JP7696161B2 - 乳汁産生の促進に有用な組成物および方法 - Google Patents

乳汁産生の促進に有用な組成物および方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８３７，５９０号の利益を主張し、この出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
２０１９年２月１５日に作成され、１３０ＫＢのサイズを有するテキストファイルＵＣＳＣ－３８３ＰＲＶ２ ｓｅｑ ｌｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして、配列表が本明細書とともに提供される。このテキストファイルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
乳腺、または乳房は、哺乳動物の乳汁産生に関与する動的な上皮器官である１。乳頭に位置する原基（anlage）として始まり、乳腺は思春期に生成されたホルモンのキューに応答して出生後に発達し、基礎にある間質脂肪パッド中に分岐する腺管構造を形成する。各管は二層であり、基底／筋上皮細胞（basal/myoepithelial cells）の外層（本明細書ではＢＣと呼ばれる）および管腔細胞（luminal cells）の内層（本明細書ではＬＣと呼ばれる）を含む。管腔細胞は、２つの亜集団にさらに細分され得、管腔を囲む管亜集団、および妊娠中に乳汁産生腺房（alveoli）が生成される腺房亜集団である（図１Ａ）。子が母乳から離乳すると、乳腺は退縮と呼ばれるプロセスで妊娠前の状態にリモデリングされる。腺房細胞亜集団内には、腺房前駆細胞（ＡＶＰ：alveolar progenitor cells）がある。現在、妊娠中の腺房の生成は、腺房前駆細胞の乳汁産生腺房細胞（ＡＶ：alveolar cells）への分化から生じると考えられている。
ノッチ（Notch）は、幹細胞／前駆細胞の維持および発生運命（fate）決定を調節する主要なシグナル伝達経路である。４つのＮＯＴＣＨ受容体がある：ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、およびＮＯＴＣＨ４－これらのすべてが乳腺で発現される２。乳腺の発達中、ノッチシグナル伝達は、基底細胞の発生運命を犠牲にして管腔細胞の発生運命を促進する３～６。さらに、構成的に活性なＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（ＩＣＤ）の過剰発現が腺房の発達を大幅に減少させることを示す研究結果により、ＮＯＴＣＨ４活性の阻害が腺房の拡大および分化に必要であるようである７～９。これは、腺房前駆細胞においてそれらが腺房細胞に分化するためにＮＯＴＣＨ４を介したシグナル伝達が阻害されなければならないことを示している。
ラウンドアバウト（ＲＯＢＯ）受容体は、多くの発達過程に関与する保存された免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。それらは、ＳＬＩＴ（例えば、乳腺におけるＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３）と呼ばれる保存された分泌型糖タンパク質細胞外マトリックスリガンドのファミリーに結合し、これは乳腺上皮全体に発現する（図１Ｂ）１０、１１。このシグナル伝達システムは、マウスの神経系およびショウジョウバエの腸における細胞の発生運命決定を調節することが示されている１２、１３。
妊娠のたびに乳汁の供給を構築するには、細胞増殖および分化を大幅に加速する必要がある。本明細書に開示されるのは、脱抑制性シグナル伝達回路に影響を与える薬剤で処置することによってその加速された細胞増殖および分化を促進する方法であり、それにより、ＲＯＢＯ２はＲＯＢＯ１を阻害し、次にＮＯＴＣＨ４活性化を阻害する。ＲＯＢＯ１は、処女乳腺のＢＣおよびＬＣの両方で発現するが、妊娠中のＬＣではアップレギュレートされる。ＲＯＢＯ２の発現は、管腔細胞のサブセットに制限されている。本明細書で初めて開示されるのは、以下の発見である：Ｒｏｂｏ１遺伝子の喪失（または欠失）は、乳腺腺房分化の阻害をもたらす。これは、ＨＣ１１細胞授乳モデルと乳腺のインビボの両方で実証されている。Ｒｏｂｏ２の喪失（または欠失）は、両方のモデルで反対の表現型をもたらす、つまり、乳腺腺房の分化がより大きくなる。ＲＯＢＯ１は、ＮＯＴＣＨ４に特異的に結合して、そのシグナル伝達を阻害することが示されている。ＲＯＢＯ２は、ＲＯＢＯ１に特異的に結合し、ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４を阻害するのを防止することが示されている。ＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２の間の相互作用は、ＳＬＩＴ２によって強化される。本明細書に開示されるのは、ＮＯＴＣＨ４シグナル伝達を阻害するＲＯＢＯ１細胞外ドメインの部分を含むＲＯＢＯ１受容体フラグメントである。本明細書に開示される実験は、ＳＬＩＴ／ＲＯＢＯシグナル伝達が、ＮＯＴＣＨ４活性化を支配し、乳汁産生腺房細胞に分化する腺房前駆細胞の数を制御することにより、乳腺腺房形成を調節することを示している。
哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法、薬剤、および組成物が提供される。乳汁産生を促進するのに有用な薬剤には、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤が含まれ得る。薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインであり得るか、または薬剤は、ＲＯＢＯ２に結合することによっておよび／またはＮＯＴＣＨ４に結合することによってＮＯＴＣＨ４活性を阻害し得る。薬剤は、ＲＯＢＯ１と競合してＲＯＢＯ２への結合から離し、それによってＮＯＴＣＨ４活性を阻害するためのＲＯＢＯ１を利用可能にすることにより、ＮＯＴＣＨ４を阻害し得る。薬剤は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する抗ＮＯＴＣＨ４抗体であり得る。薬剤は、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物であり得る。薬剤は、ＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物であり得る。本明細書では、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現、ＲＯＢＯ２の発現の阻害、および／またはＮＯＴＣＨ４の発現の阻害のために遺伝子改変されたトランスジェニック哺乳動物も提供される。本明細書に開示される薬剤の１つ以上を投与することによってそのようなトランスジェニック哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法も提供される。
ＲＯＢＯ１発現。（Ａ）基底（筋上皮および幹）（ＢＣ）細胞、管腔腺房前駆（ＡＶＰ）細胞および腺房（ＡＶ）細胞を含む二層腺房の模式図。（Ｂ）ＳＬＩＴ／ＲＯＢＯ１の模式図。（Ｃ）処女およびＰＤ１８の管腔前駆（ＬＰ）細胞、成熟管腔（ＭＬ）細胞および基底（ＢＣ）細胞におけるＲｏｂｏ１のＲＴ－ｑＰＣＲは、妊娠中の管腔細胞（ＬＣ）におけるアップレギュレーションを示す（ｎ＝３）。（Ｄ～Ｇ）成熟した処女管（Ｄ、Ｅ）およびＰＤ１６腺房（Ｆ）における管腔細胞（矢頭）の亜集団におけるＲＯＢＯ１免疫組織化学（Ｄ）またはβ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）染色（Ｅ）。ＲＯＢＯ１は、ＰＤ１６（Ｆ）および授乳日（ＬＤ３）（Ｇ）腺房における基底細胞（矢印）でも発現する。（ＳＥＭ、ｔ検定ｐ＜０．０１）。 ＲＯＢＯ１は腺房形成を増強する。（Ａ）ＨＣ１１分化プロトコルの模式図表現。（Ｂ）デキサメタゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）およびプロラクチン（Ｐｒｌ、５μｇ／ｍｌ）（ＤＩＰ培地）での分化（Ｄｉｆ）の８日後の、Ｓｃｒと比較した、Ｒｏｂｏ１ノックダウン（ＫＤ）ＨＣ１１細胞におけるドーム形成（矢印）の減少１４。ドーム形成は、Ｒｏｂｏ１の過剰発現（ｏ／ｅ）によって救済（レスキュー）される。非分化条件（Ｕｎｄｉｆ）下でのごくわずかなドーム形成。Ｓｃｒコントロールに対して正規化されたＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｒｏｂｏ１ノックダウン後のＲｏｂｏ１およびＷＡＰの低減を示している（ｎ＝３）。（Ｃ、Ｄ）ＰＤ１８ Ｒｏｂｏ１ ＷＴおよびＫＯインタクト乳腺（Ｃ）および対側的に移植された派生物（Ｄ）の代表的なＨ＆Ｅ染色切片であり、グラフは腺房面積の減少を示している（１０画像、ｎ＝３）。（Ｅ）Ｒｏｂｏ１＋／＋と比較したＲＴ－ｑＰＣＲは、ＬＤ１ Ｒｏｂｏ１－／－乳腺（ｎ＝３）における乳汁遺伝子発現の減少を示している。（Ｆ）ＷＡＰで免疫染色されたＰＤ１８ Ｒｏｂｏ１＋／＋、Ｒｏｂｏ１－／－乳腺の代表的な免疫組織化学およびグラフ（ｎ＝１０画像、ｎ＝１）。（Ｇ）妊娠１８日目の反対側に移植されたＲｏｂｏ１ ＷＴ／ＫＯ派生物におけるＰＬＩＮ２およびＳＭＡについての代表的な免疫組織化学であり、グラフはＫＯにおけるＰＬＩＮ２強度の減少を示している（１０画像、ｎ＝３）。（Ｈ）反対側に移植された妊娠１８日目のＲｏｂｏ１ ＷＴ／ＫＯ派生物におけるＣＵＢＩＣ法ＥＬＦ５およびＣＤＨ１免疫組織化学であり、グラフはＥＬＦ５強度の減少を示している（１０画像、ｎ＝１）。（Ｉ）子の体重を監視することによって乳汁産生を測定するためのアッセイの模式図表現。（Ｊ）Ｒｏｂｏ１－／－雌親（ｎ＝２）によって養育された子における体重増加の低減を示す現在のデータ。（ＳＥＭ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ＲＯＢＯ１は、直接相互作用によりＮＯＴＣＨ４の活性化を調節する。（Ａ）Ｒｏｂｏ１により調節される遺伝子Ｈｅｙ１のゲノムブラウザースナップショットであり、Ｒｏｂｏ１＋／＋およびＲｏｂｏ１－／－管腔前駆細胞（ＬＰ）試料のＲＮＡ－ｓｅｑ読み取りカバレッジがヒストグラムとしてプロットされている（ｎ＝３）。（Ｂ、Ｃ）Ｒｏｂｏ１調節遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ検証は、ＷＴ（Ｂ）（ｎ＝３）に正規化されたＲｏｂｏ１ ＫＯ初代腺房前駆細胞（ＡＶＰ）、およびコントロール（Ｓｃｒ）細胞（Ｃ）（ｎ＝３）に正規化されたＲｏｂｏ１ノックダウンＨＣ１１細胞におけるＮｏｔｃｈエフェクター遺伝子の増加を示している。（Ｄ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、処女の乳腺と比較して、妊婦から採取したＡＶＰにおけるＮｏｔｃｈエフェクター遺伝子Ｈｅｙ１およびＨｅｓ１の発現の有意な低減を示している（ｎ＝３）。（Ｅ）Ｒｏｂｏ１ノックダウン（ＫＤ）ＨＣ１１細胞のドーム形成の減少は、ＧＳＩ処理によって救済される（ｎ＝３）。（Ｆ）Ｒｏｂｏ１ノックダウン（ｓｉＲ１）ＨＣ１１細胞におけるＷＡＰおよびＬａｌｂａ発現の減少は、ＧＳＩ処理（ｓｉＲ１＋ＧＳＩ）によって救済される。Ｎｏｔｃｈ４ノックダウン（ｓｉＮ４）は、Ｎｏｔｃｈ４およびＲｏｂｏ１の両方のダブルノックダウン（ｄＫＤ）と同様に、ＷＡＰとＬａｌｂａの発現を増加させる（ｎ＝１）。（Ｇ）Ｒｏｂｏ１はＨＣ１１ドーム形成を減少させ、これは、Ｎｏｔｃｈ４のノックダウンおよびＲｏｂｏ１／Ｎｏｔｃｈ４ダブルノックダウン（ｄＫＤ）によって救済される結果である（ｎ＝２）。（Ｈ）内因性ＲＯＢＯ１はＮＯＴＣＨ４と共免疫沈降するが、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞溶解物においてはＮＯＴＣＨ１と共免疫沈降しない（ｎ＝３）。（Ｉ～Ｋ）細胞分画ウエスタンブロット（Ｉ）および定量化は、Ｒｏｂｏ１ノックダウン（ｓｉＮ４）分化ＨＣ１１細胞の核画分におけるＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）（Ｊ）およびＨＥＳ１（Ｋ）の増加を示している。Ｒｏｂｏ１過剰発現（ｓｉＲ１＋Ｒ１ｏ／ｅ）およびＧＳＩ処理（ｓｉＲ１＋ＧＳＩ）は、該効果を救済する（ｎ＝３）。（Ｌ）ＲＯＢＯ１およびｐＳＴＡＴ５の増加、ただしＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）の減少が、未分化（Ｕｎｄｉｆ）細胞と比較して、分化（Ｄｉｆ）ＨＣ１１細胞に存在する（ｎ＝１）。（Ｍ）内因性ＮＯＴＣＨ４は、分化ＨＣ１１（Ｄｉｆ）細胞および後期プライミング（－ＥＧＦ）ＨＣ１１細胞からのＲＯＢＯ１と共免疫沈降する。ＳＬＩＴは、分化ＨＣ１１細胞における複合体形成には影響を与えないようであるが、後期（－ＥＧＦ）プライミング細胞では複合体の減少が観察される。初期プライミング細胞（＋ＥＧＦ）からは、またはコントロールＩｇＧを使用した場合には、ＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ４複合体は沈殿しない（ｎ＝１）。（ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ＦＡＣＳ精製Ｒｏｂｏ１－／－ＡＶＰコロニーはより小さく、ＷＡＰをほとんど／まったく発現しない：（Ａ）Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ－２７６３２、（１０μＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）、Ｎｒｇ１（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、Ｒ－スポンジン１（６００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ）、プロラクチン（５□ｇ／ｍｌ、ＮＨＰＰ）を含むマトリゲルで５日間培養したＲｏｂｏ１－／－ＦＡＣＳ精製腺房前駆細胞（ＡＶＰ）は、Ｒｏｂｏ１＋／＋ＡＶＰよりも小さく、ＷＡＰをほとんどないしまったく発現しない（ｎ＝２）。（Ｂ）Ｒｏｂｏ１＋／＋、初代（１°）管腔上皮細胞と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－の核におけるＮＯＴＣＨ４ ＩＣＤ（Ｎ４－ＩＣＤ）のレベルの増加。（ｎ＝２）。（Ｃ）Ｒｏｂｏ１＋／＋およびＲｏｂｏ１－／－マウスをガンマセクレターゼ（ＧＳＩ）阻害剤で処理することによりＮｏｔｃｈ阻害を試験するためのアッセイの模式図表現。（Ｄ）ビヒクルまたはＧＳＩで処理されたＲｏｂｏ１＋／＋およびＲｏｂｏ１－／－マウスから収集されたＦＡＣＳ精製ＡＶＰの数。（ｎ＝３）。（Ｅ）ＦＡＣＳ精製ＡＶＰでのＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｒｏｂｏ１＋／＋腺房前駆細胞（ＡＶＰ）でのＨｅｙ１、Ｈｅｓ１発現の減少を示し、ＧＳＩがＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害したことを示している。また、Ｒｏｂｏ１＋／＋細胞と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－ではＨｅｙ１、Ｈｅｓ１が増加し、Ｅｌｆ５の発現が減少し、これは、ＧＳＩ処理によって救済される効果である（ｎ＝１）。（ＳＥＭ、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 Ｒｏｂｏ２は、腺房形成を阻害する。（Ａ）３日間の分化後のＲｏｂｏ２ノックダウンによるドーム形成およびＷＡＰ発現の増加（矢印）（この表現型はＲｏｂｏ１＆２ダブルノックダウン（ｄＫＤ）によって救済された）。（Ｂ）ＤＰ１６ Ｒｏｂｏ２ ＷＴおよびＫＯ乳腺の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。インタクトＲｏｂｏ２－／－乳腺および移植されたＲｏｂｏ２－／－派生物における腺房の定量化は、Ｒｏｂｏ２＋／＋組織と比較して、Ｒｏｂｏ２－／－における腺房面積の増加を示している（ｎ＝１０画像、ｎ＝１）。（Ｃ）Ｒｏｂｏ２＋／＋コントロールに対して正規化されたＲｏｂｏ２－／－乳腺（ＭＧ）における乳汁遺伝子（上）およびＮｏｔｃｈエフェクター遺伝子（下）のＲＴ－ｑＰＣＲ。（Ｄ）β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）染色は、ＤＰ１６腺房における管腔細胞のサブセット（上）および引退したブリーダーからの管内に基底的に位置する細胞のサブセット（下）におけるＲｏｂｏ２を示している。（Ｅ）乳腺上皮細胞のＦＡＣＳ精製亜集団におけるＲｏｂｏ２およびＲｏｂｏ１に対するＲＴ－ｑＰＣＲ。Ｒｏｂｏ１発現はすべての集団におけるものであるが、Ｒｏｂｏ２発現は腺房前駆細胞（ＡＶＰ）および基底（ＢＣ）細胞に限定されている（Ｆ）ＲＯＢＯ２がＲＯＢＯ１を阻害し、腺房分化を低減させるＮＯＴＣＨ４（Ｎ）の活性化を可能にすることを示す模式図モデル（左）。ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）はＲＯＢＯ２に結合し、ＲＯＢＯ１を解放し、次いでそれがＮＯＴＣＨ４を阻害し、および／または、ＥＣＤはＮＯＴＣＨ４に結合し、ＮＯＴＣＨ４を直接阻害する；両方のシナリオが分化を促進する。プロジェクト用に生成された異なる構成を表すＥＣＤのパネル（右）。（Ｇ）ＨＥＫ２９３ライセート中の内因性レベルのＲＯＢＯ２がＲＯＢＯ１と共免疫沈降し、共免疫沈降はＳＬＩＴ２／ＳＬＩＴ３処理によって増強される。＊はＲＯＢＯ２であり、＃はグリコシル化ＲＯＢＯ２である（ｎ＝１）。（ＳＥＭ、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５）。 ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン。（Ａ）ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）パネルのドメイン構造を示す模式図（Ｂ）プラスミドコンストラクトを過剰発現するＨＥＫ細胞の溶解液および馴化培地におけるＲＯＢＯ１ ＥＣＤおよびコントロールＤＣＣ ＥＣＤのウエスタンブロット。（Ｃ）ヘパリン（３００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下でＲｏｂｏ－Ｉｇ５を過剰発現するＨＥＫ細胞からのＲＯＢＯ１－Ｉｇ５分泌の培地のドットブロットアッセイ（左）および定量化（右）。ヘパリンは分泌を適度に増加させる（ｎ＝１）。（Ｄ）ヘパリン（３００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下での溶解液タイトレーションのウエスタンブロットは、タンパク質分解を示さない。（Ｅ）ＨＣ１１ドーム形成アッセイは、ＥＣＤ ＲＯＢＯ１－Ｉｇ２およびＲＯＢＯ１－Ｉｇ５の機能がヘパリンの存在下で減少することを示す（ｎ＝１）。（Ｆ）ＲＯＢＯ１－ＥｃｔｏとＲＯＢＯ２過剰発現細胞（上、緑）およびＤＣＣ過剰発現細胞（下、緑）とを使用したＥＣＤ結合アッセイ。ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ－ＨＡ（赤）はＲＯＢＯ２に結合するが、ＤＣＣには結合しない。 ＲＯＢＯ１細胞外ドメインは分化を促進する。（Ａ）ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ処理の非存在下および存在下でのＨＣ１１細胞の代表的な位相差（上）およびＢｏｄｉｐｙ ４９３／５０３染色（下）。（Ｃ～Ｇ）ＨＣ１１分化に対するＲＯＢＯ１ ＥＣＤの効果を測定するタイトレーションアッセイは、ＤＣＣ－ＥＣＤではなくＲＯＢＯ１－ＥＣＤが、ＥＣＤ濃度の増加とともにＨＣ１１ドーム形成を増加させることを示している（示されている場合を除いてｎ＝３）。（Ｈ）ＨＣ１１分化に対するウシＲＯＢＯ１－Ｉｇ５の効果を測定するタイトレーションアッセイは、濃度の増加とともにドーム形成の増加を示す（ｎ＝２）。（Ｉ～Ｋ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、コントロール処理と比較して、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤ処理後のＷＡＰ（ｎ＝１）およびＬａｌｂａ（ｎ＝２）遺伝子発現の増加を示している。ＤＣＣ－Ｉｇ４（０．７μＭ）処理後のＷＡＰ（ｎ＝１）の発現に変化はない。（Ｌ～Ｏ）ＲＯＢＯ１ ＥＣＤタイトレーションは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５（Ｌ、Ｍ）でＷＡＰ（ｎ＝１）およびＰＬＩＮ２（ｎ＝４）の発現が増加し、ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ（Ｎ、Ｏ）処理でＷＡＰ（ｎ＝３）およびＰＬＩＮ２（ｎ＝２）が増加することを示している。（ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１） ＲＯＢＯ１細胞外ドメインはＮｏｔｃｈの活性化を阻害する。（Ａ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ２ではなくＲＯＢＯ１－Ｉｇ５およびＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏで処理されたＨＣ１１細胞におけるＨｅｙ１およびＨｅｓ１発現の減少を示している（ｎ＝１）。（Ｂ）ウエスタンブロットによって分析された、分画化（細胞質／核）されたプライミングＨＣ１１細胞は、核画分においてはＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理によってＨＥＳ１およびＮＯＴＣＨ４－ＩＣＤ（Ｎ４－ＩＣＤ）が減少し、ＮＯＴＣＨ４－ＩＣＤ（Ｎ４－ＩＣＤ）は細胞質画分においても減少したことを示している。（Ｃ）ＨＣ１１分化アッセイは、スクランブルＫＤ（Ｓｃｒ）条件下でのＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理によるドーム形成の増加を示している。Ｒｏｂｏ１のノックダウン（ｓｈＲＯＢＯ１）は、未処理の細胞（コントロール）のドーム形成を減少させ、これは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理によって救済される効果である。Ｎｏｔｃｈ４のノックダウン（ｓｈＮｏｔｃｈ４）は、未処理の細胞（コントロール）のドーム形成を増加させ、これは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理の影響を受けない増加である（ｎ＝２）。 ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントの皮下注射は分岐を増加させる：（Ａ）ＷＴ初代マウス腺房前駆細胞（ＡＶＰ）はＦＡＣＳ精製され、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤの非存在下（コントロール）および存在下でマトリゲル中で増殖される。すべてのＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントはオルガノイドの数を増加させ、代表的な写真はＲＯＢＯ１－Ｉｇ５（ｎ＝３）の存在下で成長したＡＶＰを示している。（Ｂ）ＷＴ初代ウシ腺房前駆細胞（ＡＶＰ）をＦＡＣＳ精製し、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５の非存在下（コントロール）および存在下でマトリゲル中で増殖させ、それはオルガノイドのサイズを増加させた（ｎ＝２）。（Ｃ）ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５注入プロトコルの模式図表現。動物は卵巣切除（Ｏｖｘ）され、ホルモンで処理され、ＰＢＳまたはＲＯＢＯ１－Ｉｇ５フラグメントのいずれかが注射される。（Ｄ）ＲＯＢＯ１－Ｉｇ－５が注射された動物における乳腺サイズおよび一次（１°）枝の数の増加（ｎ＝３）。（Ｅ）ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５が注射された乳腺における二次／三次（２°、３°）分岐の数は増加したが、分岐密度は増加しなかった（ｎ＝３）。（ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）。 ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは小葉腺胞乳腺の発達を促進する。（Ａ）ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃフラグメント皮下注射プロトコルの模式表現。Ｒｏｂｏ１＋／＋（ＷＴ）またはＲｏｂｏ１－／－動物に、妊娠日（ＰＤ）８．５、１１．５、および１４．５にＰＢＳまたはＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃのいずれかを皮下注射する。乳腺はＰＤ１７．５で採取される。（Ｂ、Ｃ）模擬注射されたＷＴおよびＲｏｂｏ１－／－腺（コントロール）の代表的なＨ＆Ｅ染色は、上記で観察された小葉腺房発達の低減（矢印）およびより小さく高密度のアベオリ（アスタリスク）のＲｏｂｏ１－／－表現型を示している。（Ｄ、Ｅ）ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃフラグメントが皮下注射されたＷＴ（Ｄ）およびＲｏｂｏ１－／－（Ｅ）腺における小葉腺房発達および乳汁液滴産生の増加。（Ｆ）腺房のパーセンテージ（％）の定量化は、コントロールＲｏｂｏ１＋／＋組織と比較して、模擬注射されたＲｏｂｏ１－／－乳腺組織における腺房面積の有意な減少、および、Ｒｏｂｏ１＋／＋またはＲｏｂｏ１－／－動物へのＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｒ１ＥＣＤ）フラグメントの注射による腺房面積の有意な増加を示している。（ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは乳汁産生を増加させる。（Ａ～Ｃ）ＲＴ－ｑＰＣＲは、Ｒｏｂｏ１＋／＋動物と比較して、模擬注射されたＲｏｂｏ１－／－においてＷＡＰ（Ａ）、ＸＤＨ（Ｂ）、およびＣＳＮ２（Ｃ）の発現が大幅に低下していることを示している。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｒ１ＥＣＤ）が注射されたＲｏｂｏ１＋／＋動物では、ＷＡＰ、ＣＳＮ２の発現が大幅に増加し、ＸＤＨが増加傾向にある。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｒ１ＥＣＤ）が注射されたＲｏｂｏ１－／－動物では、ＷＡＰ、ＸＤＨ、およびＣＳＮ２の発現が大幅に増加している。（Ｄ～Ｈ）免疫組織化学（Ｄ～Ｇ）および定量化（Ｈ）は、コントロールのＲｏｂｏ１＋／＋組織と比較して、模擬注射されたＲｏｂｏ１－／－乳腺組織における乳汁タンパク質発現の有意な減少、およびＲｏｂｏ１＋／＋またはＲｏｂｏ１－／－動物のいずれかへのＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃ（Ｒ１ＥＣＤ）フラグメント注射による乳汁タンパク質発現の有意な増加を示している。（ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。 ＲＯＢＯ１は、乳腺の基底細胞において腺房分化と乳汁産生のために必要である。（Ａ～Ｄ）モザイクオルガノイドは、管腔細胞および基底細胞の精製された集団を再構成することによって生成された。ＷＴ組織にはＡＣＴｂ－ＥＧＦＰマウスを使用した（ＧＦＰ＋／＋）。（Ａ）乳腺オルガノイドに再構成されたＧＦＰ＋／＋基底細胞およびＧＦＰ＋／＋管腔細胞は、分化時にＣＳＮ２（β－カゼイン）を生成する。（Ｂ）乳腺オルガノイドに再構成されたＲｏｂｏ１－／－基底細胞およびＲｏｂｏ１－／－管腔細胞は、分化時にＣＳＮ２をほとんど／まったく生成しない。（Ｃ）乳腺オルガノイドに再構成されたＲｏｂｏ１－／－基底細胞およびＧＦＰ＋／＋管腔細胞は、分化時にＣＳＮ２をほとんど／まったく生成しない。（Ｄ）乳腺オルガノイドに再構成されたＧＦＰ＋／＋基底細胞およびＲｏｂｏ１－／－管腔細胞は、分化時にＣＳＮ２を生成する。 ＲＯＢＯ１は、基底細胞におけるＪａｇｇｅｄ１発現を阻害する。（Ａ）増加する量のＲｏｂｏ１プラスミド（ＲＯＢＯ１）を発現する細胞からのＨＥＫ２９３溶解液の免疫ブロットおよび定量化は、ＪＡＧＧＥＤ１発現のレベルの減少を示している。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールである。（Ｂ）Ｒｏｂｏ１ノックダウン（ｓｈＲｏｂｏ１）細胞からのＨＥＫ２９３溶解液の免疫ブロットおよび定量化は、ＪＡＧＧＥＤ１発現が増加しＪＡＧＧＥＤ２発現には変化がないことを示している。（Ｃ）初代乳腺上皮細胞を、Ｒｏｂｏ１＋／＋およびＲｏｂｏ１－／－動物からＦＡＣＳ精製した。ＪＡＧＧＥＤ１発現は、ＷＴと比較して、Ｒｏｂｏ１－／－基底細胞において増加している。（Ｄ）ＪＡＧＧＥＤ１および基底マーカーサイトケラチン１５（ＣＫ１４）についての免疫組織化学は、Ｒｏｂｏ１＋／＋と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－の乳腺オルガノイドの基底細胞におけるＪＡＧＧＥＤ１発現の増加を示している。（＊＊＊Ｐ＜０．００１）
