JP7800902B2

JP7800902B2 - コラーゲンペプチド吸収促進組成物とその製造方法

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Publication number: JP7800902B2
Application number: JP2022113873A
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Inventors: 乃理子宮本; 和之三吉
Original assignee: Taiyo Corp
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Publication date: 2026-01-16
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Description

本発明は、コラーゲンペプチド吸収促進組成物およびその製造方法に関する。

コラーゲンは、動物の皮膚、骨、軟骨等に多く含まれるタンパク質である。また、コラーゲンは、皮膚の真皮層では、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸などと共にマトリックス構造を形成する。そのため、コラーゲンは、細胞及び皮膚組織の支持、細胞間隙における保水、皮膚の潤滑性と柔軟性の保持、紫外線、乾燥環境、機械的刺激や損傷、微生物感染等の外的因子から皮膚組織を保護する役割を果たす重要な成分の１つである。

コラーゲンは、経口摂取された後、体内の消化酵素によってジペプチドやトリペプチドに分解され、小腸から血中へ吸収される。従って、コラーゲンの加水分解物であるコラーゲンペプチドを経口摂取することで、コラーゲンの持つ有益な効果を得ることが期待できる。

コラーゲンを構成する特徴的なアミノ酸であるヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含むペプチド（ペプチド型Ｈｙｐ）は、経口摂取後のコラーゲンペプチドの消化吸収の動態を観察する指標となることが分かっている（非特許文献１～３）。ペプチド型Ｈｙｐの血中への移行によりコラーゲンペプチドの吸収を観測した場合、コラーゲンペプチド２ｇ／６５ｋｇ体重では有意な吸収が見られず、１０ｇ／６５ｋｇ体重でペプチド型Ｈｙｐの血中への移行が見られた（非特許文献２）。これは、コラーゲンペプチドは経口摂取しても吸収されにくいこと、従って、コラーゲンペプチドはそのままでは大量に摂取しなければ、コラーゲンペプチドを経口摂取しても十分な効果を達成できないであろうことを示唆している。

日本香粧品学会誌 Vol. 44、 No. 4、pp.308-313（2020）日本食生活学会誌第27巻、第3号、pp.147-152（2016）皮革科学 Vol.56、No. 2、pp.71-79（2010）

従って、コラーゲンペプチドの吸収を促進し、それにより、必要な効果を達成するのに摂取すべきコラーゲンペプチドの量を減らすことが求められている。
さらに、コラーゲンは体内の種々の部位で使用されているため、摂取されたコラーゲンが、目的とする効果をもたらすことも確認する必要がある。

本発明者らは、本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物が、コラーゲンペプチドの吸収を促進することを見出した。
さらに、本発明者らは、本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物およびコラーゲンペプチドを含有する本発明の組成物が、肌状態を改善することを見出した。

本発明は、以下の態様１～５を含む：
［態様１］大豆ペプチド乳酸菌発酵物を含有する、コラーゲンペプチド吸収促進組成物；
［態様２］７０％以上の乳酸菌を除去した、態様１に記載のコラーゲンペプチド吸収促進組成物；
［態様３］コラーゲンペプチドまたはコラーゲンペプチド含有組成物と一緒に、同時に、または、その摂取前もしくは摂取後に、摂取することによって使用される、態様１または２に記載のコラーゲンペプチド吸収促進組成物；
［態様４］肌状態を改善するために使用される、態様１または２に記載のコラーゲンペプチド吸収促進組成物；
［態様５］大豆ペプチド乳酸菌発酵物を混合する、コラーゲンペプチド吸収促進組成物の製造方法。
［態様６］大豆ペプチド乳酸菌発酵物およびコラーゲンペプチドを含有する、肌状態改善組成物。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、コラーゲンペプチドの吸収を促進することができる。また、本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、コラーゲンペプチドの吸収を促進することによって、肌の水分量および／または弾力を改善し、肌状態を改善することができる。

