JP7641908B2 - Ｉｌ－５に対する抗体を含有する医薬組成物及びその使用 - Google Patents

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Description

本開示は、医薬製剤の分野に属し、特には、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物と、ＩＬ－５関連疾患のための診断用薬及び治療薬としての、この医薬組成物の使用とに関する。
本明細書における記載事項は、本開示に関連付けられた背景情報を提供するにすぎず、必ずしも従来技術を校正するとは限らない。
インターロイキン－５（ＩＬ－５）は、インターロイキンファミリーの重要なメンバーの１つであるが、主にヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）によって分泌されるホモダイマー型糖タンパク質であるＴ細胞代行因子（ＴＲＦ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、Ｂ細胞増殖因子－ＩＩ（ＢＣＧＦ－ＩＩ）、ＩｇＡ増強因子（ＩｇＡ－ＥＦ）又は好酸球分化因子（ＥＤＦ）としても公知である。ヒトＩＬ－５は、１３４個のアミノ酸残基から構成され、２２個のアミノ酸及び２つのグリコシル化部位から構成されるシグナルペプチドを含む。活性ＩＬ－５は、逆平行構成になった２本のペプチド鎖がジスルフィド結合によって連結されたオリゴダイマーであるが；ＩＬ－５モノマーは、生物活性を有さない（Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；５７：１４５～９０）。
好酸球（ＥＯＳ）は、アレルギー性反応に関連付けられたアレルギー性疾患を含む、様々な肺の炎症性疾患に関連付けられている。ぜんそくは、慢性炎症性呼吸器疾患である。世界中で約３億人の患者が存在し、発症率は１０％である。ぜんそくの発病機序は、様々なサイトカインに関連付けられている。ＩＬ－５及び受容体ＩＬ－５Ｒは、ぜんそくの発病機序において、重要な役割を担う。現在、ぜんそくを処置する最も効果的な方法は、ぜんそくに関与するいくつかの重要なメディエーター（ＩＬ－５を含む）の発現を阻害し、これにより、肺の炎症を低減するようにステロールを経鼻又は経口投与することである。しかしながら、ステロイド剤の長期的な施用には、数多くの副作用がある。したがって、ぜんそくの処置のための新規な創薬ターゲットを見つけ出すことが必要である。研究により、抗ＩＬ－５抗体の投与は、ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を阻害し；肺における好酸球の蓄積を有意に低減し、血液、組織及び喀痰中における好酸球のレベルを低下させ；好酸球によって媒介され得る炎症反応を低減し；肺機能を改善し；好酸球性ぜんそく及び再発性ぜんそくに好ましい影響を与えることが示されている（Ｄｒｕｇｓ．２０１７年５月；７７（７）：７７７～７８４）。
抗体剤は、高い分子量及び複雑な構造を有する。製造、輸送及び貯蔵のプロセスにおいて、抗体にはしばしば、粒子の変性、凝集、汚染及び形成を原因とする課題がつきまとう。抗体を効果的なものに保つためには、製造中、精製、中輸送中及び貯蔵中に抗体の生物活性が維持されなければならない。現在、高度に精製された多数のモノクローナル抗体を製造すべく、製造及び精製のための新技術が開発されている。しかしながら、どのようにしてこれらの抗体を輸送及び貯蔵中に安定させるか、及びどのようにして投与に適した剤形の抗体を用意するかが常に課題となってきた。
抗ＩＬ－５抗体に関しては、ＧＳＫのメポリズマブ及びＴｅｖａ Ｐｈａｒｍａのレスリズマブのみが、現在、市販を承認されている。関連特許は、国際公開第２０１８／１１９０１６号、国際公開第２０１７／０３３１２１号、国際公開第２０１４／１４１１４９号、国際公開第２０１６／０４０００７号、国際公開第２０１５／０９５５３９号、国際公開第２０１２／１３８９５８号及び国際公開第９５／３５３７５号等を含む。
国際公開第２０１８／１１９０１６号 国際公開第２０１７／０３３１２１号 国際公開第２０１４／１４１１４９号 国際公開第２０１６／０４０００７号 国際公開第２０１５／０９５５３９号 国際公開第２０１２／１３８９５８号 国際公開第９５／３５３７５号
Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４；５７：１４５～９０ Ｄｒｕｇｓ．２０１７年５月；７７（７）：７７７～７８４
本開示は、ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、バッファー及び界面活性剤を含む、医薬組成物であって、バッファーが、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー、ヒスチジン－塩酸塩バッファー及びクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファーからなる群より選択されるいずれか１つであり、好ましくは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー又はコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーであり；抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントが、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
（ｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：１６、１７及び１８に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：１９、２０及び２１に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２２、２３及び２４に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２５、２６及び２７に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｉｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：２８、２９及び３０に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３１、３２及び３３に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｉｖ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３４、３５及び３６に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３７、３８及び３９に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；
（ｖ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：４０、４１及び４２に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：４３、４４及び４５に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み；又は、
（ｖｉ） 重鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３４、８２及び３６に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
軽鎖可変領域が、それぞれアミノ酸配列番号：３７、３８及び３９に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む、
医薬組成物を提供する。
代替的な実施形態において、医薬組成物中におけるバッファーのｐＨは、約５．０～約６．５、好ましくは約５．５～約６．５、好ましくは約６．０～約６．５、好ましくは約５．０～約６．０、好ましくは約５．５～約６．０、好ましくは約５．０～約５．５、好ましくは約５．０～約５．８、好ましくは約５．２～約５．８であり；バッファーのｐＨの非限定的な例は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．５を含み、最も好ましくは約５．５が最も好ましい。
代替的な実施形態において、医薬組成物中におけるバッファーの濃度は、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約１５ｍＭであり；バッファーの濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３２ｍＭ、約３４ｍＭを含み、約３０ｍＭが最も好ましい。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中における抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約９０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１１０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約９０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌであり；非限定的な例として、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌ、約８５ｍｇ／ｍｌ、約９０ｍｇ／ｍｌ、約９１ｍｇ／ｍｌ、約９２ｍｇ／ｍｌ、約９３ｍｇ／ｍｌ、約９４ｍｇ／ｍｌ、約９５ｍｇ／ｍｌ、約９６ｍｇ／ｍｌ、約９７ｍｇ／ｍｌ、約９８ｍｇ／ｍｌ、約９９ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約１０１ｍｇ／ｍｌ、約１０２ｍｇ／ｍｌ、約１０３ｍｇ／ｍｌ、約１０４ｍｇ／ｍｌ、約１０５ｍｇ／ｍｌ、約１０６ｍｇ／ｍｌ、約１０７ｍｇ／ｍｌ、約１０８ｍｇ／ｍｌ、約１０９ｍｇ／ｍｌ、約１１０ｍｇ／ｍｌ、約１１５ｍｇ／ｍｌ、約１２０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約１００ｍｇ／ｍｌである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物に含まれる界面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ポリヒドロキシアルキレン、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホン酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン、ステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン、ステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン、セチルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミタミドプロピルベタイン、イソステアミドプロピルベタイン（ｉｓｏｓｔｅａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ－ｂｅｔａｉｎｅ）、ミリスタミドプロピルジメチルアミン、パームアミドプロピルジメチルアミン（ｐａｌｍａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）、イソステアラミドプロピルジメチルアミン、ナトリウムメチルココイル（ｓｏｄｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｃｏｃｏｙｌ）、メチルオレオイルタウリン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー等からなる群より選択することができる。好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０又はポリソルベート２０であり、より好ましくはポリソルベート８０である。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中におけるポリソルベート８０の濃度は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌ～約０．５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌであり、非限定的な例として、本医薬組成物中における界面活性剤の濃度は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは約０．４ｍｇ／ｍｌである。
さらに、代替的な実施形態において、本医薬組成物は、賦形剤をさらに含み、賦形剤は、安定剤から選択される。
代替的な実施形態において、安定剤は、糖又はアミノ酸から選択され；糖は、スクロース、トレハロース、マンニトール及びソルビトールからなる群より選択することができ、好ましくはスクロースである。アミノ酸は、グリシン、メチオニン及びプロリンからなる群より選択される。
代替的な実施形態において、糖の濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約６０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７５ｍｇ／ｍｌ～約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約７０ｍｇ／ｍｌ～約７５ｍｇ／ｍｌであり；非限定的な例として、本医薬組成物中における安定剤の濃度は、約７０ｍｇ／ｍｌ、約７１ｍｇ／ｍｌ、約７２ｍｇ／ｍｌ、約７３ｍｇ／ｍｌ、約７４ｍｇ／ｍｌ、約７５ｍｇ／ｍｌ、約７６ｍｇ／ｍｌ、約７７ｍｇ／ｍｌ、約７８ｍｇ／ｍｌ、約７９ｍｇ／ｍｌ、約８０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約７２ｍｇ／ｍｌを含む。
代替的な実施形態において、アミノ酸の濃度は、約８ｍｇ／ｍｌである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ａ） 約１ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｂ） ｐＨ約５．０～６．５の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；及び（ｃ） 約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ａ） 約８０ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｂ） ｐＨ約５．０～約６．０の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；及び（ｃ） 約０．１ｍｇ／ｍｌ～約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物は、
（ｄ） 約８０ｍｇ／ｍｌ～約１２０ｍｇ／ｍｌのＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；（ｅ） ｐＨ約５．０～約５．８の約１０ｍＭ～約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；（ｆ） 約０．２ｍｇ／ｍｌ～約０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；及び（ｇ） 約７０ｍｇ／ｍｌ～約７５ｍｇ／ｍｌのスクロース
を含み；好ましくは、本医薬組成物は好ましくは、
（ｈ） 約１００ｍｇ／ｍｌのＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、（ｉ） ｐＨ約５．５の約３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、（ｊ） 約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び（ｋ） 約７２ｍｇ／ｍｌのスクロース
を含む。
一部の好ましい実施形態によれば、本開示の医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントは、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、配列番号：４９、５７、６３、６９若しくは７５に示された重鎖可変領域又はそのバリアントを含み；バリアントは、それぞれ配列番号：４９、５７、６３、６９又は７５に示された重鎖可変領域配列中に１～１０個のアミノ酸復帰変異を含む。
代替的な実施形態において、バリアントは、
（ｉ） 配列番号：４９に示された重鎖可変領域中にあるＳ４９Ｔ、Ｖ９３Ｔ及びＫ９８Ｓからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉ） 配列番号：５７に示された重鎖可変領域中にあるＳ４９Ｔ、Ｖ９３Ｔ及びＫ９８Ｔからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉｉ） 配列番号：６３に示された重鎖可変領域中にあるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４Ｋ及びＬ８３Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｖ） 配列番号：６９に示された重鎖可変領域中にあるＦ２９Ｉ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ４８Ｉ、Ｒ７２Ａ及びＴ９７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異及び／若しくはＣＤＲ中にあるＮ５５Ｖ変異を含む、バリアント；又は、
（ｖ） 配列番号：７５に示された重鎖可変領域中にあるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｍ８１Ｌ、Ｌ８３Ｆ及びＤ８９Ｅからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか１つに示されたバリアントである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
配列番号：５０若しくは５１に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：５８若しくは５９に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：６４、６５及び６６からなる群より選択されるいずれか１つに示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：７０若しくは７１に示された重鎖可変領域；又は、
配列番号：７６、７７、７８及び７９からなる群より選択されるいずれか１つに示された重鎖可変領域
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、配列番号：４６、５４、６０、６７若しくは７２に示された軽鎖可変領域又はそのバリアントを含み；バリアントは、配列番号：４６、５４、６０、６７又は７２に示された軽鎖可変領域中にある１～１０個のアミノ酸復帰変異を含む。
代替的な実施形態において、バリアントは、