配列表
配列番号１－ウシＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号２－ウシＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号３－ウシＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号４－ホモサピエンスＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号５－ホモサピエンスＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号６－ホモサピエンスＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号７－アメリカバイソンＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号８－アメリカバイソンＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号９－アメリカバイソンＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号１０－フタコブラクダＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号１１－フタコブラクダＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号１２－フタコブラクダＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号１３－ヤギＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号１４－ヤギＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号１５－ヤギＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号１６－ヒツジＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号１７－ヒツジＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号１８－ヒツジＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号１９－ヤクＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号２０－ヤクＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号２１－ヤクＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号２２－ハツカネズミＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号２３－ハツカネズミＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号２４－ハツカネズミＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号２５－ドブネズミＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ
配列番号２６－ドブネズミＲＯＢＯ１－Ｉｇ５
配列番号２７－ドブネズミＲＯＢＯ１－Ｉｇ２
配列番号２８－ドブネズミＤＣＣ Ｉｇ２
配列番号２９－ドブネズミＤＣＣ Ｉｇ４
配列番号３０－Ｒｏｂｏ１ ｓｈＲＮＡフォワードストランド
配列番号３１－Ｒｏｂｏ１ ｓｈＲＮＡリバースストランド
配列番号３２－Ｎｏｔｃｈ４ ｓｈＲＮＡフォワードストランド
配列番号３３－Ｎｏｔｃｈ４ ｓｈＲＮＡリバースストランド
配列番号３４－Ｒｏｂｏ２ ｓｈＲＮＡフォワードストランド
配列番号３５－Ｒｏｂｏ２ ｓｈＲＮＡリバースストランド
哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法、薬剤、および組成物が提供される。乳汁産生を促進するのに有用な薬剤には、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤が含まれ得る。薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインであり得、薬剤は、ＲＯＢＯ２に結合することによっておよび／またはＮＯＴＣＨ４に結合することによってＮＯＴＣＨ４活性を阻害し得る。薬剤は、ＲＯＢＯ１と競合してＲＯＢＯ２への結合から離し、それによってＮＯＴＣＨ４活性を阻害するためのＲＯＢＯ１を利用可能にすることにより、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害し得る。薬剤は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する抗ＮＯＴＣＨ４抗体であり得る。薬剤は、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物であり得る。薬剤は、ＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物であり得る。本明細書では、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現、ＲＯＢＯ２の発現の阻害、および／またはＮＯＴＣＨ４の発現の阻害のために遺伝子改変されたトランスジェニック哺乳動物も提供される。本明細書に開示される薬剤の１つ以上を投与することによってそのようなトランスジェニック哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法も提供される。
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、各個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されるところに関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行日は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる可能性があるため、本方法、組成物、およびトランスジェニック動物が、このような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意選択的な要素を排除するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、クレーム要素の記載に関連して、「もっぱら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、または「負の」限定の使用のための根拠としての役割を果たすことを意図している。
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証される個々の実施形態の各々は、本方法の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のいずれかの特徴と容易に分離され得る、または組み合わせられ得る個別の構成要素および特徴を有する。記載された方法は、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合部位を介して標的を認識して結合する免疫グロブリン分子を指す。「抗体」は、本明細書で最も広い意味で使用され、ポリクローナル抗体、組換え抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体（ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダなどの２つ以上の異なる種からの抗体配列のキメラ）、ヒト化抗体、ヒト抗体、ウシ化抗体、ヒツジ化抗体、ヤギ抗体、ラクダ化抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、シングルドメイン抗体（例えば、ラクダ／ラマ抗体）、および抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
「インタクト抗体」または「全長抗体」という用語は、天然の抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指す。これは、各々が可変領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む２つの軽鎖と、各々が可変領域および少なくとも重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３とを含む２つの重鎖を含む抗体を含む。
本明細書で使用される「抗体フラグメント」という用語は、抗体の一部分および一般に抗原結合部位を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｆｄ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ミニボディ、デュアル可変ドメイン抗体（ＤＶＤ）、シングル可変ドメイン抗体、および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「可変領域」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体軽鎖の領域または抗体重鎖の領域を指す。抗体重鎖および抗体軽鎖の可変領域は、類似の構造を有し、一般に、４つのフレームワーク領域および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域としても知られる）を含む。
「フレームワーク領域」という用語は、可変領域内のＣＤＲ残基以外のアミノ酸残基を指す。可変領域は通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４の４つのフレームワーク領域を含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原決定基またはエピトープの非常に特異的な認識および結合に関与する実質的に均質な抗体集団を指す。集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る、自然に発生する可能性のある突然変異を除いて、同一である。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトおよび完全長モノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）抗体、抗体フラグメント、および抗原結合部位を含む他の修飾免疫グロブリン分子を含む融合タンパク質を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ産生、ファージライブラリーディスプレイ、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、任意の数の技術によって作製されたそのような抗体を指す。
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、一般にヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）を含むキメラ抗体を指し、天然のＣＤＲ残基は、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種からの対応するＣＤＲからの残基によって置き換えられ、ここでドナー抗体は、所望の特異性、親和性、および／または活性を有する。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の特徴をさらに洗練および／または最適化するために行われ得る。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲのすべてまたは実質的にすべて、およびヒト免疫グロブリンのものに対応するフレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてを含む可変領域を含み得る。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、免疫グロブリンＦｃ領域（例えば、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、および／またはＣＨ３）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含むであろう。同様の定義が、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、およびラクダ化抗体に適用される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体および／またはヒト抗体を作製するための当業者に知られた技術のいずれかを使用して作製された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。これらの技術には、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、トランスジェニック動物、およびＢ細胞ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で定義されるヒト抗体は、非ヒト供給源からの残基を含むヒト化抗体を除外する。
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、特定の結合剤または結合剤（例えば抗体）によって認識および結合され得る抗原または標的のその部分を指す。抗原または標的がポリペプチドである場合、エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された隣接アミノ酸および非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープとも呼ばれる）は、通常、タンパク質変性時に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとも呼ばれる）は、通常、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、通常、独特の空間的立体構造で少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５、６、７、または８～１０個のアミノ酸を含む。エピトープは、インターネット上で利用可能な多数のソフトウェアバイオインフォマティクスツールのいずれか１つを使用して予測され得る。Ｘ線結晶学が、抗原／抗体複合体のアミノ酸残基相互作用を分析することにより、標的タンパク質上のエピトープを特徴づけるために使用され得る。
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、代替物質よりも特定の抗原、エピトープ、タンパク質、または標的分子に対して、より頻繁に、より迅速に、より長い継続期間で、より高い親和性で、または上記のいくつかの組み合わせで相互作用する結合剤（例えば、抗体）を指す。抗原に特異的に結合する抗体は、例えば、イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）、ＦＡＣＳ、または当業者に知られている他の技術によって同定され得る。
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。「ペプチド」という用語は、５０アミノ酸未満、例えば、５～５０アミノ酸のポリマーを指すように使用され得る。ポリマーは、線状または分枝状であり得、それは、修飾されたアミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸によって中断され得る。これらの用語はまた、自然に、または介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他の操作または修飾によって、修飾されたアミノ酸ポリマーを包含し得る。定義には、例えば、非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ以上の類似体、ならびに当技術分野で知られている他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本開示のポリペプチドのいくつかは抗体に基づき得るため、「ポリペプチド」という用語は、一本鎖としてのポリペプチドおよび２つ以上の随伴する鎖のポリペプチドを包含することが理解される。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。
２つ以上の核酸またはポリペプチドの文脈における「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、その配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応が得られるように比較されアラインメントされた（必要に応じてギャップを導入して）場合、同一であるか、または特定されたパーセンテージで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアは、当該技術分野でよく知られている。これらには、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、およびそれらの変形が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本開示の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定された、最大の対応となるように比較されアラインメントされた場合、実質的に同一であり、これは、それらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびいくつかの態様では少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。いくつかの態様では、同一性は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０～６０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、少なくとも約６０～８０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、またはそれらの間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様では、同一性は、６０～８０のヌクレオチドまたはアミノ酸残基よりも長い領域、例えば少なくとも約８０～１００のヌクレオチドまたはアミノ酸残基にわたって存在し、いくつかの態様では、配列は、例えば（ｉ）ヌクレオチド配列のコード領域または（ｉｉ）アミノ酸配列のような比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」という句は、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置き換えられる置換を指す。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で一般的に定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含み、。例えば、チロシンからフェニルアラニンへの置換は、保存的置換であるとみなされる。一般に、ポリペプチドおよび／または抗体の配列における保存的置換は、標的の結合部位へのポリペプチドまたは抗体の結合を損なわせない。結合を損なわせないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野でよく知られている。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子または配列を送達することができ、通常は発現することができる、構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、またはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随するＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、およびリポソームにカプセル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、自然界には見られない形態のポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物を指す。「単離された」抗体は、それが由来する細胞源からの物質を実質的に含まない。いくつかの態様では、単離されたポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、それらがもはや自然界に見出される形態ではない程度に精製されたものである。いくつかの態様では、単離されるポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。ポリペプチド、ペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然の供給源から、または操作された細胞株などの供給源から単離され得る。
本明細書で使用される「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも５０％純粋である（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋である、少なくとも９５％純粋である、少なくとも９８％純粋である、または少なくとも９９％純粋である物質を指す。
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの文脈における「由来する」という用語は、特定の供給源からのタンパク質の配列に基づく配列を有するポリペプチドを指す。特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、特定の供給源からのタンパク質の変異体であり得る。例えば、特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、それが由来するタンパク質の配列に関して改変された配列を有し得る。特定の供給源からのタンパク質に由来するポリペプチドは、それが由来するタンパク質との少なくとも５０％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、哺乳動物などの、対象において意図された効果を生み出すのに十分な薬剤（例えば、抗体、ポリペプチド、核酸など）の量を指す。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータに向けられた態様を含む（かつ記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の形態を含む。
本明細書の「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される「および／または」という用語は、ＡおよびＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、ならびにＢ（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用される「および／または」という用語は、以下の態様の各々を包含することが意図されている：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ構築物という用語は、それが細胞内に存在することによりＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）がもたらされ、そのＲＮＡｉ構築物が標的とする転写物の発現の低減につながるＲＮＡ分子およびベクターを包含する。この用語には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびＲＮＡｉ誘導ベクターが含まれる。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、それが細胞内に存在することにより、自己ハイブリダイズまたは互いにハイブリダイズしてｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡの転写をもたらすベクターである。この用語は、プラスミド、例えば、ＤＮＡベクターまたはウイルスベクターを包含する。該ベクターは、そのベクターが細胞内に存在する場合にハイブリダイズまたは自己ハイブリダイズしてｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを形成する１つ以上のＲＮＡ分子が転写されるように、発現シグナルに作動可能に連結された核酸を含み得る。したがって、ベクターは、１つもしくは複数のＲＮＡまたはその前駆体の細胞内合成のためのテンプレートを提供する。
短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、約１９塩基対の長さのＲＮＡ二重鎖を含み、任意で１つまたは２つの一本鎖オーバーハングをさらに含む。ｓｉＲＮＡは、一緒にハイブリダイズする２つのＲＮＡ分子から形成され得るか、あるいは、自己ハイブリダイズする部分を含む単一のＲＮＡ分子から生成され得る。ｓｉＲＮＡの二本鎖部分は、１つ以上の対になっていないヌクレオチドを含み得る。ｓｉＲＮＡの１本の鎖には、完全な相補性または１つもしくは２つのミスマッチを有する標的転写物とハイブリダイズする部分が含まれる。完全な相補性が達成されない態様では、ミスマッチはｓｉＲＮＡ終端またはその近くに位置し得る。
