１、ｖ／ｖ、３ｍＬ）中に溶解し、得られた溶液を直ちに凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（８．８１ｍｇ、９６％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度＝８４％。１４％の加水分解されたＮＨＳを含有（化学式：Ｃ１１７Ｈ１６９Ｎ７Ｏ５５、精密質量：２５５２，０６）。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２５５１［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．７６／２．７８２（異性体による二重ピーク）
ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵ（分子２６）の合成；図５９参照
ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵを生成するためには、ＳＯ１８６１のカルボキシル基が、ペプチドカップリング化学において活性エステルを生じるべく使用される試薬、すなわち、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、によって活性化される。得られたＳＯ１８６１の活性エステルは、図５９に示される。
以下の修飾されたＱＳ－２１サポニン、すなわちサポニン誘導体は、天然産ＱＳ－２１をベースとして合成された：
ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＯＨ（分子２７）の合成；図３８参照
ＱＳ２１（９．４１ｍｇ、４．７３μｍｏｌ）を、メタノール（０．５０ｍＬ）中に溶解した。次に、水素化ホウ素ナトリウム（１．７９ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。３０分後、反応混合物を水（０．５０ｍＬ）で希釈し、分取ＭＰ－ＬＣ．２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（４．６８ｍｇ、５０％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９９％（精密質量：１９９０，４異性体：Ａｐｉ／Ｘｙｌ（２：１））。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：１９９０ ［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：１．２５／２．３１１Ｂ（二重ピーク，１７／８３ ＵＶ－面積％，混合物であるＱＳ２１に起因）
ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（分子２８）の合成；図３９参照
ＱＳ－２１（２．４２ｍｇ、１．２２μｍｏｌ；図４１）、ＡＥＭ（１．６８ｍｇ、６．６１μｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１．４８ｍｇ、３．８９μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（１．３４μＬ、０．０１２ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１．８０ｍｇ、７０％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９２％（精密質量：２１１０，４異性体：Ａｐｉ／Ｘｙｌ（２：１））。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１１０［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．８４／２．９３１Ｂ（二重ピーク，１０／９０ ＵＶ－面積％ 混合物であるＱＳ２１に起因）
ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）（分子２９）の合成；図４０Ａ参照
ＱＳ－２１－Ａｌｄ－ＯＨ（１．９２ｍｇ、０．９６４μｍｏｌ）、ＡＥＭ（１．２９ｍｇ、５．０８μｍｏｌ）、およびＨＡＴＵ（１．１０ｍｇ、２．８９μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（１．０６μＬ、９．６４μｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温で静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（１．４６ｍｇ、７２％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９２％（精密質量：２１１２，４異性体：Ａｐｉ／Ｘｙｌ（２：１））。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１１２［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．８３／２．９２１Ｂ（二重ピーク，７／９３ ＵＶ－面積％ 混合物であるＱＳ２１に起因）
ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（図４０Ｂ、分子３０）の合成
ＱＳ２１（４．８２ｍｇ、２．４２μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ．ＴＦＡ（４．１１ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を、メタノール（超脱水、０．２５ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥した。次に生成物を、分取ＭＰ－ＬＣ２Ａを用いて再精製した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２．７８ｍｇ、５２％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２１９６［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．４４１Ｂ（混合物であるＱＳ２１に起因する多重ピーク）
ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（図４０Ｃ；分子３１）の合成
ＱＳ２１（４．８９ｍｇ、２．４６μｍｏｌ）、ＡＭＰＤ（１．２９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（３．２６ｍｇ、７．３７μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（２．７０μＬ、０．０２５ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（３．７６ｍｇ、７４％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９４％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７６［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．７８１Ｂ（混合物であるＱＳ２１に起因する多重ピーク）
ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（図４０Ｄ；分子３２）の合成
ＱＳ２１－Ｇｌｕ（２．４７ｍｇ、１．１９μｍｏｌ）およびＥＭＣＨ．ＴＦＡ（２．０２ｍｇ、５．９５μｍｏｌ）を、メタノール（超脱水、１００μＬ）中に溶解した。次に、ＴＦＡ（０．３６μＬ、４．７６μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。２時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２．２５ｍｇ、８３％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９５％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２２８３［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．８８１Ｂ（混合物であるＱＳ２１に起因する多重ピーク）
ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（図４０Ｅ；分子３３）の合成
ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）（４．９０ｍｇ、２．４６μｍｏｌ）、ＡＭＰＤ（１．２９ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、およびＢＯＰ（３．２６ｍｇ、７．３７μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．５０ｍＬ）およびＮＭＭ（２．７０μＬ、０．０２５ｍｍｏｌ）の混合物中に溶解した。反応混合物を１分間振とうし、室温に静置した。１時間後、反応混合物を分取ＭＰ－ＬＣ２Ａに供した。生成物に対応する分画を直ちに一緒にプールし、凍結し、一晩凍結乾燥して、標題化合物（２．１６ｍｇ、４２％）を白色のふわふわした固体として得た。ＬＣ－ＭＳに基づく純度９６％。
ＬＲＭＳ（ｍ／ｚ）：２０７７［Ｍ－１］１－
ＬＣ－ＭＳ ｒ．ｔ．（ｍｉｎ）：２．７７１Ｂ（混合物であるＱＳ２１に起因する多重ピーク）
実施例２：サポニン誘導体の活性－予備実験
本明細書に記載されたサポニン修飾は、エンドソーム脱出を促進するサポニンの能力を実質的に妨害しないことが判明した（エンドソームの内側でコンジュゲートから解放された修飾サポニンまたはサポニン）。実験の結果は、以下の表Ｅｘ２に要約される。
化学修飾されたサポニンＳＯ１８６１は、細胞ベースのバイオアッセイにおいて、読取り値としての相対細胞生存率によって反応性を示した。ＨｅＬａ細胞を、以下の構成で７２時間インキュベートし、７２時間のインキュベーションの前後における細胞生存率を評価した。実験では、細胞を１．５ｐＭのジアンチン－ＥＧＦコンジュゲートに暴露した。ネガティブコントロールは、ジアンチン－ＥＧＦなしで、バッファビヒクルおよび１０マイクログラム／ｍｌサポニンとインキュベートした細胞であった。細胞生存率は、サポニンおよびＥＧＦ－ジアンチンの双方が除外されたコントロールについて１００％に設定した。ポジティブコントロールは、１０マイクログラム／ｍｌの非修飾サポニンＳＯ１８６１＋ジアンチン－ＥＧＦであった。７２時間後の細胞生存率は、基本的に０％であった。化学修飾されたサポニン変異体については、１０マイクログラム／ｍｌサポニンを１．５ｐＭのジアンチン－ＥＧＦと組合せて検査した。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、１０マイクログラム／ｍｌにおいて細胞生存率を低減した。
これらのデータは、サポニンが、遊離のアルデヒド基において、または遊離のカルボニル基において、エンドソーム脱出促進活性を失うことなく修飾され得ることを証明する。