実施例１、実施例２および比較例１のコラーゲンドリンク摂取後の経過時間に対する被験者の血漿中のペプチド型Ｈｙｐの量の平均値をプロットしたグラフである。実施例１、実施例２および比較例１のコラーゲンドリンク摂取後の経過時間に対する被験者の血漿中のＰｒｏ－Ｈｙｐ量の平均値をプロットしたグラフである。実施例１、実施例２および比較例１のコラーゲンドリンク摂取後の経過時間に対する被験者の血漿中のＨｙｐ－Ｇｌｙ量の平均値をプロットしたグラフである。実施例３および比較例２のコラーゲンドリンクの被験者の肌の全体的な状態の変化をプロットしたグラフである。実施例３および比較例２のコラーゲンドリンクの被験者の肌の乾燥状態の変化をプロットしたグラフである。実施例３および比較例２のコラーゲンドリンクの被験者の肌の弾力の変化をプロットしたグラフである。実施例４、比較例３および比較例４のコラーゲンドリンクの被験者の肌の全体的な状態の変化をプロットしたグラフである。実施例３、比較例３および比較例４のコラーゲンドリンクの被験者の肌の乾燥状態の変化をプロットしたグラフである。実施例３、比較例３および比較例４のコラーゲンドリンクの被験者の肌の弾力の変化をプロットしたグラフである。

以下、本発明に係る実施の形態を、詳しく説明する。
本発明の一態様において、本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物を含有する組成物は、コラーゲンペプチドの吸収を促進する。さらに、本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物から乳酸菌の菌体を７０％以上、例えば８０％以上、または９０％以上除去したものも、乳酸菌除去前と同様にコラーゲンペプチドの吸収を促進する。また、大豆ペプチド乳酸菌発酵物、若しくは、大豆ペプチド乳酸菌発酵物から乳酸菌の菌体が上記割合のいずれかで除去されたものが混合された組成物とすることで、本発明のコラーゲンペプチド吸収促進組成物を製造することができる。
本発明のコラーゲンペプチド吸収促進組成物は、コラーゲンペプチドそれ自体またはコラーゲンペプチド含有組成物と一緒に、同時に、またはその摂取前もしくは摂取後に摂取することによって、コラーゲンペプチドの吸収を促進することができる。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、大豆ペプチドを乳酸菌で発酵させることで製造される。

本発明のペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用されるペプチドは、例えば、動植物性あるいは微生物由来のタンパク質を、酸、アルカリまたはタンパク質加水分解酵素で加水分解することによって得られるものであり、例えばコラーゲンペプチド、大豆ペプチド、乳ペプチド、小麦ペプチドまたは卵ペプチドであり、好ましくは大豆ペプチドである。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される大豆ペプチドは、例えば大豆タンパク質を酵素分解したものであり、好ましくは不二製油株式会社からハイニュートシリーズとして販売されているものであり、さらに好ましくはハイニュートＡＭ（不二製油株式会社）である。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される大豆ペプチドの量は、０．１～２０％、好ましくは２～１０％、より好ましく３～５％である。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌は、例えばラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・パニス、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラム、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・クンキー、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス、ラクトバチルス・ヘルベティカス、または、ストレプトコッカス・サーモフィラスであり、好ましくはラクトバチルス・プランタラムまたはラクトバチルス・パラカゼイであり、特に好ましくはラクトバチルス・プランタラムである。また、乳酸菌は複数使用してもよく、例えば上に示したものから１種以上選択してもよい。

ラクトバチルス・プランタラムの菌株は、例えばラクトバチルス・プランタラムＦＬ－６６４である。
ラクトバチルス・パラカゼイの菌株は、例えばラクトバチルス・パラカゼイＮＢＲＣ１５８８９である。
ラクトバチルス・ロイテリの菌株は、例えばラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１１１２、ラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１０８１、またはラクトバチルス・ロイテリＪＣＭ１０８４である。
ラクトバチルス・パニスの菌株は、例えばラクトバチルス・パニスＪＣＭ１１０５３である。
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの菌株は、例えばラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＪＣＭ１００２である。
ラクトバチルス・アシドフィラスの菌株は、例えばラクトバチルス・アシドフィラスＪＣＭ１０３４である。
ラクトバチルス・ブレビスの菌株は、例えばラクトバチルス・ブレビスＪＣＭ１０６１である。

ラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイの菌株は、例えばラクトバチルス・パラカゼイ・サブスピーシーズ・パラカゼイＪＣＭ１１０９である。
ラクトバチルス・ガセリの菌株は、例えばラクトバチルス・ガセリＪＣＭ１１３１である。
ラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラムの菌株は、例えばラクトバチルス・プランタラム・サブスピーシーズ・プランタラムＪＣＭ１１４９である。
ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株は、例えばラクトバチルス・ファーメンタムＪＣＭ１１７３である。
ラクトバチルス・クンキーの菌株は、例えばラクトバチルス・クンキーＪＣＭ１６１７３である。
ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌株は、例えばラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスＪＣＭ５８０５である。
ラクトバチルス・ヘルベティカスの菌株は、例えばラクトバチルス・ヘルベティカスＦＬ－６５株である。
ストレプトコッカス・サーモフィラスの菌株は、例えばストレプトコッカス・サーモフィラスＦＬ－１７６株である。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌の菌株は、好ましくはラクトバチルス・プランタラムＦＬ－６６４株である。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌の菌株は、例えば、国内または外国の公的微生物保存機関、例えば独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター、または、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターから分譲を受けることが可能なものである。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵用培地には、ｐＨ調整剤を添加してもよい。ｐＨ調整剤は、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム）、無機酸の塩（例えば炭酸カリウム）、有機酸の塩（例えばクエン酸三ナトリウム）、または、有機酸（例えば乳酸、クエン酸、リンゴ酸もしくは酢酸）である。培地に添加するｐＨ調整剤の量は、乳酸菌発酵に適したｐＨの範囲（例えばｐＨ３～９）に培地のｐＨを調整するのに必要な量である。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵用培地には、香料を添加してもよい。香料は、例えば果物（例えばリンゴ、イチゴ、グレープ、マスカット、ピーチまたはバナナ）のフレーバー、柑橘類（レモン、オレンジまたはライム）のフレーバー、あるいは、バニラ、ココア、紅茶またはコーヒーのフレーバーである。香料の種類および量は、必要な風味に合わせて適宜選択される。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵用培地には、糖を添加してもよい。添加する糖は、例えばグルコース、スクロース、フルクトースまたはマルトースである。添加する糖は１種類であっても複数種類の混合物（例えば液糖や水飴などの混合物）であってもよい。あるいは、糖を高含有する食品（例えば濃縮果汁）として添加してもよい。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵の培地に添加する糖の量は、例えば０．１～６％であり、好ましくは１～６％であり、より好ましく２．５～４．５％であるが、これらの量に限定されない。本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵の培地に添加する糖は、好ましくはグル・ファイナル（サンエイ糖化株式会社）またはハイマルトースＭ７０－７５Ｃ（日本コーンスターチ株式会社）である。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵の培地に添加する糖の量は、例えば０．１～６％であり、好ましくは１～６％であり、より好ましく２．５～４．５％であるが、これらの量に限定されない。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵用培地には、アミノ酸を添加してもよい。添加するアミノ酸は、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギンまたはグルタミンである。添加するアミノ酸は１種類であっても複数種類の混合物であってもよい。あるいは、アミノ酸含有食品、例えば酵母エキスとして添加してもよい。酵母エキスは、好ましくは酵母エキスＳＬ－Ｗ（三菱商事ライフサイエンス株式会社）である。また、酵母エキスは、他の栄養素との混合物の形で添加してもよい。
酵母エキスを添加する場合、酵母エキスの量は、例えば０．１～６％であり、好ましくは０．１～３％であり、より好ましく０．１～１％であるが、これらの量に限定されない。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造に使用される乳酸菌発酵用培地には、栄養素として、例えばビタミン類（例えばビオチン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２）、ミネラル類（例えばマンガン、マグネシウム、鉄）および／または脂肪酸（例えばオレイン酸）を添加してもよい。これらの栄養素は単独でも、これらの栄養素を含有する食品として添加してもよい。添加する栄養素は、例えばイーストリッチマンガン（オリエンタル酵母工業株式会社）である。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造において、乳酸菌の発酵時間は、例えば約８時間～約１０８時間であり、好ましくは約１２時間～約９６時間であり、より好ましくは約１６時間～約７２時間であるが、これらに限定されない。乳酸菌の発酵時間は、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などにより適宜選択される。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造において、乳酸菌の発酵温度は、例えば２０～４５℃であり、好ましくは２５～４３℃であり、より好ましくは３０～４０℃であるが、これらに限定されない。乳酸菌の発酵温度は、原料、使用微生物、発酵時間、および目的とする風味などにより適宜選択される。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造の際の乳酸菌発酵開始時のｐＨは、例えばｐＨ３～９であり、好ましくはｐＨ４～８であり、より好ましくはｐＨ５～７であるが、これらのｐＨに限定されない。乳酸菌発酵時のｐＨは、原料、使用微生物、発酵温度、および目的とする風味などにより適宜選択される。

