JP7724292B2 - ペンタフルオロフェニルエステルを含む高分子およびそれを含む電気化学的バイオセンサ - Google Patents

ペンタフルオロフェニルエステルを含む高分子およびそれを含む電気化学的バイオセンサ

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Description

［関連出願との相互引用］
本出願は２０２０年１２月３１日付韓国特許出願第１０－２０２０－０１８９１４０号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本発明は電子伝達メディエータおよび酸化還元酵素を電気化学的バイオセンサのような装置中の電極表面に固定させるために有用なペンタフルオロフェニルエステルを含む高分子およびそれを含む電気化学的バイオセンサに関する。
糖尿病は高い血糖数値が長い間持続した時現れる疾患として心血管疾患、脳卒中、腎臓疾患などの合併症を誘発する。高い血糖数値に対応してインシュリン注入により血糖数値を減少させる過程が必要であるが、もし、インシュリンが過多注入されると、低血糖症が発生してこれによりショックまたは死亡に至る場合もある。これを防止するために糖尿病患者は適切な血糖数値を維持する目的で血糖測定センサを用いて持続的に体内血糖濃度を測定することが必須である。
最近では、持続血糖測定システム（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ＣＧＭＳ）が適用された血糖センサが多く研究されて商用化されている。ＣＧＭＳセンサは皮下組織に挿入されて血液でない細胞間液を通して連続してブドウ糖の濃度を測定する装置である。指採血方式の場合は一日に５～６回の血糖測定では正確な血糖数値変化を確認することが難しいことに対して、ＣＧＭＳは一日に血糖数値変化と傾向性を確認できる長所がある。これにより患者が高血糖症または低血糖症を早く認知することができ、血糖管理能力をより改善することができる。
バイオセンサは選択的に生体試料を感知し、これを特定の信号に切り替える機器を意味する。特に電気化学的方式を用いた酵素系のバイオセンサは酵素によって選択性が向上するだけでなく小型化が可能であり、測定の正確性を有することから多く好まれる。電気化学方式を用いた血糖バイオセンサは大きく１世代と２世代方式に分けられる。１世代血糖センサはクラーク（Ｃｌａｒｋ）とリヨン（Ｌｙｏｎ）により初めて開発され、酵素の酸化－還元反応を経て減少した酸素濃度および発生した過酸化水素の濃度変化により血糖数値を測定する方式であり、２世代血糖センサは酵素の酸化－還元反応により発生した電子を電子伝達メディエータにより電極に伝達する方式である。２世代センサは１世代センサより酸素濃度による誤差が少なく、媒介体による電子伝達反応が効率的でかつ早いという点で多くの長所を有している。このような理由から、電子伝達メディエータを含む２世代センサ方式がＣＧＭＳ血糖センサに適用されている。
電気化学方式の酵素系の血糖バイオセンサは一般的に酵素、電子伝達メディエータ、電極で構成されている。最初は酵素によってブドウ糖がグルコノラクトン（ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）に酸化され、次に還元された酵素は酸化されて電子伝達メディエータに電子を供与する。その次に還元された媒介体が酸化されて電極に電子を伝達する過程を経る。このような一連の過程から血糖数値を電気的信号により確認することができる。
血糖センサを製作するにあたって電極表面に電子伝達メディエータと酵素を固定する方法は非常に重要である。これまでは電子伝達メディエータを含む酸化－還元水和高分子を酵素と混ぜて架橋剤を添加して電極に固定させる方法が研究されてきた。中でもポリビニルピリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ）とポリビニルイミダゾール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）が酸化－還元高分子マトリックスとして良く知られている。しかし、このような既存の酸化－還元高分子は下記反応式１で見るように、最終材料の合成段階が長く複雑であり、遷移金属錯体の低い固定化効率を示すだけでなく、高分子に他の機能性の導入が難しいという問題を有していた。したがって、現在までも優れた性能の酸化－還元高分子の開発のために既存材料の限界を超える新しい素材の開発が求められている実情である。
このような背景下で、本発明者らは電気化学的バイオセンサのための電子伝達メディエータおよび酵素を固定するのに有用な高分子に対して研究を重ねた結果、ペンタフルオロフェニル（Ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ，ＰＦＰ）エステルを含む高分子を使用する場合、アミン官能基との高い反応性を有し、加水分解が起こりにくく、有機溶媒に汎用的に良い溶解度を有するだけでなく類似構造を有する高分子と比較する時立体障害と毒性が少ないことを確認して特に持続血糖モニタリングセンサのように人体内にセンサの一部が入る挿入型装置に有用であることを確認して本発明を完成した。
本発明の目的はペンタフルオロフェニルエステルを含む酸化－還元高分子材料製造用重合体を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、前記遷移金属錯体および前記酸化－還元高分子材料製造用重合体を含む酸化－還元高分子材料薄膜および電気化学的バイオセンサを提供することにある。
前記のような目的を解決するための一つの様態として、本発明はペンタフルオロフェニルエステルを含む酸化－還元高分子材料製造用重合体、前記重合体および遷移金属錯体を含む電気化学的バイオセンサ用酸化－還元高分子、これから製造された電気化学的バイオセンサ用酸化－還元高分子を含む酸化－還元高分子材料薄膜およびそれを含む電気化学的バイオセンサ、例えば血糖センサに関する。
本発明によるポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体は電気化学的センサに用いる場合、アミン官能基との高い反応性を有し、加水分解が起こりにくく、有機溶媒に対する高い溶解度を有し、立体障害および毒性や副作用の問題が低く、特に持続血糖モニタリングセンサのように人体内にセンサの一部が入る挿入型装置に有用である。
本発明によるＰＦＰＡ高分子Ｐ１にオスミウム錯体２２を添加した後１９Ｆ ＮＭＲによる反応モニタリング結果を示すグラフである。 ＰＦＰＡ高分子（３６）とオスミウム錯体（２２，３３）の最終反応が行われた時の１９Ｆ ＮＭＲ、そしてこれに基づいて予想した酸化－還元高分子（３７，３８）の比率を確認したグラフである。 ＰＦＰＡ高分子（３６）とオスミウム錯体（２２，３３）の最終反応が行われた時の１９Ｆ ＮＭＲ、そしてこれに基づいて予想した酸化－還元高分子（３７，３８）の比率を確認したグラフである。 実施例１－４のＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子の合成を確認した１９Ｆ ＮＭＲデータである。 実施例１－５のＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子の合成を確認した１９Ｆ ＮＭＲデータである。 酸化－還元重合体および酵素の組成とＳＰＣＥｓ電極表面上の架橋方法の模式図である。 本発明による酸化－還元高分子（３７および３８）を２００秒ごとにブドウ糖濃度を０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４、１００ｍＭに増加させた時に現れた電流の変化（上）、ブドウ糖濃度に応じた電流の変化（下）、低濃度区間（０～１ｍＭ）（左）、全体区間（０～１００ｍＭ）（右）を示すグラフである。 本発明による酸化－還元高分子（Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１）を２００秒ごとにブドウ糖濃度を０．０１、０．０５、０．１、０．５ｍＭに増加させた時に現れた電流の変化（上－左側）、ブドウ糖濃度に応じた電流の変化（上－右側）および２００秒ごとにブドウ糖濃度を０、１、５、１０、５０、１００ｍＭに増加させた時現れた電流の変化（下－左側）、ブドウ糖濃度に応じた電流の変化（下－右側）を示すグラフである。 