実施例３：サポニン誘導体の活性－詳細な研究
種々のサポニン（例えば、ＳＯ１８６１、ＱＳ－２１）を、細胞に対し、「遊離の」非コンジュゲート分子として、標的発現細胞の増強された殺細胞活性を生じる結果となる、リガンド毒物融合物（例えば、ＥＧＦ－ジアンチン）または抗体－タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて同時投与した。
本発明者らは、ＳＯ１８６１（サポナリア・オフィキナリスの根の抽出物から単離および精製された）およびＱＳ２１（キラヤ・サポナリアから単離および精製された；Ｄｅｓｅｒｔ Ｋｉｎｇ）を、分子内の種々の位置において化学修飾し（単一、二重、または三重修飾）、それにより表Ａ２およびＡ３に概説したような一連のサポニン誘導体を提供した。サポニン誘導体を、１）ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａおよびＡ４３１）でのリガンド毒素（修飾ＳＯ１８６１／ＱＳ２１タイトレーション＋５ｐＭ ＥＧＦジアンチン）のエンドソーム脱出促進活性について；２）ＨｅＬａおよびＡ４３１に対する内在的細胞毒性（修飾ＳＯ１８６１／ＱＳ２１タイトレーション）について；および３）ヒト赤血球溶血活性（ヒト赤血球に対する修飾ＳＯ１８６１／ＱＳ２１タイトレーション）について検査した。
エンドソーム脱出促進活性を測定するため、修飾ＳＯ１８６１を、ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａおよびＡ４３１）において、非有効的な定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下でタイトレーションした（図１８Ａ－Ｂ、および１９Ａ－Ｂ参照）。さらに、エンドソーム脱出促進活性はまた、非有効的な定濃度の５ｐｍ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下でタイトレーションされたサポニン誘導体についても測定された（ＳＯ１８６１とＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨおよびブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨとの比較には、図２３Ａ－Ｂを、ＳＯ１８６１とＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、およびＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）との比較には、図２４Ａ－Ｂを参照）。これは、単一修飾をもつ修飾サポニンが、ＳＯ１８６１に比較して、以下の濃度：ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝６００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝６００ｎＭ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝６００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝６００ｎＭ、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝１０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝８００ｎＭ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝１５００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝２０００ｎＭ、およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝２０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝２０００ｎＭ、で活性を示したこと、並びに二重修飾体が、以下のＩＣ５０値：ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝３０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝３０００ｎＭ、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝４０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝４０００ｎＭ、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）（Ａｃ－ＯＨ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝４０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝５０００ｎＭ、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｃ－ＯＨ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝８０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝４０００ｎＭ、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝８０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭ、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝４０，０００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ、で活性を示したことを表している。検査した三重修飾体は、この濃度では何ら活性を示さなかった。非修飾ＳＯ１８６１コントロールでは、以下のＩＣ５０値：ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝１００ｎＭ、およびＡ４３１で：ＩＣ５０＝２００ｎＭ、が観察された。修飾ＱＳ２１のエンドソーム脱出促進は、サポニン誘導体を、ＥＧＦＲ発現細胞において、非有効的な定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下でタイトレーションすることにより測定した（図３０Ａ、および３０Ｂ）。これは、以下の修飾ＱＳ２１が、非修飾ＱＳ２１に比較して、以下の濃度：ＱＳ２１では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝２００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝２００ｎＭ、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＯＨでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝６００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝６００ｎＭ、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭでは、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝６００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝７００ｎＭ、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）では、ＨｅＬａで：ＩＣ５０＝１５００ｎＭおよびＡ４３１：ＩＣ５０＝３０００ｎＭ、において活性を示したことを表す。結論として、修飾されていない、ＳＯ１８６１およびＱＳ２１の双方は、ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞において、ＩＣ５０＝２００ｎＭで有効であった。単一ＳＯ１８６１／ＱＳ２１修飾体（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＯＨ、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ）は、ＨｅＬａまたはＡ４３１において、ＩＣ５０＝６００ｎＭ－２０００ｎＭで活性を示した（表Ａ５およびＡ６）のに対し、二重ＳＯ１８６１／ＱＳ２１修飾体は、ＨｅＬａまたはＡ４３１細胞において、ＩＣ５０＝１５００ｎＭ－４０，００ｎＭで活性を示した（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１の三重修飾体については、２０，０００ｎＭまで何ら活性は観察できなかった。
上述の通り、エンドソーム脱出促進活性を測定するために、ＳＯ１８６１誘導体、ＱＳ２１誘導体、およびそれらの非誘導体化対応物を、ＥＧＦＲ発現細胞（ＨｅＬａおよびＡ４３１）において、非有効的な定濃度の５ｐＭ ＥＧＦ－ジアンチンの存在下でタイトレーションした。これは、非誘導体化ＳＯ１８６１および非誘導体化ＱＳ２１、およびＱＳ２１誘導体であるＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤが、ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞において、ＩＣ５０＝２００ｎＭで有効であったことを表す。単一ＳＯ１８６１／ＱＳ２１修飾体（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ブロック）（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（メルカプトエタノール）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ）は、ＨｅＬａまたはＡ４３１において、ＩＣ５０＝６００ｎＭ－２０００ｎＭで活性を示した（表Ａ５およびＡ６）のに対し、二重ＳＯ１８６１修飾体および二重ＱＳ２１修飾体は、ＨｅＬａまたはＡ４３１において、ＩＣ５０＝１５００ｎＭ－４０，０００ｎＭで活性を示した（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１の三重修飾体については、２０，０００ｎＭまで何ら活性は観察できなかった。
