JP7619582B2 - Ｃｄ５５に対する新規抗体及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、ＣＤ５５を特異的に認識する新規抗体又はその抗原結合断片及びこれを用いた癌の予防、治療及び／又は診断用組成物に関する。
全世界の抗癌剤市場は、過去１０年間に年平均１０％～１３％の成長率を示しており、２０２２年には総２，０００億ドルに達すると予想される。２０２０年、現在の全世界において、男性は５人のうち１人、女性は６人のうち１人が一生に１回以上の癌発病を経験しており、男性８人のうち１人と女性１１人のうち１人が癌で死亡しているほど癌の有病率及び死亡率は持続的に増加している。
全世界の抗癌剤市場においては、１世代化学療法を始めとして、２世代標的抗癌剤と３世代免疫抗癌剤までパラダイム転換がなされている。初期の単純な癌の縮小・抑制を目的としていた治療方法から逸脱し、正常に速く分裂する細胞に対する損傷がなく、癌細胞のみを選択的に攻撃する標的抗癌治療技術が活発に研究されており、このような標的抗癌治療技術の開発は、癌細胞を選択的に標的化できるようにする、癌細胞で特異的に発現される受容体の選別、及び受容体と結合する標的化化合物の開発の二つの段階からなる。
一方、ＣＤ５５（Ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＤＡＦ）は、補体免疫メカニズムを抑制する受容体であって、大腸癌、肺癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、白血病、頭頸部癌などの多様な固形癌で高発現し、体内の補体免疫体系が癌細胞を死滅させることを抑制することによって癌細胞の増殖を促進する。したがって、ＣＤ５５は、標的抗癌治療のターゲット分子として活発に研究されている。
特に、ＣＤ５５が高発現する固形癌では、補体依存性細胞毒性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）を作用メカニズムとする多様な抗癌剤に対して低い治療反応性を示すので、より高い親和度及び特異性でＣＤ５５に結合し、その活性を効率的に抑制できる優れた抗体治療剤の開発が要求されている。
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として挿入され、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
大韓民国特許登録第１０－１８００７７４号
本発明者等は、補体免疫メカニズムを抑制する受容体であるＣＤ５５タンパク質を特異的に認識し、その活性を特異的に抑制することによって、ＣＤ５５によって阻害された免疫メカニズムを効率的に復旧できる優れたＣＤ５５抑制剤を開発するために鋭意研究・努力した。その結果、可変領域内の核心抗原認識部位の一部のアミノ酸を置換した抗体を用いた場合、著しく増加したＣＤ５５結合力及び抑制力により、癌細胞などに対する補体媒介細胞溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）活性が有意に回復されることを発見し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片；及びこれを含む癌の予防又は治療及び／又は診断用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、及びＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
本発明の一様態によると、本発明は、下記一般式１で表されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域；配列リストの第１配列のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域；及び下記一般式２で表されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域；を含む重鎖可変領域を含む、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する：
一般式１
Ｄ－Ｒ－Ｇ－Ｍ－Ｘ１；
一般式２
Ｎ－Ａ－Ｘ２－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｗ－Ｈ－Ａ－Ａ－Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ａ、
前記一般式１におけるＸ１は、Ａｌａ又はＶａｌで、前記一般式２におけるＸ２は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ及びＭｅｔで構成された群から選ばれる。
本発明者等は、補体免疫メカニズムを抑制する受容体であるＣＤ５５タンパク質を特異的に認識し、その活性を特異的に抑制することによって、ＣＤ５５によって阻害された免疫メカニズムを効率的に復旧できる優れたＣＤ５５抑制剤を開発するために鋭意研究・努力した。その結果、可変領域内の核心抗原認識部位の一部のアミノ酸を置換した抗体を用いた場合、著しく増加したＣＤ５５結合力及び抑制力により、癌細胞などに対する補体媒介細胞溶解（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）活性が有意に回復されることを発見した。
本明細書において、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫学的に特定の抗原との反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体としての役割をするタンパク質分子を意味し、多クローン抗体及び単クローン抗体を全て含む。