ショートヘアピンＲＮＡという用語は、ＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（通常は、少なくとも１９塩基対の長さ）の二本鎖（デュプレックス）構造を形成するためにハイブリダイズしたまたはハイブリダイズすることができる少なくとも２つの相補的部分と、少なくとも１つの一本鎖部分であって、通常はループを形成する約１～１０ヌクレオチドの長さのものとを含むＲＮＡ分子を指す。二本鎖部分は、１つ以上の対になっていないヌクレオチドからなる１つ以上のバルジを含み得るが、通常は含まない。
本明細書に開示されているのは、乳腺腺房形成の際のＲＯＢＯ受容体の役割の調査である。特に、Ｒｏｂｏ１の喪失は腺房形成を阻害し、Ｒｏｂｏ２の喪失は腺房形成を促進する。ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４に特異的に結合してＮＯＴＣＨ４活性化を阻害することを明らかにする、細胞株における生化学的研究が開示されている。ＲＯＢＯ１は乳腺上皮コンパートメント全体で広く発現していることが示されているが、ＲＯＢＯ２の発現は腺房前駆細胞および基底／筋上皮細胞（ＢＣ）に限定されている。また、ＮＯＴＣＨ４シグナル伝達を阻害し腺房形成を促進するＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の部分を含むＲＯＢＯ１受容体フラグメントも開示されている。ＲＯＢＯ２がＲＯＢＯ１に結合することを阻害する抗体で細胞および哺乳動物を処理することによって腺房形成が増強されることも開示されている。理論に拘束されることなく、本明細書に開示される発見は、ＮＯＴＣＨ４シグナル伝達を調節し、その結果、妊娠ごとに乳汁産生腺房に分化する腺房前駆細胞の数を調節する、阻害回路メカニズム（ＲＯＢＯ２―｜ＲＯＢＯ１―｜ＮＯＴＣＨ４）を示す。
哺乳動物における乳汁産生を増強させる方法
本開示は、哺乳動物における乳汁産生を促進する方法を提供する。特定の態様では、この方法は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第１の薬剤を哺乳動物に投与することを含み得、第１の薬剤は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに十分な量で投与され、それにより乳汁産生を促進する。第１の薬剤は、ＮＯＴＣＨ４タンパク質に直接結合することにより、ＲＯＢＯ２のＲＯＢＯ１への結合を阻害することにより、ＲＯＢＯ１のＮＯＴＣＨ４への結合を促進することにより、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害することにより、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害することにより、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害し得る。
特定の態様では、第１の薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＲＯＢＯ１の細胞外ドメイン全体またはそのＲＯＢＯ２結合フラグメントを含み得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＲＯＢＯ１の少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、例えば、ＲＯＢＯ１の最初の２つのＩｇドメインを含み得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＲＯＢＯ１の少なくとも５つの免疫グロブリンドメインを含み得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトＲＯＢＯ１の細胞外ドメインに由来し得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、配列番号１～２７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性であるアミノ酸配列を含み得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、それに対する１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または最大２０）の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１～２７のいずれか１つの配列を含み得る。特定の態様では、哺乳動物に投与される可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤに対する免疫応答を低減させるために、その哺乳動物によって発現されるＲＯＢＯ１タンパク質の配列に由来し得る。
ＲＯＢＯ１の細胞外領域全体またはそのＲＯＢＯ２結合フラグメントを含み得る可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、任意の手段によって同定され得る。例えば、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに有効な可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＲＯＢＯ２への可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤの結合を測定するためのアッセイを実施することによって同定され得る。アッセイは、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが、完全長ＲＯＢＯ１または配列番号１～２７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有する可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤなどの競合の存在下でＲＯＢＯ２に結合するかどうかを決定することを含み得る。特定の態様では、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに有効な可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＮＯＴＣＨ４への可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤの結合を測定するためのアッセイを実施することによって同定され得る。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤのＲＯＢＯ２および／またはＮＯＴＣＨ４への結合は、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ：：ＲＯＢＯ２複合体および／またはＲＯＢＯ１ ＥＣＤ：：ＮＯＴＣＨ４複合体の形成を検出することによって測定され得る。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤのＲＯＢＯ２および／またはＮＯＴＣＨ４への結合を同定するための他の方法もまた使用され得る。
いくつかの態様では、可溶性ＲＯＢＯ１は、異種ポリペプチドに融合または連結されている。いくつかの態様では、異種ポリペプチドは、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤのアミノ終端、カルボキシル終端、または両方の終端に連結している。本明細書で使用される場合、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤの文脈で使用される可溶性という用語は、細胞表面局在化に必要な膜貫通領域を欠いているため、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが細胞表面に局在化されていないか、局在化することができないことを意味する。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＲＯＢＯ１の細胞内領域の配列も欠いている。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃポリペプチド（例えば、ＩｇＧ１ ＦｃなどのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ）、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミンもしくはウシ血清アルブミン）、またはマルトース結合タンパク質に融合され得る。特定の態様では、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ポリペプチドの精製または追跡を容易にするタンパク質タグに融合され得る。このようなタンパク質タグには、Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、Ｆｃ領域（ヒト、ウシ、ヒツジ、またはヤギ抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＤに由来するＩｇに由来する）、またはＭｙｃタグが含まれる。
いくつかの態様では、第１の薬剤は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する抗ＮＯＴＣＨ４抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントであり得る。本明細書で使用される場合、抗体という用語は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、その抗原結合フラグメントを包含する。いくつかの態様では、抗体は、抗原上の異なるエピトープに結合する複数のポリクローナル抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は組換え抗体である。いくつかの態様では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様では、抗体はキメラ抗体である。特定の態様では、抗体は、その抗体を受け入れる哺乳動物における免疫原性の減少を提供するように改変されている。いくつかの態様では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様では、抗体はウシ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はウシ抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒツジ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヒツジ抗体である。いくつかの態様では、抗体はヤギ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はヤギ抗体である。いくつかの態様では、抗体はラクダ化抗体である。いくつかの態様では、抗体はラクダ抗体である。いくつかの態様では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体である。いくつかの態様では、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの態様では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの態様では、抗体は、少なくとも１つの抗原結合部位を含む抗体フラグメントである。いくつかの態様では、抗体は、ｓｃＦｖである。いくつかの態様では、抗体は、ジスルフィド結合ｓｃＦｖである。いくつかの態様では、抗体は、Ｆａｂである。いくつかの態様では、抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。
いくつかの態様では、第１の薬剤は、ＮＯＴＣＨ４に結合するポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、当業者に知られている任意の方法によって調製され得る。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、複数の皮下または腹腔内注射を使用して、動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、ロバ）を目的の抗原（例えば、精製ペプチドフラグメント、組換えタンパク質、または融合タンパク質）で免疫化することによって産生される。いくつかの態様では、抗原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などの担体にコンジュゲートされている。抗原（担体タンパク質の有無にかかわらず）は、滅菌生理食塩水で希釈され、通常はアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）と組み合わされて安定なエマルジョンを形成する。一定期間後、免疫化された動物から（例えば、血液または腹水から）ポリクローナル抗体が回収される。いくつかの態様では、ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および／または透析を含むがこれらに限定されない、当該技術分野における標準的な方法に従って血清または腹水から精製される。
いくつかの態様では、第１の薬剤は、ＮＯＴＣＨ４に結合するモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている任意の方法によって調製され得る。いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、当業者に知られているハイブリドーマ法を使用して調製される。マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、上記のように免疫化される。いくつかの態様では、リンパ球が、インビトロで免疫化される。いくつかの態様では、免疫化抗原は、ヒトタンパク質またはそのフラグメントである。免疫化に続いて、リンパ球が単離され、例えば、ポリエチレングリコールを使用して適切な骨髄腫細胞株と融合される。当該技術分野で知られている特殊な培地を使用してハイブリドーマ細胞が選択され、融合していないリンパ球および骨髄腫細胞はこの選択プロセスで生き延びない。選択した抗原に特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫沈降、イムノブロッティング、およびインビトロ結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ＳＰＲ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）およびラジオイムノアッセイ）を含むがこれらに限定されない様々な方法によって同定され得る。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定されると、クローンは、限界希釈または他の技術によってサブクローン化され得る。ハイブリドーマは、標準的な方法を使用したインビトロ培養で、または動物の腹水腫瘍としてインビボのいずれかで増殖され得る。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および透析を含むがこれらに限定されない当該技術分野の標準的な方法に従って、培養培地または腹水から精製され得る。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、当業者に知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作製される。例えば、抗体をコードするポリヌクレオチドが、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＲＴ－ＰＣＲなどによって成熟Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、それらの配列は標準的な技術を使用して決定される。次に、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは、通常なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば大腸菌、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など）にトランスフェクトされたときにモノクローナル抗体を産生する、適切な発現ベクターにクローン化される。
いくつかの態様では、組換えモノクローナル抗体は、所望の種（例えば、ウシまたはヒト）の可変ドメインまたはＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離される。ファージライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で知られている様々な技術によって達成され得る。
いくつかの態様では、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ技術を使用して代替抗体を生成することによって改変される。いくつかの態様では、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインが、キメラ抗体を生成するために、ヒト抗体、ヒツジ抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体、またはラクダ抗体の定常領域で置き換えられる。いくつかの態様では、定常領域は、モノクローナル抗体の所望の抗体フラグメントを生成するために切断されるかまたは除去される。いくつかの態様では、モノクローナル抗体の特異性および／または親和性を最適化するために可変領域の部位特異的または高密度突然変異誘発が使用される。
いくつかの態様では、抗ＮＯＴＣＨ４抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体を生成するための様々な方法が当該技術分野で知られている。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその配列に導入された１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ヒト化は、ヒト抗体のＣＤＲ配列の１つ以上のアミノ酸を非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）からの対応するアミノ酸に置換することによって行われる。いくつかの態様では、ヒト化抗体は、ヒト抗体の６つのＣＤＲすべてを、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のＣＤＲからの対応するアミノ酸で置換することによって構築される。
ヒト化抗体を生成するために使用されるヒト重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の選択は、様々な要因に基づいて、かつ当該技術分野で知られている様々な方法によって行われ得る。いくつかの態様では、「ベストフィット」法が使用され、非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の可変領域の配列が、既知のヒト可変領域配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。非ヒト（例えば、げっ歯類）配列の配列に最も類似しているヒト配列が、ヒト化抗体のヒト可変領域フレームワークとして選択される。いくつかの態様では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定の可変領域フレームワークが、可変領域フレームワークとして選択される。いくつかの態様では、可変領域フレームワーク配列は、最も豊富なヒトサブクラスのコンセンサス配列に由来する。いくつかの態様では、ヒト生殖系列遺伝子が可変領域フレームワーク配列の供給源として使用される。
いくつかの態様では、抗ＮＯＴＣＨ４抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して調製され得る。いくつかの態様では、ヒト抗体は、インビトロで免疫化された不死化ヒトＢリンパ球から生成される。いくつかの態様では、ヒト抗体は、免疫化された個体から単離されたリンパ球から生成される。いずれにしても、標的抗原に対する抗体を産生する細胞が生成および単離され得る。いくつかの態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、そのファージライブラリーはヒト抗体を発現する。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生することができる。抗体ファージライブラリーの生成および使用のための技術は、当該技術分野でよく知られている。抗体が同定されると、鎖シャッフリングおよび部位特異的突然変異誘発を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている親和性成熟戦略を使用して、より親和性の高いヒト抗体を生成し得る。いくつかの態様では、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックマウスにおいて産生される。免疫化の際に、これらのマウスは、内因性免疫グロブリン産生がなくても、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。
特定の態様では、抗体は、ウシ化抗体または完全ウシ抗体であり得る。非ウシ抗体からウシ化抗体を産生するための方法は、非ウシ抗体からのＣＤＲを保持するキメラ抗体を形成することを含み得、一方、抗体の他の領域は、ウシ抗体から１つ以上のアミノ酸残基を導入して、ウシ抗体からの対応する配列で置き換えられ得る。特定の態様では、非ウシ抗体は、定常領域をウシ抗体からの定常領域で置き換えることによってウシ化され得る。特定の態様では、非ウシ抗体は、定常領域をウシ抗体からの定常領域で置き換え、かつフレームワーク領域をウシ抗体からのフレームワーク領域で置き換えることによって、ウシ化され得る。特定の態様では、ウシ化抗体は、ウシ抗体のＣＤＲを非ウシ抗体からのＣＤＲで置き換えることによって生成され得る。場合によっては、抗体は、ウシ抗体をコードする遺伝子配列を使用して産生される完全ウシ抗体であり得る。完全ウシ抗体は、ウシ、ウシ細胞株、ウシ抗体を発現するように遺伝子改変された非ウシ細胞株、またはウシ抗体を発現するように遺伝子改変されたトランスジェニック非ウシ動物において産生され得る。同様の方法を使用して、種に投与されたときに抗体に対する免疫応答が低減する種特異的抗体を生成することができる。例えば、ヒツジ、ヤギ、およびラクダにそれぞれ抗体を投与する目的で、ヒツジ抗体、ヤギ化抗体、ラクダ化抗体を産生することができる。
抗体のＣＤＲは、様々な方法／システムを使用して当業者によって定義される。これらのシステムおよび／または定義は、何年にわたって開発および改良されており、それらにはＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、およびＣｏｎｔａｃｔが含まれる。Ｋａｂａｔの定義は、シーケンスの変動性に基づいており、一般的に使用されている。Ｃｈｏｔｈｉａの定義は、構造的ループ領域の位置に基づいている。ＩＭＧＴシステムは、可変ドメインの構造内の配列変動性および位置に基づいている。ＡｂＭの定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの間の妥協点である。Ｃｏｎｔａｃｔの定義は、利用可能な抗体の結晶構造の分析に基づいている。Ｅｘｅｍｐｌａｒｙシステムは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの組み合わせである。抗体配列の分析およびＣＤＲの決定のためにソフトウェアプログラム（例えばａｂＹｓｉｓ）が利用可能であり、当業者に知られている。
本明細書で定義される特定のＣＤＲ配列は、一般に、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの定義の組み合わせ（Ｅｘｅｍｐｌａｒｙシステム）に基づいている。しかしながら、特定の抗体の１つもしくは複数の重鎖ＣＤＲおよび／または１つもしくは複数の軽鎖ＣＤＲへの言及は、当業者に知られているすべてのＣＤＲ定義を包含することが理解されるであろう。
いくつかの態様では、抗ＮＯＴＣＨ４抗体は、少なくとも１つ以上の定常領域が改変または欠失されている抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は、３つの重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３）のうちの１つ以上および／または軽鎖定常領域（ＣＬ）の改変を含み得る。いくつかの態様では、改変された抗体の重鎖定常領域は、少なくとも１つのヒト定常領域を含む。いくつかの態様では、改変された抗体の重鎖定常領域は、複数のヒト定常領域を含む。いくつかの態様では、定常領域の改変は、１つ以上の領域における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含む。いくつかの態様では、１つ以上の領域が、改変された抗体の定常領域から部分的にまたは完全に欠失される。いくつかの態様では、ＣＨ２ドメイン全体が、抗体から除去されている（ΔＣＨ２構築物）。いくつかの態様では、削除された定常領域は、通常ならその不在となった定常領域によって与えられる分子柔軟性のいくらかを提供する、短いアミノ酸スペーサーによって置き換えられる。いくつかの態様では、改変された抗体は、抗体のヒンジ領域に直接融合されたＣＨ３ドメインを含む。いくつかの態様では、改変された抗体は、ヒンジ領域と改変されたＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインとの間に挿入されたペプチドスペーサーを含む。
抗体の定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介し、これらのエフェクター機能が抗体のアイソタイプに応じて変化し得ることが当該技術分野で知られている。例えば、補体のＣ１成分がＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（抗原に結合）のＦｃ領域に結合すると、補体系が活性化される。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用および溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫性過敏症に関与する可能性がある。さらに、抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する細胞に結合し得る。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む様々なクラスの抗体に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。抗体が細胞表面上のＦｃ受容体に結合すると、抗体被覆粒子の貪食と破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害性またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む多くの重要で多様な生物学的反応が引き起こされる。