毒性測定には、修飾ＳＯ１８６１を、ＨｅＬａ細胞（図２０Ａおよび２１Ａ参照）およびＡ４３１細胞（図２０Ｂおよび２１Ｂ参照）においてタイトレーションした。図２５Ａおよび２５Ｂは、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨについての毒性試験の詳細を描き、図２６Ａおよび２６Ｂは、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、およびＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）についての詳細を示す。これは、非修飾ＳＯ１８６１が、ＨｅＬａ細胞に対し、最も強い内在的毒性：ＩＣ５０＝２０００ｎＭを示すのに対し、単一修飾体ＳＯ１８６１－Ａｃが、ＨｅＬａ細胞に対し、ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭで毒性を示すことを表す。他の全てのＳＯ１８６１誘導体では、ＨｅＬａ細胞に対する内在的毒性（ＩＣ５０）は、２０，０００ｎＭより高かった。Ａ４３１細胞では、非修飾ＳＯ１８６１の毒性は、ＩＣ５０：１０００ｎＭで観察されたのに対し、単一修飾体ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、（受容可能な）ＩＣ５０＝２０００ｎＭ、ＩＣ５０＝７０００ｎＭ、ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ、およびＩＣ５０＝３０，０００ｎＭで毒性を示す。修飾ＱＳ２１の毒性測定には、サポニン誘導体を、ＨｅＬａ細胞（図３１Ａ）およびＡ４３１細胞（図３１Ｂ参照）においてタイトレーションした。これは、ＱＳ２１が、ＨｅＬａ細胞で：ＩＣ５０＝６０００ｎＭおよびＡ４３１細胞：ＩＣ５０＝３０００ｎＭ、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＯＨが、ＨｅＬａ細胞で：ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭおよびＡ４３１細胞：ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭが、ＨｅＬａ細胞で：ＩＣ５０＝＞１００，０００ｎＭおよびＡ４３１細胞：ＩＣ５０＝＞１００，０００ｎＭ、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）が、ＨｅＬａ細胞で：ＩＣ５０＝＞１００，０００ｎＭおよびＡ４３１細胞：ＩＣ５０＝＞１００，０００ｎＭ、の毒性を示すことを表す。ＳＯ１８６１またはＱＳ２１の二重修飾体、およびＳＯ１８６１三重修飾体では、１００，０００ｎＭまで何ら毒性は観察できなかった。上述の通り、修飾されないかまたは修飾された、ＳＯ１８６１またはＱＳ２１を、ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞についてタイトレーションした。これは、非修飾ＳＯ１８６１がＩＣ５０＝１０００ｎＭ（ＨｅＬａ）およびＩＣ５０＝２０００ｎＭ（Ａ４３１）で毒性を示したのに対し、ＱＳ２１がＩＣ５０＝６０００ｎＭ（ＨｅＬａ）（ＩＣ５０＝３０００ｎＭ（Ａ４３１）で毒性を示し、かつＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤが、ＩＣ５０＝９０００ｎＭ（ＨｅＬａ）およびＩＣ５０＝５０００ｎＭ（Ａ４３１）で毒性を示したことを表す（表Ａ５およびＡ６）。ＨｅＬａ細胞での単一ＳＯ１８６１修飾体および単一ＱＳ２１修飾体については、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ブロック）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭは、１００，０００ｎＭまで何ら毒性を示さなかったのに対し、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）は、それぞれＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ、ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭ、ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭで毒性を示した（表Ａ５およびＡ６）。Ａ４３１細胞においては、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭおよびＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭは、１００，０００ｎＭまで何ら毒性を示さなかったのに対し、毒性は、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ブロック）（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝７０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（ＩＣ５０＝２０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）について観察できた（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１二重修飾体またはＱＳ２１二重修飾体、およびＳＯ１８６１三重修飾体については、１００，０００ｎＭまで何ら毒性は観察できなかった（表Ａ５およびＡ６）。
加えて、非修飾および修飾ＳＯ１８６１の溶血活性を、ヒト赤血球溶血アッセイによって測定した（図２２、図２７、図２８、および図３２参照）。これは、非修飾ＳＯ１８６１がＩＣ５０＝８０００ｎＭで、および非修飾ＱＳ２１がＩＣ５０＝３０００ｎＭで、活性を示したことを表す。単一修飾体ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、１，０００，０００ｎＭまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、ヒト赤血球の溶血活性は、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ブロック）（ＩＣ５０＝３００，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＯＨ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭ）について観察できた（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１およびＱＳ２１二重修飾体については、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）、およびＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）では何ら溶血活性が（１，０００，０００ｎＭまで）観察されなかったのに対し、溶血活性は、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（ＩＣ５０＝１００，０００）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝２００，０００）、ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（ＩＣ５０＝１４０，０００）、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｃ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝１００，０００）では観察された。何らのＳＯ１８６１三重修飾体についても、１００，０００ｎＭまで溶血は観察できなかった。溶血アッセイは、非修飾ＳＯ１８６１についてはＩＣ５０＝８０００ｎＭで、および非修飾ＱＳ２１についてはＩＣ５０＝３０００ｎＭで、また修飾ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤについてはＩＣ５０＝３０００ｎＭで、溶血活性を示した。単一修飾体ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、１，０００，０００ｎＭまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、ヒト赤血球の溶血活性は、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ブロック）（ＩＣ５０＝３００，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝３０，０００ｎＭ）、ＱＳ２１（Ａｌｄ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭ）、およびＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ（ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭ）で観察できた（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１二重修飾体またはＱＳ２１二重修飾体については、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、およびＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）については何らの溶血活性も（１，０００，０００ｎＭまで）観察されなかったのに対し、溶血活性は、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（ＩＣ５０＝１００，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）（ＩＣ５０＝２００，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（ＩＣ５０＝１４０，０００ｎＭ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）（ＩＣ５０＝１００，０００ｎＭ）、およびＱＳ２１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）（ＩＣ５０＝４０，０００ｎＭ）について観察された（表Ａ５およびＡ６）。ＳＯ１８６１三重修飾体では１００，０００ｎＭまで何ら溶血活性は観察できなかった（表Ａ５およびＡ６）。
様々なＱＳサポニン分画の、エンドソーム脱出促進活性（ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞でのサポニン＋５ｐＭ セツキシマブ－サポリンのタイトレーション、図３３Ａ－Ｂ参照）、毒性（ＨｅＬａおよびＡ４３１細胞でのサポニンのタイトレーション、図３４Ａ－Ｂ参照）および溶血活性（ヒト赤血球でのサポニンのタイトレーション、図３２および３５参照）を検査した。これは、ＱＳ２１（分画）、ＱＳ１７（分画）、ＱＳ１８（分画）が、ＨｅＬａ細胞およびＡ４３１細胞において、２００ｎＭで活性を示したのに対し、ＱＳ７（分画）は、ＩＣ５０＝６０００ｎＭ（ＨｅＬａ）および１０，０００ｎＭ（Ａ４３１）で活性を示したことを表した。毒性の測定を通じて、ＱＳ２１（分画）、ＱＳ１７（分画）、ＱＳ１８（分画）が、ＨｅＬａ細胞およびＡ４３１細胞において、ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭで毒性を示したことが観察されたとき、一方でＱＳ７（分画）は、ＩＣ５０＝２０，０００ｎＭで毒性を示した（図３４）。次に、溶血アッセイを行い、これは、ＩＣ５０＝３０００ｎＭでのＱＳ２１（分画）、ＩＣ５０＝５０００ｎＭでのＱＳ１７（分画）、ＱＳ１８（分画）の溶血活性を示したのに対し、ＱＳ７（分画）では、２０，０００ｎＭまで何ら溶血活性は検出できなかったことを示した（図３５）。