（ｉ） 配列番号：４６に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｖ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉ） 配列番号：５４に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｍ、Ｆ７１Ｙ及びＹ８７Ｆからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｉｉ） 配列番号：６０に示された軽鎖可変領域中にあるＥ１Ｄ、Ｉ２Ｔ、Ｉ５７Ｖ、Ｖ８４Ｔ及びＹ８６Ｆ又はこれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；
（ｉｖ） 配列番号：６７に示された軽鎖可変領域中にあるＭ４Ｌ、Ａ４２Ｓ、Ｌ４５Ｐ及びＬ４６Ｗからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント；並びに、
（ｖ） 配列番号：７２に示された軽鎖可変領域中にあるＡ４３Ｓ、Ｉ４８Ｖ及びＦ７１Ｙからなる群より選択される１種以上のアミノ酸復帰変異を含む、バリアント
からなる群より選択されるいずれか１つに示されたバリアントである。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
配列番号：４７若しくは４８に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：５５若しくは５６に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：６１若しくは６２に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：６８に示された軽鎖可変領域；又は、
配列番号：７３若しくは７４に示された軽鎖可変領域
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中のヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
（ｉ） 配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｉ） 配列番号：５７、５８及び５９のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：５７、５８及び５９のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：５４、５５及び５６のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：５４、５５及び５６のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ） 配列番号：６３、６４、６５及び６６のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６３、６４、６５及び６６のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：６０、６１及び６２のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６０、６１及び６２のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；
（ｉｖ） 配列番号：６９、７０及び７１のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６９、７０及び７１のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：６７及び６８のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：６７及び６８のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域；又は、
（ｖ） 配列番号：７５、７６、７７、７８及び７９のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：７５、７６、７７、７８及び７９のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
配列番号：７２、７３及び７４のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：７２、７３及び７４のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域を含み；好ましくは、ヒト化抗ＩＬ－５抗体は、
（ａ） 配列番号：５１に示された重鎖可変領域及び配列番号：４７に示された軽鎖可変領域；
（ｂ） 配列番号：６５に示された重鎖可変領域及び配列番号：６２に示された軽鎖可変領域；
（ｃ） 配列番号：５８に示された重鎖可変領域及び配列番号：５６に示された軽鎖可変領域；
（ｄ） 配列番号：７１に示された重鎖可変領域及び配列番号：６８に示された軽鎖可変領域；又は、
（ｅ） 配列番号：７９に示された重鎖可変領域及び配列番号：７３に示された軽鎖可変領域
を含む。
上記少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列相同性を有し、より好ましくは、９７％、９８％又は９９％以上の配列相同性を有し、最も好ましくは、少なくとも９９％以上の配列相同性を有し、上記少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列は、変異によって得られた１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、ヒト抗体定常領域、好ましくは、配列番号：５２に示されたヒト抗体重鎖定常領域及び配列番号：５３に示されたヒト抗体軽鎖定常領域を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、
（ｉ） 配列番号：８３に示された重鎖及び配列番号：８４に示された軽鎖；
（ｉｉ） 配列番号：８５に示された重鎖及び配列番号：８６に示された軽鎖；
（ｉｉｉ） 配列番号：８７に示された重鎖及び配列番号：８８に示された軽鎖；
（ｉｖ） 配列番号：８９に示された重鎖及び配列番号：９０に示された軽鎖；又は、
（ｖ） 配列番号：９１に示された重鎖及び配列番号：９２に示された軽鎖
を含む。
代替的な実施形態において、本医薬組成物中の抗ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５への結合に関しては上記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントと競合する、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。
好ましい一実施形態において、本開示の医薬組成物中の抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイマー化Ｖ領域（二重特異性抗体）及びジスルフィド結合安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）からなる群より選択される。
本開示は、抗ＩＬ－５抗体のストック溶液をバッファーによって置きかえるステップを含む、上記医薬組成物を調製するための方法をさらに提供する。代替的な実施形態において、好ましくは、バッファーは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファーである。バッファーのｐＨは、約５．０～約６．５、好ましくは約５．５～約６．５、好ましくは約６．０～約６．５、好ましくは約５．０～約６．０、好ましくは約５．５～約６．０、好ましくは約５．０～約５．５、好ましくは約５．２～約５．８であり、バッファーのｐＨ値の非限定的な例は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．５を含み、約５．５が最も好ましい。代替的な実施形態において、本医薬組成物中におけるバッファーの濃度は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約２０ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ～約１５ｍＭであり；バッファーの濃度の非限定的な例は、約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭを含み、最も好ましくは約３０ｍＭが最も好ましい。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ６．０の１０ｍＭヒスチジン－塩酸及び０．０５ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのトレハロース及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのソルビトール及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのグリシン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのメチオニン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、８ｍｇ／ｍＬのプロリン及び０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．４の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．６ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．８の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７３ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本医薬組成物は、１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウム、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む。
一部の実施形態において、本開示の医薬組成物は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間又は少なくとも２４か月間２～８℃で安定である。本医薬組成物は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間２５℃で安定であり得る。
本開示は、上記医薬組成物を凍結乾燥させるステップを含む、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法をさらに提供する。
代替的な一実施形態において、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法における凍結乾燥は、予備凍結ステップ、一次乾燥ステップ及び二次乾燥ステップを順次含む。凍結乾燥は、製剤を凍結させた後、一次乾燥に適した温度で水を昇華させることによって実施される。このような条件下では、生産物の温度は、製剤の共晶点又は分解温度より低い。一般的に約５０～２５０ｍＴｏｒｒの範囲である適切な圧力下では、一次乾燥のための貯蔵温度は通常、約－３０～２５℃である（一次乾燥中には生産物が凍結状態のままであると仮定する）。製剤、サンプル容器（例えば、ガラスバイアル）のサイズ及び種類並びに液体の体積が、乾燥に必要な期間を決定するが、この期間は、数時間～数日の範囲（例えば、４０～６０時間）であり得る。二次乾燥は、約０～４０℃で実施することができるが、これは主に、容器の種類及びサイズ及び使用されるタンパク質の種類に左右される。二次乾燥の期間は、生産物の望ましい残留湿分レベルによって決定されるが、通常、少なくとも約５時間を必要とする。一般に、低圧下で調製された凍結乾燥製剤の含水量は、約５％未満、好ましくは約３％未満である。二次乾燥の圧力は、一次乾燥ステップにおいて適用された圧力と同じであってもよく；好ましくは、二次乾燥において使用される圧力は、一次乾燥において使用される圧力より低い。凍結乾燥のための条件は、製剤及びバイアルのサイズに応じて変化し得る。
本開示は、上記抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を調製するための方法によって調製された、ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤をさらに提供する。
一部の実施形態において、凍結乾燥製剤は、少なくとも３か月間、少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間又は少なくとも２４か月間２～８℃で安定である。一部の実施形態において、凍結乾燥製剤は、少なくとも７日間、少なくとも１４日間又は少なくとも２８日間４０℃で安定である。
本開示は、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤を復元するステップを含む、抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製するための方法であって、復元のために使用される溶液が、限定されるわけではないが注射用水、生理食塩水又はグルコース溶液を含む、方法をさらに提供する。
本開示は、上記抗ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液を調製するための方法によって調製された、ＩＬ－５抗体を含む凍結乾燥製剤の復元溶液をさらに提供する。
本開示は、本明細書における安定な医薬組成物のいずれかを含む容器を含む、物品又はキットをさらに提供する。一部の実施形態において、容器は、中性ホウケイ酸ガラス製の注射用バイアルである。
本開示は、上記医薬組成物又は凍結乾燥製剤又は凍結乾燥製剤の復元溶液を含む容器を含む、物品をさらに提供する。
本開示は、治療有効量の上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記復元溶液又は上記製造物を、それを必要としている対象に投与することを含む、ＩＬ－５媒介疾患を処置するための方法であって、ＩＬ－５媒介疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、方法をさらに提供する。
本開示は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するための医薬品の調製における、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物の使用であって、ＩＬ－５媒介性疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、使用をさらに提供する。
本開示は、ＩＬ－５媒介性疾患の処置用の治療用医薬品としての使用のための、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物であって、ＩＬ－５媒介性疾患が好ましくは、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、上記医薬組成物若しくは上記凍結乾燥製剤若しくは上記凍結乾燥製剤の復元溶液又は上記製造物をさらに提供する。
当業者には周知のように、本開示における各実施形態の特徴のうちの１つ、いくつか又はすべてをさらに組み合わせて、本開示の他の実施形態を形成することもできる。上記本開示の実施形態及び組合せによって得られたさらなる実施形態については、以下の詳細な説明によってさらに説明する。
抗ＩＬ－５抗体がＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を阻止する、ＦＡＣＳ実験の結果を示す、図である。 Ｔｈ２サイトカインに対する抗ＩＬ－５抗体の結合特異性の検出結果を示す、図である。 抗ＩＬ－５抗体が間欠呼吸（Ｐｅｎｈ）のレベルを向上させることを示す、図である。Ｇ１：正常コントロール群（ＰＢＳ）；Ｇ２：モデル群（ＩｇＧ）；Ｇ３：ｈ１７０５－００８抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５－００８抗体２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６－００９抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６－００９抗体２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０ １０ｍｐｋ群；＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１（ＡＮＯＶＡ／ＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉによるＧ２群との比較）。 ぜんそくマウスの肺におけるＢＡＬＦ好酸球のレベルを示す、図である。 ぜんそくマウスの気管粘膜厚さのスコアを示す、図である。Ｇ１：正常コントロール群；Ｇ２：モデル群；Ｇ３：ｈ１７０５－００８抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５－００８抗体２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６－００９抗体１０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６－００９抗体２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０ １０ｍｐｋ群。 ぜんそくマウスの肺におけるＢＡＬＦ好酸球の百分率を示す、図である。 ＢＡＬＦにおける好酸球のレベルを低下させるＩＬ５モノクローナル抗体の能力を示す、図である。 ＢＡＬＦにおける好酸球のレベルを低下させるＩＬ５モノクローナル抗体の能力を示す、図である。
用語
本開示をより容易く理解するために、特定の専門用語及び科学技術用語が、以下に厳密に規定されている。本明細書において使用されているすべての他の専門用語及び科学技術用語は、そうではないと明示的に規定されていない限り、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「バッファー」は、酸－塩基共役成分の作用により、ｐＨの変化に耐性のあるバッファーを指す。ｐＨを適切な範囲に制御するバッファーの例には、酢酸バッファー、コハク酸バッファー、グルコン酸バッファー、ヒスチジン塩バッファー、シュウ酸バッファー、乳酸バッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酒石酸バッファー、フマル酸バッファー、グリシル－グリシンバッファー及び他の有機酸バッファーが挙げられる。
「ヒスチジン塩バッファー」は、ヒスチジンイオンを含むバッファーである。ヒスチジン塩バッファーの例には、ヒスチジン－塩酸塩バッファー、ヒスチジン－酢酸バッファー、ヒスチジン－リン酸バッファー及びヒスチジン－硫酸バッファー等が挙げられるが；ヒスチジン－酢酸バッファー又はヒスチジン－塩酸塩バッファーが好ましく；ヒスチジン－酢酸バッファーは、ヒスチジン及び酢酸によって調製され、ヒスチジン塩バッファーは、ヒスチジン及びＨＣｌによって調製される。
「クエン酸バッファー」は、クエン酸イオンを含むバッファーである。クエン酸バッファーの例には、クエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カリウムバッファー、クエン酸－クエン酸カルシウムバッファー及びクエン酸－クエン酸マグネシウムバッファー等が挙げられる。好ましいクエン酸バッファーは、クエン酸－クエン酸ナトリウムバッファーである。
「コハク酸バッファー」は、コハク酸イオンを含むバッファーである。コハク酸バッファーの例には、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー、コハク酸－コハク酸カリウムバッファー及びコハク酸－コハク酸カルシウムバッファー等が挙げられる。好ましいコハク酸バッファーは、コハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーである。