いくつかの態様では、抗ＮＯＴＣＨ４抗体は、変異体Ｆｃ領域を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のＦｃ領域のアミノ酸配列は、当業者に知られている。いくつかの態様では、変異型Ｆｃ領域は、変更されたエフェクター機能を提供し、それは次に、抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様では、定常領域の欠失または不活性化（点突然変異または他の手段による）が、抗体が循環するときに、改変された抗体のＦｃ受容体結合を低減または排除する。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体の血清半減期を増加させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体の血清半減期を減少させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のＡＤＣＣおよび／または補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を減少、低減、または除去する。いくつかの態様では、対応するＩｇＧ２またはＩｇＧ４残基を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域における特定のアミノ酸置換が、改変された抗体におけるエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）を低減させ得る。いくつかの態様では、抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有しない。いくつかの態様では、抗体は、ＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有しない。いくつかの態様では、抗体は、Ｆｃ受容体および／または補体因子に結合しない。いくつかの態様では、抗体は、エフェクター機能を有しない（例えば、「エフェクターレス」抗体）。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のエフェクター機能を増加または増強させる。いくつかの態様では、定常領域改変は、抗体のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを増加または増強させる。いくつかの態様では、定常領域は、ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を排除するように改変される。いくつかの態様では、定常領域は、１つまたは複数のアミノ酸を付加／置換して、１つまたは複数の細胞毒素、オリゴ糖、または炭水化物付着部位を提供するように改変される。
本明細書に記載の抗体の定常領域への改変は、周知の生化学的または分子工学的技術を使用して行うことができる。いくつかの態様では、抗体変異体は、適切なヌクレオチド変化をコードＤＮＡに導入することによって、および／または所望の抗体またはポリペプチドの合成によって調製される。この技術を使用して、改変抗体の構造、結合活性、および他の所望の特性を実質的に維持しながら、特定の配列または領域によって提供される活性またはエフェクター機能を破壊することが可能となり得る。
本開示は、本明細書に記載の組換え、モノクローナル、キメラ、ヒト化、およびヒト抗体、またはそれらの抗体フラグメントに実質的に相同である追加の変異体および等価物をさらに包含する。いくつかの態様では、抗体の結合親和性を改善することが望まれる。いくつかの態様では、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性、および／または溶解性を含むがこれらに限定されない、抗体の生物学的特性を調節することが望まれる。当業者は、アミノ酸の変化が、グリコシル化部位の数もしくは位置の変化または膜固定特性の変化などの、抗体の翻訳後プロセスを変化させ得ることを理解するであろう。変異は、天然の抗体またはポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、抗体またはポリペプチドをコードする１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る。いくつかの態様では、アミノ酸置換は、ロイシンをセリンで置換することのような、あるアミノ酸を類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換すること、例えば保存的アミノ酸置換の結果である。本明細書に記載の変異体抗体またはポリペプチドは、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング変異誘発、およびＰＣＲ変異誘発を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている方法を使用して生成され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤は、化学的に修飾される。いくつかの態様では、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、および／または細胞リガンドもしくは他のタンパク質への連結によって化学的に修飾された可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤおよび／または抗ＮＯＴＣＨ４抗体。多数の化学的修飾のいずれも既知の技術によって行われ得る。
いくつかの態様では、方法は、哺乳動物種における乳汁産生を増加させることを含み得、哺乳動物種は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヤギを含み、この方法は、哺乳動物種に、それぞれヒトＲＯＢＯ１、ウシＲＯＢＯ１、ヒツジＲＯＢＯ１、ヤギＲＯＢＯ１、またはヤギＲＯＢＯ１に由来する可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤを投与することを含み得る。特定の態様では、哺乳動物は、乳汁産生に適した発育段階の雌である。例えば、哺乳動物は、乳腺を発育させた女性であり得る。特定の態様では、哺乳動物は、ヒト女性、乳牛、雌牛、雌羊、または雌ラクダである。特定の態様では、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤が哺乳動物に投与されるときに、哺乳動物は妊娠中であり得る。特定の態様では、哺乳動物は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤の投与前に出産した動物であり得る。例えば、哺乳動物は、投与から１～２年以内に、例えば、３ヶ月、６ヶ月、１年、または１８ヶ月以内に出産した動物であり得る。他の態様では、哺乳動物は妊娠していない。いくつかの態様では、哺乳動物は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤の投与前に出産していない。例えば、哺乳動物は、投与後１～２年以内、例えば、３ヶ月、６ヶ月、１年、または１８ヶ月以内に出産していない。
いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなＮＯＴＣＨ４活性を阻害する薬剤は、ＮＯＴＣＨ４ ｍＲＮＡに結合しＮＯＴＣＨ４の発現を減少させる、ＲＮＡｉ構築物であり得る。いくつかの態様では、本明細書に記載されるようなＲＯＢＯ２活性を阻害する薬剤は、ＲＯＢＯ２ ｍＲＮＡに結合しＲＯＢＯ２の発現を減少させる、ＲＮＡｉ構築物であり得る。ＲＮＡｉ構築物は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。ｓｉＲＮＡは、短いトヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡｉ構築物は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。既知遺伝子配列の発現を阻害するためのＲＮＡｉ構築物を作製するための方法は、当業者に知られている。特定の態様では、ＮＯＴＣＨ４の発現を減少させるためのｓｉＲＮＡは、配列番号３２または３３に示される核酸配列を含み得る。特定の態様では、ＲＯＢＯ２の発現を減少させるためのｓｉＲＮＡは、配列番号３４または３５に示される核酸配列を含み得る。特定の態様では、ＲＮＡｉ構築物は、哺乳動物に投与され得る。他の態様において、核酸
特定の態様では、哺乳動物における乳汁産生を促進するための方法は、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する１つ以上の薬剤を投与することを含み得る。特定の態様では、この方法は、第１の薬剤および第２の薬剤のうちの少なくとも１つを投与することを含み得、第１の薬剤および第２の薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、抗ＮＯＴＣＨ４抗体、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物から独立して選択される。特定の態様では、この方法は、第１の薬剤、第２の薬剤、および第３の薬剤のうちの少なくとも１つを投与することを含み得、第１の薬剤、第２の薬剤、および第３の薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、抗ＮＯＴＣＨ４抗体、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物から独立して選択される。特定の態様では、この方法は、第１の薬剤、第２の薬剤、第３の薬剤、および第４の薬剤を投与することを含み得、第１の薬剤、第２の薬剤、第３の薬剤、および第４の薬剤は、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、抗ＮＯＴＣＨ４抗体、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物から独立して選択される。
ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するための１つ以上の薬剤は、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射またはインプラント）、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内（例えば、実質内）および脳室内）、経口、経鼻、腟内、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば、皮下）、舌下および吸入を含む、任意の適切な経路を介して、乳汁産生を促進するために哺乳動物に投与され得る。特定の態様では、１つ以上の薬剤は、直接注射、例えば、乳腺組織への注射、例えば、管内注射により投与され得る。
ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するための薬剤およびその組成物
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に開示された方法を実施するために使用され得る薬剤およびその組成物である。
特定の態様では、本明細書に開示されるような可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドは、本明細書に開示されるように異種ポリペプチドに融合され得る。特定の態様では、本明細書に開示されるような可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドをコードする核酸が提供される。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドの説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、当該技術分野で知られている方法を使用して産生され得る。ポリペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、または化学的方法を使用して、全体的または部分的に生成され得る。ポリペプチドを合成するための化学的方法は、自動化された合成器（例えば、Ｂｉｏｔａｇｅ機器）を使用して実行され得る様々な固相技術を使用することを含み得る。ポリペプチドを合成するための化学的方法は、コンビナトリアル方法論を使用することを含み得る。さらに、ポリペプチドは、当業者に知られている多種多様な化学的方法によって修飾され得る。ポリペプチド配列の変異、置換、および／または改変は、部位特異的変異誘発、アラニンスキャニング、および／またはＰＣＲベースの変異誘発などの方法を使用して行われ得る。部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、制限選択変異誘発、および他の技術をクローン化ＤＮＡに対して実行して、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、変異体、融合物、キメラ、およびそれらの他の誘導体を産生することができる。「産生された」または「合成された」ポリペプチド配列は、人の手による操作が関わる任意の方法によって作製されたポリペプチドである。そのような方法には、化学合成、組換えＤＮＡ技術、より大きな分子の生化学的または酵素的断片化、および前述のものの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
ポリペプチド、例えば、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤポリペプチドが組換え技術を使用して生成される場合、該ポリペプチドは、任意の適切な構築物、および原核細胞または真核細胞（それぞれ、細菌（例えば大腸菌）または酵母宿主細胞など）であり得る任意の適切な宿主細胞を使用して、細胞内タンパク質または分泌タンパク質として産生され得る。特定の態様では、ポリペプチドの生成のための宿主細胞として使用される真核細胞には、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および／または植物細胞が含まれる。特定の態様では、哺乳動物宿主細胞が使用され、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞）、マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、およびＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７、およびＣＶ１）ならびにハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）を含み得る。特定の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドは、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞において産生される。特定の態様では、本開示のポリペプチド、例えば、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ヘパリンの存在下で培養された細胞において産生される。例えば、約３００ｎｇ／ｍｌのヘパリンが培養培地に含まれ得る。他の態様では、本開示のポリペプチド、例えば、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、有意な量のヘパリンを含まない培養培地で培養された細胞において産生され、例えば、培養培地は、３００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、または１ｎｇ／ｍｌ未満のヘパリンを含み得、またはヘパリンなしであり得る。
ポリペプチドの発現に適した様々な宿主－ベクターシステムを、当該技術分野で知られている標準的な手順に従って使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓを参照されたい。遺伝物質を宿主細胞に導入するための方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが含まれる。導入されたポリペプチドをコードする核酸の安定した発現を提供するように、移入のための方法を選択することができる。ポリペプチドをコードする核酸は、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供され得、またはゲノムに組み込まれ得る。関心対象のポリペプチドの産生に使用するための様々な適切なベクターが市販されている。
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することができ、または宿主細胞ゲノムへの統合を提供することができる。発現ベクターは、転写調節および翻訳調節配列を提供し、誘導性または構成的発現を提供し得、コード領域が、転写開始領域の転写制御下、ならびに転写および翻訳終端領域下で機能的に連結されている。概して、転写調節配列および翻訳調節配列は、これらに限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたは活性化配列を含み得る。プロモーターは、構成的または誘導的のいずれかであり得、かつ強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
本明細書に提供されるのはまた、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸である。特定の態様では、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドの発現を与えるプロモーター配列に機能的に連結されている。特定の態様では、核酸の配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためにコドン最適化されている。特定の態様では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。特定の態様では、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）である。本明細書に提供されるのはまた、本明細書に記載されるような、乳汁産生を促進するためのポリペプチドをコードする核酸を含むベクターである。特定の態様では、ベクターは、ウイルスベクターである。
特定の態様では、本明細書に開示されるような抗ＮＯＴＣＨ４抗体が提供される。抗ＮＯＴＣＨ４抗体の説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するための抗ＮＯＴＣＨ４抗体は、本明細書に開示されるアッセイおよび／または細胞および動物モデルなどの任意の適切な手段を使用することによって同定され得る。
特定の態様では、本明細書に開示されるような、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物が提供される。そのようなＲＮＡｉ構築物の説明は、前のセクションおよび本明細書の他の場所で提供されており、簡潔にするためにここでは繰り返さない。ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するためのＲＮＡｉ構築物は、本明細書に開示されるアッセイおよび／または細胞および動物モデルなどの任意の適切な手段を使用することによって同定され得る。
本明細書に開示されるのはまた、本明細書に開示されるようなＮＯＴＣＨ４活性の１つ以上の阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。本明細書で使用されるような「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認されまたは承認可能であるか、または米国薬局方、欧州薬局方、またはヒトを含む動物で使用するための他の一般的に認められている薬局方に記載されている物質を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバント」または「許容される医薬担体」という用語は、少なくとも１つの薬剤とともに対象に投与され得、薬剤の薬理学的活性への影響を有しない、賦形剤、担体、またはアジュバントを指す。一般に、当業者およびＵ．Ｓ．ＦＤＡは、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントが、製剤の不活性成分であるとみなしている。
本明細書で使用されるような「医薬製剤」または「医薬組成物」という用語は、薬剤（例えば、抗体）の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にある調製物を指す。医薬製剤または組成物は、一般に、薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバント、緩衝液などの追加の成分を含む。
特定の態様において、ポリペプチドおよび核酸（例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡｉをコードする）は、医薬組成物中に治療有効量で存在する。治療有効量は、組成物の観察された有効性に基づいて決定され得る。治療有効量は、細胞における、例えば、本開示のポリペプチドに応答してレポーターの発現が調節されるレポーター細胞株における、所望の効果を測定するアッセイを使用して決定され得る。医薬組成物は、本明細書に記載の方法および使用を実施するために、エクスビボまたはインビボで哺乳類に投与され得る。
本開示の医薬組成物は、意図された投与方法または投与経路と適合性があるように製剤化され得、例示的な投与経路が本明細書に記載されている。適切な薬学的に許容されるまたは生理学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤には、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、生理食塩水またはクエン酸緩衝食塩水などの適切なビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。
非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分が含まれ得る：注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは、塩酸および水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回投与用バイアルに封入され得る。
注射可能な使用に適した医薬組成物は、典型的には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。
滅菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙された成分の１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒に必要な量で活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および上記に列挙されたものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これは、予め滅菌濾過されたその溶液からの活性成分プラス任意の所望する追加成分の粉末を生じる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的で、活性化合物は、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態で賦形剤とともに組み込まれて使用され得る。うがい薬として使用するための流体担体を使用して、経口組成物を調製することもできる。医薬的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含められ得る。錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテスなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくオレンジフレーバーなどの香味剤。経口送達用の製剤は、胃腸管内の安定性を改善するため、および／または吸収を増強するための薬剤を有利に組み込むことができる。
吸入による投与のために、組成物は、適切な噴霧剤（例えば二酸化炭素などのガス）を含有する加圧容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態での送達のための送達剤とともに製剤化される。
全身投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透するバリアに適した浸透剤が、製剤中に使用される。そのような浸透剤は、一般に、当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与用に、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、スプレー式点鼻剤または坐剤を使用することにより行われ得る。経皮投与の場合、活性化合物および送達剤は、当該技術分野で一般に知られているように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに製剤化される。組成物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いる）または直腸投与のための停留浣腸の形態でも調製され得る。
一態様では、組成物は、例えばインプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤のように、身体からの急速な排除に対して化合物を保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。これらの材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体と共に感染細胞に標的指向化されるリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用され得る。
経口または非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の一様性のために、投与量単位形態で製剤化され得る。本明細書で使用される投与量単位形態は、意図された対象の単一投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体に付随して所望の効果を生み出すように計算された所定量の活性化合物を含む。
上記のように、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの転写のためのテンプレートとして機能する核酸分子は、遺伝子治療ベクターとして使用され得るベクターに挿入され得る。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤをコードする核酸分子もまた、遺伝子治療ベクターとして使用され得るベクターに挿入され得る。一般に、遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与、または定位注射によって対象に送達され得る。特定の態様では、遺伝子治療ベクターおよび送達剤を含む組成物は、経口でまたは吸入により送達され得、それらを分解などから保護するためにカプセル化され得、または他の方法で操作され得る。遺伝子治療ベクターを含む医薬組成物は、許容可能な希釈剤を含み得、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター）、医薬調製物は、その遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含み得る。