種々のＳＯサポニン（ＳＯ１８６２（異性体）、ＳＯ１８３２，ＳＯ１９０４）、並びに抗体－ＳＯ１８６１コンジュゲート（セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４））の溶血活性を検査した。これは、ＳＯ１８６２（異性体、ＳＯ１８３２，ＳＯ１９０４の溶血活性が、ＳＯ１８６１（ＩＣ５０＝１０，０００ｎＭ）に匹敵していたことを示した（図２９）。セツキシマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、６０，０００ｎＭまで何ら溶血活性を示さなかったのに対し、トラスツズマブ－ＳＯ１８６１（ＤＡＲ４）は、最初の溶血活性を６０，０００ｎＭ以降に示した（ＩＣ５０＝２００，０００ｎＭ）（図２９）。
ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノール（ブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）の、細胞毒性、溶血活性、およびエンドソーム脱出促進活性を比較した場合、後者２つは同様にまたは基本的に等しく細胞毒性であり、溶血活性があり、かつエンドソーム脱出促進活性バイオアッセイにおいて活性があり、かつ後者２つはＳＯ１８６１よりも細胞毒性が低くかつ溶血活性が低かった。また表Ａ５およびＡ６も参照。
細胞生存率アッセイ
細胞生存率は、ＭＴＳアッセイにより、製造業者の指示に従って実施した（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）。ＭＴＳ溶液を、１０％ＦＢＳ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補足した、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中で２０ｘに希釈した。細胞を、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳで１回洗浄し、その後、ウェル当たり１００μＬの希釈ＭＴＳ溶液を添加した。プレートを、３７℃で約２０－３０分間インキュベートした。続いて、４９２ｎｍにおける光学密度を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。定量化には、「培地のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、他の全てのウェルから引き算し、その後に、無処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルを、処理ウェルの補正されたバックグラウンドシグナルで割ることにより、無処理／処理細胞の比率を算出した。
ＦＡＣＳ分析
細胞を、１０％ ウシ胎児血清（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）を補足したＤＭＥＭ（ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中で、１０ｃｍディッシュにおいて５００，０００ｃ／プレートで播種し、集密度９０％が達成されるまで４８時間インキュベートした（５％ＣＯ２、３７℃）。次に、細胞をトリプシン処理（ＴｒｙｐＩＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｇｉｂｃｏ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）して単一細胞とした。０．７５ｘ１０６細胞を１５ｍＬのファルコンチューブに移して遠心分離した（１，４００ｒｐｍ、３ｍｉｎ）。上清を捨てる一方、細胞ペレットは水中に沈んだままにした。ペレットをボルテックスシェイカー上でファルコンチューブを穏やかにタップすることにより溶解し、細胞を４ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋フリー、２％ＦＢＳ）で洗浄した。洗浄後、細胞を３ｍＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋フリー、２％ＦＢＳ）中に再懸濁し、３つの丸底ＦＡＣＳチューブに等しく分割した（１ｍＬ／チューブ）。細胞を再度遠心分離し、２００μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋フリー、２％ＦＢＳ）または２００μＬの抗体溶液；１９５μＬの冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋フリー、２％ＦＢＳ）中に５μＬの抗体を含有する、の中に再度懸濁した。ＡＰＣマウスＩｇＧ１、κアイソタイプＣｔｒｌ ＦＣ（＃４００１２２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を、アイソタイプコントロールとして使用し、ＡＰＣ抗ヒトＥＧＦＲ（＃３５２９０６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用した。試料を、チューブローラーミキサー上で、４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を冷ＰＢＳ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋フリー、２％ＦＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ＰＦＡ溶液を用いて、室温で２０分間固定した。細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ分析用には２５０－３５０μＬの冷ＰＢＳ中に再懸濁した。試料をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメトリーシステム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。ＦＡＣＳ分析の結果は、表Ａ４に要約される。
溶血アッセイ
赤血球（ＲＢＣ）を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）勾配を用いてバフィーコートから分離した。得られたＲＢＣペレット（～４－５ｍｌ）を、５０ｍｌのＤＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋無し、ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）で２回洗浄した。細胞を、室温で８００ｘｇ、１０分間の遠心分離によりペレット化した。ＲＢＣをカウントし、全細胞カウントに基づき、ＤＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋無し）中に５００，０００，０００ｃ／ｍｌで再懸濁した。
サポニン希釈物を、ＤＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋有り、ＰＡＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ）中で、１．１１ｘ最終強度において調製した。ポジティブリシスコントロールには、０．０２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ１００溶液を、ＤＰＢＳ＋／＋中に調製した。全ての化合物溶液の１３５μｌを、９６ウェルＶ底プレートのウェル当たりに分注した。これに、１５μｌのＲＢＣ懸濁液を添加し、短時間混合した（１０秒－６００ｒｐｍ）。プレートを、穏やかに攪拌しながら室温で３０分間インキュベートした。その後、プレートを８００ｘｇで１０分間回転してＲＢＣをペレット化し、１００－１２０μｌの上清を、標準的な９６ｗｐ（９６ウェルプレート）に移した。続いて、４０５ｎｍにおけるＯＤを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｍｕｌｉｓｋａｎ ＦＣプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。定量化には、「ＤＰＢＳ＋／＋のみ」のウェルのバックグラウンドシグナルを、他の全てのウェルから引き算し、その後に、処理ウェルのバックグラウンド補正シグナルを、０．０２％トリトン－Ｘ１００ウェルの補正されたバックグラウンドシグナルで割ることにより、０．０２％トリトン－Ｘ１００と比較する溶血のパーセントを算出した（ｘ１００）。
実施例４：サポニン誘導体の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）
材料および方法
サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）（ＳＯ）由来（表Ａ７）およびキラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ Ｓａｐｏｎａｒｉａ）（ＱＳ）由来（表Ａ８および表Ａ９）のサポニン誘導体の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、ＤｅＶｅｎｄｉｔｔｉｓらの方法（Ａ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｉｃｅｌｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ（界面活性剤の臨界ミセル濃度の推定のための蛍光測定法）、「Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９８１年８月、第１１５巻、第２号、Ｐ．２７８－２８６）により、以下のように測定した：
精製水（ＭＱ）またはＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ＋／＋）のいずれかにおける８－アニリノナフタレン－１－スルホン酸（ＡＮＳ）の発光スペクトルを、ＣＭＣの下および上の範囲をカバーするための１から１４００μＭの範囲のサポニンの乾燥重量濃度において測定した。ＣＭＣより上では、ミセル内への蛍光色素のポジショニングに起因して、ＡＮＳの蛍光収率は増加し、かつ極大発光の波長は減少する。蛍光収率は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、３５５ｎｍの励起波長、および４６０ｎｍの発光波長において記録した。試料および測定当たり、６μｇ、濃度７５．８６μＭのＡＮＳを用いた。
結果
ＳＯ１８６１サポニン