抗体は、完全な全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）抗体形態のみならず、抗体分子の抗原結合断片（抗体断片）を含む。完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であって、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
本明細書において、「抗体の抗原結合断片」という用語は、全体の抗体分子内で抗原を特異的に認識し、抗原－抗体結合機能を保有する断片を意味し、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。断片の例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインで構成された１価断片（Ｆａｂ断片）；ヒンジ領域で二硫化物橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む２価断片（Ｆ（ａｂ’）２断片）；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄ断片；抗体の一つのアーム（ａｒｍ）のＶＬ及びＶＨドメイン、及び二硫化物－連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）で構成されたＦｖ断片；ＶＨドメインで構成されたｄＡｂ断片；及び分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はリンカーによって選択的につながり得る二つ以上の分離されたＣＤＲの組み合わせ；を含む。また、ｓｃＦｖは、ＶＬとＶＨ領域がペアをなし、１価分子を形成した単一タンパク質鎖をなすようにリンカーによってつながり得る。このような単一鎖抗体も抗体の断片に含まれる。また、前記抗体又は抗体の断片は、２個の重鎖分子及び２個の軽鎖分子を含むテトラマー抗体；抗体軽鎖モノマー；抗体重鎖モノマー；抗体軽鎖ダイマー、抗体重鎖ダイマー；イントラボディ；１価抗体；ラクダ抗体；及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含む。
Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のみを有している最小の抗体フラグメントであって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されている。そして、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、又はＣ－末端で直ぐ連結されており、二重鎖Ｆｖと同様に、ダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全体の抗体をパパインで制限・切断するとＦａｂを得ることができ、ペプシンで切断するとＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を通じて製作することもできる。
本明細書において、「重鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長の重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書において、「軽鎖」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び定常領域ドメインＣＬを含む全長の軽鎖及びその断片を全て意味する。
本明細書において、「ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」という用語は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））。重鎖（ＨＣＤＲ１１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３）及び軽鎖（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３）には、それぞれ３個のＣＤＲが含まれており、これらＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合する際に主要な接触残基を提供する。
本発明の抗体又は抗体断片の範囲には、ＣＤＲ領域に保存的アミノ酸置換を有する変異体が含まれ、ＣＤ５５を特異的に認識できる範囲内で添付した配列リストに記載のアミノ酸配列に対する変異体を含むことができる。例えば、抗体の結合親和度以外に、半減期、生体適合性及びその他の生物学的特性をより改善するために、抗体のアミノ酸配列に追加的な変化を与えることができる。このような生物学的均等活性を有する変異を考慮した場合、本発明の抗体又はこれをコーディングする核酸分子は、配列リストに記載の配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものとして解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小６１％の相同性、特定の一例によると７０％の相同性、特定の他の例によると８０％の相同性、特定の更に他の例によると９０％の相同性を示す配列を意味する。配列を比較するためのアラインメント方法は、当業界に公知となっている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２ Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．（１９７０）４８：４４３；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）２４：３０７－３１；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ（１９８８）７３：２３７－４４；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）５：１５１－３；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８８）１６：１０８８１－９０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．（１９９２）８：１５５－６５及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２４：３０７－３１に開示されている。