「リン酸バッファー」は、リン酸イオンを含むバッファーである。リン酸バッファーの例には、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファー、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウムバッファー及びリン酸水素二ナトリウム－クエン酸バッファー等が挙げられる。好ましいリン酸バッファーは、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムバッファーである。
「酢酸バッファー」は、酢酸イオンを含むバッファーである。酢酸バッファーの例には、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、ヒスチジン酢酸バッファー、酢酸－酢酸カリウムバッファー、酢酸－酢酸カルシウムバッファー及び酢酸－酢酸マグネシウムバッファー等が挙げられる。好ましい酢酸バッファーは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファーである。
「医薬組成物」は、本明細書に記載された化合物（又は生理学的な／薬学的に許容されるその塩若しくはプロドラッグ）の１種以上と、他の化学成分（生理学的な／薬学的に許容されるキャリア及び賦形剤等）とを含む、混合物を意味する。医薬組成物の目的は、活性成分の吸収及び生物活性を増進するように、抗体活性成分の安定性を維持し、生物への投与を容易にすることである。
本明細書において使用されているとき、「医薬組成物」及び「製剤」は、互換的に使用されている。
本開示における「糖」は、従来の（ＣＨ２Ｏ）ｎと、単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元性のある糖、還元性のない糖等を含む、（ＣＨ２Ｏ）の誘導体とを含む。糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセロール、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メリトリオース、マンノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、イソマルツロース等からなる群より選択することができる。好ましい糖は、非還元性二糖、より好ましくはスクロースである。
本開示によれば、本医薬組成物の溶液形態に含まれる溶媒は、そうではないと指定されていない限り、水である。
「凍結乾燥製剤」は、医薬組成物又は製剤の液体又は溶液形態を真空凍結乾燥することによって得られた、製剤又は医薬組成物を意味する。
本開示における凍結乾燥は、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。予備凍結の目的は、生産物を凍結させて、結晶性の固体を得ることである。予備凍結温度及び予備凍結速度は、２つの重要なプロセスパラメータである。本開示において、予備凍結温度は、－４５℃に設定されており、予備凍結速度は、１℃／ｍｉｎである。一次乾燥は、乾燥とも呼ばれ、サンプルを凍結乾燥させるための主要段階である。一次乾燥の目的は、生産物への損傷を最小レベルに限定するように、生産物の形状を維持しながら生産物から氷を除去することである。一次乾燥温度及び真空度が適切に選択されていない場合、生産物は崩壊する。温度及び真空度を高めると、凍結乾燥の効率が加速的に高まるが、生産物崩壊の危険性も増大する。本発明における一次乾燥の温度は、－３０℃～０℃等、当技術分野における慣用的な温度であってよい。二次乾燥は真空乾燥とも呼ばれ、最高真空（ｕｌｔｉｍａｔｅ ｖａｃｕｕｍ）（０．０１ｍｂａｒ）を引き、温度（２０～４０℃）を上げることによって生産物から結合水を除去する、主要ステップである。大部分の生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ）は温度に対して鋭敏であるため、選択された二次乾燥温度は、温度範囲の下限である２５℃にすべきである。凍結乾燥の期間、冷凍機、凍結乾燥すべき製剤の用量及び凍結乾燥すべき製剤の容器に関連付けられている。当業者ならば、どのようにしてこのような期間を調整するかについてはよく知っている。
本明細書において使用されているとき、「約」及び「およそ」という用語は、ある値が、当業者によって測定された特定の値の許容誤差範囲内であることを意味する。前述の特定の値は、どのようにして値が測定又は決定されるか（すなわち、測定システムの限界）に部分的に依存する。例えば、当技術分野におけるいかなる慣行においても、「約」は、標準偏差が１以内又は１超であることを意味する。一代替形態として、「約」又は「実質的に含む」は、最大±２０％の範囲を意味し、例えば、約５．５のｐＨは、ｐＨ５．５±１．１を意味する。さらに、特に生物系又は生物学的プロセスに関しては、「約」という用語は、ある値の最大１０倍又は最大５倍を意味する。そうではないと指定されていない限り、特定の値が本出願及び特許請求の範囲に示されている場合、「約」又は「実質的に含む」の意味は、特定の値の許容誤差範囲内であるべきである。
本開示の医薬組成物は、安定な効果をもたらすことができ、すなわち、本医薬組成物に含まれる抗体は、貯蔵後でも物理的安定性及び／若しくは化学的安定性、並びに／又は、生物活性を実質的に保持している。好ましくは、本医薬組成物は、貯蔵後でも、物理的安定性及び化学的安定性並びに生物活性を実質的に保持している。一般に、貯蔵期間は、本医薬組成物の所定の貯蔵寿命に基づいて決定される。現在、タンパク質の安定性を測定するための分析法は複数存在するが、これらの分析法を使用して、選定された期間にわたって選択された温度で貯蔵された後の安定性を測定することができる。
安定な抗体の医薬製剤は、低温（２～８℃）で少なくとも３か月間、好ましくは６か月間、より好ましくは１年間、さらにより好ましくは最大２年間貯蔵されるという条件下において、有意な物理的及び／又は化学的及び／又は生物学的変化が観察されない製剤である。さらに、安定な液体製剤は、２５℃の温度で１か月間、３か月間又は６か月間貯蔵された後に望ましい特性を示す液体製剤を含む。一般的に、安定な製剤に関する基準は、次のとおりである：ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって測定したときに、分解される抗体モノマーが一般的には約１０％以下、好ましくは約５％以下であること；目視検査によると、抗体の医薬製剤が、明るい黄色であり、ほぼ無色透明な液体であり、若しくは無色であり、又は透明～わずかに淡い色がついたものであること；製剤の濃度、ｐＨ及び質量オスモル濃度のバラつきが±１０％以下であること；観察される減少が一般に約１０％以下、好ましくは約５％以下であること；形成される凝集が一般に約１０％以下、好ましくは約５％以下であること。
色及び／又は透明性についての目視検査により、又は紫外光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたときに、抗体が有意に増大した凝集、沈殿及び／又は変性を示さない場合、抗体は、医薬製剤中で「物理的安定性を保持している」と考えられる。タンパク質立体構造の変化は、タンパク質の三次構造を決定する蛍光分光法、及びタンパク質の二次構造を決定するＦＴＩＲ分光法によって評価することができる。
抗体が有意な化学的修飾を示さない場合、抗体は、医薬製剤中で「化学的安定性を保持している」と考えられる。化学的安定性は、化学的に改変されたタンパク質の形態を検出及び定量化することによって、評価することができる。タンパク質の化学的構造を高頻度で改変する分解プロセスは、加水分解又はトランケーション（サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ等の方法によって評価される）、酸化（質量分析又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと組み合わせたペプチド分光法等の方法によって評価される）、脱アミド（イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチド分光法、イソアスパラギン酸測定等の方法によって評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含量の測定、ペプチド分光法等の方法によって評価される）を含む。
所与の時間が経ったときの抗体の生物活性が、依然として、医薬製剤が最初に調製されたときの時点において示された生物活性に対して所定の範囲に収まっている場合、抗体は、医薬製剤中で「生物活性を保持している」と考えられる。抗体の生物活性は、例えば、抗原結合アッセイによって測定することができる。
本開示において使用されているアミノ酸に関する３文字のコード及び１文字のコードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２４３、ｐ３５５８（１９６８）で説明されている。
本開示において使用されている「抗体」は、免疫グロブリンを指し；完全な抗体は、鎖間ジスルフィド結合によって結合した２本の同一の重鎖及び２本の同一の軽鎖から構成される、テトラペプチド鎖構造である。
本開示において、本開示の抗体軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含み、軽鎖定常領域は、ヒト又はマウスκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントを含む。
本開示において、本開示の抗体重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、重鎖定常領域は、ヒト又はマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントを含む。
抗体重鎖及び軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０個のアミノ酸は可変性が高く、可変領域（Ｆｖ領域）として知られており；Ｃ末端に近いアミノ酸配列の残り部分は比較的安定であり、定常領域として知られている。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）及び４つの比較的保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）としても公知である。軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ、ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ、ＶＨ）のそれぞれは、３つのＣＤＲ領域及び４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシル末端までの順番は、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を指す。本開示に記載された抗体又はその抗原結合性フラグメント中のＬＣＶＲ領域及びＨＣＶＲ領域に属するＣＤＲアミノ酸残基の数及び位置は、公知のＫａｂａｔ式ナンバリング基準（ＬＣＤＲ１～３、ＨＣＤＲ１～３）に従っている。
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体を含み、好ましくはヒト化抗体が好ましい。
本開示において、「抗体の抗原結合性フラグメント」又は「機能的フラグメント」は、抗原結合活性を有するＦａｂフラグメントと、Ｆａｂ’フラグメントと、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び、抗体に結合するＦｖフラグメントとｓｃＦｖフラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは、抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むが、定常領域を有さず、Ｆｖフラグメントは、すべての抗原結合部位を有する最も小さい抗体フラグメントである。一般に、Ｆｖ抗体は、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに備え、抗原結合に必要な構造を形成することができる。異なるリンカーを使用して、２つの抗体可変領域を連結し、これにより、一本鎖抗体及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）と呼ばれるポリペプチド鎖を形成することもできる。
本開示の「抗原結合部位」という用語は、本開示の抗体又はその抗原結合性フラグメントによって認識される抗原における、連続的又は非連続的な三次元空間の部位を指す。
本開示における「マウス抗体」という用語は、当技術分野における知識及び技能に従って調製された、ヒトＩＬ－５に対するモノクローナル抗体を指す。調製中には、試験対象にＩＬ－５抗原を注射した後、所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現させるハイブリドーマを単離する。
「キメラ抗体」という用語は、マウス抗体の可変領域と、マウス抗体によって誘導される免疫反応を低減するヒト抗体の定常領域とを融合させることによって形成された、抗体である。キメラ抗体を樹立するためには、マウス特異的モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを新たに樹立し；次いで、マウスハイブリドーマ細胞から可変領域遺伝子をクローニングし；次いで、必要に応じてヒト抗体の定常領域遺伝子をクローニングし；マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子と組み合わせて、キメラ遺伝子を形成し、このキメラ遺伝子をヒトベクターに挿入し、最後に、キメラ抗体分子を、工業的な真核生物系又は工業的な原核生物系中で発現させる。本開示の好ましい一実施形態において、ＩＬ－５キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ鎖、λ鎖又はこれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。ＩＬ－５キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含む。ヒト抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はこれらのバリアントの重鎖定常領域からなる群より選択することが可能であり、好ましくは、ヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４重鎖定常領域、又は、アミノ酸の変異後にＡＤＣＣ毒性（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）を有さないＩｇＧ４を含む。
ＣＤＲグラフト化抗体としても知られる「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体可変領域フレームワークへのマウスＣＤＲ配列のグラフト化によって生成された抗体、すなわち、異なる種類のヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において生成された抗体を指す。ヒト化抗体は、多数のマウスタンパク質成分を保有するキメラ抗体によって誘導される、異種性による強い反応を回避する。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を収載した公開ＤＮＡデータベース又は公開されている参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｐｅ．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで利用可能）で確認することもできるし、さらには、Ｋａｂａｔ，ＥＡら １９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版で確認することもできる。免疫原性の低下によって起きる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域中のフレームワーク配列には、活性を維持するように最小限の逆変異（ｒｅｖｅｒｓｅ－ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は復帰変異を発生させてもよい。本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲアフィニティ成熟がファージディスプレイによって実施された、ヒト化抗体も指す。
本開示において、「ＡＤＣＣ」（すなわち、抗体依存性細胞介在性細胞傷害）は、Ｆｃ受容体を発現した細胞が、抗体のＦｃセグメントを認識することにより、抗体で覆われた標的細胞を直接死滅させることを意味する。抗体のＡＤＣＣエフェクター機能は、ＩｇＧのＦｃセグメントの修飾によって低下させ、又はなくすことができる。修飾は、ＩｇＧ１におけるＮ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ；ＩｇＧ２／４キメラ、ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異からなる群より選択されるもの等の変異が、抗体の重鎖定常領域に発生することを指す。
本開示における変異配列中の「変異」は、限定されるわけではないが、「復帰変異」、「保存的修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」又は「保存的置きかえ（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）若しくは保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」を含む。本開示において使用されている「保存的修飾」又は「保存的置きかえ若しくは保存的置換」は、タンパク質の生物活性を変化させることなく高頻度で置きかえを実施できるように、類似の特性（電荷、側鎖のサイズ、疎水性／親水性、骨格の立体構造及び剛直性等）を有する他のアミノ酸を使用して、タンパク質中のアミノ酸を置きかえることを指す。当業者ならば、一般に、ポリペプチドの必須でない領域における単一のアミノ酸置換が、生物活性を実質的に変化させないことを知っている（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、２２４頁、（第４版）を参照されたい。）。さらに、類似の構造又は機能によるアミノ酸の置換は、生物活性を乱す可能性が低い。
本開示における「変異配列」は、本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列とは異なる配列相同性の百分率を有するヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が得られるように、本開示のヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列が変異（置換、挿入又は欠失等）によって適切に修飾されていることを指す。本開示において、配列相同性は、少なくとも８５％、９０％又は９５％、好ましくは少なくとも９５％であり得る。非限定的な例としては、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が挙げられる。配列アラインメント及び２種の配列間の同一性の百分率の決定は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで利用可能なＢＬＡＳＴＮ／ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのデフォルト設定によって実施することができる。
「ＩＬ－５への結合」という用語は、ＩＬ－５、好ましくはヒトＩＬ－５との相互作用を指す。