官能基アルデヒド（Ａｌｄ）、グルクロン酸（Ｇｌｕ）における化学修飾、およびアセチル基（Ａｃ）の除去は、個々のサポニンのミセル特性に対し、強い影響を示した。図４２に示したように、ＳＯ１８６１サポニン上の個々の官能基の単一修飾は、得られたＡＮＳの相対蛍光値のスロープにおいて表されるミセル形成能に有意に影響を及ぼした。グルクロン酸に対する修飾（ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ）は明らかに、より急勾配のスロープを生じる結果となり（図４２）、天然のＳＯ１８６１について得られた１８５μＭのようにより低いＣＭＣが得られた。同様の観察が、ブロックＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ試料について得られている。しかしながらアルデヒドおよびアセチル基の修飾（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＯＨ、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、ＳＯ１８６１－Ａｃ－ＯＨ）は、有意により平坦なスロープを生じる結果となり（図４２）、天然のＳＯ１８６１についてよりも高いＣＭＣ値をもたらした。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ試料は、得られたスロープがほぼ平坦であり、かつ８００μＭまでの濃度でも何らＣＭＣが測定できなかったことから、特に興味深かった。
修飾の位置に関する同様の観察が、ＳＯ１８６１サポニンの二重修飾（図４３）および三重修飾（図４４）について得られている。グルクロン酸に対する修飾（ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、ＳＯ１８６１－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｃ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ））は、結果としてより急勾配のＡＮＳ蛍光収率スロープを、およびそれ故により低いＣＭＣ値を生じる一方、アルデヒドおよびアセチル位置に対する修飾（ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）－（Ａｃ－ＯＨ））は、平坦なＡＮＳ蛍光収率スロープを、およびそれ故天然のＳＯ１８６１に対して増大されたＣＭＣ値をもたらした（表Ａ７）。
三重修飾サポニンＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）およびＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）を比較した場合、ＳＯ１８６１－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）におけるグルクロン酸に対する修飾は、結果として個別のＡＮＳ蛍光収率のより平坦なスロープを生じたのに対し、ＳＯ１８６１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ａｃ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）におけるグルクロン酸に対する修飾は、結果として個別のＡＮＳ蛍光収率の、天然のＳＯ１８６１についてよりも急勾配なスロープを生じた（図４４）。これらの結果は、ＣＭＣが考慮される場合に、Ｇｌｕ－修飾誘導体（遊離のサポニンよりも低いＣＭＣをもつ）であっても、前記アルデヒドおよび／またはアセトキシ修飾が、Ｇｌｕ－修飾のネガティブな効果を少なくとも部分的に軽減して、ＣＭＣを増大し得ることから、ＣＭＣが考慮される場合のアルデヒドおよび／またはアセトキシ位置における修飾の重要性を示している。
ＱＳサポニン
キラヤ・サポナリア由来のサポニン（ＱＳ）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１ Ｆｒａｃ、およびＱＳ２１ ＳＰについて、ＣＭＣ値が測定されており、それらは表Ａ８に示されている。図４５に示される通り、個々のＱＳサポニンのＡＮＳ蛍光収率のスロープは、導き出されたＣＭＣ値と一致する。得られたＣＭＣ値は、４９μＭという最も高いＣＭＣ値のＱＳ２１ ＳＰから出発して、すべて７０μＭ周辺の類似したＣＭＣ値を示す、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８、ＱＳ－２１ Ｆｒａｃに向かって減少する傾向を示す。最終的には、ＱＳ－７について、ＣＭＣ値２３０μＭが得られた。
精製水（ＭＱ）およびＰＢＳ中で測定されたＱＳ２１ ＳＰのＡＮＳ蛍光収率を比較した場合、精製水（ＭＱ）中のスロープは、わずかにより急勾配であり、精製水中ではわずかに高い予想ＣＭＣ値をもたらす（図４６、表Ａ９）。
単一修飾ＱＳ２１サポニンＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（分子３０；図４０Ｂ）、ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ、ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）、およびＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ（図４７Ａ、図４７Ｂ）では、グルクロン酸に対するＡＭＰＤ修飾（ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、図４７Ｂ）のみが、結果として４０μＭというより低いＣＭＣ値を生じる天然のＱＳ２１に対し、より急勾配のＡＮＳ蛍光収率のスロープをもたらした（表Ａ９）。グルクロン酸（ＱＳ２１－Ｇｌｕ－ＡＥＭ）およびアルデヒド位置（ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ）の双方における、他の全てのＱＳ２１単一修飾は、結果として天然のＱＳ２１よりも平坦なＡＮＳ蛍光収率スロープを生じた（図４７Ｂ）。
サポナリア・オフィキナリスサポニンＳＯ１８６１に対する二重修飾についての知見と同様に、ＱＳ２１サポニンのＡｌｄＧｌｕ修飾（ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ）、図４０Ｅ、分子３３，図４７Ｃ）もまた、結果として３９μＭというより低いＣＭＣ値を生じる天然のＱＳ２１に対し、より急勾配のＡＮＳ蛍光収率のスロープをもたらした（表Ａ９）。グルクロン酸およびアルデヒド位置の双方における、他の全てのＱＳ２１二重修飾体（ＱＳ２１－（Ａｌｄ－ＯＨ）－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）、ＱＳ２１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ－（Ｇｌｕ－ＡＥＭ）、図４７Ｃ）は、結果として天然のＱＳ２１よりも平坦なＡＮＳ蛍光収率を生じた。
実施例５：ＳＯ１８６１およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨのエンドソーム脱出促進活性
ＳＯ１８６１およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（またＳＯ１８６１－ＥＭＣＨとも称される、例えば図４８－５８）を、標的化されたタンパク質毒素のエンドソーム脱出を促進するそれらの能力について検査した。このため、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを、ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）について、定濃度の１０ｐＭ セツキシマブ－サポリン（ＤＡＲ４で、タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたセツキシマブ）に対しタイトレーションした。これは、ＳＯ１８６１（ＩＣ５０＝８００ｎＭ）およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝２０００ｎＭ）が、１０ｐＭ セツキシマブ－サポリンとの組合せにおいて、Ａ４３１細胞の有効な殺細胞を誘発したのに対し、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ単独では、何ら殺細胞活性を示さないことを表した（図４８）。
次に、セツキシマブ－ジアンチンまたはセツキシマブ－サポリンを、種々の定濃度のＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨについてタイトレーションした。これは、４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、４８２９ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、または１５００ｎＭ ＳＯ１８６１の存在下での、低いｐＭ濃度のセツキシマブ－ジアンチン（ＩＣ５０＝１ｐＭ、図４９）またはセツキシマブ－サポリン（ＩＣ５０＝０，５ｐＭ、図５０）による効率的な細胞殺傷を示した。この細胞殺傷効果は、３００ｎＭ ＳＯ１８６１または３００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨでは観察されなかった（図４９および５０）。
次に、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを、ＥＧＦＲ発現細胞（Ａ４３１）について、定濃度の１０ｐＭ ＥＧＦジアンチン（ＥＧＦＲ標的化融合タンパク質毒素）に対してタイトレーションした。これは、ＳＯ１８６１（ＩＣ５０＝８００ｎＭ）およびＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝２０００ｎＭ）が、１０ｐＭのＥＧＦジアンチンとの組合せにおいて、Ａ４３１細胞の効率的な細胞殺傷を誘発するのに対し、ＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ単独では、何ら細胞殺傷活性を示さなかったことを表す（図５１）。
次に、ＥＧＦジアンチンを、種々の定濃度のＳＯ１８６１またはＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨに対してタイトレーションした。これは、４８２９ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ、または１５００ｎＭ ＳＯ１８６１の存在下での、低いｐＭ濃度のＥＧＦジアンチン（ＩＣ５０＝０，１ｐＭ、図５２）による効率的な細胞殺傷を示した。この細胞殺傷効果は、１０ｎＭ ＳＯ１８６１または３００ｎＭ ＳＯ１８６１では観察されなかった（図５２）。
次に、トラスツズマブ－ジアンチンまたトラスツズマブ－サポリン（ＤＡＲ４で、タンパク質毒素、サポリンにコンジュゲートされたトラスツズマブ）を、ＨＥＲ２発現細胞（ＳＫ－ＢＲ－３）について、定濃度の１５００ｎＭ ＳＯ１８６１または４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨに対してタイトレーションした。これは、１５００ｎＭ ＳＯ１８６１、または４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの存在下での、低いｐＭ濃度のトラスツズマブ－ジアンチン（ＩＣ５０＝０，１ｐＭ）またはトラスツズマブ－サポリン（ＩＣ５０＝０，１ｐＭ）による、効率的な細胞殺傷を示した（図５３）。