本発明による酸化－還元高分子（Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１）を２００秒ごとにブドウ糖濃度を０．０１、０．０５、０．１、０．５ｍＭに増加させた時に現れた電流の変化（上－左側）、ブドウ糖濃度に応じた電流の変化（上－右側）および２００秒ごとにブドウ糖濃度を０、１、５、１０、５０、１００ｍＭに増加させた時に現れた電流の変化（下－左側）、ブドウ糖濃度に応じた電流の変化（下－右側）を示すグラフである。 本発明による酸化－還元高分子（３７、３８およびＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１および２）の循環電圧電流試験前後の電流変化を測定した結果を示すグラフである。図７ａにおけるＣＶは電極完成直後に測定したものを示し、ａｆｔｅｒ ＣＶはＰＢＳ溶液内で１時間攪拌した後測定した値を示す。 本発明による酸化－還元高分子（３７、３８およびＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１および２）の循環電圧電流試験前後の電流変化を測定した結果を示すグラフである。図７ｂにおけるＣＶは電極完成直後に測定したものを示し、ａｆｔｅｒ ＣＶはＰＢＳ溶液内で１時間攪拌した後測定した値を示す。 本発明による酸化－還元高分子（３７、３８およびＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１および２）の循環電圧電流試験前後の電流変化を測定した結果を示すグラフである。図７ｃにおけるＣＶは電極完成直後に測定したものを示し、ａｆｔｅｒ ＣＶはＰＢＳ溶液内で１時間攪拌した後測定した値を示す。 本発明による酸化－還元高分子（３７、３８およびＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元高分子１および２）の循環電圧電流試験前後の電流変化を測定した結果を示すグラフである。図７ｄにおけるＣＶは電極完成直後に測定したものを示し、ａｆｔｅｒ ＣＶはＰＢＳ溶液内で１時間攪拌した後測定した値を示す。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明による酸化－還元高分子材料製造用重合体は、ポリペンタフルオロフェニルエステルに基づくものであり、具体的にはペンタフルオロフェニルエステルに由来する繰り返し単位を含む、酸化－還元高分子材料の高分子前駆体として使用される。好ましくは、前記重合体はアミン基を含む反応基を有する架橋物質および遷移金属錯体とともに電子伝達メディエータ用酸化－還元高分子材料を形成することができる。
一実施例として、本発明による酸化－還元高分子材料製造用重合体は、前記ポリペンタフルオロフェニルエステルに、アミン基を含む架橋物質として１次および２次アミン系化合物を使用してアミノリシス（アミノ分解、ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ）により導入することを特徴とする、酸化－還元高分子材料製造用重合体であり得る。
前記酸化－還元高分子材料用重合体の非制限的な例としては、ポリペンタフルオロフェニルアクリレート（ＰＰＦＰＡ）単一重合体、ポリペンタフルオロフェニルメタクリレート（ＰＰＦＰＭ）単一重合体、ポリペンタフルオロフェニルアクリレート－ポリジメチルアクリルアミド（ＰＰＦＰＡ－ＰＤＭＡ）共重合体、ポリペンタフルオロフェニルメタクリレート－ポリジメチルアクリルアミド（ＰＰＦＰＭ－ＰＤＭＡ）共重合体、ポリペンタフルオロフェニルアクリレート－ポリアクリルアミド（ＰＰＦＰＡ－ＰＡＡ）共重合体およびポリペンタフルオロフェニルメタクリレート－ポリアクリルアミド（ＰＰＦＰＭ－ＰＡＡ）共重合体からなる群より選ばれる１種以上の重合体であり得るが、これに限定されるものではない。
一実施例で、本発明による酸化－還元高分子材料製造用重合体は下記化学式１または２の構造を有するものであり得る：
［化学式１］
［化学式２］
前記化学式１または２において、
ＲＴおよびＲＬはそれぞれ独立して置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数１～２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数３～３０のエチレングリコール基、置換または非置換の炭素数６～３０のアリーレン基、置換または非置換の炭素数３～３０のヘテロアリーレン基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルケニル基および置換または非置換の炭素数２～４０のアルキニル基からなる群より選ばれ；
前記ｎは１０～３００の整数である。
本発明における「置換」は本発明で特に言及しない限り、少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子（例えばＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ）、シアノ基、ヒドロキシル基、チオール基、ニトロ基、アミノ基、イミノ基、アジド基、アミジノ基、ヒドラジノ基、ヒドラゾノ基、オキソ基、カルボニル基、カルバミル基、エステル基、エーテル基、カルボキシル基またはその塩、スルホン酸基またはその塩、リン酸やその塩、炭素数１～６のアルキル基、炭素数１～６のハロアルキル基、炭素数２～６のアルケニル基、炭素数２～６のハロアルケニル基、炭素数２～６のアルキニル基、炭素数２～６のハロアルキニル基、炭素数１～６のアルコキシ基、炭素数１～６のハロアルコキシ基、炭素数１～６のアルキルチオ基、１～９の炭素環員を有するヘテロシクロアルキル基、１～９の炭素環員を有するヘテロシクロアルキル基、炭素数６～１０のアリール基、炭素数６～１０のアリールオキシ基、炭素数６～１０のアリールチオ基、１～９の炭素環員を有するヘテロアルキル基、１～９の炭素環員を有するヘテロアリールオキシ基および炭素数１～９の炭素環員を有するヘテロアリールチオ基からなる群より選ばれる１種～３種であり得る。
好ましくは、前記ＲＴおよびＲＬはそれぞれ独立して分子量１，０００ｇ／ｍｏｌ～５０，０００ｇ／ｍｏｌのポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩ）、ポリビニルピリジン（ＰＶＰ）およびポリシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる群より選ばれるものであり得る。
一例として本発明による酸化－還元高分子材料製造用重合体は、１，０００ｇ／ｍｏｌ～５００，０００ｇ／ｍｏｌ範囲の重量平均分子量を有することができるが、これに制限されるものではない。
また他の様態として、本発明は前記ポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体に遷移金属錯体が導入された電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料に関するものである。
例えば、このような酸化－還元高分子材料は前記ポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体をアミン基、アンモニウム基、ハロゲン基、エポキシ基、アジド基、アクリレート基、アルケニル基、アルキニル基、チオール基、イソシアネート、アルコール基、およびシラン基からなる群より選ばれる機能基を含む化合物を導入して機能化させ、このように機能化された重合体に遷移金属錯体を結合させて製造することもできる。
また、前記酸化－還元高分子材料は前記ポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体を機能化させる代わりに、遷移金属錯体のリガンドに置換反応および添加反応によりアミン基、アンモニウム基、チオール基、アルコール基などの前記架橋物質のような機能基を導入して機能化させて、このように機能化された遷移金属錯体と前記本発明による重合体を結合させて製造することもできる。