医薬組成物は、投与の指示書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含められ得る。
トランスジェニック哺乳動物
特定の態様では、以下の表現型：可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現；ＲＯＢＯ２の発現の阻害；およびＮＯＴＣＨ４の発現の阻害のうちの１つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物が提供される。特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、ネズミ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダであり得る。
特定の態様では、表現型は、乳腺組織に限定される。特定の態様では、表現型の発現を誘導するために乳腺組織特異的プロモーターを使用することによって、表現型は乳腺組織に限定される。
特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、記載された表現型のうちの２つをもたらす２つの遺伝子改変を含み得る。特定の態様では、トランスジェニック哺乳動物は、記載された表現型の３つすべてをもたらす３つの遺伝子改変を含み得る。
特定の態様では、本明細書に開示されるような、乳汁産生を促進するための方法は、本明細書に開示されるように、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する医薬組成物の少なくとも１つをトランスジェニック哺乳動物に投与することを含み得る。
特定の態様では、トランスジェニック動物は、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み得、この方法は、抗ＲＯＢＯ１抗体、および抗ＮＯＴＣＨ４抗体、またはＲＯＢＯ２および／またはＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含む医薬組成物をトランスジェニック動物に投与することをさらに含み得る。
特定の態様では、トランスジェニック動物は、ＲＯＢＯ２および／またはＮＯＴＣＨ４の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み得、この方法は、本明細書に開示されるような可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤを含む医薬組成物をトランスジェニック動物に投与することをさらに含み得る。
トランスジェニック哺乳動物は、当該技術分野で知られている方法を使用して生産され得る。トランスジェニック哺乳動物を生産するための例示的な方法は、以下のステップを含み得る：１）プロモーターの制御下で、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤをコードする核酸、またはＮＯＴＣＨ４もしくはＲＯＢＯ２を標的とするｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡに転写される核酸配列を含む遺伝子構築物を産生するステップ。プロモーターは、乳腺特異的プロモーターまたは遍在的に活性なプロモーターであり得る。２）遺伝子構築物を哺乳動物からの細胞、例えばウシ細胞にトランスフェクトし、遺伝子構築物を組み込んだトランスジェニック細胞を選択するステップ。３）トランスジェニック細胞を、そのトランスジェニック細胞と同じ種（例えばウシ）からの除核卵母細胞と融合させ（例えば、電気パルスを印加することにより）、卵母細胞を胚に発達させるステップ。４）胚と同じ種のレシピエント哺乳動物（例えば、ウシ）に胚を移植するステップ。５）胚がトランスジェニック哺乳動物に発達したことを確認するステップ。
実験
ＲＯＢＯ１は、内腔コンパートメントと基底コンパートメントの両方で発現し、妊娠中にアップレギュレートされる。
以前に発表された研究は、処女動物における分岐形態形成の期間中のＳＬＩＴ／ＲＯＢＯ１シグナル伝達の役割に焦点を合わせている１１、１５、１６。妊娠中のＲＯＢＯ１の役割を調査するために、乳腺から分離された細胞のＲｏｂｏ１ ｍＲＮＡレベルをＲＴ ｑＰＣＲを使用して測定した（図１Ｃ）。細胞を成体の処女および妊娠１８日目（ＰＤ１８）の野生型（ＷＴ）マウスから採取し（図１Ｃに示すように）、３つの亜集団に蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって精製した：管腔前駆細胞（ＬＰ、Ｌｉｎ－ＣＤ２４ｌｏＣＤ２９＋ＣＤ６１＋）、成熟管腔（ＭＬ、Ｌｉｎ－ＣＤ２４ｌｏＣＤ２９＋ＣＤ６１－）、および基底（ＢＣ、Ｌｉｎ－ＣＤ２４＋ＣＤ２９ｈｉ）１７、１８。結果は、管腔前駆細胞および成熟管腔の両方でＲｏｂｏ１のアップレギュレーションを示すが、基底の亜集団では示さない（図１Ｃ）。
組織におけるＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２タンパク質の発現を評価するために、免疫組織化学（図１Ｄ）およびβ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）染色（図１Ｅ）を、マウスのＷＴおよびＲｏｂｏ１ｌａｃＺ／＋成熟処女乳腺の組織切片で実施した。免疫組織化学およびβ－ｇａｌ染色を、妊娠１６日目（ＰＤ１６）（図１Ｆ）および授乳３日目（ＬＤ３）（図１Ｇ）の乳腺切片でも実施した。ＲＯＢＯ１タンパク質は、成熟した処女および妊婦の乳腺の管腔細胞の亜集団で発現される（図１Ｄ－Ｆの矢頭）。基礎的な筋上皮ＲＯＢＯ１の発現は、妊娠中の妊婦および授乳中の乳腺でも観察される（図１Ｆ、Ｇ矢印）。
ＲＯＢＯ１は腺房形成を促進する：
腺房形成中のＲＯＢＯ１機能を調査するために、Ｒｏｂｏ１遺伝子発現がＨＣ１１細胞において阻害された（Ｒｏｂｏ１ ＫＤ）。ＨＣ１１細胞は、授乳の確立されたプロラクチン応答モデルである１９、２０。Ｒｏｂｏ１遺伝子発現が阻害されなかった細胞は、ここではＷＴまたはＲｏｂｏ１＋／＋と呼ばれる。乳汁産生を測定するために、細胞をコンフルエンスになるまで増殖させた後、上皮増殖因子（ＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）で処理することによりプライミングした。ＥＧＦは、チャコールストリッピング化ウシ胎児血清と組み合わせて３日間投与され、その後、ＥＧＦの非存在下で１日チャコールストリッピング化ウシ胎児血清が投与される。次に、これらのプライミングされた細胞は、デキサメタゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）およびプロラクチン（Ｐｒｌ、５μｇ／ｍｌ）培地（ＤＩＰ培地）で３～５日間処理することにより分化する（図２Ａ）。分化（Ｄｉｆ）により、乳汁で満たされたドームの発達がもたらされる（図２Ｂ）。ＤＩＰ培地での処理に応答して、統計的に有意に少ない乳汁ドーム形成および統計的に有意に少ないホエイ酸性タンパク質（ＷＡＰ）遺伝子発現が観察された（図２Ｂ）。細胞を未分化（Ｕｎｄｉｆ）のままにした場合、ＷＴ細胞またはＲｏｂｏ１－／－細胞のいずれにもドーム形成はほとんどなかった（図２Ｂ）。次に、Ｒｏｂｏ１ノックアウトマウス（Ｒｏｂｏ１－／－）および野生型マウス（ＷＴまたはＲｏｂｏ１＋／＋）マウスの組織を分析した。乳腺を妊娠１８日目のＷＴおよびＲｏｂｏ１－／－動物から採取し、腺房形成を、連続切片、カーマイン染色、および組織の上部分、中部分、下部分に位置する切片において腺房が占める面積を定量化することによって分析した。この分析により、ＷＴ乳腺と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－における腺房面積が大幅に低減していることが明らかになった（図２Ｃ）。
この欠陥が乳腺上皮のＲｏｂｏ１阻害によるものであり、ホルモン産生に影響を与える可能性のあるその全身的な欠失に起因するものではないことを確認するために２１、Ｒｏｂｏ１－／－および同腹仔Ｒｏｂｏ１＋／＋マウスの組織を、標準プロトコル２２に従って内因性乳腺上皮が事前に除去された宿主に対側的に移植した。１０週間後、動物を交配させ、妊娠１８日目に組織を検査した。移植されたＲｏｂｏ１－／－ＫＯ乳腺では腺房面積が大幅に減少し（図２Ｄ）、インタクトなＲｏｂｏ１－／－動物の乳腺で観察された結果と同様の結果が得られた（図２Ｃ）。妊娠によって調節される特定のマーカーの発現を評価するために、Ｒｏｂｏ１－／－およびＲｏｂｏ１＋／＋組織を授乳１日目に採取し、ＲＮＡを抽出し、乳汁産生に関与することが知られている遺伝子についてＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。Ｒｏｂｏ１－／－組織では、ＷＡＰ、ラクトアルブミンアルファ（Ｌａｌｂａ）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、ブチロフィリン（Ｂｔｎ１）の有意に低い発現が観察された（図２Ｅ）。
選択されたマーカーを、免疫組織化学を使用してさらに評価した。Ｒｏｂｏ１－／－およびＷＴの妊娠１８日目の乳腺でのＷＡＰ発現は、Ｒｏｂｏ１－／－組織でのＷＡＰ免疫染色が少ないことを示した（図２Ｆ）。移植された妊娠１６日目の組織を、脂質結合タンパク質ペリリピン２（ＰＬＩＮ２）に特異的な抗体で免疫染色した。Ｒｏｂｏ１－／－乳腺組織では、ＰＬＩＮ２免疫染色があまり観察されなかった（図２Ｇ）。
さらに、全臓器組織のクリアリングを使用して、組織の光学的透明度と形態学的保存を最適化した。これに続いて、腺房形成６に必要な転写因子ＥＬＦ５に特異的な抗体を使用し、細胞間接着タンパク質Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）に特異的な抗体を使用した二重免疫組織化学が行われた（図２Ｈ）。Ｒｏｂｏ１＋／＋組織と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－では有意に少ないＥＬＦ５染色が観察された（図２Ｈ）。
Ｒｏｂｏ１の喪失はインビボでの乳汁産生を妨害する：
乳汁産生に対するＲｏｂｏ１発現の影響を評価するために、ヘテロ接合の子が生まれるように交配を行って、その子らはＲｏｂｏ１－／－雌親またはＷＴ雌親のいずれかによって授乳された。ヘテロ接合の子は、ＷＴオスとＲｏｂｏ１－／－メスを交配すること、およびＲｏｂｏ１－／－オスとＷＴメスを交配することによって生まれた。同腹仔の数は５匹に制限され、これらの子の体重は毎日測定された（図２Ｉ）。ＷＴ雌親によって飼育されたヘテロ接合の子は直線的に体重が増加したが、Ｒｏｂｏ１－／－雌親によって飼育されたヘテロ接合の子の体重増加はより少なかった（図２Ｊ）。
ＲＯＢＯ１はＮＯＴＣＨ４シグナル伝達と相互作用し、それを阻害する：
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は用量に非常に敏感であり、その帰結は受容体活性のレベルに依存する２３。リガンド結合後、Ｎｏｔｃｈ受容体は切断によって活性化される。最初に細胞外切断があり、続いてγ－セクレターゼを介した細胞内切断があり、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）が放出され、ＩＣＤは核に入り、転写を調節する。処女乳腺から単離されたＦＡＣＳ精製亜集団のＲＮＡシーケンシング解析は、Ｒｏｂｏ１＋／＋と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－管腔前駆細胞（ＬＰ）亜集団におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達エフェクターＨｅｙ１のより高い発現を明らかにしている（図３Ａ）。
Ｓｃａ／ＣＤ５４マーカーを使用して、ＦＡＣＳで精製した管腔前駆細胞のプールから腺房前駆細胞（ＡＶＰ）を濃縮した。バルク管腔前駆細胞からのデータ（図３Ａ）と同様に、腺房前駆細胞（ＡＶＰ）のＲＴ－ｑＰＣＲ解析により、Ｒｏｂｏ１＋／＋と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－で３つの下流Ｎｏｔｃｈエフェクター（Ｈｅｙ１、Ｈｅｓ１およびＨｅｙ２）の有意に高い発現が明らかになった（図３Ｂ）。同様に、ＨＣ１１細胞では、ＷＴ細胞と比較して、Ｈｅｙ１、Ｈｅｓ１、およびＨｅｙ２の有意に高い発現が、Ｒｏｂｏ１発現の阻害後に観察された（図３Ｃ）。ＨＣ１１細胞におけるＲｏｂｏ１発現の阻害はまた、ＷＴと比較して、分化促進マーカーＥｌｆ５の有意に低い発現をもたらした（図３Ｃ）。これらのデータは、初代細胞および組織培養細胞の両方でのＲｏｂｏ１発現の阻害が、Ｎｏｔｃｈエフェクター遺伝子のアップレギュレーションおよび分化促進Ｅｌｆ５遺伝子のダウンレギュレーションをもたらすことを示し、ＲＯＢＯ１が存在しない場合のＮｏｔｃｈシグナル伝達の活性化をさらに示唆している。
以前の研究は、腺房形成が、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達６、特に、ＮＯＴＣＨ４７～９のダウンレギュレーションを要することを示している。腺房前駆細胞（ＡＶＰ）が処女（Ｖｉｒｇ）および妊娠１８日目（ＰＤ１８）の動物からＦＡＣＳ精製され、Ｎｏｔｃｈ４標的遺伝子Ｈｅｓ１およびＨｅｙ１の発現がＲＴ－ｑＰＣＲによって調べられた（図３Ｄ）。両方のＮｏｔｃｈ標的遺伝子が、処女動物の腺から単離された腺房前駆細胞と比較して、妊娠動物の腺から単離された腺房前駆細胞において有意にダウンレギュレーションされたことが観察された。
ＨＣ１１細胞分化アッセイにおけるＮｏｔｃｈの効果も評価された。Ｒｏｂｏ１発現の阻害（ＫＤ）により、コントロール（Ｓｃｒ）と比較して、ＨＣ１１乳汁ドームの形成の大幅な減少がもたらされた（図３Ｅ）。Ｒｏｂｏ１発現が阻害されたＨＣ１１細胞（ｓｉＲ１）は、コントロール（Ｓｃｒ）と比較して、ＷＡＰおよびＬａｌｂａの発現も少ないことが示された（図３Ｆ）。これらの効果は両方とも、γ－セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ、ＲＯ４９２９０９７）で細胞を処理することによって救済された（ｓｉＲ１＋ＧＳＩ）（図３Ｅ、Ｆ）。このγ－セクレターゼ阻害剤はＮｏｔｃｈシグナル伝達を防止するように作用するものであり、Ｒｏｂｏ１の喪失がＮｏｔｃｈ４シグナル伝達を増強して、γ－セクレターゼ処理によって救済され得る効果をもたらすという概念をさらに支持する。
追加の実験では、Ｎｏｔｃｈ４の発現が、ＨＣ１１細胞で阻害された（ｓｉＮ４）。これらの細胞は、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して、より大きなＷＡＰおよびＬａｌｂａ発現を示した。さらに他の実験では、Ｒｏｂｏ１およびＮｏｔｃｈ４の両方の発現がＨＣ１１細胞で阻害され（ｄＫＤ）、Ｒｏｂｏ１阻害プラスＧＳＩ処理（ｓｉＲ１＋ＧＳＩ）で観察されたＷＡＰとＬａｌｂａの発現レベルと同様に、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較してＷＡＰおよびＬａｌｂａの発現が増加した（図３Ｆ）。Ｎｏｔｃｈ４ノックダウンは、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して、有意に高いドーム数をもたらし（図３Ｇ）、これは、乳汁遺伝子でのより大きな発現と一致した結果である（図３Ｆ）。これらのデータは、ＮＯＴＣＨ４が腺房形成を阻害するモデルを支持する。Ｒｏｂｏ１の発現を阻害すると（ｓｉＲ１）、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して、形成される乳汁ドームが大幅に少なくなった（図３Ｇ）が、Ｒｏｂｏ１およびＮｏｔｃｈ４の両方の発現を同時に阻害すると（ｄＫＤ）、より多くの乳汁ドームが形成され、これはＮｏｔｃｈ４発現の阻害のみ（ｓｉＮ４）で観察されたのと同じ効果であった（図３Ｇ）。総合すると、これらのデータは、ＲＯＢＯ１およびＮＯＴＣＨ４が同じ経路で機能して、ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４を阻害し、ＮＯＴＣＨ４が腺房形成を阻害することで腺房形成を調節することを示唆している。
ノッチ受容体の活性化は、結合パートナーとの直接的な相互作用を通じて調節され得る２４。その結果、ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４に結合し、ＮＯＴＣＨ４の切断および活性化を直接阻害する可能性がある。この可能性を調べるために、４つのＮｏｔｃｈ受容体（ＮＯＴＣＨ１－４）すべての検出可能なレベルを発現するＭＢＡ－ＭＤ－２３１細胞溶解物を使用して、共免疫沈降実験を実施した。内因性ＲＯＢＯ１はＮＯＴＣＨ４と共免疫沈降したが、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３とは共免疫沈降しなかった（図３Ｈ、データは示していない）。次に、ＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）およびＨＥＳ１の発現と細胞内局在を、コントロール（Ｓｃｒ）およびＲｏｂｏ１（ｓｉＲ１）ノックダウンＨＣ１１細胞で調べた。ＨＣ１１細胞でＲｏｂｏ１の発現が阻害され、それからＨＣ１１細胞は上記のように分化のためにプライミングされた。Ｒｏｂｏ１ノックダウン細胞は、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して、核ＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）およびＨＥＳ１の有意に高い発現を示した。この効果は、Ｒｏｂｏ１を過剰発現するように操作されたコントロールＲｏｂｏ１ノックダウン細胞（ｓｉＲ１＋ｏ／ｅ）またはγ－セクレターゼ阻害剤ＧＳＩで処理された細胞（ｓｉＲ１＋ＧＳＩ）では観察されなかった（図３Ｉ～３Ｋ）。
追加の研究は、ＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ４複合体の形成がＨＣ１１分化の時間経過にわたってどのように調節されるかを扱った。発現解析は、ＨＣ１１分化の段階（コンフルエンス、プライミング、乳汁ドーム形成）中に実行された１９、２０。この時間経過にわたるウエスタンブロットによるＲＯＢＯ１、ｐＳＴＡＴ５、およびＮＯＴＣＨ４の細胞内ドメインの解析は、他の段階と比較して、乳汁ドーム形成段階中のＲＯＢＯ１（Ｒ１）およびｐＳＴＡＴ５のレベルが高いことを明らかにした。対照的に、ＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）は、乳汁ドーム形成段階中に低レベルで発現していた（図３Ｌ）。この発見は、ＮＯＴＣＨ４シグナル伝達が腺房形成中に減衰することを示した以前の研究と一致している７～９。抗ＲＯＢＯ１との共免疫沈降を使用して、ＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３の非存在下および存在下の両方で、初期（＋ＥＧＦ）および後期（－ＥＧＦ）の段階のプライミング化細胞および分化（Ｄｉｆ）ＨＣ１１細胞でＮＯＴＣＨ４をプルダウンした（図３Ｍ）。ＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ４複合体形成は、分化した（Ｄｉｆ）ＨＣ１１細胞においてＳＬＩＴ２／ＳＬＩＴ３処理によって影響を受けないようである。しかしながら、未処理の細胞と比較して、後期プライミング細胞（－ＥＧＦ）ではＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３の存在下でＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ４複合体形成はより少なく観察された。ＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ４複合体は、初期プライミング細胞（＋ＥＧＦ）では検出されず、コントロールＩｇＧ免疫沈降物でも検出されなかった。まとめると、これらのデータは、ＲＯＢＯ１が直接結合し、腺房形成中にＮＯＴＣＨ４の切断およびシグナル伝達を阻害し、乳腺上皮細胞の乳汁産生細胞への分化を妨害することを示唆している。
ＲＯＢＯ１は、一次細胞および哺乳動物におけるノッチシグナル伝達を阻害する：
Ｒｏｂｏ１の欠失は、ＮＯＴＣＨ４シグナル伝達を増強し、ＨＣ１１細胞の分化を阻害するため、このプロセスを一次細胞および動物においてさらに評価した。腺房前駆細胞をＦＡＣＳ精製し、マトリゲルに単一細胞密度で播種した後、ニューレグリン（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＲ－スポンジン（４２．５ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で５日間増殖させた。次に、細胞をＤＩＰ培地に切り替え、さらに５日間分化させた２５。Ｒｏｂｏ１－／－腺房前駆細胞から増殖したコロニーは、ＷＴ腺房前駆細胞から増殖したコロニーよりも小さいことが観察され、Ｒｏｂｏ１－／－コロニーはＷＡＰを生成しなかった（図４Ａ）。免疫染色が、培養されたＷＴおよびＲｏｂｏ１－／－初代管腔細胞で実施された。ＷＴ細胞と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－一次細胞の核で有意に高いレベルのＮＯＴＣＨ４細胞内ドメイン（Ｎ４－ＩＣＤ）が検出された（図４Ｂ）。これらの研究は、Ｒｏｂｏ１－／－の腺房前駆細胞（ＡＶＰ）が核内に高レベルのＮＯＴＣＨ４細胞内ドメインを含み、ＷＴの対応物のような乳汁産生オルガノイドを生成しないことを示している。この発見は、Ｒｏｂｏ１－／－乳腺で観察された腺房形成障害と一致している（図２）。
さらなる研究では、Ｒｏｂｏ１－／－表現型を逆転させることを試みてＮｏｔｃｈシグナル伝達が阻害された。乳腺２９を含むいくつかの異なる器官２６～２８においてＮｏｔｃｈを阻害するためにインビボで首尾よく以前に使用されてきたγ阻害剤が選択された。成熟した処女動物を１０ｍｇ／ｋｇのＧＳＩまたはビヒクルコントロール２９で７日間処置した（図４Ｃ）。処置後、乳腺を採取し、ＦＡＣＳおよびｑＰＣＲで解析した。Ｒｏｂｏ１－／－乳腺には、ＷＴコントロールと比較して、より多くの腺房前駆細胞が含まれていることが観察された（図４Ｄ）。Ｒｏｂｏ１－／－動物をガンマセクレターゼ阻害剤で処置すると、これらの動物はＷＴ動物と同じ数の腺房前駆細胞を有していた（図４Ｄ）。ＧＳＩ処置は、ＷＴ動物における腺房前駆細胞の数に影響を与えなかった（図４Ｄ）。
Ｎｏｔｃｈエフェクター遺伝子（Ｈｅｙ１およびＨｅｓ１）の発現の調査によって、ビヒクルで処置した動物と比較して、ＧＳＩで処置した動物ではＮｏｔｃｈエフェクターの発現が少ないことが明らかになった（図４Ｅ）。ＧＳＩ阻害剤はＮｏｔｃｈ受容体を特異的に標的としていないが、この結果は、薬剤が乳腺で作用してＮｏｔｃｈシグナル伝達を低下させることを示している。Ｒｏｂｏ１－／－腺房前駆細胞（ＡＶＰ）は、ビヒクルで処置したＷＴ動物のＡＶＰと比較して、ビヒクルで処置した場合に高レベルのＨｅｙ１およびＨｅｓ１を発現した（図４Ｅ）。この結果は、初代腺房前駆細胞およびＨＣ１１細胞で見られる結果と類似している（図３Ｂ、Ｃ）。ビヒクルで処置したＲｏｂｏ１－／－腺房前駆細胞（ＡＶＰ）は、ビヒクルで処置したＷＴ動物のＡＶＰよりも低レベルのＥｌｆ５を発現した（図４Ｅ）。これは、Ｒｏｂｏ１＋／＋乳腺と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－で低レベルのＥＬＦ５発現が観察され（図２Ｈ）、コントロール（Ｓｃｒ）ＨＣ１１細胞と比較して、Ｒｏｂｏ１ノックダウンで低レベルのＥｌｆ５が観察されたことと一致している（図３Ｃ）。さらなる観察により、ＧＳＩでＲｏｂｏ１－／－動物を処置すると、ビヒクルで処置されたＲｏｂｏ１－／－動物と比較して、変化したＡＶＰ遺伝子発現が逆転し、Ｈｅｙ１およびＨｅｓ１の発現は、ビヒクルで処置されたＲｏｂｏ１－／－動物と比較して、ＧＳＩで処置したＲｏｂｏ１－／－動物からのＡＶＰで低く、一方、Ｅｌｆ５発現は、ビヒクルで処置されたＲｏｂｏ１－／－動物と比較して、ＧＳＩで処置されたＲｏｂｏ１－／－動物からのＡＶＰで高いことが示された（図４Ｅ）。まとめると、この研究は、ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４シグナル伝達を制限していることを示している。Ｒｏｂｏ１が存在しない場合、ＮＯＴＣＨ４が活性化され、この効果は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の薬理学的阻害（図４Ｅ、３Ｅ、３Ｆ、３Ｉ～Ｋ）またはＮｏｔｃｈ４遺伝子発現のノックダウン（図３Ｆ、Ｇ）のいずれかによって逆転される。
ＲＯＢＯ２は腺房形成を阻害する：
動物および細胞におけるＲｏｂｏ２の阻害は、Ｒｏｂｏ１発現の阻害からもたらされる表現型とは反対の表現型をもたらした。ＨＣ１１細胞において、Ｒｏｂｏ２発現の阻害（Ｒｏｂｏ２ ＫＤ）により、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して分化が速くなり、ＷＡＰ発現が高くなり、乳汁ドーム数が多くなった。同じ細胞におけるＲｏｂｏ１およびＲｏｂｏ２の阻害により、乳汁ドームの数がネガティブコントロールと区別がつかなくなった（図５Ａ）。
インタクトなＲｏｂｏ２－／－乳腺および対側的に移植されたＲｏｂｏ２－／－派生物の両方で腺房形成が評価された。腺房面積で測定した場合、Ｒｏｂｏ２＋／＋コントロールの乳腺と比較して、無傷のＲｏｂｏ２－／－乳腺とＲｏｂｏ２－／－移植片の両方で、有意に速い腺房形成が観察された（図５Ｂ）。インタクトな処女Ｒｏｂｏ２－／－乳腺（ＭＧ）での乳汁遺伝子の発現は、Ｒｏｂｏ２＋／＋コントロールよりも高く、一方、Ｒｏｂｏ２－／－インタクト乳腺からのＦＡＣＳ精製腺房前駆細胞（ＡＶＰ）でのＮｏｔｃｈエフェクター遺伝子（Ｈｅｙ１、Ｈｅｓ１、およびＨｅｙ２）の発現は、Ｒｏｂｏ２＋／＋コントロールよりも低かった（図５Ｃ）。
処女乳腺上皮細胞からのＦＡＣＳ精製亜集団においてＲＴ－ｑＰＣＲによってＲｏｂｏ２の発現が評価された。すべての亜集団で発現するＲｏｂｏ１とは異なり、Ｒｏｂｏ２の発現は、より制限されており、腺房前駆細胞（ＡＶＰ）で高レベルで発現し、基底細胞（ＢＣ）でより低いレベルで発現する（図５Ｄ）。管前駆細胞（ＤＰ）での発現は、成熟管腔細胞（ＭＬ）での発現と区別できなかった；ＭＬでの発現は正規化に使用された。組織におけるＲｏｂｏ２の発現を、Ｒｏｂｏ２ｌａｃＺ／＋腺の乳腺切片でのβ－ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）染色によって調べた。Ｒｏｂｏ２の発現は、妊娠１８日目の腺房の管腔細胞の亜集団（図５Ｅ、上）、および引退したブリーダー動物の管に沿って基底に位置する細胞の亜集団（図５Ｅ、下）で観察された。
これらの表現型および発現データについての１つの解釈は、ＲＯＢＯ２が腺房前駆細胞のＲＯＢＯ１を阻害するというものである。分化中、ＲＯＢＯ２はダウンレギュレーションされ、ＲＯＢＯ１を解放し、それがＮＯＴＣＨ４を阻害して、脱抑制回路（ＲＯＢＯ２―｜ＲＯＢＯ１―｜ＮＯＴＣＨ４）を生成する（図５Ｆ左）。言い換えれば、Ｒｏｂｏ２の発現を阻害することで、ＲＯＢＯ１は腺房の分化を促進することができる。Ｒｏｂｏ１の発現を阻害すると、ＮＯＴＣＨ４は腺房の分化を阻害できる。
ＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２の間の相互作用は、ＳＬＩＴによって強化される。