図４８－５３に概説されたこれらすべての結果は、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨが、標的化タンパク質毒のエンドソーム脱出および細胞質送達を効率的に促進し、それにより標的化タンパク質毒素の有効濃度を、ｎＭレンジからｐＭレンジへ有意に低減することを示している。
ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを、ＨＳＰ２７ｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＢＮＡ、架橋型核酸）の、エンドソーム脱出を促進する能力について検査した。このため、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２発現細胞（Ａ４３１）について、定濃度の１００ｎＭ ＨＳＰ２７ＢＮＡ、１００ｎＭ セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＤＡＲ４で、ＨＳＰ２７ＢＮＡにコンジュゲートされたセツキシマブ）、または１００ｎＭ トラスツズマブＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＤＡＲ４で、ＨＳＰ２７ＢＮＡにコンジュゲートされたトラスツズマブ）に対してタイトレーションした。これは、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ（ＩＣ５０＝７００ｎＭ）が、Ａ４３１細胞において、１００ｎＭ ＨＳＰ２７ＢＮＡ、１００ｎＭ セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ（図５４）、または１００ｎＭ トラスツズマブＨＳＰ２７ＢＮＡとの組合せにおいて、効率的なＨＳＰ２７遺伝子サイレンシング細胞を誘発することを示した（示されず）。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨ単独では、何らＨＳＰ２７遺伝子サイレンシング活性は示されなかった（図５４）。
次に、セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＤＡＲ１．５またはＤＡＲ４）、トラスツズマブＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＤＡＲ４．４）を、ＥＧＦＲ（Ａ４３１）またはＨＥＲ２（ＳＫ－ＢＲ－３）発現細胞において、種々の定濃度のＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨについてタイトレーションした。これは、Ａ４３１細胞における、低いｎＭ濃度のセツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＩＣ５０＝０，５ｎＭ、図５５）の、４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの存在下での効率的なＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングを示したのに対し、セツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ単独、またはセツキシマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ＋１００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨでは、何ら遺伝子サイレンシング活性を示さないか、または非常に高い濃度においてわずかな活性を示すに過ぎなかった（ＩＣ５０＞１００ｎＭ；図５５０）。ＳＫＢＲ－３細胞では、トラスツズマブＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＩＣ５０＝０，５ｎＭ、図５６）が、４０００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの存在下で効率的なＨＳＰ２７遺伝子サイレンシング活性を示したのに対し、トラスツズマブ－ＨＳＰ２７ＢＮＡ単独、またはトラスツズマブＨＳＰ２７ＢＮＡ＋１００ｎＭ ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、わずかな遺伝子サイレンシング活性を示すに過ぎなかった（ＩＣ５０＞１００ｎＭ；図５６）。
次に、非標的化ＨＳＰ２７ＢＮＡを、種々の細胞系において、定濃度のＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨについてタイトレーションした。これは、Ａ４３１、Ａ２０５８、およびＳＫ－ＢＲ－３細胞における、４０００ｎＭまたは４８２９ｎＭのＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの存在下での、低いｎＭ濃度のＨＳＰ２７ＢＮＡ（ＩＣ５０（ＳＫ－ＢＲ３）＝２ｎＭ；ＩＣ５０（Ａ４３１）＝１０ｎＭ；ＩＣ５０（Ａ２０５８）＝１０ｎＭ）による効率的なＨＳＰ２７遺伝子サイレンシングを示したのに対し（図５７および５８）、ＨＳＰ２７ＢＮＡ単独は、はるかに高い濃度において遺伝子サイレンシングを誘発した（ＩＣ５０（ＳＫ－ＢＲ３）＝３００ｎＭ；ＩＣ５０（Ａ４３１）＝１０００ｎＭ；ＩＣ５０（Ａ２０５８）＞１０００ｎＭ）（図５７および５８）。ＨＳＰ２７ＢＮＡのこの活性（ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの有り無しで）を、ＨＳＰ２７ＬＮＡ（ＬＮＡ、ロック核酸）活性と比較した場合、本発明者らは、エンドソーム脱出／遺伝子サイレンシング促進係数は同程度であるが、しかしＨＳＰ２７ＢＮＡに比較してより高いＨＳＰ２７ＬＮＡ濃度においてであることを観察した（図５８）。
このことは全て、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨが、標的化されたアンチセンスＢＮＡオリゴ並びに非標的化ＢＮＡ／ＬＮＡオリゴの、エンドソーム脱出および細胞質送達を効率的に促進すること、それにより、標的化および非標的化アンチセンスオリゴの有効濃度を、μＭレンジから低いｎＭレンジへ有意に低減することを示している。
材料
トラスツズマブ（Ｔｒａｓ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、セツキシマブ（Ｃｅｔ、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）。ジアンチン－ｃｙｓは、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅから製造および購入し、ＥＧＦジアンチンは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、標準的な手順により製造した。セツキシマブ－サポリンおよびトラスツズマブ－サポリンコンジュゲートは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から製造および購入した。
方法
フラッシュクロマトグラフィー
Ｇｒａｃｅ Ｒｅｖｅｌｅｒｉｓ Ｘ２（登録商標）Ｃ－８１５ Ｆｌａｓｈ；溶媒送達システム：オートプライミングを備えた３－ピストンポンプ、単回のランで４つまでの溶媒を用いた４つの独立したチャンネル、溶媒枯渇時のオートスイッチライン；最大ポンプ流量率２５０ｍＬ／ｍｉｎ；最大圧 ５０ｂａｒ（７２５ｐｓｉ）；検出：ＵＶ２００－４００ｎｍ、４つまでのＵＶシグナルおよび全ＵＶ範囲のスキャンの組合せ、ＥＬＳＤ；カラムサイズ：装置上で４－３３０ｇ、ルアー型、７５０ｇから３０００ｇまで、オプションのホルダー付き。
ＨＳＰ２７ＢＮＡオリゴ配列
Ｚｈａｎｇら（２０１１）［Ｙ Ｚｈａｎｇ、Ｚ Ｑｕ、Ｓ Ｋｉｍ、Ｖ Ｓｈｉ、Ｂ Ｌｉａｏ １、Ｐ Ｋｒａｆｔ、Ｒ Ｂａｎｄａｒｕ、Ｙ Ｗｕ、ＬＭ ＧｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒおよびＩＤ Ｈｏｒａｋ“Ｄｏｗｎ－ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）－ｂａｓｅｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（トランスフェクション無しでロック核酸（ＬＮＡ）ベースのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた癌標的のダウンモジュレーション）”「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、２０１１年、第１８巻、Ｐ．３２６－３３３］）によるＨＳＰ２７ ＢＮＡオリゴ（５’－ＧＧＣａｃａｇｃｃａｇｔｇＧＣＧ－３’）（［配列番号：２］）は、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）において、５’－チオールＣ６リンカーの有り無しでオーダーした。ＨＳＰ２７ ＬＮＡオリゴ（５’－ｇｇｃａｃａｇｃｃａｇｔｇｇｃｇ－３’）（［配列番号：３］）は、Ｂｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｉｎｃ．（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，Ｔｅｘａｓ）においてオーダーした。
ＲＮＡ単離および遺伝子発現分析
細胞由来のＲＮＡは、標準的なプロトコール（Ｂｉｏｒａｄ）に従って単離および分析した。使用されたｑＰＣＲプライマーを、表Ａ１０に示す。
トラスツズマブ－サポリンおよびセツキシマブ－サポリン合成
カスタムｍＡＢ－サポリンコンジュゲートは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より製造および購入された。
トラスツズマブ－ジアンチンおよびセツキシマブ－ジアンチン合成
ジアンチン－Ｃｙｓ（１７．０ｍｌ、～９．６ｍｇ）は、限外濾過により、Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５フィルターチューブ（３，０００ｇ、２０℃、１０分間）を用いて濃縮した。得られた３．２５ｍｌのアリコートを、ＴＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａ １０ｍｌスピンカラムを用いてゲル濾過した。
トラスツズマブ（ｍＡＢ）またはセツキシマブ（ｍＡＢ）（０．３０ｍｌ、～１０ｍｇ）を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａ ５ｍｌスピンカラムを通して脱塩し、２．５０ｍｇ／ｍｌにノーマライズした。ｍＡｂのアリコートに対し、ＤＭＳＯ中に新たに調製されたＳＭＣＣ溶液のアリコート（１．００ｍｇ／ｍｌ、４．２０モル当量、１３．９ｘ１０－５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いでローラーミキシングを用いて２０℃で６０分間インキュベートした。その後、反応を、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５中に新たに調製されたグリシン溶液のアリコート（２．０ｍｇ／ｍｌ、５．０モル当量、６９．５ｘ１０－５ｍｍｏｌ）の添加によりクエンチした。ＴＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａ １０ｍｌスピンカラムを用いたゲル濾過の後、ｍＡｂ－ＳＭＣＣ（４．２７ｍｇ、２．８０ｘ１０－５ｍｍｏｌ、１．５１４ｍｇ／ｍｌ）が得られた。