または前記高分子材料はポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体および遷移金属錯体をすべてアミン基、アンモニウム基、ハロゲン基、エポキシ基、アジド基、アクリレート基、アルケニル基、アルキニル基、チオール基、イソシアネート、アルコール基、およびシラン基からなる群より選ばれる機能基を含む架橋物質を使用して機能化させて互いに結合させて製造することもできる。
好ましくは、本発明による酸化－還元高分子材料は前記ポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体に１次および２次アミン基およびアンモニウム基からなる群より選ばれる機能基および遷移金属錯体が結合されたものであり得る。
具体的には、前記遷移金属錯体は下記化学式３または４の構造を有するものであり得る。
［化学式３］
［化学式４］
前記化学式３または４において、
ＭはＯｓ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、ＦｅおよびＣｏからなる群より選ばれる１種の遷移金属であり；
前記化学式３において、ＬＧ１およびＬＧ２は互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；
ＬＧ３およびＬＧ４は互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；ＬＧ５およびＬＧ６はそれぞれ互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；
［化学式５］
［化学式６］
前記化学式５において、ＬＣは窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、好ましくは２位でベンゼンの化学式と連結され得、
前記化学式６において、ＬＮは窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、好ましくはＬＮ１とＬＮ２はそれぞれ２位で互いに連結されている。
ＲＬはヘテロ環化合物ＬＣ、ＬＮ１およびＬＮ２のすべての官能基である。
一様態で、前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲＬはそれぞれ独立して置換または非置換の炭素数１～１０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２～２０のエチレングリコール基置換または非置換の炭素数１～２０のアルコール基、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキルハロゲン基、置換または非置換の炭素数１～２０のチオール基、置換または非置換の炭素数３～２０のアルキルアジド基、置換または非置換の炭素数７～３０のアリールアジド基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルキニル基、シアノ基、ハロゲン基、重水素および水素からなる群より選ばれるものである。
一様態で、前記化学式４のＬＨ１、ＬＨ３およびＬＨ４はＬＨ２を中心に互いに合わさって下記化学式７で表される四座配位子を形成することができる。
この時、ＬＨ５およびＬＨ６はそれぞれ化学式８で表されるように遷移金属Ｍに対する単座配位子を形成するか；ＬＨ５およびＬＨ６はそれぞれ互いに合わさって下記化学式９で表されるように遷移金属Ｍに対する二座配位子を形成し；
［化学式７］
前記化学式７において、Ｃａ、ＣｂおよびＣｃはそれぞれ独立して窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、好ましくは、前記ヘテロ環化合物はその２位でメチルアミンと連結され得、前記３個のヘテロ環が有する３個の窒素と、前記３個のヘテロ環を互いに連結する中心の１個の窒素が遷移金属Ｍと連結されることができる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３はヘテロ環化合物Ｃａ、Ｃｂ、Ｃｃのすべての官能基を意味する。
一様態で、前記Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して置換または非置換の炭素数１～１０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２～２０のエチレングリコール基置換または非置換の炭素数１～２０のアルコール基、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキルハロゲン基、置換または非置換の炭素数１～２０のチオール基、置換または非置換の炭素数３～２０のアルキルアジド基、置換または非置換の炭素数７～３０のアリールアジド基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルキニル基、シアノ基、ハロゲン基、重水素および水素からなる群より選ばれることができる。好ましくはそれぞれ独立して高分子に連結できる反応基が導入されることができる。
［化学式８］
［化学式９］
前記化学式８において、
ＬＨ５およびＬＨ６はそれぞれ単座配位子であり、それぞれ独立して－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ２、－ＮＣＣＨ３、－ＣＯ、－ＯＨ２、－ＮＨ３または窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり得る。
前記化学式９において、
ＬＨ５－ＬＨ６は二座配位子であり、カテコール、アセチルアセトン、２－ピコリン酸、２－ピリジンカルボキサミド、２，２－ビピリジンまたは２，２－ビチアゾールであり得る。
前記Ｌ１は独立して置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数１～２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数２～３０のエチレングリコール基、置換または非置換の炭素数６～３０のアリーレン基、および置換または非置換の炭素数３～３０のヘテロアリーレン基からなる群より選ばれ；
前記Ａａはアミン基およびアンモニウム基からなる群より選ばれる。
本発明の一様態は前記重合体を含む酸化－還元重合体材料を電極にコートした後、コートされた電極を硬化させる段階を含む、酸化－還元高分子材料薄膜の製造方法およびこれによって製造された酸化－還元高分子材料薄膜およびそれを含む電気化学的バイオセンサに関するものである。
また、本発明の追加一様態は、液体性生体試料を酸化還元させ得る酵素と前記遷移金属錯体を含む電子伝達メディエータを含む電気化学的バイオセンサ用センシング膜に関するものである。
酸化還元酵素は生体の酸化還元反応を触媒する酵素を総称するものであり、本発明では測定しようとする対象物質、例えばバイオセンサの場合は測定しようとする対象物質と反応して還元される酵素を意味する。このように還元された酵素は電子伝達メディエータと反応し、この時発生した電流変化などの信号を測定して対象物質を定量する。本発明に使用可能な酸化還元酵素は、各種脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、エステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）等からなる群より選ばれた１種以上のものであり得、酸化還元または検出対象物質によって、前記酵素群に属する酵素の中で前記対象物質を基質とする酵素を選択して使用することができる。
より具体的には、前記酸化還元酵素は、グルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルタミン酸脱水素酵素（ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、グルコース酸化酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロール酸化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、コレステロールエステル化酵素（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ）、乳酸酸化酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ）、アスコルビン酸酸化酵素（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール酸化酵素（ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ）、アルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、ビリルビン酸化酵素（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｏｘｉｄａｓｅ）等からなる群より選ばれた１種以上であり得る。