ＳＬＩＴタンパク質とＲＯＢＯタンパク質の相互作用は、ヒトＳＬＩＴ２が哺乳類受容体と同様の親和性でショウジョウバエＲｏｂｏ１に結合し、逆に、ショウジョウバエＳｌｉｔがラットＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２に結合することを示す研究によって証明されるように、進化的に保存されている３０。生化学的研究により、この受容体／リガンド対間の相互作用にはＳｌｉｔの高度に保存された第２のＬＲＲドメインおよびＲｏｂｏの保存されたＩｇ１ドメインが関わることが示され、一方、ＲＯＢＯ１のＩｇ２～Ｉｇ５ドメインおよびすべてのＦＮ３ドメインは結合に必須ではないと見られる３１～３４。さらに、研究によれば、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２は、シス３２、３５、３６およびトランス３７の両方で、互いに結合し得ることが示されている。この相互作用もＩｇドメインに依存する。最近の結晶学の実験は、リガンド未結合ＲＯＢＯが、ＳＬＩＴに応答して開くコンパクトな同型二量体を形成し、ＲＯＢＯ間の「二量体の二量体」の形成を可能にすることを示している３８。
開示されたモデルは、ＲＯＢＯ２がＲＯＢＯ１を阻害することを示している。この阻害が直接相互作用によるものかどうかを調べるために、ＲＯＢＯ１抗体を使用してＨＥＫ細胞の内因性タンパク質に対して共免疫沈降実験を行った。ＲＯＢＯ２抗体により結合されるバンド（グリコシル化形態と見られる）が、ＲＯＢＯ１と共免疫沈降。Ｒｏｂｏ１の発現が阻害されている細胞を使用して免疫沈降を行うと、このバンドの強度は低くなる（図５Ｇ）。ライセート調製および抗ＲＯＢＯ１抗体を使用する免疫共沈降の前に、細胞をＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３（各々１μｇ）で４時間処理すると、ＲＯＢＯ２について２つの強く染色するバンドが観察される。これは、ＳＬＩＴ２およびＳＬＩＴ３がＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２との間のより効率的な相互作用を促進することを示唆している（図５Ｇ）。
ＲＯＢＯ１受容体細胞外ドメインフラグメントはＲＯＢＯ２に結合する：
本明細書に開示された実験は、ＲＯＢＯ１およびＮＯＴＣＨ４がＮＯＴＣＨ４の活性化を阻害する複合体を形成することを示唆しており、２つのタンパク質間の直接的な相互作用を示唆している。以前の研究により、多くの膜貫通受容体の可溶性細胞外ドメインフラグメントが、膜貫通受容体間の同種親和性およびヘテロ親和性相互作用の両方、ならびに膜貫通受容体とそれらのリガンドとの間の相互作用を遮断するように作用することが示された３９。可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）も同様にＲＯＢＯ１とＲＯＢＯ２との相互作用に干渉し得ることが仮定され得る。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤを含む構築物は、ＲＯＢＯ２との結合に関して内因性ＲＯＢＯ１と競合し、それによって、内因性ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４に結合してＮＯＴＣＨ４の活性化を阻害することを可能にし、それによって、腺房の分化を促進して乳汁産生を促進し得る（図５Ｆ右）。可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤはまた、相互に排他的でない態様で、ＮＯＴＣＨ４に直接結合してＮＯＴＣＨ４活性化を阻害し得、これもまた、腺房の分化を促進する結果になる（図５Ｆ右）。したがって、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤは、ＮＯＴＣＨ４の活性化を直接的および間接的に阻害し得る。
３つの組換えＲＯＢＯ１ ＥＣＤコンストラクトが構築された：１つは２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含み（ＲＯＢＯ１－Ｉｇ２）、もう１つは５つすべてのＩｇドメインを含み（ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５）、もう１つは細胞外ドメイン全体を含む（ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ）（図６Ａ）。他の構築物では、ＨＡ（血球凝集素）、Ｍｙｃ、およびヒトとマウスの免疫グロブリンＦｃがＲｏｂｏ１ ＥＣＤに融合された（図６Ａ、５Ｆ右）。２つのＩｇ（ＤＣＣ－Ｉｇ２）または４つのＩｇ（ＤＣＣ－Ｉｇ４）ドメインのいずれかを含みＨＡタグ化された、ＲＯＢＯ１と構造的に類似したＩｇスーパーファミリーメンバーであるＤｅｌｅｔｅｄ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ（ＤＣＣ）の細胞外ドメインが、ネガティブコントロールとして使用するために構築された（図６Ａ、５Ｆ右）。構築物の発現分泌は、ＨＥＫ２９３細胞で構築物を過剰発現させ、細胞溶解物および培地でウエスタンブロットを行うことで確認された（図６Ｂ）。以前の研究によって、細胞を、ヘパラン硫酸の高度に硫酸化されたバリアントであるヘパリンとインキュベートすると、いくつかの細胞外タンパク質の分泌が促進されることが示された４０。本明細書で使用されるＲｏｂｏ１－Ｉｇ５を、ヘパリン（３００ｎｇ／ｍｌ）の非存在下および存在下でＨＥＫ－２９３細胞で発現させた。プラスミドトランスフェクション後２、４、６日目にこれらのＲＯＢＯ１－Ｉｇ５過剰発現細胞から培地を回収した。この可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤの相対的な分泌を評価するために、収集した培地のドットブロット希釈アッセイを実施した（図６Ｃ）。可溶性ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５分泌はこの時間経過にわたって増加し、ヘパリン処理はより多くの分泌の傾向をもたらした（図６Ｃ）。これらのＲＯＢＯ１－Ｉｇ５トランスフェクト細胞からの培地試料はＴＣＡ沈殿されてウエスタンブロットによっても解析され、それは、ヘパリンの非存在下および存在下の両方で培地中での６日後にインタクトなＲＯＢＯ１－Ｉｇ５タンパク質を示した（図６Ｄ）。
ヘパリンの存在下で生成された可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントＲＯＢＯ１－Ｉｇ２およびＲＯＢＯ１－Ｉｇ５をドームアッセイで使用した。結果は、ヘパリンの存在下で生成された可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントが、ヘパリンの非存在下で生成された同じフラグメントよりも少ないドームを形成したことを示した（図６Ｅ）。ヘパリンによる処理は、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ産生に対して控えめなプラスの効果を有するのみで、しかもそれらの機能に対して有害な効果を有していたため（図６Ｃ、Ｅ）、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントを生成するためのヘパリンの使用は追求されなかった。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントがＲＯＢＯ２受容体に結合する能力は、Ｃｏｓ７細胞でＲｏｂｏ２を過剰発現させ、細胞をアジ化ナトリウムで処理してタンパク質の内在化を防止し、固定化および免疫染色の前に細胞をＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ－ＨＡ １Ｈとインキュベートすることによって試験した。ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ－ＨＡはＲＯＢＯ２に結合するが、ＤＣＣ－Ｉｇ２－ＨＡはＲＯＢＯ２に結合しないという結果が示された（図６Ｇ）。
ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは、ＨＣ１１細胞の分化を促進する：
ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントがＮＯＴＣＨ４シグナル伝達に影響を与えるかどうかを判断するために、ＨＣ１１アッセイを実行して、位相差顕微鏡（図７Ａ、Ｂ、上）と、中性脂質に結合する疎水性Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３を使用した蛍光顕微鏡（図７Ａ、Ｂ、下）の両方を使用してドーム形成をモニターした。未分化（Ｕｎｄｉｆ）細胞は、位相差で視認できる相互接続プロセスおよびほとんど／まったくないＢｏｄｉｐｙ染色により区別される（図７Ａ）。分化およびプロラクチン処理の際に、位相差で暗い縁の円として（図７Ｂ、上）、およびＢｏｄｉｐｙ染色によって点状の緑色の円として現れる（図７Ｂ、下）、小さな脂肪滴が蓄積する。ＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏでの処理によって、脂肪滴で完全に囲まれた細胞の数が増えることが、Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３染色により明らかになった（図７Ｂ）。
ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントのタイトレーションに応答したドーム数の形成を定量した。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ２、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５、およびＲＯＢＯ－１－Ｅｃｔｏの濃度が高いほど、ドーム形成率が高くなる。この結果は、ＤＣＣ－Ｉｇ２またはＤＣＣ－Ｉｇ４コントロールＥＣＤフラグメントのいずれかによる処理に応答しては観察されなかった（図７Ｃ～Ｇ）。ウシＲＯＢＯ１－Ｉｇ５コンストラクトもこのアッセイで試験され、ラットコンストラクトと同様に、高濃度のＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ ＥＣＤでの処理に応答してより多くのドームが形成された（図７Ｈ）。まとめると、これらの研究により、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤがＨＣ１１細胞のドーム形成を促進することが示されている。
ドーム形成の促進がより高い乳汁産生ももたらすかどうかを決定するために、ＨＣ１１細胞を、ＤＩＰ培地と同時に細胞に添加されたＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントの存在下または非存在下で分化させた。細胞を採取し、ＷＡＰおよびＬａｌｂａの発現をＲＴ－ｑＰＣＲで評価した。異なるＲＯＢＯ１－ＥＣＤでの処理は、無処理のコントラストと比較して、６～９倍高い発現をもたらした（図７Ｉ、Ｊ）。ＤＣＣ－Ｉｇ４で処理した細胞では、ＷＡＰ発現レベルは増加しなかった（図７Ｋ）。次に、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５およびＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏで処理した細胞に対してＷＡＰおよびＰＬＩＮ２のウエスタンブロット解析を行った。ＲＯＢＯ－１ ＥＣＤで処理した細胞では、ＷＡＰおよびＰＬＩＮ２タンパク質の発現が約２倍に増加することが観察された（図７Ｌ～Ｏ）。
ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する：
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に対するＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントの影響を調べるために、ＨＣ１１細胞をＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントで処理し、Ｎｏｔｃｈエフェクターの発現を評価した。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５およびＲＯＢＯ１－Ｅｃｔｏ処理では、Ｈｅｙ１およびＨｅｓ１発現の低下がもたらされた（図８Ａ）が、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ２で処理した細胞では、この効果は観察されなかった（図８Ａ）。さらに、ＨＣ１１細胞は、分化中にＲＯＢＯ－Ｉｇ５で処理された。次に、これらの細胞を分画し、ウエスタンブロットを行ってＨＥＳ１およびＮＯＴＣＨ４－ＩＣＤを検出した（図８Ｂ）。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５による処理は、コントロール処理と比較して、核画分においてＨＥＳ１およびＮＯＴＣＨ４－ＩＣＤ（Ｎ４－ＩＣＤ）タンパク質の両方のレベルが低くなり、ＮＯＴＣＨ４－ＩＣＤは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理による細胞質画分でも低かった。まとめると、これらの結果は、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤがＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害することを示唆している。
本明細書に開示されるのは、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントがＲＯＢＯ２に結合して、ＲＯＢＯ２が内因性膜貫通ＲＯＢＯ１に結合するのを防止し、それによって、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を妨害するＲＯＢＯ１／ＮＯＴＣＨ複合体の形成を促進するモデルである（図５Ｆ右）。ただし、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントがＮＯＴＣＨ４に直接結合して、ＮＯＴＣＨ４を阻害する可能性もある。したがって、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントがＲＯＢＯ１の非存在下でＮｏｔｃｈを阻害するかどうかを試験するために、Ｒｏｂｏ１の発現をＨＣ１１細胞で阻害した。次に、Ｒｏｂｏ１発現を欠いた細胞をＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントで処理し、それらのドームを形成する能力を評価した。上記で観察されたように（図７Ｃ～Ｅ、Ｈ）、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントで処理すると、コントロール細胞（Ｓｃｒ）のドーム形成が増加した（図８Ｃ）。Ｒｏｂｏ１発現の阻害（ｓｈＲｏｂｏ１）も、上記で観察されたように（図１Ｂ、３Ｅ）、コントロール細胞におけるドーム形成を阻害した（図８Ｃ）。ただし、Ｒｏｂｏ１発現が阻害された（ｓｈＲｏｂｏ１）細胞をＲＯＢＯ１－Ｉｇ５で処理すると、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントで処理したコントロール細胞（Ｓｃｒ）と同じレベルでのドーム形成がもたらされた（図８Ｃ）。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５フラグメントの非存在下でＮｏｔｃｈ４の発現を阻害すると（ｓｈＮｏｔｃｈ４）、上記で観察されたように（図３Ｇ）、コントロール細胞（Ｓｃｒ）と比較して、より大きなドーム形成がもたらされた（図８Ｃ）。これらの細胞（ｓｈＮｏｔｃｈ４）をＲＯＢＯ１－Ｉｇ５で処理すると、未処理のＮｏｔｃｈ４ノックダウン細胞（ｓｈＮｏｔｃｈ４）と同じレベルのドーム形成につながった（図８Ｃ）。これは、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理がＮＯＴＣＨ４の非存在下でＨＣ１１ドーム形成をさらに増加させないことを示唆している。まとめると、これらの結果は、ＮＯＴＣＨ４がＲＯＢＯ１－Ｉｇ５の直接の標的であることを示唆している。
ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは、オルガノイド形成および乳腺分岐を強化する：
初代腺房前駆細胞増殖に対するインビトロでのおよび分岐形態形成に対するインビボでのＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントの影響について試験した。ＦＡＣＳ精製されたマウスおよびウシの腺房前駆細胞（ＡＶＰ）をマトリゲル中で単一細胞としてプレーティングし、ＲＯＢＯ１－ＥＣＤフラグメントの非存在下および存在下で１０日間増殖させた（図９Ａ、Ｂ）。ＲＯＢＯ１－ＥＣＤでの処理は、未処理のコントロールと比較して、より多くのマウスオルガノイドをもたらした（図９Ａ）。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５での処理は、未処理のコントロールと比較して、より大きなウシオルガノイドをもたらした（図９Ｂ）。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５フラグメントは、Ｎｕｔｅｌｌａ中の以下のホルモンを経口投与された卵巣切除動物に皮下注射（７．５乳腺／ｋｇ／日）することによってインビボでも試験された：エストロゲン（Ｅ、１μｇ／日）、プロゲステロン（Ｐ、１ｍｇ／日 乳腺／日）およびプロラクチン（Ｐｒｌ、０．２ｍｇ／日 乳腺／日）（図９Ｃ）。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５フラグメント処理の１４日後に乳腺を採取し、カーマインを染色して評価した。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理は、未処理のコントロールと比較して、有意に大きな面積および多数の一次（１°）分岐をもたらした（図１Ｄ）。腺のより多くの二次（２°）および三次（３°）分岐も観察された。ただし、腺領域のサイズは、分岐が大きい腺の方が大きかったため、処理された腺の全体的な分岐密度は、コントロールのそれと異ならなかった（図１Ｅ）。まとめると、この研究は、インビボでのＲＯＢＯ１－Ｉｇ５処理が有意に多くの枝を有する乳腺をもたらしたことを示している。他の態様では、マウス－Ｆｃ配列でタグ化されたＲＯＢＯ１－ＥＣＤコンストラクトが含まれ得る。このタグは、組織中への輸送を促進する内因性受容体によって認識される４１。
ＲＯＢＯ１細胞外ドメインフラグメントは、小葉腺房乳腺の発達と乳汁産生を増加させる。
妊娠中の小葉腺房の発達に対するインビボでのＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃフラグメントの影響を調査した。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメント（７．５ｍｇ／ｋｇ）および模擬注射されたコントロールは、妊娠中に３回（妊娠日から（ＰＤ）８．５日目、ＰＤ１１．５日目およびＰＤ１４．５日目）皮下注射された（図１０Ａ）。乳腺はＰＤ１７．５日目に採取され、腺房形成は連続切片、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって分析され、次いで、組織の上部、中央部、下部にある切片で腺房が占める面積が定量化された。上記で観察されたように、ＷＴ、模擬注射された乳腺と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－における腺房面積が大幅に低減され、Ｒｏｂｏ１－／－腺房サイズが低減された（図１０Ｂ、Ｃ、Ｆ、矢印、アスタリスク）。ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－ＦｃフラグメントをＷＴ動物およびＲｏｂｏ１－／－動物の両方に注射することで、模擬注射したコントロールと比較して、腺房面積と、乳汁滴で満たされた腺房数とにおいて有意な増加が見られた。
乳汁産生をさらに評価するために、乳汁タンパク質遺伝子のホエイ酸性タンパク質（ＷＡＰ）、キサンチンデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、およびベータカゼイン（ＣＳＮ２）のＲＴ－ｑＰＣＲを実行した。コントロール処理と比較して、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ－Ｆｃ処理では乳汁タンパク質遺伝子発現が有意に増加している（図１１Ａ～Ｃ）。乳汁発現について、乳汁に対する抗体（＃ＹＮＲＭＴＭ、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ）を使用して、切片組織の免疫組織化学によってタンパク質レベルでも評価された。この場合も、ＷＴ動物またはＲｏｂｏ１－／－動物のいずれかにＲＯＢＯ１ ＥＣＤを注射すると、乳汁の有意な増加が観察された（図１１Ｄ～Ｈ）。まとめると、これらのデータは、ＲＯＢＯ１ ＥＣＤフラグメントを妊娠動物に皮下注射すると、小葉腺房の発達、乳汁タンパク質遺伝子および乳汁産生が増加することを示している。
ＲＯＢＯ１は、乳腺の基底細胞で腺房分化および乳汁産生に必要である：
乳腺は、外側の基底細胞（基底コンパートメント）と内側の管腔細胞（管腔コンパートメント）で構成される二層組織である（図１Ａ）。ＲＯＢＯ１発現は、乳腺の管腔細胞および基底細胞の両方で検出された（図１Ｄ～Ｇ）。どの細胞型においてＲＯＢＯ１が腺房前駆細胞から乳汁産生腺房細胞への分化を可能にするように機能するかを決定するために、基底コンパートメントまたは管腔コンパートメントを含む細胞のいずれかがＲｏｂｏ１－／－細胞で構成されるように、ＲＯＢＯ１の発現においてモザイク状であるオルガノイドが生成された（図１２Ｃ、Ｄ）。コントロールとして、ＷＴおよびＫＯ細胞が基底コンパートメントおよび管腔コンパートメントの両方をなすＷＴオルガノイドおよびＲｏｂｏ１－／－オルガノイドが生成された（ＷＴ／ＷＴおよびＫＯ／ＫＯ）（図１２Ａ、Ｂ）。ＷＴ細胞とＫＯ細胞を区別できるように、ＷＴ組織（ＧＦＰ＋／＋）のためにはＡＣＴｂ－ＥＧＦＰマウスをが使用した。オルガノイドは、２つの集団を分離するための分別的トリプシン処理と、それに続いて、分離された基底および管腔亜集団を混合することによって生成し（ＷＴ／ＷＴ、ＫＯ／ＫＯ、ＷＴ／ＫＯ、ＫＯ／ＷＴ）、それからそれらをマトリゲル中で培養した後に５日間分化させた。ＧＦＰ＋／＋基底細胞およびＧＦＰ＋／＋管腔細胞の両方を含むＷＴ／ＷＴオルガノイドは大きな二層オルガノイドを形成し、これは分化させると、管腔を満たす乳汁を産生した（図１２Ａ）。対照的に、Ｒｏｂｏ１－／－基底細胞およびＲｏｂｏ１－／－管腔細胞の両方を含むＫＯ／ＫＯオルガノイドはより小さな二層構造を生成し、これは分化させてもほとんどまたはまったく乳汁を産生しなかった（図１２Ｂ）。Ｒｏｂｏ１－／－基底細胞をＷＴ管腔細胞と混合すると（ＫＯ／ＷＴ）、得られたモザイクオルガノイドは分化時にほとんど／まったくミルクを生成しなかった（図１２Ｃ）。しかしながら、ＷＴ基底細胞をＲｏｂｏ１－／－管腔細胞（ＷＴ／ＫＯ）と混合すると、得られたオルガノイドは、ＷＴ／ＷＴオルガノイドでの乳汁産生（図１２Ａ）と同様に乳汁を産生した（図１２Ｄ）。これらのデータは、ホルモン刺激に際して管腔細胞が乳汁を産生するためには、ＲＯＢＯ１の発現が乳腺の管腔コンパートメントではなく基底コンパートメントで必要であることを示している。
ＲＯＢＯ１は、基底細胞でＪａｇｇｅｄ１の発現を阻害する：
Ｎｏｔｃｈ発現を調節する１つの方法は、ＮｏｔｃｈリガンドＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、またはＤｅｌｔａの発現レベルを制御することである。ＲＯＢＯ１がＮｏｔｃｈリガンド発現を調節するかどうかを調べるために、Ｒｏｂｏ１を発現するプラスミドの量を増加させながら細胞をトランスフェクトさせた。４８時間後、細胞を採取し、ＲＯＢＯ１、ＪＡＧＧＥＤ１（ＪＡＧ１）、ＧＡＰＤＨ（ローディングコントロール）に対する抗体を用いて、イムノブロッティングを行った（図１３Ａ）。データは、ＲＯＢＯ１発現の増加がＪＡＧＧＥＤ１発現の減少をもたらしたことを示している。次に、ｓｉＲＮＡを使用して、Ｒｏｂｏ１の発現をノックダウンさせた。４８時間後の細胞において、ＪＡＧＧＥＤ１およびＪＡＧＧＥＤ発現をイムノブロットで評価した。ＪＡＧＧＥＤ１の発現が増加したことと、ＪＡＧＧＥＤ２の発現の変化がないことが観察された（図１３Ｂ、Ｃ）。ＪＡＧＧＥＤ１のこの調節がインビボで起こるかどうかを調べるために、初代ＷＴおよびＲｏｂｏ１－／－乳腺上皮細胞の亜集団を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して基底、管腔、および間質の亜集団に精製し、次いで、ＪＡＧＧＥＤ１およびＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ１４（ＣＫ１４）（ローディングコントロール）に対するイムノブロットによって解析した（図１３Ｄ）。Ｒｏｂｏ１＋／＋の基底細胞と比較して、Ｒｏｂｏ１－／－ではより多くのＪＡＧＧＥＤ１が観察された。管腔細胞では検出可能な発現は存在せず、間質細胞では中程度の発現のみが存在し、これらのデータは、細胞株でＲｏｂｏ１発現をノックダウンすることによって得られた結果と類似している（図１３Ｂ）。また、Ｒｏｂｏ１＋／＋およびＲｏｂｏ１－／－オルガノイドを免疫染色することにより、ＪＡＧＧＥＤ１発現を評価した（図１３Ｅ、Ｆ）。Ｒｏｂｏ１＋／＋オルガノイドと比較して、Ｒｏｂｏ１－／－の基底細胞ではより多くのＪＡＧＧＥＤ１発現が観察された。まとめると、これらのデータは、ＲＯＢＯ１が乳腺基底細胞におけるＪＡＧＧＥＤ１の発現を阻害し、Ｒｏｂｏ１が失われるとＪＡＧＧＥＤ１が増加することを示している。ＪＡＧＧＥＤ１発現が増加すると、隣接する腺房前駆細胞におけるＮＯＴＣＨシグナル伝達が増強され、それらの乳汁産生腺房細胞への分化が阻害される。したがって、ＲＯＢＯ１が乳汁産生を調節する１つのメカニズムは、乳腺の基底コンパートメント内のＮｏｔｃｈリガンドＪＡＧＧＥＤ１のレベルを支配することによるものである。
材料および方法
動物：
すべての動物の手順は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校（ＵＣＳＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に従って実施された。すべてのＲｏｂｏ１マウスは、上記に記載されるように産生され、遺伝子型決定された１１。
乳腺脂肪パッドのクリアリングおよび移植：
８週齢のＷＴおよびＲＯＢＯ１ ＫＯマウスからの小さな乳腺組織断片を、予めクリアリングされたＦｏｘｎ１ｎｕの脂肪パッドに対側的に移植された。対側派生物は妊娠１８．５日目に採取され、カーマイン染色が施された。
乳腺ホールマウントカルミン－アルミニウムアッセイ：
マウス乳腺を外科的に解剖し、スライドガラス上に広げ、カルノア液（２５％氷酢酸および７５％エタノール）中に固定した。短時間脱水した後、腺を０．２％カルミンと０．５％硫酸アルミニウムカリウムで一晩染色し、エタノールの段階的溶液（７０％、９５％、１００％）で脱水し、トルエンでクリアリングし、パーマウントでマウントした。
脂肪パッド充填解析：
パラフィン包埋されたＲｏｂｏ１ ＫＯまたはＷＴの同腹仔組織または対側派生物を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が施された。ＩｍａｇｅＪを使用して画像を分析し、腺房が占める面積を測定することにより、脂肪パッドの充填率を計算した。
免疫組織化学およびベータガラクトシダーゼ染色：