ジアンチン－Ｃｙｓ（７．５４ｍｇ、２５．３ｘ１０－５ｍｍｏｌ、２．２５８ｍｇ／ｍｌ）に対し、ＴＢＳ ｐＨ７．５中に新たに調製されたＴＣＥＰ溶液のアリコート（１．００ｍｇ／ｍｌ、０．５モル当量、１２．６ｘ１０－５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いでローラーミキシングを用いて２０℃で６０分間インキュベートした。その後、ＴＢＳ ｐＨ７．５で溶出するｚｅｂａ １０ｍｌスピンカラムを用いたゲル濾過により、ジアンチン－ＳＨ（６．０ｍｇ、２０．２ｘ１０－５ｍｍｏｌ、１．７２２ｍｇ／ｍｌ、ジアンチン：ＳＨ＝１：１）が得られた。
バルクｍＡｂ－ＳＭＣＣに対し、ジアンチン－ＳＨのアリコート（７．２０モル当量）を添加し、混合物を短時間ボルテックスし、次いで２０℃で一晩インキュベートした。約１６時間後、ＴＢＳ ｐＨ７．５中に新たに調製されたＮＥＭ溶液のアリコート（２．５０ｍｇ／ｍｌ、５．０モル当量、１０１ｘ１０－５ｍｍｏｌ）の添加により、反応をクエンチした。反応混合物を、０．４５μｍに対して濾過し、次いで限外濾過により、Ｖｉｖａｓｐｉｎ Ｔ１５フィルターチューブ（３，０００ｇ、２０℃、１５分間）を用いて、＜２ｍｌに濃縮した。コンジュゲートを、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６ｘ３５ｃｍのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＰＧカラムを用いたゲル濾過により精製した。
抗体－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）ｎ［ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィド上で］
ＤＡＲ４でのＰＥＧ４－ＳＰＤＰを介した、トラスツズマブ－（Ｌ－ＨＳＰ２７）４、セツキシマブ－（Ｌ－ＨＳＰ２７）４合成、およびＤＡＲ２でのＰＥＧ４－ＳＰＤＰを介した、セツキシマブ－（Ｌ－ＨＳＰ２７）２合成
トラスツズマブおよびセツキシマブは、以降「Ａｂ」と称される。Ａｂは、ＡｂとＨＳＰ２７ ＢＮＡとの間に不安定な（Ｌ）ジスルフィド結合を形成するテトラ（エチレングリコール）スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ）リンカーを介して、ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィドにコンジュゲートされた。手順を、例示的にトラスツズマブ－（Ｌ－ＨＳＰ２７ ＢＮＡ）４について記載する：
ＨＳＰ２７ ＢＮＡジスルフィドオリゴ（２．７ｍｇ、４７０ｎｍｏｌ、６．１０ｍｇ／ｍｌ）を、ＴＣＥＰ（１０モル当量、４．７μｍｏｌ、１．３４ｍｇ、５０ｍｇ／ｍｌ）と、ローラーミキシングを用いて２０℃で３０分間反応させた。その後、オリゴ－ＳＨを、ＴＢＳ ｐＨ７．５中に溶出するＰＤ１０ Ｇ２５脱塩カラムによって精製して、速やかに使用した。オリゴ－ＳＨが得られた（２．４８ｍｇ、９０％、１．２４ｍｇ／ｍｌ、ＳＨ対オリゴ比＝０．８）。
トラスツズマブ（１．５ｍｇ、１０．３ｎｍｏｌ、２．５０ｍｇ／ｍｌ）を、ＤＭＳＯ（１ｍｇ／ｍｌ）中に新たに調製されたＰＥＧ４－ＳＰＤＰ溶液のアリコート（６．８１モル当量、７０．１ｎｍｏｌ、３９μｇ）と、ローラーミキシングを用いて２０℃で６０分間反応させた。その後、反応をグリシン（ＴＢＳ ｐＨ７．５中に新たに調製された２ｍｇ／ｍｌの溶液の１５．１μｌ）でクエンチし、次いでｚｅｂａ脱塩カラムにより、ＴＢＳ ｐＨ７．５で溶出して脱塩した。得られたＴｒａｓ－Ｓ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰのアリコートを採取して、ＵＶ－Ｖｉｓ分析により検査した。ＳＰＤＰの取込みは、ＴＣＥＰを用いてピリジル－２－チオン（ＰＤＴ）を遊離させ、そして３４３ｎｍにおけるＵＶ－Ｖｉｓ分析によって測定した（ＳＰＤＰ対Ａｂ比：４）。残りのＴｒａｓ－（Ｓ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ）４を、新たに調製されたＨＳＰ２７オリゴヌクレオチド（オリゴ－ＳＨ）のアリコート（８モル当量、８２．４ｎｍｏｌ、１．２４ｍｇ／ｍｌ）と反応させ、ローラーミキシングを用いて２０℃で一晩インキュベートした。１７時間後、コンジュゲートをＵＶ－Ｖｉｓ分析によって分析し、ピリジル－２－チオン（ＰＤＴ）の置換によるＨＳＰ２７の取込みを、３４３ｎｍにおいて確認した。粗コンジュゲートを、ＤＰＢＳ ｐＨ７．５で溶出する１．６ｘ３３ｃｍのＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０カラムを用いて精製した。結果として生じたトラスツズマブ－（Ｌ－ＨＳＰ２７）４を、単一の分画として得た。収率：ｎ．ｄ． 純度：９６％、ＨＳＰ２７ ＢＮＡ対Ａｂ比＝４．４
実施例６－サポニンのエンドソーム脱出促進活性
先には、種々のサポニン（ＳＯ１８６１、ＳＡ１６４２）の効能が、「遊離の」非コンジュゲート分子として、リガンド毒素融合物（例えば、ＥＧＦジアンチン）または抗体－タンパク質毒素コンジュゲートと組合せて細胞に同時投与され、標的発現細胞の細胞殺傷活性を促進する結果を生じている。ここでは、サポナリア・オフィキナリスの根の抽出物から単離された３つの異なるサポニン分子（ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）、ＳＯ１８３２、およびＳＯ１９０４）を、ＨｅＬａ（ＥＧＦＲ＋）細胞について、非有効定濃度の１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しでタイトレーションした。これは、全ての検査されたサポニン変異体について、ＥＧＦジアンチン無しの処理に比較して、細胞殺傷活性の強い促進を示した（ＩＣ５０＝３００ｎＭ；図６３Ａ）。次に、ＥＧＦジアンチンを、定濃度のサポニン（～１０００ｎＭ）を用いてタイトレーションし、これは、全ての使用したサポニンＳＯ１８６１、ＳＯ１８６２（ＳＯ１８６１の異性体）、ＳＯ１８３２、およびＳＯ１９０４について観察された、ＥＧＦジアンチンの低いｐＭ濃度における強い標的化細胞殺傷促進を示した（ＩＣ５０＝０．４ｐＭ；図６３Ｂ）。ＥＧＦ－ジアンチン単独では、非常に高い濃度において細胞殺傷を誘発し得たにすぎない（ＩＣ５０＝１０．０００ｐＭ）。これは、これらの特定のタイプのサポニンが全て、非常に少量の利用可能な標的化毒素を用いるだけで、効率的にエンドソーム脱出を誘発する内在的な能力を持つことを示している。
この検査を拡張するため、他の供給源に由来するサポニンを分析した。カスミソウ（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｍ．Ｂｉｅｂ）の根の抽出物から精製されたサポニン（ＧＥ１７４１）を、ＨｅＬａ細胞について、１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンの有り無しでタイトレーションし、精製されたＳＯ１８６１と比較した。ＧＥ１７４１もまた、ＥＧＦジアンチン誘発性のＨｅＬａ細胞殺傷を促進するが、しかしＳＯ１８６１に比較してやや低い効率を示し（ＧＥ１７４１ ＩＣ５０＝８００ｎＭ、図６３Ｃ）、またより高い一般毒性を示した（ＥＧＦジアンチン無しでＩＣ５０＝５，０００ｎＭ、図６３Ｃ）。同様の検査においては、キラヤ・サポナリアの異なる部分精製されたサポニンの混合物（ＱＳｍｉｘ１－３）が、ＨｅＬａ細胞に対し、１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンと同時投与され、３つのうち２つ（ＱＳｍｉｘ１およびＱＳｍｉｘ３）について、ＳＯ１８６１と同様の活性が示された（ＩＣ５０ ＱＳｍｉｘ／ＱＳｍｉｘ３＝３００ｎＭ；図６３Ｄ）。ＱＳｍｉｘ（２）は、１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチン誘発性の細胞殺傷の促進においては効率がより低いが（ＩＣ５０＝２０００ｎＭ；図６３Ｄ）、しかしながら、何ら一般毒性は観察されない。これは、ＱＳ抽出物においても、特定のタイプのサポニンが利用可能であって、標的化リガンド毒素ＥＧＦジアンチンのエンドソーム脱出を効率的に誘発することを示す。したがって、本実施例において記載されたサポニン、例えばキラヤ・サポナリアサポニン、ＧＥ１７４１、ＳＯ１８６１、ＳＯ１８６２、ＳＯ１８３２、およびＳＯ１９０４は、本発明によって誘導体化するために特に魅力的なサポ二ンである。
実施例７：サポニンおよびサポニン誘導体のエンドソーム脱出促進活性
不安定／酸感受性誘導体（Ａｌｄ－ＥＭＣＨまたはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３（またＳＯ１８６１－Ｎ３およびＳＯ１８６１－アジドまたはＳＯ１８６１－Ｎ３／アジドとも称される）を、アルデヒド基を介してＳＯ１８６１に適用して、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨまたはＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３を生成した。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨの活性を確認するため、ＥＧＦＲ発現（Ａ４３１，ＨｅＬａ）および非発現細胞（Ａ２０５８）について、固定非有効濃度（１．５ｐＭ）のＥＧＦジアンチンの有り無しで、この分子をタイトレーションした。３つの全ての細胞系において、ＳＯ１８６１単独では強い細胞生存率減少が示されたのに対し、単一化合物としてのＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨは、２５，０００ｎＭまで何ら毒性を示さなかった（図６４Ａ－Ｃ）。ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨを１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンと組合せた場合、ＥＧＦＲ＋Ａ４３１およびＨｅＬａ細胞において、強い標的特異な細胞生存率減少が観察される（ＩＣ５０＝３，０００ｎＭ、図６４Ａ、Ｂ）のに対し、ＥＧＦＲ－－Ａ２０５８細胞は、全く影響を受けない（図６４Ｃ）。同様の結果が、ＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３について得られた。１．５ｐＭ ＥＧＦジアンチンと同時投与されたＳＯ１８６１－Ｌ－Ｎ３もまた、Ａ４３１およびＨｅＬａ細胞に対し、効率的な殺細胞を示す（ＩＣ５０＝３，０００ｎＭ）が、しかしＥＧＦジアンチン無しでは、一般毒性は１０，０００ｎＭより上において観察される（図６４Ｄ、６４Ｅ）。