一方、前記酸化還元酵素は測定しようとする対象物質（例えば、対象物質）から酸化還元酵素が奪い取った水素を保管する役割をする補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）を共に含み得るが、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ）、ピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ，ＰＱＱ）等からなる群より選ばれた１種以上であり得る。
例えば、血中のグルコース濃度を測定しようとする場合、前記酸化還元酵素としてグルコース脱水素酵素（ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＤＨ）を使用でき、前記グルコース脱水素酵素は補助因子としてＦＡＤを含むフラビンアデニンジヌクレオチド－グルコース脱水素酵素（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＦＡＤ－ＧＤＨ）、および／または補助因子としてＦＡＤ－ＧＤＨを含むニコチンアミドアデニンジヌクレオチド－グルコース脱水素酵素（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であり得る。
具体例で、前記使用可能な酸化還元酵素はＦＡＤ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ １．１．９９．１０等）、ＮＡＤ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ １．１．１．４７等）、ＰＱＱ－ＧＤＨ（例えば、ＥＣ１．１．５．２等）、グルタミン酸脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．４．１．２等）、グルコース酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．４等）、コレステロール酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．６等）、コレステロールエステル化酵素（例えば、ＥＣ ３．１．１．１３等）、乳酸酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．２等）、アスコルビン酸酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１０．３．３等）、アルコール酸化酵素（例えば、ＥＣ １．１．３．１３等）、アルコール脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．１．１．１等）、ビリルビン酸化酵素（例えば、ＥＣ １．３．３．５等）等からなる群より選ばれた１種以上であり得る。
最も好ましくは、前記酸化還元酵素は３７℃緩衝液で１週間７０％以上の活性度を維持できるグルコース脱水素酵素である。
本発明によるセンシング膜は酸化還元酵素１００重量部を基準として酸化－還元重合体２０～７００重量部、例えば６０～７００重量部または３０～３４０重量部を含有することができる。前記酸化－還元重合体の含有量は酸化還元酵素の活性度に応じて適宜調節することができる。
さらに、本発明によるセンシング膜は膜性能を高めるためにカーボンナノチューブをさらに含むことができる。具体的には、カーボンナノチューブは遷移金属錯体、特にオスミウムと共に使用時に電子伝達速度が増加してセンシング膜の性能をより高めることができる。
また、本発明によるセンシング膜は架橋剤をさらに含むことができる。
一方、本発明によるセンシング膜は界面活性剤、水溶性高分子、４次アンモニウム塩、脂肪酸、粘増剤などからなる群より選ばれた１種以上の添加剤を試薬溶解時の分散剤、試薬製造時の粘着剤、長期保管の安定剤などの役割のために追加で含むことができる。
前記界面活性剤は組成物を分注する時組成物が電極上でまんべんなく広がって均一な厚さで分注されるようにする役割をするものであり得る。前記界面活性剤としてトリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）、パーフルオロオクタンスルホネート（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｏｃｔａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ソジウムステアレート（ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒａｔｅ）等からなる群より選ばれた１種以上を使用することができる。本発明による試薬組成物は、試薬を分注する時試薬が電極上でまんべんなく広がって試薬が均一な厚さで分注されるようにする役割を適切に行うようにするために、前記界面活性剤を酸化還元酵素１００重量部を基準として３～２５重量部、例えば１０～２５重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として界面活性剤１０～２５重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、界面活性剤の含有量をこれより低く調節することができる。
前記水溶性高分子は試薬組成物の高分子支持体として酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割をするものであり得る。前記水溶性高分子としてはポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ；ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ；ＰＶＡ）、ポリフルオロスルホネート（ｐｏｌｙｐｅｒｆｌｕｏｒｏ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、ヒドロキシエチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＨＰＣ）、カルボキシメチルセルロース（ｃａｒｂｏｘｙ ｍｅｔｈｙｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＣＭＣ）、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ）、ポリアミド（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ）等からなる群より選ばれた１種以上を使用することができる。本発明による試薬組成物は、酸化還元酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を十分かつ適切に発揮するようにするために、前記水溶性高分子を酸化還元酵素１００重量部を基準として１０～７０重量部、例えば３０～７０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として水溶性高分子３０～７０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、水溶性高分子の含有量をこれより低く調節することができる。
前記水溶性高分子は支持体および酵素の安定化および分散（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ）を助ける役割を効果的に行うために重量平均分子量が２，５００ｇ／ｍｏｌ～３，０００，０００ｇ／ｍｏｌ程度、例えば、５，０００ｇ／ｍｏｌ～１，０００，０００ｇ／ｍｏｌ程度であり得る。