本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物から、乳酸菌の菌体を７０％以上、例えば８０％以上、または９０％以上除去したものを得るには、例えばデカンテーション（傾斜）、遠心分離、遠心分離及びデカンテーション、濾過、減圧濾過、膜濾過、または、限外濾過が用いられる。好ましくは、遠心分離を行った後にデカントし、沈殿した菌体を除去することによって、乳酸菌を７０％以上除去したものを得ることができる。
本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、乳酸菌の菌体を除去しても除去しなくても、コラーゲンペプチドの吸収を促進する。例えば本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物を飲料として摂取する場合、口当たりや飲みやすさの点から、好ましくは乳酸菌の菌体を、ある程度、例えば７０％以上除去したものを使用してよい。

本発明の他の態様において、本発明の肌状態改善組成物は、大豆ペプチド乳酸菌発酵物およびコラーゲンペプチドを含有する。本発明の肌状態改善組成物に含有される大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、本発明のコラーゲン吸収促進組成物に含有される大豆ペプチド乳酸菌発酵物である。また、本発明の肌状態改善組成物に含有される大豆ペプチド乳酸菌発酵物は、乳酸菌除去前のものであっても、乳酸菌を除去したものであってもよい。

本発明の肌状態改善組成物は、固体であっても液体であってもよく、例えば粉末、顆粒、丸剤、錠剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、ペースト、溶液、懸濁液または乳液であってもよい。本発明の肌状態改善組成物はまた、水などの液体と混合して飲料として再構成される粉末または顆粒であってもよい。
また、本発明の肌状態改善組成物は、飲食品組成物の形態であってもよい。本発明の肌状態改善組成物は、飲料、例えばジュース、スープまたはドリンク剤であるか、あるいは、食品、例えば栄養補助食品、特定保健用食品、機能性食品または健康食品の形態であってもよい。

本発明の肌状態改善組成物に含有されるコラーゲンペプチドは、コラーゲンを加水分解して得られるコラーゲンペプチドである。コラーゲンペプチドの原料となるコラーゲンは、哺乳類、例えばウシまたはブタの尾、四肢等；鳥類、例えばトリのとさか（鶏冠）等；あるいは、魚類、例えばマグロ、サメ、タラ、ヒラメ、カレイ、タイ、テラピア、サケ、ナマズ、スズキまたはウナギの鰭、皮、鱗等から得られるコラーゲンである。本発明の肌状態改善組成物に含有されるコラーゲンペプチドは、例えばブタのコラーゲンを原料とするものである。

本発明の肌状態改善組成物に含有されるコラーゲンペプチドの平均分子量は、ブタ由来のコラーゲンペプチドにおいて、例えば８０００以下であり、好ましくは５０００以下であり、より好ましく３０００以下であり、さらに好ましくは２０００以下である。
本発明の肌状態改善組成物に含有されるコラーゲンペプチドの量は、例えば５～４０重量％であり、好ましくは５～３０重量％であり、さらに好ましくは１０～２５重量％である。

本発明の肌状態改善組成物は、さらに、甘味料（例えばデキストリン、ブドウ糖、乳糖もしくは糖類（例えばグラニュー糖））、糖アルコール類、澱粉又はその加工物、セルロース類、着色剤、香料、果汁、ビタミン類、ミネラル類、蛋白質、アミノ酸、酸化防止剤（例えばビタミンＣ）、保存剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤（例えば食塩）、ｐＨ調整剤（例えばクエン酸またはクエン酸ナトリウム）、酸味料、各種栄養機能成分などの他の成分を含んでよい。本発明の肌状態改善組成物は、さらに、コラーゲン類の吸収を促進する作用を有する成分、例えば界面活性剤、セサミンまたはリン脂質を含んでよい。

本明細書において「約」とは記載の数値の±１０％、好ましくは±５％の範囲を意味する。
以下、本開示に係る実施例を説明するが、本開示の技術的範囲はこの説明に限定されるものではない。

（Ｉ）本発明の大豆ペプチド乳酸菌発酵物の製造
（１）乳酸菌スターターの製造
ＭＲＳ（de Man Rogosa Sharpe）培地（メルク社）をメーカー指定通りに調製し、３０℃まで加温した。次いで、ＭＲＳ培地にラクトバチルス・プランタラムＦＬ－６６４株０．０５％を接種して生菌数を約１．０×１０^５～１．０×１０^７ｃｆｕ／ｍｌとした後、３０℃で２０時間発酵させた。次いで、発酵物を遠心分離して菌体を回収し、さらに同量の滅菌生理食塩水にて懸濁し、再度遠心分離して菌体を洗浄した。最終的に得られた菌体を滅菌生理食塩水にて再度懸濁し、生菌数を約１．０×１０^８～２．０×１０^９ｃｆｕ／ｍｌに調整したものをＦＬ－６６４スターターとした。