「抗ＩＬ－５抗体」及び「ＩＬ－５抗体」という用語は、互換的に使用されており、これらは両方とも、ＩＬ－５に結合する抗体を指す。
本開示において、融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えによる２つの遺伝子の共発現によって得られた、タンパク質生成物である。組換えＩＬ－５細胞外領域Ｆｃ融合タンパク質は、ＤＮＡ組換えによるＩＬ－５細胞外領域と、ヒト抗体Ｆｃフラグメントとの共発現によって得られた、融合タンパク質である。ＩＬ－５細胞外領域は、細胞膜の外部に発現したＩＬ－５タンパク質を指し、ＩＬ－５細胞外領域の配列は、配列番号：１に提示のとおりである。
抗体及び抗原結合性フラグメントを生成及び精製するための方法は周知であり、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ、第５～８章及び１５章等の従来技術においても提供されている。例えば、マウスは、ヒトＩＬ－５又はそのフラグメントによって免疫化することが可能であり、得られた抗体は、復元及び精製されてもよく、従来の方法を用いることによってアミノ酸シーケンシングを実施することもできる。抗原結合性フラグメントは、従来の方法を用いることによって調製することもできる。本開示による抗体又は抗原結合性フラグメントは、１つ以上のヒトＦＲ領域を非ヒトＣＤＲ領域にグラフト化するよう遺伝子操作されている。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから得ることもできるし、又はＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１ＩＳＢＮ０１２４４１３５１から得ることもできる。
人工抗体（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又はその抗原結合性フラグメントは、慣用的な方法によって調製及び精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクター内に組み換えることができる。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクションすることができる。推奨される一従来技術として、ほ乳類発現系により、抗体を、特に、Ｆｃ領域に属する高度に保存的なＮ末端位をグリコシル化することができる。安定なクローンは、ヒトＩＬ－５に特異的に結合する抗体を発現させることによって、得られる。陽性クローンをバイオリアクターの無血清培地中で増やして、抗体を産生する。抗体が分泌された培地は、慣用的な技法によって精製することができる。例えば、調整済みのバッファーを含むプロテインＡ又はプロテインＧ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムが、精製のために使用されてもよい。非特異的に結合した成分は、洗い流される。次いで、結合した抗体をｐＨグラジエントによって溶出させ、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出し、収集する。抗体は、慣用的な方法によってろ過及び濃縮することができる。可溶性の混合物及びマルチマーは、慣用的な方法、例えば分子ふるい及びイオン交換によって除去することもできる。得られた生成物は、－７０℃等で直ちに凍結し、又は凍結乾燥させるべきである。
「任意選択による」又は「任意選択により」は、これらの用語の後に続く事象又は環境が発生してもよいし、発生しなくてもよいことを意味するが、その記載には、事象又は環境が発生する場合又は発生しない場合が含まれる。例えば、「任意選択により、抗体の１～３つの重鎖ＣＤＲ領域を含んでもよい」は、特異的配列を有する抗体の重鎖ＣＤＲ領域が存在してもよいが、必ずしも存在するとは限らないことを意味する。
動物、人間、実験対象、細胞、組織、器官又は生物体液に適用された場合、「投与する」及び「処置する」は、外因性医薬品、治療剤、診断薬又は組成物と、動物、人間、対象、細胞、組織、器官又は生物体液との接触を指す。「投与する」及び「処置する」は、例えば処置、薬物動態、診断、研究及び実験方法を指し得る。細胞の処置は、試薬と細胞との接触及び試薬と流体との接触を含み、この場合、流体は、細胞と接触している。「投与する」及び「処置する」は例えば、インビトロ及びエクスビボでの試薬、診断薬、結合作用のある組成物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）又は別の細胞による細胞の処置も意味する。ヒト、獣医学的対象又は研究対象に適用された場合の「処置する」は、治療処置、予防又は予防的措置、研究及び診断の適用を指す。
「処置」は、内用又は外用治療剤、例えば、本開示の結合作用のある化合物（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）のいずれか１種を含む組成物を、それに対して治療剤が治療効果を有することが知られている１種以上の疾患症状のある患者に施用することを意味する。一般に、治療剤は、処置された患者又は集団の１種以上の疾患症状を緩和するのに効果的な量で与えられ、これによって、臨床的に検出できる任意の程度までこのような症状の後退を誘導し、又はこのような症状の発症を阻害する。何らかの特定の疾患症状を緩和するのに効果的な治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、様々な因子、例えば患者の疾患状態、年齢及び体重、並びに、望ましい治療効果を患者に生じさせる治療剤の能力に応じて変化し得る。疾患症状が緩和されたかどうかは、症状の重症度又は進行を評価するために医師又は他の医療専門家によって一般的に使用されている任意の臨床検査法によって、評価することができる。本開示の一実施形態（例えば、処置方法又は製造物）は、ターゲットとする各疾患症状を緩和するのに有効ではないこともあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン－ホイットニーのＵ検定、クラスカル－ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ検定及びウィルコクソン検定等の当技術分野において知られた任意の統計学的な試験方法によって判定されたときに、統計学的に有意な数の患者にあるターゲットとする疾患症状を緩和するはずである。
その疾患がＩＬ－５に関連付けられた疾患である限り、ＩＬ－５に関連付けられた疾患に制限はない。例えば、本開示の分子によって誘導される治療反応は、ヒトＩＬ－５への結合後に好酸球の刺激効果を遮断又は阻害することによって、発生させることができる。したがって、治療用途に適した調製物及び製剤に応用された場合、本開示の医薬組成物は、アレルギー及び／若しくはアトピー反応に苦しんでいる、又は、限定されるわけではないがぜんそく、ぜんそくの増悪、悪性のぜんそくの発症、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症若しくはステロイド依存性好酸球性気管支炎等の好酸球に関連付けられた反応に苦しんでいる対象にとっては、非常に有用である。好ましい一実施形態において、処置は、肺組織への好酸球の浸潤を阻害又は緩和することができる。本医薬組成物の投与頻度は、１日当たり３回から、６か月ごとに１回までとすることができる。投与経路は、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、非経口経路又は局所的経路であってよい。
本開示の製剤は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するために使用することができる。例えば、製剤は、限定されるわけではないが、インビボ及びインビトロにおけるＩＬ－５によって媒介される炎症反応及び好酸球の成熟、活性化、脱顆粒又は組織浸潤を阻害又は緩和し；ＩＬ－５によって引き起こされる平滑筋の過剰なストレスを抑制し；肺、気道又は血液におけるＩＬ－５のレベルを低下させるために使用することができる。好ましくは、本開示の製剤は、ＩＬ－５媒介性疾患を処置するために使用することができ、好ましくは、ＩＬ－５媒介性疾患は、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される。
「有効量」は、医学的疾患の症状又は状態を改善又は予防するのに十分な量を含む。有効量は、診断を可能にし、又は容易にするのに十分な量も指す。特定の患者又は獣医学的対象に関する有効量は、次の因子に応じて変化し得る：例えば、処置すべき状態、患者の全身状態、投与経路及び投薬量、並びに副作用の重症度。有効量は、有意な副作用又は毒性作用を回避する最大用量又は投与スケジュールであり得る。
「交換」は、抗体タンパク質を溶解させるために使用される溶媒系の交換を指す。例えば、抗体タンパク質を含む高塩濃度の又は高張性の溶媒系が、物理的な操作により、安定な製剤のバッファー系によって置きかえられ、この結果、抗体タンパク質は、安定な製剤中に存在することになる。物理的操作には、限定されるわけではないが、限外ろ過、透析又は遠心分離後の復元が挙げられる。
（実施例及び試験例）
以下、例と組み合わせて本開示をさらに説明するが、これらの例は、本開示の範囲を限定しない。本開示の例において特定の条件を採用していない実験方法は通常、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ制作のＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇという刊行物を参考にする等、慣用的な条件によるものであり；又は、材料若しくは製品の製造業者によって推奨されている条件によるものである。特定の供給源が示されていない試薬は、市場から購入した慣用的な試薬である。
（実施例１）
ＩＬ－５抗原の調製、及びその検出に使用されたタンパク質
１．１ ＩＬ－５抗原の設計及び発現
Ｈｉｓタグ付きのヒトＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのアカゲザルＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのマウスＩＬ－５と、Ｈｉｓタグ付きのラットＩＬ－５と、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃフラグメントを含むヒトＩＬ－５Ｒα受容体細胞外領域融合タンパク質とをコードする配列を、ｃｐｈｒベクターにクローニングし、発現プラスミドを構築し、次いで、ＨＥＫ２９３にトランスフェクションした。トランスフェクションから６日目に、サンプルを収集し、４５００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離によって細胞上清を収集した。組換えＩＬ－５及びＩＬ－５α受容体タンパク質を含む上清を、ニッケルカラムの使用によって精製し、組換えヒトＩＬ－５－Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムの使用によって精製した。精製されたタンパク質は、後続の実験に使用することができる。特異的なタンパク質抗原の配列は、以下のとおりである。
ｈｉｓタグ（ｒｈＩＬ－５－ｈｉｓ）付きのヒトＩＬ－５のアミノ酸配列
ｈｉｓタグ付きのカニクイザルＩＬ－５のアミノ酸配列
注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ｈｉｓタグ付きのマウスＩＬ－５のアミノ酸配列
注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ｈｉｓタグ付きのラットＩＬ－５のアミノ酸配列
注記：イタリック体の部分は、Ｈｉｓ６タグを表す。
ヒトＦｃフラグメントに融合したヒトＩＬ－５α受容体のアミノ酸配列
注記：イタリック体の部分は、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃタグを表す。
（実施例２）
組換えＩＬ－５α受容体及びＩＬ－５α／β受容体細胞株の構築及び同定
機能的抗体をスクリーニングするために、本開示は、ＩＬ－５αを発現させるＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α細胞株、及び、ＩＬ－５αとＩＬ－５βとの両方を発現させるＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α／ＩＬ－５β細胞株を構築した。
具体的には、ヒトＩＬ－５α完全長遺伝子（Ｑ０１３４４）をほ乳類細胞発現ベクターｐＴａｒｇｅＴにクローニングし、直線化したプラスミドをＣＨＯ－Ｓ細胞にエレクトロトランスフェクションし、Ｇ４１８の存在下で２週間スクリーニングした後、限界希釈を２回実施した。ＦＡＣＳによって細胞表面上のＩＬ－５α遺伝子を検出し、ＩＬ－５α発現レベルが高いＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α細胞株を選択した。これをベースにして、直線化したｐｃＤＮＡ３．１－ＩＬ－５βをエレクトロトランスフェクションし、Ｇ４１８及びｚｅｏｃｉｎの存在下で２週間スクリーニングした後、限界希釈を２回実施した。ＦＡＣＳによって細胞表面上のＩＬ－５α及びＩＬ－５β遺伝子を検出し、ＩＬ－５α及びＩＬ－５βの発現レベルが高いＣＨＯ－Ｓ／ＩＬ－５α／ＩＬ－５β細胞株を選択した。
（実施例３）
抗ヒトＩＬ－５マウスモノクローナル抗体の調製
２種の用量の組換えタンパク質ｒｈＩＬ－５－ｈｉｓ、フロイントアジュバントＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ、ロット番号ＳＬＢＱ１１０９Ｖ）及びＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ、ロット番号ＳＬＢＪ２８４５Ｖ）（１００ｇ／５０ｇ／５０ｇ（高用量）及び２５ｇ／１２．５ｇ／１２．５ｇ（低用量））を使用して、それぞれ２つのＢａｌｂ／ｃマウス群（５マウス／群）及び４つのＳＪＬマウス群（５マウス／群）を免疫化した。ＥＬＩＳＡ、リガンド－受容体遮断アッセイ及びＴＦ－１増殖阻害アッセイによって血清力価を検出することにより、ＩＬ－５に対する特異的免疫反応を測定した。良好な特異的免疫反応が良好だったマウスを選択して屠殺し；脾臓細胞を収集し、骨髄腫細胞と融合させた。
一次スクリーニングを、ヒトＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイによって実施した。ハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートに移したらすぐに、ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイ、ＩＬ－５に対するＥＬＩＳＡベース受容体遮断アッセイ及びＴＦ－１増殖の阻害アッセイを用いることにより、上清を再びスクリーニングした。陽性クローンを２回サブクローニングした後には、ハイブリドーマクローンが得られたが、これを抗体の製造のために使用し；得られた抗体を、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
精製済みの抗体には、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ、エンドトキシン含量の検出、様々な種ＩＬ－５に対するＢｉａｃｏｒｅアフィニティアッセイ、ＩＬ－５に対するＦＡＣＳベース受容体遮断アッセイ、ＴＦ－１増殖の阻害アッセイ、好酸球の接着試験、並びに、インビボでのぜんそくのマウスモデル及びモルモットの中和モデルにおける有効性評価を施し；インビボ及びインビトロで好ましい活性を示したモノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９を選択した。
陽性ハイブリドーマから配列をクローニングするためのプロセスは、次のとおりだった。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番１５５９６－０１８）を用いて、キットの取扱説明書に従ってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写酵素キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号２６８０Ａ）を使用して逆転写した。逆転写によって得られたｃＤＮＡを、Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ０５０３）を使用したＰＣＲによって増幅した後、シーケンシングした。ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域ＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列が得られた（ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。）。
ｍＡｂ１７０５マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：６
ｍＡｂ１７０５マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＩＡＲＳＰＫＬＶＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＮＴＬＥＳＥＤＴＧＩＹＦＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＲＬＥＬＫ
配列番号：７
ｍＡｂ１７０６マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＫＫＧＬＥＷＶＴＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＤＳＬＲＳＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：８
ｍＡｂ１７０６マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＭＳＶＳＬＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＬＧＫＳＰＫＬＭＩＨＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＳＬＴＩＮＴＬＥＳＥＤＰＧＩＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号：９
ｍＡｂ１７８０マウス重鎖可変領域の配列
ＱＶＫＬＬＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＤＳＶＫＭＳＣＫＡＳＤＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＫＱＳＱＧＲＳＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＦＳＳＴＡＹＭＥＦＲＲＬＴＦＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＶＭＶＴＶＳＳ
配列番号：１０
ｍＡｂ１７８０マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＬＡＶＳＰＧＥＲＶＳＩＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＱＰＫＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＡＤＤＡＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＬＫ
配列番号：１１
ｍＡｂ１７７３マウス重鎖可変領域の配列
ＥＶＱＬＱＱＳＬＡＥＬＶＲＰＧＡＳＶＴＬＳＣＴＡＳＧＦＮＩＫＮＴＹＩＨＷＶＫＱＲＰＥＱＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＮＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧＫＡＴＩＴＡＤＴＳＳＮＴＡＹＬＱＦＳＳＬＴＳＥＤＴＡＩＹＹＣＦＲＹＧＩＹＰＤＨＷＧＱＧＴＰＬＴＶＳＳ