前記粘増剤は試薬を電極に堅固に付着するようにする役割をする。前記粘増剤としてはナトロゾール、ジエチルアミノエチル－デキストランヒドロクロリド（ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）等からなる群より選ばれた１種以上を使用することができる。本発明による電気化学的センサは、本発明による酸化－還元重合体が電極に堅固に付着するようにするために、前記粘増剤を酸化還元酵素１００重量部を基準として１０～９０重量部、例えば３０～９０重量部の量で含有することができる。例えば、活性度が７００Ｕ／ｍｇである酸化還元酵素を使用する場合、酸化還元酵素１００重量部を基準として粘増剤３０～９０重量部を含有することができ、酸化還元酵素の活性度がこれより高くなると、粘増剤の含有量をこれより低く調節することができる。
また他の様態として、本発明はこのような有機電子伝達メディエータを含む装置、好ましくは、挿入可能な装置、例えば人体内に挿入可能な装置であり得る。また好ましくは、前記装置は電気化学的バイオセンサであり得、より好ましくは電気化学的グルコース（血糖）センサであり得る。
具体的には、前記電気化学的バイオセンサの種類には制限がないが、好ましくは持続血糖モニタリングセンサであり得る。
このような持続血糖モニタリングセンサの構成として、本発明は、例えば電極、絶縁体（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、基板、前記酸化－還元重合体および酸化還元酵素を含むセンシング膜（ｓｅｎｓｉｎｇ ｌａｙｅｒ）、拡散膜（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｌａｙｅｒ）、保護膜（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｌａｙｅｒ）等を含むことができる。電極の場合、作動電極および対向電極のような２種の電極を含むこともでき、作動電極、対向電極および基準電極のような３種の電極を含むこともできる。一実施形態で、本発明によるバイオセンサは、少なくとも二つ、好ましくは二つまたは三つの電極を備えた基板に、前記化学式１の有機系電子伝達メディエータを含む酸化－還元重合体と液体性生体試料を酸化還元させ得る酵素を含む試薬組成物を塗布した後乾燥して製作した電気化学的バイオセンサであり得る。例えば、電気化学的バイオセンサにおいて作動電極および対向電極が基板の互いに反対面に備えられ、前記作動電極の上に本発明による有機系電子伝達メディエータを有する酸化－還元重合体が含まれるセンシング膜が積層され、作動電極および対向電極が備えられた基板の両側面に順に絶縁体、拡散膜および保護膜が積層されることを特徴とする平面形電気化学的バイオセンサが提供される。
具体的な様態として、前記基板はＰＥＴ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ）、ＰＣ（ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）およびＰＩ（ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）からなる群より選ばれる１種以上の素材からなるものであり得る。
また、作動電極は炭素、金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができる。
また、２電極を有する電気化学的バイオセンサの場合、対向電極が基準電極の役割までともにするので、対向電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、基準電極まで含む３電極の電気化学的バイオセンサの場合、基準電極として金、白金、銀または銀／塩化銀電極を使用することができ、対向電極として炭素電極を使用することができる。
拡散膜としてはＮａｆｉｏｎ、セルロースアセテート（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｃｅｔａｔｅ）、シリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ）を使用することができ、保護膜としてはシリコーンゴム（ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）、ポリウレタン（ｐｏｌｙｕｒｅｔｈａｎｅ）系の共重合体などを使用できるが、これに制限されるものではない。
非制限的な例として、２電極である場合、対向電極が基準電極の役割までともにするので塩化銀または銀が使用され得、３電極の場合、基準電極が塩化銀または銀が使用され、対向電極は炭素電極を使用することができる。
本発明の具体例は電気化学的バイオセンサの適用可能な例としてグルコースを測定するためのバイオセンサを例示しているが、本発明の試薬組成物に含まれる酵素の種類を異にすることによってコレステロール、ラクテート、クレアチニン、過酸化水素、アルコール、アミノ酸、グルタメートのような多様な物質の定量のためのバイオセンサに適用することができる。
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明を例示するだけであり、本発明の内容は下記の実施例によって限定されるものではない。
実験材料
参考例１．試薬および試料
Ａｌｄｒｉｃｈ社とＡｃｒｏｓ社、ＴＣＩ社、Ａｌｆａ ａｅｓａｒ社から商業的に購入した試薬は格別な精製を行わずに使用し、エチレンジアミン、ピリジン、１－メチルイミダゾール、トリエチルアミンの場合には１０ｍＬピペットにベーシックアルミナを満たした後濾して使用した。Daejung社とSamjun社から購入した次のいくつかの溶媒は精製して使用した。無水ジクロロメタンと無水Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドは水素化カルシウムを入れて蒸留して得て、無水アセトニトリルはＰ２Ｏ５を用いて蒸留して得た。ジエチルエーテルはソジウムとベンゾフェノンを使用して蒸留した。分析用薄層クロマトグラフィーはＭｅｒｃｋ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４ｇｌａｓｓ ｐｌａｔｅを使用し、二重の短波長（２５４ｎｍ）／長波長（３６５ｎｍ）ＵＶランプを用いて蛍光を観察した。カラムクロマトグラフィーにはＡｌｄｒｉｃｈ ｂａｓｉｃ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｏｘｉｄｅまたはＡｌｆａ ｎｅｕｔｒａｌ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｏｘｉｄｅを使用した。Ｓｃｒｅｅｎ ｐｒｉｎｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ（ＳＰＣＥｓ）はＺｅｎｓｏｒ社のＳＥ１０２製品を使用した。
参考例２．装備
水素核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）、炭素核磁気共鳴（１３Ｃ ＮＭＲ）およびフッ素核磁気共鳴（１９Ｆ ＮＭＲ）スペクトルはＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ４００（４００ ＭＨｚ ｆｏｒ １Ｈ、ａｎｄ １００ ＭＨｚ ｆｏｒ １３Ｃ） ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて得た。すべての化学的移動はテトラメチルシラン（δ０．００）や重水素化クロロホルム（δ７．２６ ｆｏｒ ＣＤＣｌ３ ｉｎ １Ｈ ＮＭＲ，δ７７．２ ｆｏｒ ＣＤＣｌ３ ｉｎ １３Ｃ ＮＭＲ）、重水素化ジメチルスルホキシド（δ２．５０ ｆｏｒ ＤＭＳＯ ｉｎ １Ｈ ＮＭＲ，δ３９．５２ ｆｏｒ ＤＭＳＯ ｉｎ １３Ｃ ＮＭＲ）、重水素化アセトニトリル（δ１．９４ ｆｏｒ ＣＤ３ＣＮ ｉｎ １Ｈ ＮＭＲ）を基準としてｐｐｍ単位で示した。フッ素核磁気共鳴（１９Ｆ ＮＭＲ）の場合は、重水素化メタノールにトリフルオロトルエン（ＣＦ３－Ａｒ，δ－６９．２７ ｆｏｒ ＣＤ３ＯＤ ｉｎ １９Ｆ ＮＭＲ）を少量添加してこれを基準としてｐｐｍ単位で示した。Ｃｙｃｌｉｃ ｖｏｌｔａｍｍｏｇｒａｍｓ（ＣＶ）の測定はＣＨ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＣＨＩ１０４０Ｃのモデルにより測定した。よく洗浄された直径３ｍｍ炭素ガラス電極を作業電極として用いてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を基準電極として、Ｐｔ電極を相対電極として１０～５０ｍＶ／ｓの走査速度で測定した。質量スペクトルは西江大学校の有機化学研究センターでＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＬＴＱ ＸＬモデルの低分解能の場合はＥＳＩ－Ｉｏｎｔｒａｐ、高分解能の場合はＥＳＩ－ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器により得た。単結晶Ｘ－ｒａｙ回折分析は韓国化学研究院に依頼してＢｒｕｋｅｒ ＳＭＡＲＴ ＡＰＥＸ ＩＩモデルを使用して結晶構造を把握することができた。