（２）乳酸菌発酵用培地の調製
大豆ペプチド：ハイニュートＡＭ（不二製油株式会社）５％、
ハイマルトースＭ７０－７５Ｃ（日本コーンスターチ株式会社）３％、
酵母エキスＳＬ－Ｗ（三菱商事ライフサイエンス株式会社）０．３％、
イーストリッチマンガン（オリエンタル酵母工業株式会社）０．０６％、
水９０．６４％
を混合し、乳酸菌発酵用培地を調製した。調製した培地は、９０℃で１分間殺菌した後、３０℃まで冷却した。

（３）乳酸菌発酵物の製造
（２）で調製した乳酸菌発酵用培地に、（１）で調製したＦＬ－６６４スターターを１％接種し、３０℃で２４時間発酵させた後、８５℃で５分間加熱することで発酵を停止させた。得られた大豆ペプチド乳酸菌発酵物を乳酸菌発酵物（Ａ）とした。

（４）乳酸菌除去
（３）で得られた大豆ペプチド乳酸菌発酵物を、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離し（株式会社コクサン製卓上遠心機、使用ローター：ＲＦ－１１０）、固く沈殿する乳酸菌の層のみを取り除くように上澄み液をデカントすることで乳酸菌を除去した大豆ペプチド乳酸菌発酵物を得た。これを乳酸菌除去発酵物（Ｂ）とした。このとき、ＤＡＰＩ染色で乳酸菌数を測定し、乳酸菌発酵物（Ａ）の乳酸菌数と比較することにより、乳酸菌除去発酵物（Ｂ）からは乳酸菌が９０％以上除去されていることを確認した。なお、ここで除去された乳酸菌の菌体の重量は全体量の２％程度であったことから、乳酸菌発酵物（Ａ）と乳酸菌除去発酵物（Ｂ）に含まれる発酵物の量は、ほぼ同程度である。

（５）コラーゲンドリンクの製造
豚コラーゲンペプチド１０ｇ、グラニュー糖６ｇ、ｐＨと風味を整えるためのクエン酸および香料を添加したコラーゲンドリンク（×３）に、それぞれ、（２）で得られた乳酸菌接種前の乳酸菌発酵用培地、乳酸菌発酵物（Ａ）または乳酸菌除去発酵物（Ｂ）を１０ｇ加え、総量５０ｇとなるように水と混合した。混合後は瓶詰めして８５℃で１０分間加熱処理して冷却した。ここで、（２）で得られた乳酸菌接種前の乳酸菌発酵用培地を混合したものを比較例１、乳酸菌発酵物（Ａ）を混合したものを実施例１、乳酸菌除去発酵物（Ｂ）を混合したものを実施例２とする。

（６）コラーゲンペプチド低減コラーゲンドリンクの製造
豚コラーゲンペプチド５ｇ、グラニュー糖６ｇ、ｐＨと風味を整えるためのクエン酸および香料を添加したコラーゲンドリンク（×２）に、それぞれ、（２）で得られた乳酸菌接種前の乳酸菌発酵用培地または乳酸菌発酵物（Ａ）を５ｇ加え、総量５０ｇとなるように水を添加して混合した。混合後はアルミパウチに充填して、８５℃で１０分間加熱処理し、冷却した。ここで、乳酸菌発酵用培地を添加したものを比較例２、乳酸菌発酵物（Ａ）を添加したものを実施例３とする。