配列番号：１２
ｍＡｂ１７７３マウス軽鎖可変領域の配列
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＬＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＲＳＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＳＬＴＩＳＲＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＥ
配列番号：１３
ｍＡｂ１７７９マウス重鎖可変領域の配列
ＱＶＫＬＬＱＳＧＡＡＬＶＫＰＧＤＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＳＨＧＫＳＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＬＥＦＳＲＶＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＧＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＰＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号：１４
ｍＡｂ１７７９マウス軽鎖可変領域の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＬＧＥＴＶＳＩＥＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＳＧＲＳＰＱＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＲＹＦＦＫＩＳＧＭＱＰＥＤＥＡＤＹＦＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号：１５
各抗体の軽鎖及び重鎖のＣＤＲ配列は、表１に示されている。
Figure 0007641908000006
Ｂｉａｃｏｒｅによる活性の検出結果は、表２で確認することができる。
Figure 0007641908000007
上記結果により、本開示のマウス抗体が、抗原に対する高いアフィニティを有することが示されている。
（実施例４）ＩＬ－５関連組換えタンパク質の精製並びにハイブリドーマ抗体及び組換え抗体の精製
４．１ ＩＬ－５－Ｆｌａｇ－Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製ステップ：
サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去し、適切な体積になるまで濃縮した。ＮＩ－ＮＴＡアフィニティカラム（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号３０７２１）をＰＢＳによって平衡させ、カラム容積の２～５倍で洗浄した。不純物の除去後、細胞発現上清サンプルをカラムにロードした。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、ＰＢＳによってカラムを洗浄した。ＰＢＳによってカラムを洗浄して、汚染タンパク質を除去し、サンプルを収集した。標的タンパク質を、洗浄バッファー（２０ｍＭイミダゾール）及び溶出バッファー（３００ｍＭイミダゾール）によって順次溶出させ、溶出ピークを収集した。
収集された溶出液を、イオン交換（Ｈｉｌｏａｄ１６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム）によってさらに精製した。カラム容積の約２倍のＰＢＳによってカラムを平衡させて、ｐＨが確実に７．４になるようにした。同定された標的タンパク質を含む溶出バッファーを濃縮してロードし、サンプルを収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ－ＭＳによる同定によって確認し、アリコート化して使用した。
４．２ ハイブリドーマ発現抗体及びＦｃ融合タンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して、不純物を除去した。ハイブリドーマ発現上清をプロテインＧカラムによって精製し、Ｆｃ融合タンパク質発現上清をプロテインＡカラムによって精製した。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをＰＢＳによって洗浄した。ｐＨ３．０の１００ｍＭ酢酸によって標的タンパク質を溶出させ、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、ＰＢＳによって平衡させたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によってサンプルをさらに精製し、凝集物を含まないピークを収集した後、アリコート化して使用に供した。
（実施例５）抗ヒトＩＬ－５モノクローナル抗体のヒト化の設計
当技術分野における数多くの参考文献において開示されているようにして、マウス抗ヒトＩＬ－５モノクローナル抗体のヒト化を実施した。簡単に言うと、マウス抗体の定常領域をヒト定常領域によって置きかえ、マウス抗体のＣＤＲを、最も高い相同性を有するＦＲヒトテンプレートにグラフト化し、ＦＲ領域中のアミノ酸に復帰変異を発生させた。
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖可変領域及び軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースに対して整合させることにより、ｍＡｂ－１７０５、ｍＡｂ－１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９抗体のアミノ酸配列のそれぞれに対して高い同一性を有する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域生殖細胞系列を、テンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを、対応するヒトテンプレートにグラフト化して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順番の可変領域を形成した。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ式ナンバリング基準に従って決定し、注釈を付けた。
ヒトＦＲ領域及びアミノ酸復帰変異の選択
得られたマウス抗体ＶＨ／ＶＬ ＣＤＲの典型的な構造に基づいて、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）相同配列をヒト生殖細胞系列データベースから検索し、ＦＲ相同性に応じて（降順に）ランク付けし；ＦＲ相同性が最も高い生殖細胞系列を、主要なテンプレートとして選択した。マウス抗体のＣＤＲ領域をヒトテンプレートにグラフト化した後、ＦＲ残基を変異させ、アミノ酸残基を最適化すると、最終的なヒト化分子が得られた。
５．１ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０５に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０５に関しては、ＩＧＨＶ３－２３＊０４をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－１２＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。ｍＡｂ１７０５のＣＤＲをヒトテンプレートにグラフト化し；組み込まれた残基と、ＣＤＲ領域（ソフトウェアによって発見された）と直接相互作用した残基とを復帰変異させた。表３に示されているように、様々なヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 0007641908000008
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
Figure 0007641908000009
 注記：この表は、様々な変異の組合せによって得られた配列を示している。ｈ１７０５－００７によって示されているように、ヒト化マウス抗体ｈ１７０５－００７は、２種の変異体、すなわち、軽鎖ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａ及び重鎖ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａ等を含む。
ヒト化抗体ｈ１７０５の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１（配列番号：４６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：４７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：４８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＶＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＳＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１（配列番号：４９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：５０）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：５１）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成し、重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。例示的なヒト化抗体定常領域配列が、以下に示されている。
＞重鎖ＩｇＧ１定常領域：
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：５２
注記：アンダーライン部分は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ変異を表す。
＞軽鎖κ定常領域：
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：５３
５．２ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０６に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０６に関しては、ＩＧＨＶ３－２３＊０４をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－１２＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７０６のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；ＦＲアミノ酸を復帰変異させた。表５に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 0007641908000010
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
表６に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な抗体を形成した。
Figure 0007641908000011
ｈ１７０６ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１（配列番号：５４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：５５）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：５６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＭＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１（配列番号：５７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：５８）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：５９）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
５．３ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７８０に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７８０に関しては、ＩＧＨＶ１－２＊０２をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ３－１１＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７８０のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；ＦＲアミノ酸を復帰変異させた。表７に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 0007641908000012
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ｅ１Ｄは、「グラフト化」の１位のＥが変異して、Ｄに戻ったことを表す。
表８に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 0007641908000013
ｈ１７８０ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１（配列番号：６０）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：６１）
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：６２）
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１（配列番号：６３）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：６４）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：６５）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号：６６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＫＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ。
上記軽鎖可変領域のそれぞれを軽鎖定常領域と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
５．４ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７３に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７３に関しては、ＩＧＨＶ３－７３＊０１をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－３９＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｍＡｂ１７７３のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；アミノ酸を復帰変異させた。表９に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。さらに、ｈ１７７３ ＨＣＤＲ２（ＲＩＤＰＡＮＧＤＴＫ ＨＧＰＫＦＱＧ）中のＮをＶに変異させて（すなわち、Ｎ５５Ｖ）、重鎖可変領域ＨＣＤＲ２バリアントを形成した（変異したＨＣＤＲ２の配列は、配列番号：８２：ＲＩＤＰＡＶＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧに示されたとおりである。）。
Figure 0007641908000014
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ｍ４Ｌは、「グラフト化」の４位のＭが変異して、Ｌに戻ったことを表す。
表１０に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 0007641908000015
ｈ１７７３ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１（配列番号：６７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：６８）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１（配列番号：６９）
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：７０）
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：７１）
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５３に示された軽鎖定常領域配列と組み合わせて、最終的な完全軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５２に示された重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な完全重鎖配列を形成した。
５．５ ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７９に関するヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７９に関しては、ＩＧＨＶ１－２＊０２をＶＨ用のテンプレートとして選択し、ＩＧＫＶ１－３３＊０１をＶＬ用のテンプレートを選択した。マウス抗体ｈ１７７９のＣＤＲを、選択したヒト化テンプレートにグラフト化し；アミノ酸を復帰変異させた。表１１に示されているように、ヒト化抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域が得られた。
Figure 0007641908000019
 注記：「グラフト化」は、マウス抗体ＣＤＲをヒト生殖細胞系列ＦＲ領域にグラフト化したことを表す。例えば、アミノ酸配列の天然ナンバリングに従えば、Ａ４３Ｓは、「グラフト化」の４３位のＡが変異して、Ｓに戻ったことを表す。
表１２に示されているように、設計したヒト化分子を組み合わせて、下記の表に提示の様々な分子を形成した。
Figure 0007641908000020
ｈ１７７９ヒト化抗体の可変領域の特異的配列は、以下のとおりである。