実施例１．ＰＦＰＡ高分子マトリックスを用いた酸化－還元高分子の合成
この実験の目的はペンタフルオロフェニルアクリレート（ＰＦＰＡ）系の高分子マトリックスから末端にアミン（－ＮＨ２）基を含む電子伝達メディエータと反応により酸化－還元高分子を合成しようとした。先にＡＩＢＮを使用してペンタフルオロフェニルアクリレート（ＰＦＰＡ）とジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）を５：５の比率でラジカル重合によってＤＭＡ：ＰＦＰＡ高分子（Ｐ１）を合成した。
１－１．Poly(N,N-dimethyl acrylamide-co-pentafluorophenyl acrylate)(P1)の合成
［ＤＭＡ：ＰＦＰＡ高分子の合成］
ガラス培養チューブにＮ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド（１５０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、ペンタフルオロフェニルアクリレート（３６０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）を入れてアセトニトリル（８ｍＬ）を入れて混合溶液を作る。その後、アルゴン気体を１０分間吹き込んでガラス培養チューブの中をアルゴン雰囲気に作った後８０℃で１２時間還流する。反応が終わった後、回転蒸発乾燥器を用いて溶媒を除去し、ＣＨ２Ｃｌ２を入れて混合溶液を作る。ｎ－ヘキサンに混合溶液をゆっくり落として沈殿を得ることを３回繰り返して生成された高分子を精製する。沈殿物を濾してｎ－ヘキサンで洗浄して得た高分子を真空状態で６時間以上乾燥して白色固体形態の生成物Ｐ１を得た。(482 mg, 95%) 1H
NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.81 to 3.34 ppm (br, 7H, -CH- in the
backbone of PPFPA and -N(CH3)2 from PDMA), 2.47 to 2.65
ppm (br, 1H, -CH- in the backbone of PDMA), 1.13 to 2.22 ppm (br, 4H, -CH2-
in the backbone of PDMA and PPFPA), 19F NMR (400 MHz, CDCl3)
δ -152.90 (br, ortho), -157.21 (br, para), -162.15 (br, meta)
合成した高分子はメタノール、アセトニトリル、アセトン、ジクロロメタンでは良い溶解度を示したが、水とジエチルエーテルでは全く溶解しなかった。
１－２．ＰＦＰＡ高分子が電子伝達メディエータとＧＤＨを固定できる高分子マトリックスとして機能できるかどうかの確認
前記実施例１－１で合成した高分子Ｐ１と末端にアミン基を含むオスミウム錯体２２の間の反応進行の有無を確認するために１９Ｆ ＮＭＲにより観察した。
２２番錯体は双性イオンがＣｌ－である形態で反応して錯体と高分子をすべて溶解させ得る重水素化メタノール溶媒下でＮＭＲピークを確認した。また、２２番錯体のアミン基がアンモニウム（－ＮＨ４ ＋）形態で存在する場合、ＰＦＰエステルと反応できないので錯体の当量だけトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加した。結果を図１に示した。図１で確認できるように、最初に１９Ｆ ＮＭＲにより高分子Ｐ１のみを確認した結果、ＰＦＰＡに該当する広い形態のピーク３個が示された。その次、２２番錯体を添加するとすぐにとがった形状のペンタフルオロフェノール（ＰＦＰＯＨ）ピーク３個がさらに示されたことを観察した。これは２２番錯体末端のアミンが反応して生成される副産物であるＰＦＰＯＨのピークである。時間が経過するとともにＰＦＰＯＨのピークが大きくなり、ＰＦＰＡのピークが減る変化が示され、約３６時間後にすべてのＰＦＰＡのピークが消えてＰＦＰＯＨのピークだけが残った。この結果によりＴＰＭＡ系のオスミウム錯体を含むアミン基ともＰＦＰエステルが反応することができ、ＰＦＰＡ高分子が電子伝達メディエータとＧＤＨを固定できる高分子マトリックスとして機能することができると判断した。
１－３．酸化－還元重合体の合成（Ｒｅｄｏｘ ｐｏｌｙｍｅｒ（３６）および（３７））
アミン官能基を含むＴＰＭＡ系のオスミウム錯体２２と３３をＰＦＰＡ高分子３６と反応して酸化－還元高分子を合成した（図２）。全体高分子鎖でオスミウム錯体を２５～３０％程度含み得る酸化－還元高分子を得るために当量比を計算して反応を行った。
１）酸化－還元重合体（３６）の合成
ＮＭＲチューブに開始物質２２（６ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶かす。溶かした溶液を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶けている開始物質Ｐ１（５ｍｇ）に入れて次にトリエチルアミン（１．２４μＬ、０．００９ｍｍｏｌ）を入れる。反応進行の有無を１９Ｆ ＮＭＲにより確認した後、反応溶液をジエチルエーテルにゆっくり落として沈殿を得ることを３回繰り返して生成された高分子を精製する。生成された沈殿物を濾してジエチルエーテルで洗浄した後真空状態で４時間以上乾燥して茶色固体形態の生成物３６を得た。(6 mg, 64%) 19F
NMR (400 MHz, CD3OD) δ -153.38 (br, ortho), -159.74 (br,
para), -163.53 (br, meta)
２）酸化－還元重合体（３７）の合成
ＮＭＲチューブに開始物質３３（６．５ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶かす。溶かした溶液を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶けている開始物質Ｐ１（５ｍｇ）に入れて次にトリエチルアミン（１．２２μＬ、０．００９ｍｍｏｌ）を入れる。反応進行の有無を１９Ｆ ＮＭＲにより確認した後、反応溶液をジエチルエーテルにゆっくり落として沈殿を得ることを３回繰り返して生成された高分子を精製する。生成された沈殿物を濾してジエチルエーテルで洗浄した後真空状態で４時間以上乾燥して茶色固体形態の生成物３７を得た。(7.2 mg, 73%) 19F
NMR (400 MHz, CD3OD) δ -154.57 (br, ortho), -160.27 (br,
para), -164.95 (br, meta)
添加した錯体とＰＦＰＡ高分子の間の反応は１９Ｆ ＮＭＲによりこれ以上ピークの変化がないときまで確認して酸化－還元高分子の比率を判断した。添加したオスミウム錯体がすべて反応するのに約２４～３６時間が必要とされた。１９Ｆ ＮＭＲにより二つの酸化－還元高分子の比率を確認した結果、酸化－還元高分子３７はＰＦＰＡ：ＰＦＰＯＨの比率が２：３で示され、オスミウム錯体が全体鎖の３０％を占めて、３８はＰＦＰＡ：ＰＦＰＯＨの比率が２．２：２．８で示され、オスミウム錯体が２８％程度が高分子マトリックスに含まれたものとして間接的に判断することができた。二つの高分子はすべてジエチルエーテルに沈殿により得、開始物質３６高分子とは異なり酸化－還元高分子はすべて水に溶ける性質を示した。また、以下で確認したようにＣＶを測定した時、オスミウム錯体単量体と類似の酸化－還元電位を示した。このような結果により成功的にＴＰＭＡ系のオスミウム錯体を含む酸化－還元高分子を合成したと判断した。