（７）ペプチドを培地原料としない乳酸菌発酵物（比較例）の製造
ハイマルトースＭ７０－７５Ｃ（日本コーンスターチ株式会社）３％、
酵母エキスＳＬ－Ｗ（三菱商事ライフサイエンス株式会社）０．６％、
イーストリッチマンガン（オリエンタル酵母工業株式会社）０．０６％、
Ｌ－グルタミン酸ナトリウム（三菱商事ライフサイエンス株式会社）２％、
リン酸水素二カリウム（米山化学株式会社）０．４３５％、
液体クエン酸０．０７５％（扶桑化学工業株式会社）、
水９２．８３％
を混合し、大豆ペプチド非含有乳酸菌発酵用培地を調製した。調製した培地は、９０℃で１分間殺菌した後、３０℃まで冷却した。この培地に、（１）で調製したＦＬ－６６４スターターを１％接種し、３０℃で２４時間発酵させた後、８５℃で５分間加熱することで発酵を停止させた。得られた大豆ペプチド非含有培地での乳酸菌発酵物には、コラーゲンドリンクに使用する際に乳酸菌発酵物（Ａ）を使用したものと大豆ペプチド量を揃えるために、大豆ペプチド：ハイニュートＡＭを５％添加して、乳酸菌発酵物（Ｃ）として使用した。このとき、ＤＡＰＩ染色で乳酸菌数を確認し、乳酸菌発酵物（Ａ）と乳酸菌発酵物（Ｃ）に含まれる乳酸菌数が同程度であることを確認した。

（８）乳酸菌発酵物高用量コラーゲンドリンクの製造
豚コラーゲンペプチド５ｇ、グラニュー糖６ｇ、ｐＨと風味を整えるためのクエン酸および香料を添加したコラーゲンドリンク（×３）に、それぞれ、（２）で得られた乳酸菌接種前の乳酸菌発酵用培地、乳酸菌発酵物（Ａ）、または、（７）で得られた乳酸菌発酵物（Ｃ）を２０ｇ加え、総量５０ｇとなるように水を添加して混合した。混合後は瓶詰めして８５℃で１０分間加熱処理して冷却した。ここで、乳酸菌発酵用培地を添加したものを比較例３、乳酸菌発酵物（Ａ）を添加したものを実施例４、乳酸菌発酵物（Ｃ）を添加したものを比較例４とする。

各実施例と、各実施例のコラーゲンドリンク中のコラーゲンペプチドの量及び発酵物等の内容と量を以下の表に示す。

（II）ヒトにおけるコラーゲンペプチドの吸収促進試験
健康な２０～４０歳の男女５名を被験者とした。試験前日、５名の被験者には試験開始の１２時間前から絶食させ、水以外は摂取させない。試験当日、０時間目の血液を採取した後、（５）で作成した比較例１のコラーゲンドリンクを飲ませ、１、２、４時間後に血液を採取した。

採取した血液を遠心分離して血漿を得た。次いで、血漿をエタノールで除タンパクした。除タンパクした血漿を、試料１、試料２及び試料３に３分割した。試料１は１１０℃２０分間ＨＣｌで加水分解し、ＰＩＴＣ処理後、ＨＰＬＣで分析し、全Ｈｙｐ量を算出した。試料２は、加水分解せずにＰＩＴＣ誘導体化処理をした後、ＨＰＬＣで分析し、遊離Ｈｙｐ量を算出した。次いで、全Ｈｙｐから遊離Ｈｙｐを引いて、血中に移行したペプチド型Ｈｙｐ量を算出した。さらに、試料３は、ＡｃｃＱ誘導体化処理後にＬＣ－ＭＳで分析し、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙを測定した。

同一の被験者で実施例１および実施例２のコラーゲンドリンクについて同様に試験した。コラーゲンドリンク摂取後１、２、４時間後に血液を採取し、上記の通り全Ｈｙｐ量、遊離Ｈｙｐ量を測定して、ペプチド型Ｈｙｐ量を算出した。また、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙも測定した。なお、比較例１の試験および実施例１の各試験終了後、次の試験までにそれぞれ１週間以上のウォッシュアウト期間を設けた。

図１は、経過時間（経過時間０時間＝コラーゲンドリンク摂取時）に対する５名の被験者の血漿中のペプチド型Ｈｙｐ量の平均値をプロットしたグラフである。図２は、経過時間（経過時間０時間＝コラーゲンドリンク摂取時）に対する５名の被験者の血漿中のＰｒｏ－Ｈｙｐ量の平均値をプロットしたグラフである。図３は、経過時間（経過時間０時間＝コラーゲンドリンク摂取時）に対する５名の被験者の血漿中のＨｙｐ－Ｇｌｙ量の平均値をプロットしたグラフである。

図１のグラフによると、経過時間２時間程度までの間で、実施例１及び実施例２のペプチド型Ｈｙｐ量は共に、比較例１のペプチド型Ｈｙｐ量に対して多かった。Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差法によると、比較例１と実施例２の間（＊で示す）でｐ＜０．０５であったことから、実施例２のコラーゲンペプチド吸収量は、比較例１のものより有意に高かったことが確認された。