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１（配列番号：７２）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ａ（配列番号：７３）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号：７４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１（配列番号：７５）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ａ（配列番号：７６）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＶＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号：７７）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号：７８）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＲＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｄ（配列番号：７９）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５３に示された軽鎖定常領域配列と組み合わせて、軽鎖配列を形成した。重鎖可変領域のそれぞれを、配列番号：５２に示された重鎖定常領域と組み合わせて、重鎖配列を形成した。
例示的なヒト化抗体の完全長配列は、以下のとおりである。
ｈ１７０５－００８重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＳＩＳＹＥＧＤＩＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＴＹＹＣＡＳＱＴＬＲＥＳＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８３
ｈ１７０５－００８軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＡＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＩＹＧＴＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＫＥＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８４
ｈ１７０６－００９重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＨＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＹＥＧＮＳＡＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＥＴＬＲＥＳＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８５
ｈ１７０６－００９軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＩＧＮＹＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＭＩＹＳＡＳＮＬＥＶＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＬＱＨＫＱＦＰＲＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８６
ｈ１７８０－０１７重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＥＹＬＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＳＧＧＴＶＹＮＥＫＦＫＳＲＡＴＬＴＶＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＦＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＤＰＬＤＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８７
ｈ１７８０－０１７軽鎖：
ＤＴＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＥＧＬＴＳＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＡＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＱＮＷＮＤＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８８
ｈ１７７３－００７重鎖：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＩＳＮＴＹＩＨＷＶＫＱＡＳＧＫＧＬＥＷＩＧＲＩＤＰＡＶＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧＲＦＴＩＳＡＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＦＲＹＧＩＹＰＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：８９
ｈ１７７３－００７軽鎖：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＮＹＩＹＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＰＷＩＹＬＴＡＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＮＳＹＰＹＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：９０
ｈ１７７９－０１４重鎖：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＩＩＨＷＶＫＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＦＮＰＮＳＧＧＳＮＹＮＥＮＦＫＲＫＡＴＭＴＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＥＦＳＲＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＩＡＷＤＨＷＹＦＤＦＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＹＩＴＲＥＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号：９１
ｈ１７７９－０１４軽鎖：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＮＤＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＳＰＫＬＬＶＹＡＡＳＲＬＱＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＧＹＫＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：９２；
国際公開第２０１２／０８３３７０号におけるＩＬ５に対する抗体Ｈｕ３９Ｄ１０を、本開示においてはポジティブコントロールとして使用したが、その重鎖配列及び軽鎖配列が、それぞれ配列番号：８０及び配列番号：８１に示されている。
Ｈｕ３９Ｄ１０重鎖の配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＬＳＬＴＳＮＳＶＮＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＷＳＮＧＤＴＤＹＮＳＡＩＫＳＲＦＴＩＳＲＤＴＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＹＹＧＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号：８０
Ｈｕ３９Ｄ１０軽鎖の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＬＡＳＥＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＮＳＬＱＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＡＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＫＦＰＮＴＦＧＱＧＴＫＶＥＶＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号：８１。
（実施例６）組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の調製
１．組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマのスクリーニングによって陽性抗体分子を得た後、可変領域をコードする遺伝子配列をシーケンシングによって得た。得られた配列をベースにして、フォワードプライマー及びリバースプライマーを設計し、シーケンシングされた遺伝子をテンプレートとして使用して、ＰＣＲによって各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築した後、相同組換によって（シグナルペプチド及びｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒに挿入して、組換えキメラ抗体完全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築して、５種のキメラ抗体Ｃｈ１７０５、Ｃｈ１７０６、Ｃｈ１７８０、Ｃｈ１７７３及びＣｈ１７７９を得た。
２．ヒト化抗体の分子クローニング
ヒト化抗体配列にコドン最適化を施した後には、ヒトコドン選好性を有するコーディング遺伝子配列が得られ；プライマーを設計して、ＰＣＲによって各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築し、次いでこれを、相同組換えによって（シグナルペプチド及びｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１－Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを有する）発現ベクターｐＨｒにして、ヒト化抗体完全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ｐＨｒ／ＶＬ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。
３．組換えキメラ抗体及びヒト化抗体の発現及び精製
抗体軽鎖又は重鎖を発現したプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に別々にトランスフェクションした。６日後、発現上清を収集し、高速で遠心分離して、不純物を除去し、プロテインＡカラムによって精製した。Ａ２８０測定値が低下してベースラインに至るまで、カラムをＰＢＳによって洗浄した。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶出バッファーによって標的タンパク質を溶出させ、ｐＨ８．０～９．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌによって中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮し、ＰＢＳによってあらかじめ平衡させたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によってさらに精製して、凝集物を除去し、モノマーピークを収集し、アリコート化して使用した。
次の試験方法を使用して、本開示の抗体の性能及び有益な効果を確認した。
インビトロ活性の生物学的評価
試験例１．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる異なる種のＩＬ－５へのマウスＩＬ－５抗体の結合
試験すべきマウスＩＬ－５抗体とヒトＩＬ－５とのアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）機器によって測定した。
プロテインＡバイオセンサチップを使用して、試験すべき分子をアフィニティ捕捉した後、抗原（実施例１において調製された組換えヒト及びカニクイザルＩＬ－５）がチップの表面を流れて通過したら、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によって反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合曲線及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了したら、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン－塩酸再生溶液（ｐＨ１．５）によって再生した。ＢＩＡ評価バージョン４．１ ＧＥソフトウェアを使用して、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに対してデータを当てはめ、アフィニティ値を得て表１３に示した。
Figure 0007641908000021
この例は、本開示の抗体ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３及びｍＡｂ１７７９が、異なる種のＩＬ－５（ヒト、サル）に対する高いアフィニティを有することを実証している。
試験例２．Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる異なる種のＩＬ－５に対するヒト化ＩＬ－５抗体のアフィニティ
試験すべきヒト化ＩＬ－５抗体とヒトＩＬ－５とのアフィニティを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）機器によって測定した。
プロテインＡバイオセンサチップを使用して、試験すべき分子をアフィニティ捕捉した後、抗原（例１において調製）がチップの表面を流れて通過したら、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器によって反応シグナルをリアルタイムで検出して、結合曲線及び解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了したら、バイオセンサチップを洗浄し、グリシン－塩酸型再生溶液（ｐＨ１．５）によって再生した。ＢＩＡ評価バージョン４．１ ＧＥソフトウェアを使用して、（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルに対してデータを当てはめ、アフィニティ値を得て表１４に示した。
Figure 0007641908000022
上記結果により、すべてのヒト化ＩＬ－５抗体は、ヒトＩＬ－５に対する高いアフィニティを有することが示されている。
試験例３．ＩＬ－５α受容体へのＩＬ－５の結合を遮断するマウスＩＬ－５抗体のＥＬＩＳＡベースアッセイ
組換え発現したＩＬ－５α受容体タンパク質の細胞外領域へのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体の能力を確認するために、ＩＬ－５（ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡプレートに塗り、３７℃で１時間インキュベートし；液体を取り除き、ＰＢＳによって希釈した２００μｌ／ｗｅｌｌの５％脱脂乳ブロッキング溶液を加え、ブロッキングのためにお３７℃のインキュベーター内で２．５時間インキュベートした。ブロッキング後、ブロッキング溶液を除去し、プレートをＰＢＳＴバッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ）によって５回洗浄し；ビオチン標識キット（Ｔｏｊｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＬＫ０３）によって標識された１０μｇ／ｍｌのＩＬ－５Ｒα（１％ＢＳＡ中）２５μｌを加えた後、勾配希釈された２５μｌの抗体を加え（抗体は、ＩＬ－５との結合に関してはＩＬ－５Ｒαと競合した。）、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、マイクロタイタープレート中の反応溶液を取り除き、プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、サンプル希釈溶液によって１：６００に希釈された５０μｌ／ｗｅｌｌのストレプトアビジン－ペルオキシダーゼポリマー（Ｓｉｇｍａ、Ｓ２４３８－２５０ＵＧ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴによって５回洗浄し、５０μｌ／ｗｅｌｌのＴＭＢ発色基質（ＫＰＬ、５２－００－０３）を加え、室温で３～１０分間インキュベートし；５０μｌ／ｗｅｌｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて、反応を停止させ；ＮＯＶＯＳｔａｒマイプロプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度の値を読み取り；ＩＬ－５ＲαへのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＩＣ５０値を計算した。その結果は、表１５に示されている。本開示の抗体は、ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を効果的に阻害することができる。
Figure 0007641908000023
試験例４．ＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＦＡＣＳベースアッセイ
細胞表面上のＩＬ－５受容体を遮断することができるスクリーニングされたＩＬ－５抗体を確認するために、ＩＬ－５Ｒα／βという２種の受容体を高発現させるＣＨＯＳ組換え細胞株を構築した。この実験により、ＩＬ－５抗体はそれぞれ、それぞれＣＨＯＳ細胞株の表面上の組換えＩＬ－５α／β受容体へのＩＬ－５の結合を遮断できることが実証された。
特定の方法は、次のとおりだった。１００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８及び２５ｎｇ／ｍｌのｚｅｏｚｉｎを含むＣＤ－ＣＨＯを使用して、ＣＨＯ－Ｓ－ＩＬ－５Ｒα及びβを培養した。細胞培養中、濃度は、３×１０６細胞／ｍｌを超えるべきではない。良好な状態のＩＬ－５Ｒα／β－ＣＨＯＳ細胞を（１０００ｒｐｍで５分間）遠心分離し、ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳによって１回洗浄し、細胞をカウントし、細胞濃度を４×１０６細胞／ｍｌに調整し、２５μｌを取り出し、丸底９６ウェルプレートに加えた。試験すべき抗体を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ溶液によって希釈した。初期濃度は２００μｇ／ｍｌだったが、８種の勾配希釈物になるように１：１０に希釈した。ビオチン標識キット（Ｔｏｊｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＬＫ０３）によって標識された１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ－５ ２５μｌを加え、各濃度の希釈抗体５０μｌと完全に混合したら、細胞を加えておいた９６ウェルプレートに加え、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを４℃で遠心分離（４００ｇ、５分間）し、上清を取り除き、プレートを、あらかじめ冷却した２００μｌのＰＢＳを用いた遠心分離によって洗浄し、これを２回繰り返し；１：１３３３に希釈されたＰＥ－Ａｖｉｄｉｎ二次抗体を加え、暗所において４℃で４０分間インキュベートし、４℃（４００ｇ、５分）で遠心分離し；上清を除去し、あらかじめ冷却した２００μｌのＰＢＳを加えて、細胞をピペッティングし；プレートを遠心分離によって４℃で３回洗浄し；１００μｌのＰＢＳを加え、プレートを機械で読み取り；ＩＬ－５Ｒα／βへのＩＬ－５の結合を遮断するＩＬ－５抗体のＩＣ５０値を、蛍光シグナル値によって計算した。その結果は、表１６及び図１に示されている。