ＨＡＴＵを、ＳＯ１８６１のカルボン酸基を介してＳＯ１８６１にコンジュゲートし、ＳＯ１８６１－ＨＡＴＵまたはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＨＡＴＵとも称される、ＳＯ１８６１－（Ｓ）を生成した。活性を測定するため、ＥＧＦＲ発現ＨｅＬａ細胞において、様々な濃度のＳＯ１８６１－（Ｓ）を１．５ｐ ＭＥＧＦジアンチンと同時投与し、細胞殺傷活性について検査した。ＳＯ１８６１－（Ｓ）は、ＳＯ１８６１と同様の活性を示し、ＳＯ１８６１－Ａｌｄ－ＥＭＣＨについて観察されたものと同様に、カルボン酸基へのコンジュゲーションが何らこの分子のエンドソーム脱出促進活性に影響を及ぼさないことを示している（図６５）。

Claims (25)

  1. トリテルペンアグリコンコア構造と、前記トリテルペンアグリコンコア構造に結合された、第１の糖鎖および第２の糖鎖の少なくとも１つとを含む、ＳＯ１８６１サポニンをベースとする化学的に修飾されたサポニンであって、
    前記化学的に修飾されたサポニンはキラ酸アグリコンコア構造を有し、これにおいて、ＳＯ１８６１に対応する前記化学的に修飾されたサポニンが分子１：
    によって表される、サポニンに対応しており、
    これにおいて、前記分子１のアグリコンコア構造はキラ酸であり、Ｒはヒドロキシルと定義され、これにおいて、前記第１の糖鎖Ａ１がＧａｌ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）］－ＧｌｃＡであり、前記第２の糖鎖Ａ２がＧｌｃ－（１→３）－Ｘｙｌ－（１→４）－Ｒｈａ－（１→２）－［Ｘｙｌ－（１→３）－４－ＯＡｃ－Ｑｕｉ－（１→４）］－Ｆｕｃであり、
    これにおいて、以下の少なくともいずれか１つの化学的修飾が存在する：
    ｉ． 前記化学的に修飾されたサポニンが、Ｃ２３において化学的に修飾されているアルデヒド基を含有する前記アグリコンコア構造を含むか、
    ｉｉ． 前記第１の糖鎖Ａ１が、化学的に修飾されているグルクロン酸部分のカルボキシル基を含有するか：または
    ｉｉｉ． 前記第２の糖鎖Ａ２が、化学的に修飾されたアセトキシ（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）基を含有するか；または
    ｉｖ． 前記化学的に修飾されたサポニンが、化学的修飾ｉ．ｉｉ．およびｉｉｉ．の任意の組合せを含む、
    化学的に修飾されたサポニン。
  2. 以下の化学的修飾：
    ｉ． キラ酸の位置Ｃ２３におけるアルデヒド基が、化学的に修飾される；
    ｉｉ． Ａ１のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基が、化学的に修飾され、それにより、ＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＭＰＤ、またはＳＯ１８６１－Ｇｌｕ－ＡＥＭを提供する；および
    ｉｉｉ． Ａ ２ の１つ以上のアセトキシ基が、化学的に修飾されている、
    の少なくとも１つが存在する、請求項１に記載の化学的に修飾されたサポニン。
  3. 前記化学的に修飾されたＳＯ１８６１が単一化学的修飾を含み、ここで前記単一化学的修飾が、ＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基の変換であり、或いはこれにおいて前記化学的修飾されたサポニンが；ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨである、キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３にアルデヒド基を含有する、分子２によって表される化学的に修飾されたＳＯ１８６１であり：
    或いはこれにおいて、前記化学的に修飾されたサポニンが；ＳＯ１８６１－ＥＭＣＨ－メルカプトエタノールである、前記キラ酸アグリコンコア構造の示した位置Ｃ２３にアルデヒド基を含有する化学的に修飾されたＳＯ１８６１を表す、分子３によって表される化学的に修飾されたＳＯ１８６１である、請求項１に記載の化学的に修飾されたサポニン。
  4. 前記化学的に修飾されたサポニンが前記アグリコンコア構造を含み、ここで前記アグリコンコア構造が、アルデヒド基を含有し、かつここで、前記第１の糖鎖が、化学的に修飾されている、前記カルボキシル基を含有する、請求項１に記載の化学的に修飾されたサポニン。
  5. 前記アグリコンコア構造中の前記アルデヒド基が化学的に修飾され、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１－ＥＭＣＨである場合には、グルクロン酸およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた化学的に修飾されるという条件付きであり、かつ前記サポニンがＳＯ１８６１でありかつＳＯ１８６１のグルクロン酸部分の前記カルボキシル基が化学的に修飾される場合には、前記アルデヒド基およびアセトキシ基（Ｍｅ（ＣＯ）Ｏ－）のうちの少なくとも１つもまた化学的に修飾されるという条件付きである、請求項１に記載の化学的に修飾されたサポニン。
  6. 前記化学的に修飾されたサポニンが、分子２、分子３、分子３Ａ、分子６、分子８、分子９、分子１０、分子１１、分子１４、分子１５、分子１８、分子１９、分子２０、および分子２６からなる群より選択されるサポニン誘導体であって、これにおいて、ＳＯ１８６１のグルクロン酸部分が化学的に修飾される、請求項１に記載の化学的に修飾されたサポニン。









  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の前記化学的に修飾されたサポニンと、薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤とを含む、第１の医薬組成物。
  8. 前記化学的に修飾されたサポニンが分子２によって表される前記化学的に修飾されたサポニンであるか：
    または単一化学的修飾を含む化学的に修飾されたＳＯ１８６１であり、ここで前記単一化学的修飾は、ＳＯ１８６１の前記グルクロン酸部分の前記カルボキシル基の変換であり、或いは前記化学的に修飾されたサポニンが分子３によって表される化学的に修飾されたサポニンである、請求項７に記載の第１の医薬組成物。
  9. ・ 請求項７または８に記載の前記第１の医薬組成物と、
    ・ 抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含む、第２の医薬組成物と、
    を含む医薬組合せ剤。
  10. 請求項１～６のいずれか１項に記載の前記化学的に修飾されたサポニンを含み、かつさらに：抗体－毒素コンジュゲート、受容体－リガンド－毒素コンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－核酸コンジュゲート、または受容体－リガンド－核酸コンジュゲートの任意の１つ以上を含む、第３の医薬組成物。
  11. 第２の医薬組成物が、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含む、請求項９に記載の医薬組合せ剤。
  12. 前記抗体－薬物コンジュゲートが、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、１つまたは複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、またはラクダ類のＶＨのコンジュゲートを含む抗体である、請求項９もしくは１１に記載の医薬組合せ剤。
  13. 第３の医薬組成物が、抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つ以上を含む、請求項１０に記載の第３の医薬組成物。
  14. 前記抗体－薬物コンジュゲートが、ＩｇＧ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、１つまたは複数のＶＨドメイン、単一ドメイン抗体、Ｖ ＨＨ 、またはラクダ類のＶ Ｈ のコンジュゲートを含む抗体である、請求項１０もしくは１３に記載の第３の医薬組成物。
  15. 医薬としての使用のための、請求項１０、１３又は１４に記載の第３の医薬組成物。
  16. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、請求項１０及び１３～１５のいずれか１項に記載の第３の医薬組成物。
  17. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防のための医薬の製造のための、請求項１０及び１３～１６のいずれか１項に記載の第３の医薬組成物の使用。
  18. 医薬としての使用のための、請求項９および１１－１２のいずれか１項に記載の医薬組合せ剤。
  19. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、請求項９および１１－１２のいずれか１項に記載の医薬組合せ剤。
  20. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防のための医薬の製造のための、請求項９、１１－１２および１８－１９のいずれか１項に記載の医薬組合せ剤の使用。
  21. 医薬としての使用のための、請求項７－９のいずれか１項に記載の第１の医薬組成物。
  22. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防における使用のための、請求項７－９および２１のいずれか１項に記載の第１の医薬組成物。
  23. 癌、感染症、ウイルス感染、高コレステロール血症、原発性高シュウ酸尿症、血友病Ａ、血友病Ｂ、アルファ－１アンチトリプシン関連肝疾患、急性肝性ポルフィリン症、トランスサイレチン媒介アミロイドーシス、または自己免疫疾患の治療もしくは予防のための医薬の製造のための、請求項７－９および２１－２２のいずれか１項に記載の第１の医薬組成物の使用。
  24. 分子を細胞の外側から前記細胞の内側へ移行させるための、インビトロまたはエクスビボの方法であって：
    ａ） 細胞を提供する工程と；
    ｂ） 工程ａ）において提供された前記細胞の内側に、前記細胞の外側から移行させるための前記分子を提供する工程と；
    ｃ） 請求項１～６のいずれか１項に記載のサポニン誘導体を提供する工程と；
    ｄ） 工程ａ）の前記細胞を、インビトロまたはエクスビボにおいて、工程ｂ）の前記分子および工程ｃ）の前記サポニン誘導体と接触させ、それにより前記分子の前記細胞の外側から前記細胞内への移行を確立させる工程とを含む、方法。
  25. 前記細胞が、Ｔ－細胞、ＮＫ－細胞、腫瘍細胞を含むヒト細胞であり、および／またはこれにおいて前記サポニン誘導体が、請求項１～６のいずれか１項に記載のサポニン誘導体であり、および／またはこれにおいて、工程ｂ）の前記分子が：抗体－薬物コンジュゲート、受容体－リガンド－薬物コンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または受容体－リガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの任意の１つである、請求項２４に記載の方法。
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