図２のグラフにおいて、経過時間２時間程度までの間で、実施例１及び実施例２のＰｒｏ－Ｈｙｐ量は共に、比較例１のＰｒｏ－Ｈｙｐ量に対して多かった。
図３のグラフにおいて、経過時間２時間程度までの間で、実施例１及び実施例２のＨｙｐ－Ｇｌｙ量は共に、比較例１のＨｙｐ－Ｇｌｙ量に対して多かった。Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差法によると、実施例１と実施例２間（＊で示す）で、ｐ＜０．０５であり、比較例１と実施例２間（＊で示す）でｐ＜０．０１であった。すなわち、実施例１に比べて実施例２のＨｙｐ－Ｇｌｙ量が有意に多く、また、比較例１に比べて実施例２のＨｙｐ－Ｇｌｙ量が有意に多いことが確認された。

すなわち、図１～３によれば、比較例１と実施例１を比較すると、実施例１でペプチド型Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙの量が比較例１よりも多かった。すなわち、実施例１のコラーゲンペプチドドリンクに含有される大豆ペプチド乳酸菌発酵物または乳酸菌自体によって、コラーゲンペプチドの吸収が促進されていることが示唆された。

また、比較例１と実施例２を比較すると、ペプチド型Ｈｙｐ、Ｐｒｏ－Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙが多く検出され、特にペプチド型Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙで有意に多く検出された。そして、実施例１と実施例２を比較すると、実施例２でペプチド型Ｈｙｐ、Ｈｙｐ－Ｇｌｙが多く、特にＨｙｐ－Ｇｌｙは有意に多く検出された。このことは、すなわち、乳酸菌除去発酵物（Ｂ）を用いて製造された実施例２のコラーゲンドリンクで、乳酸菌を除去していない乳酸菌発酵物（Ａ）と同等またはそれ以上、コラーゲンペプチドの吸収促進が見られたことを示している。従って、本発酵液のコラーゲンペプチドの吸収促進効果は、乳酸菌自体というよりむしろ、大豆ペプチドを乳酸菌で発酵させた生産物が主に働いていることが示唆された。すなわち、乳酸菌自体の効果の有無に関わらず、大豆ペプチドを乳酸菌で発酵させた生産物の効果が大きいことが示唆された。

（III）ヒトによる肌状態の官能試験（並行群間）
健康な２０～６０代男女３１人を年代と性別が偏らないように１６人（第１群）と１５人（第２群）の２群に分け、第１群の被験者には比較例２、第２群の被験者には実施例３のコラーゲンドリンクをブラインドで提供した。飲用前観察期間５日間及び飲用期間５日間の計１０日間、試験を行った。飲用期間５日間はコラーゲンドリンクを１日１本飲用させた。

試験期間中、被験者は、毎日鏡を見ながら肌を自分自身で触診して、毎日の肌の全体的な状態、乾燥、弾力について、飲用前観察期間と飲用期間の連続１０日間、５段階で自己評価した。評価は、下記の評価基準に従って行った。
＜肌状態の評価＞
・全体的な状態
１点：肌の調子が悪いと感じる
３点：どちらでもない
５点：肌の調子が良いと感じる
として、１～５点で５段階評価した。
・乾燥について
１点：乾燥していると感じる
３点：どちらでもない
５点：潤っていると感じる
として、１～５点で５段階評価した。
・弾力について
１点：固くこわばっている
３点：どちらでもない
５点：もっちり柔らかい
として、１～５点で５段階評価した。

表２は、肌の状態についての評価結果を平均値±標準偏差で示したものである。また、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ符号付順位和検定により、飲用前観察期間の結果に対する飲用期間と飲用後観察期間の結果に有意差があるかを確認するためにｐ値を計算した。

比較例２摂取群、実施例３摂取群のどちらも、コラーゲンペプチドを飲用しているため、飲用前観察期間と比較して、飲用期間のスコアが高い傾向にあったが、比較例２飲用群の結果は、全てｐ＞０．０５であってｐが０．０５よりかなり大きく、有意差がなかった。一方、実施例３飲用群は、肌の全体的な状態、乾燥についてｐ＝０．０７で有意傾向であり、特に弾力についてはｐ＜０．０５であったことから、有意に改善されていた。実施例３飲用群が、飲用前の状態と比較して、飲用期間中に肌の全体的な状態、乾燥、弾力の全てにおいて、比較例２飲用群よりも改善されたことが分かった。