本明細書において、「親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」という用語は、抗体又はその抗原結合断片と抗原との間の結合強度を意味し、これは、「結合力」としても表現され得る。
本発明の具体的な具現例によると、前記一般式１のＸ１はＡｌａである。
本発明の具体的な具現例によると、前記一般式２のＸ２はＶａｌである。
より具体的には、本発明の重鎖可変領域は、次のＨＦＲ１乃至ＨＦＲ４で構成された群から選ばれる一つ以上のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む：
ＨＦＲ１：ＥＶＱＬＹ１ＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＹ２ＡＹ３ＧＦＴＦＳ（Ｙ１は、Ｖａｌ又はＡｌａで、Ｙ２は、Ｖａｌ又はＡｌａで、Ｙ３は、Ｓｅｒ又はＡｒｇである。）
ＨＦＲ２：ＷＶＲＱＹ４ＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（Ｙ４は、Ａｌａ又はＳｅｒである。）
ＨＦＲ３：ＲＹ５ＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＹ６ＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（Ｙ５は、Ａｌａ又はＴｈｒで、Ｙ６は、Ｓｅｒ又はＡｓｎである。）
ＨＦＲ４：ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
より具体的には、本発明の重鎖可変領域は、配列リスト１９乃至２２で構成された群から選ばれるアミノ酸配列を有する。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、配列リストの第２配列のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域；下記一般式３で表されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域；及び配列リストの第３配列のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域；を含む軽鎖可変領域をさらに含む：
一般式３
Ｗ－Ｎ－Ｘ３－Ｋ－Ｒ－Ｐ－Ｓ、
前記一般式３におけるＸ３は、Ａｓｎ又はＡｓｐである。
より具体的には、前記Ｘ３はＡｓｐである。
より具体的には、本発明の軽鎖可変領域は、次のＬＦＲ１乃至ＬＦＲ４で構成された群から選ばれる一つ以上のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む：
ＬＦＲ１：ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＳＰＧＱＴＡＳＩＴＣ
ＬＦＲ２：ＷＹ７ＱＱＫＰＧＱＳＰＶＴＶＩＹ（Ｙ７は、Ｐｈｅ又はＴｙｒである。）（Ｆ又はＹ）
ＨＦＲ３：ＧＩＰＥＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＭＤＥＡＤＹＹＣ
ＨＦＲ４：ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
より具体的には、本発明の軽鎖可変領域は、配列リスト４又は１８のアミノ酸配列を有する。
本発明の他の様態によると、本発明は、下記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する：
ａ）配列リストの第４配列の軽鎖可変領域；又は前記配列リストの第４配列の軽鎖可変領域において、３２番目のアミノ酸配列であるＹ（Ｔｙｒ）のＦ（Ｐｈｅ）への置換、及び４８番目のアミノ酸配列であるＤ（Ａｓｐ）のＮ（Ａｓｎ）への置換で構成された群から選ばれる１以上の置換を含む軽鎖可変領域、及び
ｂ）配列リストの第５配列の重鎖可変領域；又は前記配列リストの第５配列の重鎖可変領域において、５番目のアミノ酸配列であるＶ（Ｖａｌ）のＡ（Ａｌａ）への置換、２３番目のアミノ酸配列であるＡ（Ａｌａ）のＶ（Ｖａｌ）への置換、２５番目のアミノ酸配列であるＳ（Ｓｅｒ）のＲ（Ａｒｇ）への置換、３５番目のアミノ酸配列であるＡ（Ａｌａ）のＶ（Ｖａｌ）への置換、４０番目のアミノ酸配列であるＡ（Ａｌａ）のＳ（Ｓｅｒ）への置換、６８番目のアミノ酸配列であるＡ（Ａｌａ）のＴ（Ｔｈｒ）への置換、８５番目のアミノ酸配列であるＳ（Ｓｅｒ）のＮ（Ａｓｎ）への置換、及び１０１番目のアミノ酸配列であるＧ（Ｇｌｙ）のＶ（Ｖａｌ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｍ（Ｍｅｔ）又はＡ（Ａｌａ）への置換で構成された群から選ばれる１以上の置換を含む重鎖可変領域。
本発明の他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子を提供する。
本明細書において、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドのみならず、糖又は塩基部位が変形した類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（１９９０）９０：５４３－５８４）。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコーディングする核酸分子の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、非保存的置換又は保存的置換を含む。