Figure 0007641908000024
上記結果により、抗体ｈ１７０５－００８、ｈ１７０６－００９、ｈ１７８０－０１７及びｈ１７７９－０１４は、細胞表面上のＩＬ－５受容体へのＩＬ－５の結合を遮断する強力な能力を呈することが示されている。
試験例５．ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５によって誘導されるＴＦ１細胞の増殖を阻害する
ＩＬ－５は、ＴＦ－１細胞の増殖を誘導することが可能であり、ＩＬ－５抗体は、ＩＬ－５が、ＴＦ－１細胞の増殖を刺激しないようにすることができる。
具体的には、ＴＦ－１細胞（ＴＣＣ、ＣＲＬ－２００３）を、１０％ＦＢＳ及び２ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ－ＣＳＦ（ＬＩＮＫＢｉｏ、カタログ番号９６－ＡＦ－３００－０３－２０）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れたが、細胞密度は、１×１０６細胞／ｍｌを超えない。抗体を検出するために、対数増殖期の細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離し；ＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ：２％、組換えヒトＩＬ－５：１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、細胞密度を６０００細胞／ｗｅｌｌ／９０μｌに調整し；勾配希釈された試験すべき抗体１０μｌを、培養するために９６ウェルプレートに加え、培養から３日後、３０μｌの細胞タイター溶液を加え、検出のために混合し、ＩＣ５０を測定値によって計算した。試験結果は、以下の表１７に示されている。
Figure 0007641908000025
試験例６．ＩＬ５によって誘導される好酸球の接着を阻害するＩＬ５抗体の試験
ＩＬ５は、好酸球の分化、成熟、遊走及び活性化を誘導し、呼吸器の炎症を起こし、ぜんそくを発症させる可能性がある。この実験は、ＩＬ－５サイトカインが好酸球の接着及び活性化を促進できる原理に基づいている。ヒト末梢血から好酸球を収集し、精製して、ＩＬ－５経路に対するＩＬ－５特異的抗体の遮断効果を試験し、インビトロでＩＬ５によって媒介される好酸球の接着に対するＩＬ－５抗体の遮断効果を検出した。
具体的には、ヒト末梢血を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳによって５倍希釈し、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（１．０８８の密度勾配）を使用して、単球及び顆粒球を単離した。顆粒球を含む赤血球層を慎重に吸引し、赤血球溶解溶液を使用して、赤血球を除去し；残存の細胞をカウントし、ＣＤ１６抗体を備える分離用磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０４５－７０１）を相応に加え、３０分間インキュベートし、磁性ビーズカラムに流して通過させ、分集団（主に好酸球）はカラムに直接流して通過させ、負の選択によって収集した。単離された好酸球をカウントし、ＩｇＧ抗体をあらかじめ塗っておいた９６ウェル細胞培養プレートに、ウェル１個当たり約１×１０４個の細胞になるように加え；異なる濃度（１０μｇ／ｍｌから出発で、３倍希釈、１０点の濃度点）のヒトＩＬ－５（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ－５抗体分子を加え；細胞培養プレートを３７℃の５％ＣＯ２インキュベーターに入れ、１時間インキュベートした後、培養プレートを取り出し、０．３％ＣＴＡＢを加えて、細胞を溶解させ、最後に、ペルオキシダーゼ反応基質ＴＭＢを加えて発色させ、ＯＤ４５０吸収値をマイプロプレートリーダーによって読み取った。ＩＬ－５のみを加えられたウェルの測定値は、最大吸収値であり；ＩＬ－５及び抗体型作用物質を不含のウェルは、バックグラウンドコントロールとして採用し；最大吸着値に対する各濃度における抗体型作用物質の阻害値を計算し＝（最大吸着値－［抗体型作用物質］）／（最大吸着値－バックグラウンドコントロール値）×１００％、ＩＣ５０を計算した。その結果は、表１８に示されている。
Figure 0007641908000026
上記結果により、本開示のヒト化抗体は、ＩＬ５によって媒介される好酸球の接着を遮断する強力な能力を呈することが示されている。
試験例７．Ｔｈ２サイトカインに対するヒト化ＩＬ－５抗体の特異性の評価
ＩＬ－５は、Ｔｈ２サイトカインのうちの１つだった。ＩＬ－５抗体がＩＬ－５のみを特異的にターゲッティングし、他のサイトカインとの間で交差反応しないことを確認するために、Ｆｏｒｔｅｂｉｏして、ＩＬ－５との間でα受容体を共有する、ＩＬ２（Ｒ＆Ｄ、２０２－ＩＬ－０１０／ＣＦ）、ＩＬ４（Ｒ＆Ｄ、２０４－ＩＬ－０５０／ＣＦ）、ＩＬ－５（Ｒ＆Ｄ、２０５－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＦＮｇａｍｍａ、ＩＬ６（Ｒ＆Ｄ、７２７０－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ９（Ｒ＆Ｄ、２０９－ＩＬ－０１０／ＣＦ）、ＩＬ１０（Ｒ＆Ｄ、２１７－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ１３（Ｒ＆Ｄ、２１３－ＩＬＢ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ２５（Ｒ＆Ｄ、８１３４－ＩＬ－０２５／ＣＦ）、ＩＬ３１（Ｒ＆Ｄ、２８２４－ＩＬ－０１０／ＣＦ）及びＩＬ３（２０３－ＩＬ－０５０／ＣＦ）並びにＧＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ、２１５－ＧＭ－０１０／ＣＦ）を含む１２種類のＴｈ２及び関連サイトカインを検出した。
具体的には、プロテインＡバイオセンサー（ＰＡＬＬ Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、１８－５０１０）を使用して、抗体を捕捉し、捕捉シグナルを記録した後、４０ｎＭ サイトカインのそれぞれを注入し、結合シグナルを記録した。最後に、ＩＬ－５との結合シグナルを１００％として規定した。他のサイトカインと抗体との結合シグナルを観察したが、その結果は、図２に示されている。
上記結果により、１２種の関連サイトカインの中でも、ヒト化ＩＬ－５抗体ｈ１７０５－００８及びｈ１７０６－００９のみは、ＩＬ－５に特異的に結合し、他のＴｈ２サイトカインとの交差反応性を有さないことが示されている。
インビボ活性の生物学的評価
試験例８．ＯＶＡ誘導性マウスぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体の有効性の評価
この試験は、気道炎症反応及び気道リモデリングに基づいて、オバルブミン（ＯＶＡ）エアロゾルによって誘導されたＢＡＬＢ／ｃマウスぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体の有効性を評価する。
マウスは体重に応じて、各群が１０匹のマウスを含むように７つの群にランダムに分けられた：正常コントロール群（Ｇ１）；モデル群（Ｇ２）；試験すべき抗体のそれぞれが２種の用量（１０ｍｐｋ及び２ｍｐｋ）のときの、試験すべき２種の抗体の処置群ｈ１７０５－００８（Ｇ３及びＧ４）及びｈ１７０６－００９（Ｇ５及びＧ６）；並びに、陽性抗体Ｈｕ３９Ｄ１０コントロール群（Ｇ７、１０ｍｐｋ）。１日目及び１４日目には、すべてのマウスを、アレルゲン溶液の腹腔内注射によって感作した。２８日目、２９日目及び３０日目には、エアロゾルＯＶＡ惹起溶液により、６つのマウス群（第１の群を除く）に３０分間チャレンジした。チャレンジの２時間前に、第２の群（Ｇ２）にリン酸バッファーを腹腔内注射し、第３の群～第７の群（Ｇ３～Ｇ７）のマウスに異なる用量の異なる抗体を（１日１回、３日間連続で）腹腔内注射した。試験すべき抗体は、毎回の注入前に新しく調製し、投与は、抗体の調製から３０分以内に終了させた。（正常コントロール群である）第１の群のマウスには、ＰＢＳエアロゾルを３０分間チャレンジしたが、このチャレンジの２時間前には、リン酸バッファーを１日１回３日間連続で腹腔内注射した。
３１日目には、ＷＢＰシステムを使用して、動物の気道過敏性を試験した。すべての動物には、２倍に増えていく濃度（１．５６２５ｍｇ／ｍＬ、３．１２５ｍｇ／ｍＬ、６．２５ｍｇ／ｍＬ、１２．５ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ及び５０ｍｇ／ｍＬ）のメタコリンを摂取するように、エアロゾルによって投与し、対応する濃度における呼吸休止期の延長（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ）の値を測定した。
３１日目には、ＷＢＰシステムによる気道過敏性の検出から１時間後、直径１．２ｍｍの気管チューブを気管に挿入して固定し、肺洗浄を２回実施したが、毎回、１％ＢＳＡ及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．８ｍｌリン酸バッファーを用いて実施した。洗浄液の回収体積を記録した。
ＢＡＬＦを、３００ｇにおいて４℃で５分間遠心分離した。上清は、サイトカイン分析のために維持した。遠心分離後には、細胞を１．５ｍｌのＰＢＳ（１％ＢＳＡ及び０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に再懸濁させて、細胞をカウントした。血球計数機及びトリパンブルー染色実験を用いて、ＢＡＬＦ中の細胞の総数をカウントした。細胞をスライドになすりつけ、ライト染色溶液によって１分間染色し、次いで、ギムザ染色によって７分間染色して、好酸球、好中球、マクロファージ及びリンパ球を識別した。光学顕微鏡下でカウントした。
洗浄後、肺組織を収集し、１０％中性ホルムアルデヒド溶液によって染色した後、１０％中性ホルムアルデヒド溶液中に固定した。固定組織をパラフィンに包埋し、トリミングし、Ｈ＆Ｅによって染色し、スコア付けした。試験結果は、図３、図４Ａ及び図４Ｂに示されている。
上記結果により、本開示の抗体分子ｈ１７０５－００８及びｈ１７０６－００９は、用量依存的に肺機能を有意に改善することができるが、高用量（１０ｍｐｋ）の陽性化合物は、肺機能を改善できないことが示されている（図３を参照されたい。）。一方、２種の抗体は、同じ用量（１０ｍｐｋ）で好酸球のレベル及び粘膜の厚さを有意に減少させており、陽性抗体のものより強力な好酸球減少能力を示している（図４Ａ及び図４Ｂを参照されたい。）。同じ種類のマウスぜんそくモデルにおいて、繰返し実験により、１ｍｇ／ｍｌのｈ１７０５－００８、ｈ１７０６－００９及びｈ１７８０－０１７が、陽性抗体の場合に比べてＢａｌＦ中における好酸球のレベルを有意に低下させることも確認した（図４Ｃを参照されたい。）。
試験例９．外因性ヒトＩＬ－５によって誘導されたモルモット急性ぜんそくモデルにおけるＩＬ－５抗体のインビボ有効性の評価
この実験においては、雄モルモットを選択して、ヒトＩＬ－５によって誘導された急性ぜんそくモデルを確立し、これにより、ヒトＩＬ－５によって誘導されたモルモット肺の気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）中における好酸球の増加に対する、本開示の５種のＩＬ－５ヒト化ｍＡｂの阻害効果を評価したが；ｈｕ３９Ｄ１０を陽性抗体として使用した。モルモットは、それぞれが８～１０匹の動物を含む９つの群に分けられた：正常コントロール群、モデル群、ｈｕ３９Ｄ１０（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０５－００８（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０６－００９（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７８０－０１７（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７７３－００７（１ｍｇ／ｋｇ）群及びｈ１７７９－０１４（１ｍｇ／ｋｇ）群。モデル群及び投与群のモルモットのそれぞれには、１日目に刺激のために１００μｌのヒトＩＬ５（５μｇのＩＬ５抗原を含む）を気管経由で注入し；正常コントロール群には、ＰＢＳを気管経由で注入した。投与群には、刺激の２時間前に５ｍｌ／ｋｇの投与量になるように、１ｍｇ／ｋｇの上記ＩＬ５モノクローナル抗体を腹腔内注射し；モデル群には、対応するＩｇＧ抗体を投与し；正常コントロール群には、ＰＢＳ溶媒を腹腔内投与した。モルモットには、気管への注入から２４時間後に麻酔をかけ、肺気管支洗浄液を抜き出した。細胞濃度を５＾１０６／ｍｌに調整し、１５μｌをスライドに滴下し、乾燥させて固定し；ＨＥ染色を実施し、全細胞の数及び好酸球の数を４００倍の顕微鏡下でカウントし、好酸球の百分率を計算した。その結果は、図５Ａ及び図５Ｂに示されおり、本開示の５種のヒト化抗体が、ＢＡＬＦ中における好酸球のレベルを有意に低下させることが示されている。
製剤中における成分の選択及び安定性評価
抗体の医薬組成物（製剤）のための例示的な調製プロセス：
ステップ１：
ある特定の量の精製済みの抗ＩＬ－５抗体溶液をとり、抗体不含バッファー（ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー等）を使用して、（好ましくは限外ろ過によって）溶媒交換を置きかえ；少なくとも６倍の体積を限外ろ過膜によって交換し、タンパク質を約１２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。スクロースの最終濃度が７２ｍｇ／ｍＬになるように、ある特定の体積のスクロースストック溶液を加え、混合した。ポリソルベート８０の最終濃度が０．４ｍｇ／ｍＬになるように、ある特定の体積のポリソルベート８０ストック溶液を加え、混合した。ある特定の体積になるまで、ｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファーを加えることにより、タンパク質濃度を１００ｍｇ／ｍＬにした（試験すべき他の製剤又は安定な製剤も、同様のステップに従って調製した。）。
上記生産物をろ過した後、病原性作用物質が存在しないように集中管理方式のサンプリングによって試験した。ストック溶液を０．２２μｍ ＰＶＤＦフィルターに通し、ろ液を収集した。
ステップ２：
体積を１．２ｍｌに調整し、栓を装着した２ｍｌバイアルにろ液を充填し、チャレンジの開始時、中頃及び終了時に集中管理方式のサンプリングを実施して、チャレンジ体積の差を検出した。
ステップ３：
フタ付け機を始動させて、アルミニウム製のフタを装着し、フタ付けを実施した。
ステップ４：
目視検査を実施して、不正確な充填等の欠陥が生産物にないことを確認した。バイアルラベルを印刷して貼り付け；カートンラベルを印刷し；カートンを折りたたんで梱包し；箱のラベルを貼り付けた。
試験例１０．バッファー系のスクリーニング
タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬのｈ１７０５－００８製剤を、ｐＨ５．０～６．５の一連のバッファー中に調製したが、振とう用サンプルは、０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０（ＰＳ８０）を含み、他のサンプルは、０．０５ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含んでいた。バッファー系は、次のとおりだった：ｐＨ５．０、５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー（ＡＡ）；ｐＨ５．０、５．５、６．０の１０ｍＭコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファー（ＳＡ）；ｐＨ５．５、６．０、６．５の１０ｍＭクエン酸－クエン酸ナトリウムバッファー（ＣＡ）；ｐＨ５．５、６．０、６．５の１０ｍＭヒスチジン－塩酸塩バッファー（Ｈｉｓ）；ｐＨ６．０、６．５の１０ｍＭ リン酸バッファー（ＰＢ）。各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけた。サンプルを強制分解実験に供し；外観、ＳＥＣ、ｉＣＩＥＦは、評価指標として採用した。
上記の結果は、表１９に示されている。外観データにより、振とう（３００ｒｐｍ、２５℃）されたサンプル及び４０℃のサンプルは、様々な度合いの粒子形成を呈することが示されている。概して、外観は、ｐＨが低下するほど良化し、酢酸－酢酸ナトリウム及びコハク酸－コハク酸ナトリウムのバッファー系は良化しており；ＳＥＣデータにより、ＡＡ ｐＨ５．５群は、４０℃ではわずかに良化していることが示されており；ｉＣＩＥＦデータにより、ＡＡ ｐＨ５．５群、Ｈｉｓ ｐＨ５．５群、ＣＡ ｐＨ６．５群は、４０℃ではわずかに良化していることが示されているが；物理的及び化学的安定性を総合的に考慮すると、ｐＨ５．５のＡＡが好ましい。
Figure 0007641908000027
Figure 0007641908000028
 注記：Ｎ／Ａは、検出なしを表し、Ｄは、日数を表し、Ｔ０は、０日目を表す。
試験例１１．製剤中の賦形剤のスクリーニング
タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬのｈ１７０５－００８製剤を、下記の様々な種類の賦形剤を含む１０ｍＭ ＳＡ（ｐＨ５．０）バッファー中に調製した。特に、賦形剤は、以下のとおりだった：
１） ０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０（ＰＳ２０）
２） ０．１ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０（ＰＳ８０）
３） ５０ｍｇ／ｍＬのスクロース＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
４） ５０ｍｇ／ｍＬのトレハロース＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
５） ５０ｍｇ／ｍＬのマンニトール＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
６） ５０ｍｇ／ｍＬのソルビトール＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
７） ８ｍｇ／ｍｌのアルギニン（Ａｒｇ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
８） ８ｍｇ／ｍｌのリシン（Ｌｙｓ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
９） ８ｍｇ／ｍｌのグリシン（Ｇｌｙ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１０） ８ｍｇ／ｍｌのメチオニン（Ｍｅｔ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１１） ８ｍｇ／ｍｌのプロリン（Ｐｒｏ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０
１２） ８ｍｇ／ｍｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）＋０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０。