１－４．Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体およびＰＦＰ高分子を含む酸化－還元重合体の合成１
ＮＭＲチューブに開始物質としてＣ－Ｎリガンドを含むオスミウム錯体である［Ｏｓ（２－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ－κＮ）－５－ｍｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ－ｐｈｅｎｙｌ－κＣ）（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２］Ｃｌ２（１１ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶かす。溶かした溶液を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶けている開始物質ＰＦＰ ｐｏｌｙｍｅｒ（７：３）（１７ｍｇ）に入れて次にトリエチルアミン（３．８μＬ、０．０２８ｍｍｏｌ）を入れた。反応進行の有無を１９Ｆ ＮＭＲにより確認した後（図３）、反応溶液をジエチルエーテルにゆっくり落として沈殿を得ることを３回繰り返して生成された高分子を精製した。生成された沈殿物を濾してジエチルエーテルで洗浄した後真空状態で４時間以上乾燥して茶色固体形態の生成物を得た。
１－５．Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元重合体の合成２
ＮＭＲチューブに開始物質［Ｏｓ（２－（２－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ－κＮ）－５－ｍｅｔｈａｎｅａｍｉｎｅ－ｐｈｅｎｙｌ－κＣ）（４，４’－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－２，２’－ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）２］Ｃｌ２（９．７ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶かす。溶かした溶液を重水素化メタノール（０．５ｍＬ）に溶けている開始物質ＰＦＰ ｐｏｌｙｍｅｒ（７：３）（１５ｍｇ）に入れて次にトリエチルアミン（３．１μＬ、０．０２４ｍｍｏｌ）を入れる。反応進行の有無を１９Ｆ ＮＭＲにより確認した後（図４）、反応溶液をジエチルエーテルにゆっくり落として沈殿を得ることを３回繰り返して生成された高分子を精製する。生成された沈殿物を濾してジエチルエーテルで洗浄した後真空状態で４時間以上乾燥して茶色固体形態の生成物を得た。
実施例２．酸化－還元高分子と酵素の固定およびブドウ糖に対する感応試験
オスミウム錯体を含む酸化－還元高分子と糖脱水素酵素（ＧＤＨ）を混ぜた溶液をＳＰＣＥｓ電極の上に固定させてブドウ糖濃度による感応を確認するために次の試験を行った。
２－１．酸化－還元高分子と糖脱水素酵素が固定された電極の製造
酸化－還元高分子０．４ｍｇを蒸留水５０μＬに溶かした溶液と糖脱水素酵素（ＧＤＨ）０．８ｍｇを蒸留水５０μＬに溶かした溶液を混ぜた混合溶液を製造した（ｖ／ｖ １：１）。この混合溶液をＳＰＣＥｓの上に前記混合溶液を酸化－還元高分子３７および３８の場合は０．８３μＬ、そしてＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子１および２の場合は１μＬを均一に載置して常温でゆっくり乾燥させた。乾燥が終了すると混合溶液を酸化－還元高分子３７および３８の場合は０．８３μＬ、そしてＣ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子１および２の場合は１μＬを再び載置してこの過程を２回さらに繰り返した。合計２．５μＬ（高分子３７および３８）および３μＬ（Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子１および２）の混合溶液が載置された電極を１２時間以上常温で乾燥して電極を製造した。媒介体と酵素の組成とＳＰＣＥｓ電極表面上の架橋方法を概略的に図５に示した。
２－２．ブドウ糖濃度による電流の測定
前記実施例２－１で製造された、酸化－還元高分子と糖脱水素酵素が固定された電極を１０ｍＭ ＰＢＳ溶液５０ｍＬに攪拌棒を入れて１５０ｒｐｍで攪拌してｉ－ｔ ｃｕｒｖｅを測定した。２００秒ごとにブドウ糖を１０ｍＭ ＰＢＳに溶かした溶液を一定量添加して０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、４、８、１６、３２、６４、１００ｍＭ濃度下で電流を測定して電流の変化を確認した。その結果を図６ａに示した。
試験結果、それぞれ３７および３８番酸化－還元高分子を酵素と架橋させた電極はブドウ糖濃度が徐々に増加するにつれて電流も大きさが徐々に増加した。まず電流－時間グラフでは二つの電極がいずれも１００ｍＭ濃度まで階段式に徐々に増加することが示され、低濃度区間（０～１ｍＭ）でもその変化が明らかに示された。また、濃度に応じて発生した電流の平均を出して電流－濃度グラフを図示した時、ブドウ糖の濃度別に発生する電流の大きさに対する相関関係を確認した。低濃度区間では一定電流の量が直線に増加したことに対して濃度が徐々に増加して１６ｍＭ以上の高濃度区間では電流増加量が徐々に減少して電流値が一定に示された。これは電極で糖が酸化できる最大値に到達して電流の増加量が徐々に減少して限界触媒電流（ｉｍａｘ）に到達したことがわかる。また、３７番酸化－還元高分子が架橋した電極は１．５μＡ程度の最大電流を示したことに対して、３８番酸化－還元高分子が架橋した電極は最大電流が０．５μＡ程度で３７番系の電極より１／３水準で低く示された。
前記実施例２－１で製造された、酸化－還元高分子と糖脱水素酵素が固定された電極を１０ｍＭ ＰＢＳ溶液５０ｍＬに攪拌棒を入れて１５０ｒｐｍで攪拌してｉ－ｔ ｃｕｒｖｅを測定した。Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子１および２を酵素と架橋させた電極は２００秒ごとにブドウ糖を１０ｍＭ ＰＢＳに溶かした溶液を一定量添加して０．０１、０．０５、０．１、０．５ｍＭに増加する低濃度区間下で、そして１、５、１０、５０、１００ｍＭに増加する高濃度区間下でそれぞれ電流を測定して電流の変化を確認した。その結果を図６ｂ～６ｃに示した。
試験結果、二つの電極はいずれも低濃度区間（０～０．５ｍＭ）と高濃度区間（０～１００ｍＭ）ですべて階段式に電流の大きさが徐々に増加した。低濃度区間では一定の電流の量が直線に増加したことに対して高濃度区間では濃度が徐々に増加して５０ｍＭ以上の濃度からは電流値が一定に示された。これは電極で糖が酸化できる最大値に到達したことであり、Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子１が架橋した電極は約１．０μＡ程度の最大電流を示し、Ｃ－Ｎリガンドを含む遷移金属錯体を含む酸化－還元高分子２が架橋した電極は最大電流が約０．２μＡ程度で示された。
さらに、循環電圧電流の試験前後の電流変化を測定した。具体的には電流変化のために１０ｍＭ ＰＢＳでの－０．５～＋０．１Ｖで、Ｃ－Ｎリガンドを含む電子伝達メディエータおよびＰＦＰＡを含む酸化－還元高分子１および２の場合は－０．３～＋０．４Ｖで測定し、その結果を図７ａ～７ｄに示した。図７ａ～７ｄでＣＶは電極完成直後に測定したものを示し、ａｆｔｅｒ ＣＶはＰＢＳ溶液内で１時間攪拌した後測定した値を示す。
以上のように、ＰＦＰＡを含む酸化－還元高分子が酵素と電極表面によく固定されて低濃度区間でも明らかな感応を示し、一定の濃度までも直線の電流変化を確認することができた。また、架橋電極が１００ｍＭ濃度でそれぞれ１．５μＡ、０．５μＡ、１．０μＡ、０．２μＡの限界触媒電流を示した。これによりＴＰＭＡ－オスミウム錯体系の電子伝達メディエータまたはＣ－Ｎリガンド－オスミウム錯体系の電子伝達メディエータとＰＦＰＡ高分子マトリックスを用いた固定方式が血糖センサとして機能できることを証明した。