組織を、４％パラホルムアルデヒドで固定した。パラフィン包埋組織を６μｍで切片化し、連続的にマウントした。免疫組織化学については、標準的なプロトコルに従った。ベータガラクトシダーゼ染色では、４０ｍｇ／ｍｌの５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドを１ＭのＭｇＣｌ２および１０ｍＭのシアン化第一鉄カリウムを含む１Ｍのリン酸緩衝液中で調製した。組織の凍結切片を、３７℃のアテイン溶液で１．５～２４時間処理し、ＰＢＳで洗浄し、エタノールで脱水し、キシレンで固定し、カバーガラスで覆った４２。
顕微鏡観察：
明視野イメージングをＢｉｏｒｅｖｏ ＢＺ－９０００デジタル顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で行い、共焦点顕微鏡観察をＮｉｋｏｎ Ｃ２ Ｃｏｎｆｏｃａｌ、Ｌｅｉｃａ ＳＰ５ ｃｏｎｆｏｃａｌで行った。収集したデータを、ＩｍａｇｅＪを使用して解析した。
共免疫沈降：
付着細胞を、１％Ｉｇｅｐａｌ ＮＰ４０（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭアプロチニン、およびホスファターゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）を添加した１ｍＬの１Ｘ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１３７ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、２ｎＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム）に溶解させた。細胞溶解物を穏やかに揺り動かしながら４℃で１５分間インキュベートした後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。可溶性相を、企業プロトコルに従って、１μｇの抗体と結合したＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ－ｆｉｓｈｅｒ）とともに、室温で１時間、または４℃で４時間インキュベートした。試料を、プロトコルに従って洗浄し、溶出した。溶出したタンパク質複合体を２Ｘ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒと混合し、７０℃で１０分間および１００℃で５分間インキュベートした。
ウエスタンブロッティング：
付着細胞を、５％ベータメルカプトエタノールを添加した１Ｘサンプルバッファーで直接溶解し、５分間煮沸してタンパク質溶解液を調製した。タンパク質溶解液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦに４００ｍＡで９０分間、または３０ｍＡで一晩転写した。一次抗体を表１に示す濃度で使用し、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を１：３０００で使用し、室温で４５分間インキュベートした。すべてのタンパク質は、ＢｉｏＲａｄ Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ ＭＰ Ｉｍａｇｅｒを使用してＣｌａｒｉｔｙ ＥＣＬ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて検出し、上記に記載されるようにＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して定量した４３。
２Ｄ細胞培養：
すべての細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｓｅｒａｄｉｇｍ）および１Ｘ抗生物質－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＤＭＥＭ増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。未分化ＨＣ１１細胞をＲＰＭＩ－１６４０増殖培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養し、１０μｇ／ｍＬウシインスリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した。一次ＬＥＣを、前に記述されたように８週齢のＲｏｂｏ１ ＫＯまたはＷＴ同腹仔から採取した１５。
３Ｄ細胞培養：
ＦＡＣＳ精製ＡＶＰをマトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で５０００細胞／１００ｕＬの密度で培養し、基本培地ＤＭＥＭ：１００ｎｇ／ｍＬニューレグリン（Ｒ＆Ｄ）、４２．５ｎｇ／ｍＬ Ｒ－Ｓｐｏｎｄｉｎ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＦ１２フェノール不含、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、Ｎ２（Ｇｉｂｃｏ）、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）で５日間培養した。培養されたＡＶＰを分化させるために、１０－６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍＬウシインスリン（Ｓｉｇｍａ）、および５μｇ／ｍＬプロラクチン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅプログラム）を添加した基本培地でさらに５日間増殖させた。腺房を、前に記載されたように固定および処理した４４。
ＨＣ１１ドームアッセイ：
ＨＣ１１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＢｉｏＦｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μｇ／ｍＬインスリン（Ｓｉｇｍａ）、および１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で増殖させた。ＨＣ１１細胞における分化を誘導するために、コンフルエントなプレートに、新鮮な培地（５％チャコールストリッピング化ウシ胎児血清（ＢｉｏＦｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μｇ／ｍＬインスリン、および１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ；Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）が３日間与えられ、続いてプライミング培地（５％チャコールストリッピング化ウシ胎児血清（ＢｉｏＦｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５μｇ／ｍＬインスリンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地）で２４時間プライミングされる。プライミング後、ＤＩＰ培地（５％チャコールストリッピング化ウシ胎児血清（ＢｉｏＦｌｕｉｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０－６Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍＬインスリン、および５μｇ／ｍＬプロラクチン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｏｇｒａｍ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地）を２４時間ごとに新鮮な培地で追加した。
レンチウイルス産生：
スクランブル、Ｒｏｂｏ１、Ｒｏｂｏ２、およびＮｏｔｃｈ４のノックダウン実験のためのレンチウイルス粒子産生には、ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ、およびｐＬＶＴＨＭ－スクランブル－ＧＦＰ（ＳＣＲ）またはｐＬＶＴＨＭ－ｓｈ－ｔａｒｇｅｔ ＧＦＰのＨＥＫ２９３Ｔ細胞への組み合わせトランスフェクションが含まれた。次に、濾過した（０．４５ｕｍ）ウイルス粒子を培地で希釈して、標的の乳腺株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＨＣ１１細胞）に感染させた。
乳腺上皮細胞の単離およびフローサイトメトリー：
機械的に解離された鼠径部および胸部乳腺の脂肪パッドが、記載されているようにＦＡＣＳ用の細胞懸濁液中に調製された１７。ＡＶＰを、記載されているように、ＦＩＴＣ－ＣＤ１４（クローンＳａ１４－２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＡＣＰ－Ｃｙ７－ＣＤ１１７（クローン２Ｂ８；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して単離した１４。
インビボガンマセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）：
ＧＳＩ阻害剤（ＲＯ４９２９０９７；ＭｅｄｃｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）は、記載されるように、１０ｍｇ／ｋｇで５日間経口投与された２９。乳腺は、ＧＳＩまたはビヒクル処理の５日後に採取され、単一細胞解析のために調製された。精製された集団を収集し、ＲＮＡ用に処理した。ＦｌｏｗＪｏを使用して、精製された集団数を解析した。
ＲＮＡ抽出およびＲＴ－ｑＰＣＲ：
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で溶解した細胞から回収し、エタノール中に一晩のＲＮＡ沈殿を追加して、メーカーのプロトコルに従って相を分離した（Ｍａｃｉａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。ＲＮＡを、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）処理でさらに精製した。全ＲＮＡの品質をアガロースゲル電気泳動で解析し、ＮＤ－１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）で定量した。ｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、１μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを調製した。定量的ＲＴ－ＰＣＲは、ライトサイクラー４８０ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉマスター（Ｒｏｃｈｅ）を使用して３回実行し、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ’Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＳｙｓｔｅｍおよびＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して定量化した。結果はＧＡＰＤＨに対して正規化された。
ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン生成：
タンパク質フラグメントを生成するために、関心対象のフラグメントに対応するプラスミドでＨＥＫ細胞をトランスフェクトした。Ｃｙｔｏｇｒａｐｈｉｃａプロトコルに従ってＰＥＩトランスフェクションを行った。トランスフェクションの２４時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭに交換した。トランスフェクションの８日後、培地を回収し、３０００ｘｇで１０分間遠心分離した。次に、上清を０．４５μｍ ＰＶＤＦフィルターで濾過した。
ＴＣＡ沈殿：
１容量のＴＣＡストックを４容量のタンパク質サンプルに追加する。４℃で１０分間インキュベートする。１４Ｋｒｐｍで５分間マイクロ遠心機でチューブを回転させる。タンパク質ペレットをインタクトのまま残して、上清を除去し、２００μｌの冷アセトンでペレットを洗浄する。マイクロフュージで、１４Ｋｒｐｍで５分間回転させる。合計２回のアセトン洗浄のために、ステップ４～６を繰り返す。サンプルバッファーに懸濁する前にペレットを乾燥させる。
Ｂｏｄｉｐｙ ４９３／５０３染色：
細胞を半分の体積のバッファーまたは培地に入れる。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＢＯＤＩＰＹ（商標）４９３／５０３色素の２Ｘ溶液（２μｇ／ｍｌ＝７．６μＭ）を、０．５ｍＬの加温した同じバッファーまたは培地（細胞なし、ＢＳＡも血清もなし）中に作製し、勢いよく混合してこの溶液を機械的に乳化させる。すぐに細胞の溶液に加え、混合し、最大３０分間インキュベートする。
ＣＵＢＩＣ免疫蛍光法：
腺を採取し、１０％中性緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で４℃で一晩固定した。固定を、０．２％グリシン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００；Ｓｉｇｍａ）で２Ｘ１０分間クエンチした。次に、腺をＣＵＢＩＣ試薬１Ａ中３７℃で４８時間インキュベートし、続いて、記載されているように、ＰＢＳＴで３×１０分間洗浄した４５。腺をＰＢＳＴ／１０％ロバ血清（Ｓｉｇｍａ）で４℃で一晩ブロックし、次にＰＢＳＴ／５％ロバ血清中の一次抗体とともに４℃で４８時間インキュベートした。次に、腺をＰＢＳＴで３Ｘ１時間洗浄し、ＰＢＳＴ／５％ロバ血清で希釈した二次抗体とともに４℃で２４時間インキュベートした。ＤＮＡを対比染色するために、腺をＰＢＳＴで希釈したＨｏｅｃｈｓｔと共に１時間インキュベートし、次にＰＢＳＴで２Ｘ１時間洗浄した。最後に、腺を、それらが透明になるまで、通常は２４時間、ＣＵＢＩＣ試薬２とともに４℃でインキュベートした。
管内注射：
注射の準備：イソフルランチャンバーを使用してマウスを麻酔し、眼の潤滑剤を適用した。マウスは、ノーズコーンを介して酸素中の２～４％イソフルランで継続的に麻酔された。Ｎａｉｒケミカルヘアリムーバーで乳頭領域から毛を除去する。注射：妊娠７日目に、ＰＢＳまたはＲＯＢＯ２ ｍＡｂを、５０μｌの注射器に取り付けられた３３ゲージの斜角針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、腺＃３、＃４、＃５の乳首に両側から注射する。注射は非常にゆっくりと（約４０μｌ／分）行い、管腔内で急速に移動する流体によって引き起こされる可能性のある損傷を最小限に抑えた。注射後：動物をノーズコーンから取り出し、回復のために別のケージに移す４６。
卵巣摘出、ホルモン処理および皮下注射：
Ｃ５７ＢＬマウス（８～１０週齢）を両側卵巣切除し、１週間回復させた４７。回復中、マウスはＮｕｔｔｅｌｌａの経口投与で訓練された。マウスに、１７ベータ－エストラジオール（Ｅ、１μｇ、Ｓｉｇｍａ）＋プロゲステロン（Ｐ、１ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を混合したＮｕｔｅｌｌａを３週間（毎日）与えた。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５ ＥＣＤの場合、プロラクチン（Ｐｒｌ、２００μｇ、ＮＨＰＰ）が、１週間のＥ＋Ｐの後に開始して、１週間にわたって（毎日）Ｎｕｔｅｌｌａの経口投与によって投与された。ＲＯＢＯ２ ｍＡｂの場合、プロラクチン（Ｐｒｌ、５０μｇ）を、１週間のＥ＋Ｐの後に開始して、２．５週間にわたって（毎日）腹腔内注射によって注射した。ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５ ＥＣＤは、Ｅ＋Ｐの１週間後に開始して、２週間にわたって皮下注射した（７．５ｍｇ／ｋｇ、ＲＯＢＯ１－Ｉｇ５ ＥＣＤまたはＰＢＳ；毎日）。ＲＯＢＯ２ ｍＡｂまたはＩｇＧアイソタイプコントロールｍＡｂ（２５０μｇ／マウス）は、１週間のＥ＋Ｐ後に開始して、１７日間にわたって週２回皮下注射した４８。

参考文献：
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１３ Ｂｉｔｅａｕ，Ｂ．＆ Ｊａｓｐｅｒ，Ｈ．Ｓｌｉｔ／Ｒｏｂｏ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ７，１８６７－１８７５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１４．０５．０２４（２０１４）．
１４ Ｓｈｏｒｅ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｅｇｎａｎｃｙ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ＰＩＮＣ） ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｒｅｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ２ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ ８，ｅ１００２８４０，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｇｅｎ．１００２８４０（２０１２）．
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１６ Ｂａｌｌａｒｄ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｍｍａｒｙ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｓｅｌｆ－Ｒｅｎｅｗａｌ Ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｓｌｉｔ２／Ｒｏｂｏ１ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＮＡＩ１ ａｎｄ ｍＩＮＳＣ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ １３，２９０－３０１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１５．０９．００６（２０１５）．
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１８ Ｓｔｉｎｇｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４３９，９９３－９９７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０４４９６（２００６）．
１９ Ｂａｌｌ，Ｒ．Ｋ．，Ｆｒｉｉｓ，Ｒ．Ｒ．，Ｓｃｈｏｅｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．Ａ．，Ｄｏｐｐｌｅｒ，Ｗ．＆ Ｇｒｏｎｅｒ，Ｂ．Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａ－ｃａｓｅｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ １２０－ｋｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ａ ｃｌｏｎｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．ＥＭＢＯ Ｊ ７，２０８９－２０９５（１９８８）．
２０ Ｄｅｓｒｉｖｉｅｒｅｓ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２，１０３９－１０５４，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ３０００３２－ＭＣＰ２００（２００３）．
２１ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．＆ Ｄｕｎｃａｎ，Ｗ．Ｃ．Ｔｈｅ ＳＬＩＴ－ＲＯＢＯ ｐａｔｈｗａｙ：ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ １３９，６９７－７０４，ｄｏｉ：１０．１５３０／ＲＥＰ－１０－００１７（２０１０）．
２２ Ｄｅｏｍｅ，Ｋ．Ｂ．，Ｆａｕｌｋｉｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｊｒ．，Ｂｅｒｎ，Ｈ．Ａ．＆ Ｂｌａｉｒ，Ｐ．Ｂ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｆｒｏｍ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ ａｌｖｅｏｌａｒ ｎｏｄｕｌｅｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｇｌａｎｄ－ｆｒｅｅ ｍａｍｍａｒｙ ｆａｔ ｐａｄｓ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ Ｃ３Ｈ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９，５１５－５２０（１９５９）．
２３ Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｒ．＆ Ｌｅｎｄａｈｌ，Ｕ．Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ ｉｎ ｄｅｓｉｇｎ，ｖｅｒｓａｔｉｌｉｔｙ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３８，３５９３－３６１２，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．０６３６１０（２０１１）．
２４ Ｃｈｉｌｌａｋｕｒｉ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｄ．，Ｌｅａ，Ｓ．Ｍ．＆ Ｈａｎｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ａ．Ｎｏｔｃｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２３，４２１－４２８，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１２．０１．００９（２０１２）．
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２６ Ｂｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｂｒｏｗｎｉｎｇ ｏｆ ｗｈｉｔｅ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０，９１１－９１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３６１５（２０１４）．
２７ Ｈｕａｎｇ，Ｒ．，Ｚｈｏｕ，Ｑ．，Ｖｅｅｒａｒａｇｏｏ，Ｐ．，Ｙｕ，Ｈ．＆ Ｘｉａｏ，Ｚ．Ｎｏｔｃｈ２／Ｈｅｓ－１ ｐａｔｈｗａｙ ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ａｎｄ ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＤＡＰＴ ｈａｓ ａ ｎｅｐｈｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ．Ｒｅｎ．Ｆａｉｌ．３３，２０７－２１６，ｄｏｉ：１０．３１０９／０８８６０２２Ｘ．２０１１．５５３９７９（２０１１）．
２８ Ｃｈｅｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｔｃｈ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ａ ｇａｍｍａ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７，ｅ４６５１２，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４６５１２（２０１２）．
２９ Ｒｅｇａｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ａｕｒｏｒａ Ａ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｍａｍｍａｒｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｂｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｍｉｔｏｔｉｃ ｓｐｉｎｄｌｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｎｏｔｃｈ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ４，１１０－１２３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｒｅｐ．２０１３．０５．０４４（２０１３）．
３０ Ｂｒｏｓｅ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｌｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｉｎｄ Ｒｏｂｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｈａｖｅ ａｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ｃｅｌｌ ９６，７９５－８０６（１９９９）．
３１ Ｈｏｗｉｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｃｌｏｕｔ，Ｎ．Ｊ．＆ Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｒｏｂｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｓｌｉｔ．ＥＭＢＯ Ｊ ２３，４４０６－４４１２，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｍｂｏｊ．７６００４４６（２００４）．
３２ Ｌｉｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｇ ｄｏｍａｉｎｓ １ ａｎｄ ２ ｏｆ Ｒｏｂｏ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ（Ｓｌｉｔ） ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２６，２３２－２４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｃｎ．２００４．０１．００２（２００４）．
３３ Ｍｏｒｌｏｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｓｌｉｔ－Ｒｏｂｏ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０４，１４９２３－１４９２８，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０７０５３１０１０４（２００７）．