各製剤をろ過し、充填し、栓を装着し、フタをつけて使用に供した。サンプルは、４０℃における強制分解実験に供したが、その結果により、次のことが示されている（表２０）。各サンプル群間には、ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦの試験結果に有意差がなく、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／ＮａＣｌ群は外観が劣っているが、他の群間には有意差がない。スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グリシン、プロリン及びメチオニンは、タンパク質の安定性に好ましい影響を与える。
Figure 0007641908000029
 注記：Ｄは、日数を表す。
試験例１２．界面活性剤のスクリーニング
ｐＨ５．５の１０ｍＭ ＳＡ、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ２０又はＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように調製した。
サンプルを４℃に置いて、安定性を調査した。その結果は、表２１に示されている。その結果により、ＰＳ８０群は、４℃においては４か月間にわたって透明な外観を呈し、ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦの有意な変化を呈さないことが示されており、このことは、好ましい安定性を示しているが；ＰＳ２０群においては、大量の粒子が観察されている。したがって、ＰＳ８０は、ＰＳ２０より良好である。さらに、製剤へのＰＳ８０の添加は、より良好な安定化効果をｈ１７０５－００８に及ぼしており、製剤の安定性が良化していることも分かる。
Figure 0007641908000030
 注記：Ｍは、月数を表し；Ｎ／Ａは、検出なしを表す。
試験例１３．ＤＯＥ製剤の設計及びスクリーニング
ＤＯＥ（実験計画法）は、１０ｍＭ酢酸バッファー（ＡＡ）のｐＨ、タンパク質濃度及びＴｗｅｅｎ濃度を変数として用いて実施され；一連の製剤は、次の因子及びレベルに基づいて設計した：ｐＨは、５．０～５．８であり、ＰＳ８０の濃度は、０．２～０．６ｍｇ／ｍＬであり、抗体ｈ１７０５－００８の濃度は、８０～１２０ｍｇ／ｍＬである。製剤は、表２２に示されている。サンプルを４０℃の高温で強制分解した。外観、ＳＥＣ、非還元型ＣＥ及びｉＣＩＥＦを、評価指標として使用した。その結果は、表２３に示されている。
Figure 0007641908000031
Figure 0007641908000032




注記：Ｄは、日数を表す。
上記結果により、各製剤の外観は、透明であり；ＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦは、それぞれ２％未満、２％未満及び約１４％低下しているが許容範囲内であり；製剤の安定性は、好ましいものであることが示されており；したがって、製剤は、８０～１２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を有し、０．２～０．６ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０を含み、５．０～５．８のｐＨを有する。最適な製剤は、次のものである：１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０、ｐＨ５．５。
試験例１４．安定性試験
ｐＨ５．５の１０ｍＭ ＡＡ、７０ｍｇ／ｍｌのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、タンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように調製し；サンプルは、４℃及び２５℃で安定性の調査に供した。その結果は、表２４に示されている。
上記結果により、高温条件下においては、ｈ１７０５－００８製剤のＳＥＣ、ＣＥ及びｉＣＩＥＦがわずかに低下しているが、この低下は許容範囲内であり；他の条件下ではすべての指標に有意な変化がないことが示されている。製剤は、好ましい安定性を有し、６か月以内までの４℃におけるｈ１７０５－００８の安定性を確実なものにすることができる。
Figure 0007641908000033
注記：Ｍは、月数を表す。
試験例１５．イオン強度のスクリーニング
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、７０ｍｇ／ｍＬのスクロース及び０．４ｍｇ／ｍＬのＰＳ８０を含むｈ１７０５－００８製剤を、イオン強度が異なる（ナトリウム）酢酸バッファー中に調製し；交換のために使用されたバッファーのｐＨ及び最終的な製剤のｐＨを測定した。その結果は、表２５に示されている。この結果により、イオン強度が高いほど、ｐＨのずれが減少することが示されている。イオン強度が３０ｍＭである場合、ｐＨのずれは、０．１未満である。
Figure 0007641908000034
試験例１６．糖の濃度のスクリーニング
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、ｐＨ５．５の３０ｍＭ ＡＡと、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０とを含むｈ１７０５－００８製剤を、濃度が異なるスクロースを含む後述のバッファー中に調製した。浸透圧を測定した。その結果は、表２６に示されている。
上記結果により、糖濃度が７０～７５ｍｇ／ｍｌである場合、浸透圧は、２９０～３１０ｍｏｓｍの最適な等張範囲であり；７０ｍｇ／ｍｌ群及び７３ｍｇ／ｍｌ群の浸透圧データによれば、糖濃度が７２ｍｇ／ｍｌである場合、浸透圧は、約３００ｍｏｓｍの最も良い値になることが示されている。
Figure 0007641908000035
試験例１７．製剤の安定性試験
１００ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有し、ｐＨ５．５の３０ｍＭ ＡＡと、７２ｍｇ／ｍｌのスクロースと、０．４ｍｇ／ｍｌのＰＳ８０とを含むｈ１７０５－００８製剤を調製して、４℃及び２５℃における安定性を調査した。その結果は、表２７に示されている。その結果により、高温条件下においては、ｈ１７０５－００８製剤のＳＥＣ、ＣＥ及びＩＥＣがわずかに低下しているが、この低下は許容範囲内であり；４℃条件ではすべての指標に有意な変化がないことが示されており、このことは、製剤が好ましい安定性を有することを示している。
Figure 0007641908000036
 注記：Ｍは、月数を表し、Ｔは、時間を表し、Ｎ／Ａは、検出なしを表す。
試験例１８．さらなる任意選択による製剤
さらに、本開示は、抗ＩＬ－５抗体医薬製剤のためのさらなる配合も提供し、限定されるわけではないが、以下のものを含む：
（１） １ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の１０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（２） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（３） １２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（４） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．０の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（５） ８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．４の２０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（６） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（７） ９０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７４ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．５ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．６の２５ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（８） ９０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７６ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．３ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．４の３５ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（９） ８０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．６の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（１０） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
（１１） １００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体（ｈ１７０５－００８）、８０ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及びｐＨ５．５の４０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー。
上記実験結果により、上記ＩＬ－５抗体製剤は、好ましい安定性を有し、ＩＬ－５抗体型作用物質の調製に応用することができることが示されている。
試験例１９．抗ＩＬ－５抗体製剤の凍結乾燥
７２ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び１００ｍｇ／ｍｌの濃度の抗ＩＬ－５抗体を含むｈ１７０５－００８抗体製剤を、ｐＨ５．５の３０ｍＭ酢酸－酢酸ナトリウムバッファー中に調製した。抗体を２．１５ｍＬ／バイアルで６ｍＬバイアルに充填し、凍結乾燥のために凍結乾燥チャンバに入れた。凍結乾燥プロセスは、予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥を含む。凍結乾燥プロセスが終わったら、バイアルを真空を適用し、栓を装着した。復元したサンプルは、凍結乾燥前の対応物と比較した。その結果により、復元溶液は、液体製剤の性能と同様の好ましい性能を維持できることが示されている。
Figure 0007641908000037
 注記：Ｎ／Ａは、上記表が適用不可であることを表す。

Claims (27)

  1. （ａ）抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、
    （ｂ）バッファーであって、該バッファーは、酢酸－酢酸ナトリウムバッファー又はコハク酸－コハク酸ナトリウムバッファーであり、ｐＨが５．０～６．５であり、濃度が１０ｍＭ～４０ｍＭである、バッファー；
    （ｃ）界面活性剤であって、該界面活性剤はポリソルベート８０であり、該ポリソルベート８０の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌである、界面活性剤；
    （ｄ）安定剤であって、該安定剤はスクロースであり、該スクロースの濃度は５０ｍｇ／ｍｌ～８０ｍｇ／ｍｌである、安定剤
    を含む、医薬組成物であって、
    抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントが、
    それぞれアミノ酸配列番号：１６、１７及び１８に示されたＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
    それぞれアミノ酸配列番号：１９、２０及び２１に示されたＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、医薬組成物。
  2. 前記バッファーのｐＨが、５．０～５．８である、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記バッファーのｐＨが、約５．５である、請求項２に記載の医薬組成物。
  4. 前記バッファーの濃度が、２０ｍＭ～３０ｍＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記バッファーの濃度が、約３０ｍＭ又は約３２ｍＭである、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度が、１ｍｇ／ｍｌ～１２０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度が、８０ｍｇ／ｍｌ～１２０ｍｇ／ｍｌである、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントの濃度が、約１００ｍｇ／ｍｌである、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. ポリソルベート８０の濃度が、０．２ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. ポリソルベート８０の濃度が、約０．４ｍｇ／ｍｌ又は約０．６ｍｇ／ｍｌである、請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 前記スクロースの濃度が、７０ｍｇ／ｍｌ～７５ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の医薬組成物。
  12. 前記スクロースの濃度が、約７２ｍｇ／ｍｌである、請求項１１に記載の医薬組成物。
  13. 次の成分を含む、請求項１に記載の医薬組成物：
    １ｍｇ／ｍｌ～１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント；
    ｐＨが５．０～６．５の１０ｍＭ～４０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウムバッファー；
    ０．１ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０；及び
    ５０ｍｇ／ｍｌ～８０ｍｇ／ｍｌスクロース。
  14. ８０ｍｇ／ｍｌ～１２０ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、
    ｐＨが５．０～５．８の１０ｍＭ～３０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、
    ０．２ｍｇ／ｍｌ～０．６ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び
    ７０ｍｇ／ｍｌ～８０ｍｇ／ｍｌのスクロース
    を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  15. 約１００ｍｇ／ｍｌの抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメント、
    ｐＨが約５．５の約３０ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウムバッファー、
    約０．４ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０及び
    約７２ｍｇ／ｍｌのスクロース
    を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 前記抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントが、マウス抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
  17. 前記ヒト化抗ＩＬ－５抗体が、配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４９、５０及び５１のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、重鎖可変領域；並びに、
    配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つに示された、若しくは配列番号：４６、４７及び４８のいずれか１つとの間に９５％の配列相同性を有する、軽鎖可変領域
    を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記ヒト化抗ＩＬ－５抗体が、配列番号：５１に示された重鎖可変領域及び配列番号：４７に示された軽鎖可変領域を含む、請求項１７に記載の医薬組成物
  19. 前記抗ＩＬ－５抗体が、ヒト抗体定常領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  20. 前記抗ＩＬ－５抗体が、配列番号：５２に示されたヒト抗体重鎖定常領域及び配列番号：５３に示されたヒト抗体軽鎖定常領域を含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 前記抗ＩＬ－５抗体が、配列番号：８３に示された重鎖及び配列番号：８４に示された軽鎖を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントのストック溶液をバッファーによって置きかえるステップを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物を調製するための方法であって、バッファーが酢酸－酢酸ナトリウムバッファーである、方法。
  23. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物の凍結乾燥形態である、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む凍結乾燥製剤。
  24. 予備凍結ステップ、一次乾燥ステップ及び二次乾燥ステップを順次含む、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤を得る方法。
  25. 請求項２３に記載の凍結乾燥製剤の復元形態である、抗ＩＬ－５抗体又はその抗原結合性フラグメントを含む復元溶液。
  26. 請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物又は請求項２３に記載の凍結乾燥製剤又は請求項２５に記載の復元溶液を含む容器を含む、物品。
  27. ＩＬ－５媒介性疾患を処置するための請求項１～２１のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記ＩＬ－５媒介性疾患が、ぜんそく、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増加症、チャーグ－ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠性血管性浮腫、好酸球性筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、寄生虫感染症、ホジキン病、鼻茸、レフラー症候群、じんま疹、過好酸性気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症及びステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群より選択される、医薬組成物。
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