Claims (7)

  1. 下記化学式１または２の構造を有する、ポリペンタフルオロフェニルエステル系の重合体を含む、電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料であって、
    前記電気化学的センサは持続血糖モニタリング装置であり、
    前記重合体に１次および２次アミン基およびアンモニウム基からなる群より選ばれる機 能基および遷移金属錯体が結合されたことを特徴とし、前記遷移金属錯体は下記化学式３または４の構造を有する、電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料：
    ［化学式１］
    ［化学式２］
    前記化学式１または２において、
    ＲＴおよびＲＬは、それぞれ独立してポリジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡ）およびポリアクリルアミド（ＰＡＡ）からなる群より選ばれ、
    ［化学式３］
    ［化学式４］
    前記化学式３または４において、
    ＭはＯｓ、Ｒｈ、Ｒｕ、Ｉｒ、ＦｅおよびＣｏからなる群より選ばれる１種の遷移金属であり；
    前記化学式３において、Ｌ Ｇ１ およびＬ Ｇ２ は互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；
    Ｌ Ｇ３ およびＬ Ｇ４ は互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；
    Ｌ Ｇ５ およびＬ Ｇ６ はそれぞれ互いに合わさって下記化学式５～６から選ばれる二座配位子を形成し；
    ［化学式５］
    ［化学式６］
    前記化学式５において、Ｌ Ｃ は窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、２位でベンゼンの化学式と連結され；
    前記化学式６において、Ｌ Ｎ は窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、Ｌ Ｎ１ とＬ Ｎ２ はそれぞれ２位で互いに連結されており；
    Ｒ Ｌ はヘテロ環化合物Ｌ Ｃ 、Ｌ Ｎ１ およびＬ Ｎ２ のすべての官能基であり；
    前記Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ およびＲ Ｌ はそれぞれ独立して置換または非置換の炭素数１～１０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２～２０のエチレングリコール基置換または非置換の炭素数１～２０のアルコール基、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキルハロゲン基、置換または非置換の炭素数１～２０のチオール基、置換または非置換の炭素数３～２０のアルキルアジド基、置換または非置換の炭素数７～３０のアリールアジド基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルキニル基、シアノ基、ハロゲン基、重水素および水素からなる群より選ばれるものであり；
    前記化学式４のＬ Ｈ１ 、Ｌ Ｈ３ およびＬ Ｈ４ はＬ Ｈ２ を中心に互いに合わさって下記化学式７で表される四座配位子を形成し；
    この時、Ｌ Ｈ５ およびＬ Ｈ６ はそれぞれ化学式８で表されるように遷移金属Ｍに対する単座配位子を形成するか；Ｌ Ｈ５ およびＬ Ｈ６ はそれぞれ互いに合わさって下記化学式９で表されるように遷移金属Ｍに対する二座配位子を形成し；
    ［化学式７］
    前記化学式７において、
    Ｃ ａ 、Ｃ ｂ およびＣ ｃ はそれぞれ独立して窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり、前記ヘテロ環化合物は２位でアミン基とメチレン基で連結され、前記３個のヘテロ環が有する３個の窒素と、前記３個のヘテロ環を互いに連結する中心の１個の窒素が遷移金属Ｍと連結され、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ はそれぞれヘテロ環化合物Ｃ ａ 、Ｃ ｂ 、Ｃ ｃ の官能基であって、前記Ｒ １ 、Ｒ ２ およびＲ ３ はそれぞれ独立して置換または非置換の炭素数１～１０のアルキル基、置換または非置換の炭素数２～２０のエチレングリコール基置換または非置換の炭素数１～２０のアルコール基、置換または非置換の炭素数１～２０のアルキルハロゲン基、置換または非置換の炭素数１～２０のチオール基、置換または非置換の炭素数３～２０のアルキルアジド基、置換または非置換の炭素数７～３０のアリールアジド基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルケニル基、置換または非置換の炭素数２～４０のアルキニル基、シアノ基、ハロゲン基、重水素および水素からなる群より選ばれ；
    ［化学式８］
    ［化学式９］
    前記化学式８において、
    Ｌ Ｈ５ およびＬ Ｈ６ はそれぞれ単座配位子であり、それぞれ独立して－Ｈ、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－ＮＯ ２ 、－ＮＣＣＨ ３ 、－ＣＯ、－ＯＨ ２ 、－ＮＨ ３ または窒素原子を一つ以上含むヘテロ環化合物であり；
    前記化学式９において、
    Ｌ Ｈ５ －Ｌ Ｈ６ は二座配位子であり、カテコール、アセチルアセトン、２－ピコリン酸、２－ピリジンカルボキサミド、２，２－ビピリジンまたは２，２－ビチアゾールであり；
    前記Ｌ １ は独立して置換または非置換の炭素数１～２０のアルキレン基、置換または非置換の炭素数１～２０のシクロアルキレン基、置換または非置換の炭素数２～３０のエチレングリコール基、置換または非置換の炭素数６～３０のアリーレン基、および置換または非置換の炭素数３～３０のヘテロアリーレン基からなる群より選ばれ；
    前記Ａ ａ はアミン基およびアンモニウム基からなる群より選ばれる。
  2. １，０００ｇ／ｍｏｌ～５００，０００ｇ／ｍｏｌ範囲の重量平均分子量を有する、請求項１に記載の電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料。
  3. 請求項１による電気化学的センサ用酸化－還元重合体材料を電極にコートした後、コートされた電極を硬化させる段階を含む、電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料薄膜の製造方法。
  4. 液体性生体試料を酸化還元させ得る酵素；および
    請求項１による電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料を含む、電気化学的バイオセンサ用センシング膜。
  5. 前記酵素は、
    脱水素酵素（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、酸化酵素（ｏｘｉｄａｓｅ）、およびエステル化酵素（ｅｓｔｅｒａｓｅ）からなる群より選ばれた１種以上の酸化還元酵素；または
    脱水素酵素、酸化酵素、およびエステル化酵素からなる群より選ばれた１種以上の酸化還元酵素とフラビンアデニンジヌクレオチド（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ）、およびピロロキノリンキノン（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｑｕｉｎｏｎｅ，ＰＱＱ）からなる群より選ばれた１種以上の補助因子を含む、請求項４に記載の電気化学的バイオセンサ用センシング膜。
  6. 請求項４による電気化学的バイオセンサ用センシング膜を含む、持続血糖モニタリングセンサ。
  7. 請求項１または２による電気化学的センサ用酸化－還元高分子材料を含む、持続血糖モニタリング装置。
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