さらに、実施例３摂取群、比較例２摂取群の肌の全体的な状態、乾燥、弾力について、各個人の飲用前観察期間５日間の評価の平均値を計算し、飲用期間５日間の各日の評価の値との差を求め、その値の各群の平均値をプロットしたものを図４～６に示した。飲用期間５日間のうち、早ければ２日目から、遅くとも３日目から、実施例３摂取群において、比較例２摂取群よりも明らかな肌状態の改善効果が見られた。

以上より、従来コラーゲンペプチドの吸収が確認されていた量の半量（コラーゲンペプチド５ｇ）までコラーゲンペプチドの量を減らしても、コラーゲンペプチドの効果、すなわち被験者の肌状態の改善が見られることが分かった。また、飲用期間の初期から、被験者が実感できるような肌状態の改善が見られることが分かった。このことは、消費者が継続的に本発明の肌状態改善組成物を飲用しようとする意欲をもたらす点で、商業的にも重要である。

（IV）ヒトによる肌状態の官能試験（同一群間）
健康な３０～４０代男女３人で、乳酸菌発酵物高用量コラーゲンドリンクについて、同一群間の官能試験を実施した。試験期間は、飲用前観察期間１日間及び飲用期間５日間の計６日間とし、飲用期間５日間はコラーゲンドリンクを１日１本飲用させた。試験期間中、被験者は、毎日鏡を見ながら肌を自分自身で触診して、毎日の肌の全体的な状態、乾燥、弾力について、飲用前観察期間と飲用期間の連続６日間、５段階で自己評価した。評価は、（III）に記載された評価基準に従って行った。

試験は、同一の被験者群で、最初に比較例３を、次に実施例４および比較例４のコラーゲンドリンクを使用して行った。比較例３及び実施例４の試験終了後は、次の試験までに１週間以上のウォッシュアウト期間を設けた。

比較例３、実施例４、比較例４摂取群の肌の全体的な状態、乾燥、弾力について、各個人の飲用前観察期間１日間の値と、飲用期間５日間の各日の評価の値との差を求め、その差の各群の平均値をプロットしたものを図７～９に示した。飲用期間５日間のうち、実施例４摂取群において、４日目から比較例３、４摂取群よりも明らかな肌状態の改善効果が見られた。比較例３と実施例４の結果から、乳酸菌発酵物高用量コラーゲンドリンクにおいても、大豆ペプチド乳酸菌発酵物の肌状態改善効果が確認された。また、比較例４と実施例４の結果から、大豆ペプチド非含有培地での乳酸菌発酵物では効果がないこと、未発酵の大豆ペプチドでは効果がないこと、すなわち肌状態の改善は、「大豆ペプチドを乳酸菌で発酵させた生成物」の効果によるものであることが示された。さらに言えば、比較例４も実施例４も何れも乳酸菌の菌体を含むが、比較例４では実施例４のような効果が見られなかったことから、肌状態の改善効果は、乳酸菌の菌体ではなく大豆ペプチド乳酸菌発酵物の効果によるものであることが示唆された。

Claims

大豆ペプチド乳酸菌発酵物を含有する組成物を使用した、コラーゲンペプチド吸収を促進する美容上の方法（但し、ヒトに対する医療行為（診療、治療、予防又は健康状態を維持するための処置を含む）を除く。）。
請求項１記載の方法において、当該組成物を、コラーゲンペプチドまたはコラーゲンペプチド含有組成物と一緒に、同時に、または、その摂取前もしくは摂取後に、摂取するために使用することによって行われる、請求項１に記載のコラーゲンペプチド吸収を促進する美容上の方法（但し、ヒトに対する医療行為（診療、治療、予防又は健康状態を維持するための処置を含む）を除く。）。
２０重量％～４０重量％の大豆ペプチド乳酸菌発酵物および１０重量％～４０重量％のコラーゲンペプチドを含有し、前記大豆ペプチド乳酸菌発酵物が、７０％以上の乳酸菌を除去したものである、肌状態改善組成物。
２０重量％～４０重量％の大豆ペプチド乳酸菌発酵物および１０重量％～４０重量％のコラーゲンペプチドを含有し、大豆ペプチド乳酸菌発酵物とコラーゲンペプチドを混合することによって製造される、肌状態改善組成物の製造方法。