３４ Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｎ．，Ｈｏｗｉｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｓ．Ａ．＆ Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｌｉｔ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １ ａｎｄ ２ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｒｏｂｏ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８３，１６２２６－１６２３４，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ８００６８８２００（２００８）．
３５ Ｈｉｖｅｒｔ，Ｂ．，Ｌｉｕ，Ｚ．，Ｃｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｐ．＆ Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ，Ｖ．Ｒｏｂｏ１ ａｎｄ Ｒｏｂｏ２ ａｒｅ ｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ａｘｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１，５３４－５４５（２００２）．
３６ Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ａ．＆ Ｂａｓｈａｗ，Ｇ．Ｊ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｒｏｂｏ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ａｘｏｎ ｇｕｉｄａｎｃｅ ｄｅｃｉｓｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ２０，５６７－５７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｕｂ．２０１０．０２．０２１（２０１０）．
３７ Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ａ．，Ｓａｎｔｉａｇｏ，Ｃ．，Ａｒｂｅｉｌｌｅ，Ｅ．＆ Ｂａｓｈａｗ，Ｇ．Ｊ．Ｒｏｂｏ２ ａｃｔｓ ｉｎ ｔｒａｎｓ ｔｏ ｉｎｈｉｂｉｔ Ｓｌｉｔ－Ｒｏｂｏ１ ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅ－ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ ａｘｏｎｓ．Ｅｌｉｆｅ ４，ｅ０８４０７，ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０８４０７（２０１５）．
３８ Ａｌｅｋｓａｎｄｒｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｒｏｂｏ１ Ｆｏｒｍｓ ａ Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｍｅｒ－ｏｆ－Ｄｉｍｅｒｓ Ａｓｓｅｍｂｌｙ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２６，３２０－３２８ ｅ３２４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｒ．２０１７．１２．００３（２０１８）．
３９ Ｐｅｓｃｈｏｎ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２，１２８１－１２８４（１９９８）．
４０ Ｌｕｐｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９，２２５１－２２６２（１９９９）．
４１ Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｗ．Ｆ．＆ Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｂ．Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｋｎｏｗｎｓ ａｎｄ ｕｎｋｎｏｗｎｓ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．４２，１８８１－１８８９，ｄｏｉ：１０．１１２４／ｄｍｄ．１１４．０５９２３８（２０１４）．
４２ Ｂｒｉｓｋｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｖｉａ ｄｉｒｅｃｔ ａｎｄ ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１０，９６－１０６．（１９９９）．
４３ Ｌｅ，Ｌ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｍｉＲ－２０３ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｍａｔｒｉｘ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ＲＯＢＯ１／Ｒａｃ／ＦＡＫ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１２，７０７－７１９，ｄｏｉ：１０．１０８３／ｊｃｂ．２０１５０７０５４（２０１６）．
４４ Ｈａｒｂｕｒｇ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．ＳＬＩＴ／ＲＯＢＯ２ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｍａｍｍａｒｙ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ ３，３８５－３９３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍｃｒ．２０１４．０７．００７（２０１４）．
４５ Ｌｌｏｙｄ－Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ ｔｈｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ａｎｄ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｕｒｓ ｉｎ ３Ｄ：ｏｐｔｉｃａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １８，１２７，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０５８－０１６－０７５４－９（２０１６）．
４６ Ｋｒａｕｓｅ，Ｓ．，Ｂｒｏｃｋ，Ａ．＆ Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．Ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，ｄｏｉ：１０．３７９１／５０６９２（２０１３）．
４７ Ｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｏ．，Ｔｈｅｏｄｏｒｓｓｏｎ，Ａ．，Ｉｎｇｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｉｓａｋｓｓｏｎ，Ｉ．Ｍ．＆ Ｔｈｅｏｄｏｒｓｓｏｎ，Ｅ．Ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ ａｎｄ １７ｂｅｔａ－ｅｓｔｒａｄｉｏｌ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｒａｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｅ：ａ ｖｉｓｕａｌ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，ｅ４０１３，ｄｏｉ：１０．３７９１／４０１３（２０１２）．
４８ Ｍａｃｈｈｏｌｚ，Ｅ．，Ｍｕｌｄｅｒ，Ｇ．，Ｒｕｉｚ，Ｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｂ．Ｆ．＆ Ｐｒｉｔｃｈｅｔｔ－Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｋ．Ｒ．Ｍａｎｕａｌ ｒｅｓｔｒａｉｎｔ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｒｏｕｔｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ，ｄｏｉ：１０．３７９１／２７７１（２０１２）．
本発明の好ましい態様を本明細書に図示して説明してきたが、そのような態様が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換を思いつくであろう。本明細書に記載されている本発明の態様の様々な代替態様が、本発明を実施する際に用いられ得ることを理解されたい。下記の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによって網羅されることが意図されている。
完全性の理由から、本開示のポリペプチド、組成物、および方法の特定の態様は、以下の番号が付けられた条項に記載されている。
１．哺乳動物の乳生産を促進する方法であって、
哺乳動物に、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第１の薬剤を、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに十分な量で投与し、それにより乳汁産生を促進することを含む、方法。
２．第１の薬剤が、ＮＯＴＣＨ４タンパク質に直接結合することにより、ＲＯＢＯ２のＲＯＢＯ１への結合を阻害することにより、ＲＯＢＯ１のＮＯＴＣＨ４への結合を促進することにより、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害することにより、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害することにより、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する、条項１に記載の方法。
３．第１の薬剤が可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含む、条項１に記載の方法。
４．可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトＲＯＢＯ１ ＥＣＤである、条項３に記載の方法。
５．ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが、異種ポリペプチドを含む、条項３または４に記載の方法。
６．異種ポリペプチドが、Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域、またはＭｙｃタグを含む、条項５に記載の方法。
７．第１の薬剤が、ＮＯＴＣＨ４またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含む、条項１に記載の方法。
８．ＲＮＡｉ構築物が、短い干渉ＲＮＡである、条項７に記載の方法。
９．第１の薬剤が、抗ＮＯＴＣＨ４抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントを含む、条項１に記載の方法。
１０．第１の薬剤が、複数のポリクローナル抗ＮＯＴＣＨ４抗体を含む、条項９に記載の方法。
１１．抗ＮＯＴＣＨ４抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントである、条項９に記載の方法。
１２．ポリクローナル抗ＮＯＴＣＨ４抗体が、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体であり、ポリクローナル抗体が生成される種が、第１の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項１０に記載の方法。
１３．モノクローナル抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、もしくはヒトモノクローナル抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントであり、モノクローナル抗体が由来する種が、第１の薬剤が投与される哺乳動物の種と一致する、条項１１に記載の方法。
１４．抗ＮＯＴＣＨ４モノクローナル抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントが、ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化されている、条項１３に記載の方法。
１５．第１の薬剤が、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインを含み、方法が、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第２の薬剤を、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに十分な量で哺乳動物に投与することをさらに含む、条項１に記載の方法。
１６．第２の薬剤が、ＮＯＴＣＨ４またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含む、条項１５に記載の方法。
１７．ＮＯＴＣＨ４またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含む第３の薬剤をさらに含む、条項１６に記載の方法。
１８．方法が、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第１の薬剤、第２の薬剤、第３の薬剤、および第４の薬剤のうちの少なくとも１つを投与することを含み、第１の薬剤、第２の薬剤、第３の薬剤、および第４の薬剤の各々が独立して、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、抗ＮＯＴＣＨ４抗体、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、およびＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物から選択される、条項１に記載の方法。
１９．ポリペプチドであって、
異種ポリペプチドに融合した可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインを含む、ポリペプチド。
２０．可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトＲＯＢＯ１ ＥＣＤである、条項１９に記載のポリペプチド。
２１．異種ポリペプチドが、Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、ヒトもしくはマウスＦｃ領域、Ｍｙｃタグ、または蛍光タンパク質を含む、条項２０に記載のポリペプチド。
２２．医薬組成物であって、
条項１９～２１のいずれか一条項に記載のポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
２３．哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項２２に記載の医薬組成物。
２４．ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する抗ＮＯＴＣＨ４抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメント。
２５．抗体が、複数のポリクローナル抗体を含む、条項２４に記載の抗体。
２６．抗体が、モノクローナル抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントである、条項２４に記載の抗体。
２７．抗体が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体の少なくとも一部が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒト抗体からの抗体配列を含む、条項２４～２６のいずれか一条項に記載の抗体。
２８．ウシ化、ヒツジ化、ヤギ化、ラクダ化、またはヒト化抗体またはその任意の抗原結合フラグメントを含む、条項２６に記載の抗体。
２９．条項２４～２８のいずれか一条項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
３０．哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項２９に記載の医薬組成物。
３１．ＲＯＢＯ２またはＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含む、ポリヌクレオチド。
３２．少なくとも１つの天然に存在しないヌクレオチドを含む、条項３１に記載のポリヌクレオチド。
３３．配列番号３２～配列番号３５のうちの１つ以上を含む、条項３１または３２に記載のポリヌクレオチド。
３４．条項３１～３３のいずれか一条項に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
３５．哺乳動物における乳汁産生を促進するのに使用するための、条項３４に記載の医薬組成物。
３６．以下の表現型：可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現；ＲＯＢＯ２の発現の阻害；およびＮＯＴＣＨ４の発現の阻害のうちの１つ以上をもたらす遺伝子改変を含む、トランスジェニック哺乳動物。
３７．表現型が、乳腺組織に限定される、条項３６に記載のトランスジェニック動物。
３８．トランスジェニック動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダである、条項３６または３７に記載のトランスジェニック哺乳動物。
３９．記載された表現型のうちの２つをもたらす２つの遺伝子改変を含む、条項３６～３８のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
４０．記載された表現型の３つすべてをもたらす３つの遺伝子改変を含む、条項３６～３８のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物。
４１．乳汁産生を促進する方法であって、
条項３６～４０のいずれか一条項に記載のトランスジェニック哺乳動物に、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する医薬組成物を投与することを含む、方法。
４２．医薬組成物が、条項２２、２３、２９、３０、３４および３５のいずれか一条項に記載の組成物である、条項４１に記載の方法。
４３．トランスジェニック動物が、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項２２、２３、２９、３０、３４および３５のいずれか一条項に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項４１に記載の方法。
４４．トランスジェニック哺乳動物が、ＲＯＢＯ２および／またはＮＯＴＣＨ４の発現の阻害をもたらす遺伝子改変を含み、方法が、トランスジェニック動物に条項３４または３５に記載の医薬組成物を投与することをさらに含む、条項４１に記載の方法。

Claims (20)

  1. 非ヒト哺乳動物の乳汁産生を促進する方法であって、
    前記哺乳動物の乳腺組織に、ＮＯＴＣＨ４タンパク質に直接結合することにより、ＲＯＢＯ２がＲＯＢＯ１に結合することを阻害することにより、ＲＯＢＯ１がＮＯＴＣＨ４に結合することを促進することにより、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害することにより、またはＲＯＢＯ２の発現を阻害することによりＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第１の薬剤であって、
    （ｉ）可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）；
    （ｉｉ）ＮＯＴＣＨ４またはＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物；および
    （ｉｉｉ）抗ＮＯＴＣＨ４抗体またはそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメント
    からなる群から選択される、第１の薬剤を、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害するのに十分な量で投与し、それにより乳汁産生を促進すること、を含む、方法。
  2. 前記第１の薬剤が、可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、またはヒトＲＯＢＯ１ ＥＣＤである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが、異種ポリペプチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記異種ポリペプチドが、Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃ領域、またはＭｙｃタグを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記方法が、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する第１の薬剤、第２の薬剤、第３の薬剤、および第４の薬剤のうちの少なくとも１つを乳腺組織に投与することを含み、前記第１の薬剤、前記第２の薬剤、前記第３の薬剤、および前記第４の薬剤の各々が独立して、可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤ、抗ＮＯＴＣＨ４抗体、ＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物、およびＲＯＢＯ２の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物から選択される、請求項１に記載の方法。
  7. 可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含むポリペプチドを含む、哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための組成物。
  8. 前記ポリペプチドは、異種ポリペプチドに融合されており、任意で、前記可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤがマウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトＲＯＢＯ１ ＥＣＤである、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記可溶性ＲＯＢＯ１ ＥＣＤが、Ｈｉｓタグ、血球凝集素タグ、ヒトもしくはマウスＦｃ領域、Ｍｙｃタグ、または蛍光タンパク質を含む異種ポリペプチドに融合されている、請求項７または８に記載の組成物。
  10. 哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための医薬組成物であって、
    請求項７または８に記載の組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
  11. ポリヌクレオチドを乳腺組織に投与することにより哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための、前記ポリヌクレオチドを含む組成物であって、
    前記ポリヌクレオチドはＲＯＢＯ２またはＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含み、前記ＲＮＡｉ構築物は配列番号３２～配列番号３５のうちの１つ以上を含む、組成物。
  12. ポリヌクレオチドを乳腺組織に投与することにより哺乳動物における乳汁産生を促進することにおける使用のための、前記ポリヌクレオチドを含む医薬組成物であって、
    前記ポリヌクレオチドはＲＯＢＯ２またはＮＯＴＣＨ４の発現を阻害するＲＮＡｉ構築物を含み、前記ＲＮＡｉ構築物は配列番号３２～配列番号３５のうちの１つ以上を含む、医薬組成物。
  13. 乳腺組織において以下の表現型：
    可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現；および
    ＲＯＢＯ２の発現の阻害
    のうちの１つまたは両方をもたらす遺伝子改変を含む、非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  14. 前記遺伝子改変は可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現をもたらすものである、請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  15. 前記遺伝子改変はＲＯＢＯ２の発現の阻害をもたらすものである、請求項１３に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  16. 前記表現型が、乳腺組織に限定される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  17. 前記トランスジェニック動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはラクダである、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  18. 前記表現型が、乳腺組織に限定される、請求項１７に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物。
  19. 乳汁産生を促進する方法であって、
    請求項１３～１８のいずれか一項に記載の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の乳腺組織に、ＮＯＴＣＨ４活性を阻害する医薬組成物を投与することを含み、前記医薬組成物が、請求項１０もしくは１２に記載の医薬組成物を含むか、または抗ＮＯＴＣＨ抗体もしくはＮＯＴＣＨ４活性を阻害するそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントを含む、
    方法。
  20. 前記トランスジェニック動物が、乳腺組織において可溶性ＲＯＢＯ１細胞外ドメインの発現をもたらす遺伝子改変を含み、前記医薬組成物が、請求項１０もしくは１２に記載の医薬組成物を含むか、または抗ＮＯＴＣＨ抗体もしくはＮＯＴＣＨ４活性を阻害するそのＮＯＴＣＨ４結合フラグメントを含む、請求項１９に記載の方法。
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