本発明の核酸分子は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものとして解釈される。前記実質的な同一性は、前記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常用いられるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合、最小８０％の相同性、特定の一例では最小９０％の相同性、特定の他の例では最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物を提供する。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量を対象体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法を提供する。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片の治療用途（ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）を提供する。
本明細書において、「予防」という用語は、疾患又は疾病を保有していると診断されたことはないが、このような疾患又は疾病にかかる可能性のある対象体における疾患又は疾病の発生を抑制することを意味する。
本明細書において、「治療」という用語は、（ａ）疾患、疾病又は症状の発展の抑制；（ｂ）疾患、疾病又は症状の軽減；又は（ｃ）疾患、疾病又は症状を除去することを意味する。本発明の組成物を対象体に投与すると、ＣＤ５５受容体の活性を抑制することによって補体免疫メカニズムを回復し、癌細胞の増殖を抑制することによって癌の進行を阻害したり、これによる症状を除去又は軽減させる役割をする。よって、本発明の組成物は、それ自体が癌治療用組成物になることもあり、或いは、他の薬理成分、例えば、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を作用メカニズムとする治療剤と共に投与され、その治療反応性を向上させる治療補助剤として適用されることもある。そこで、本明細書において、「治療」又は「治療剤」という用語は、「治療補助」又は「治療補助剤」の意味を含む。
本明細書において、「投与」又は「投与する」という用語は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接投与することによって、対象体の体内で同一の量が形成されるようにすることを意味する。
本発明において、「治療的有効量」という用語は、本発明の薬剤学的組成物を投与しようとする個体に組成物内の薬理成分が治療的又は予防的効果を提供するのに十分な程度に含有された組成物の含量を意味し、これは、「予防的有効量」を含む意味である。
本明細書において、「対象体」という用語は、制限なしで、ヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、サル、チンパンジー、ヒヒ又はアカゲザルを含む。具体的には、本発明の対象体はヒトである。
本発明の具体的な具現例によると、前記組成物は、抗ＣＤ２０抗体及びチロシンキナーゼ抑制剤で構成された群から選ばれる一つ以上の薬理成分をさらに含む。
より具体的には、前記抗ＣＤ２０抗体はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）である。
より具体的には、前記チロシンキナーゼ抑制剤は、イマチニブ（Ｉｍａｔｉｎｉｂ）及びゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）で構成された群から選ばれる。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の組成物で予防又は治療可能な癌は、ＣＤ５５陽性である癌である。
本明細書において、「ＣＤ５５陽性癌」という用語は、ＣＤ５５受容体を発現する癌細胞で構成された癌腫を意味し、具体的には、対象体内での補体免疫活性が測定可能な程度に阻害されるほどにＣＤ５５が発現される癌を意味する。そこで、「ＣＤ５５陽性癌」という用語は、「ＣＤ５５過剰発現癌」を含む意味である。本発明によると、本発明の組成物は、ＣＤ５５の過剰発現により、治療剤に対する耐性が誘導された多様な癌腫において薬物の耐性を除去し、治療敏感性を増進させることができる。
ＣＤ５５陽性癌は、例えば、黒色腫、リンパ腫、肺癌、甲状腺癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、頭頸部癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、子宮頸部癌、膵臓癌、白血病、骨髓癌、卵巣癌、子宮頸部癌、肉腫、胆管癌及び子宮内膜細胞癌を含むが、これに制限されなく、ＣＤ５５を発現する全ての固形癌及び血液癌を含む。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の診断用組成物を提供する。
本発明で使用される抗体又はその抗原結合断片と対象になる癌については既に詳細に説明したので、過度な重複を避けるために、それについての記載は省略する。
本明細書において、「診断」という用語は、特定の疾患に対する個体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）の判定、特定の疾患を現在の個体が有しているかどうかの判定、及び特定の疾患にかかった一つの客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）の判定を含む。
ＣＤ５５受容体は、正常組織に比べて癌組織で高い発現水準を示す典型的な癌診断マーカーであって、ＣＤ５５に特異的に結合する本発明の抗体は、生物学的試料内の腫瘍の存在を正確に判定することができる。併せて、本発明の抗体は、多様な免疫アッセイ方法を通じて腫瘍内のＣＤ５５の発現水準を正確に測定し、該当の腫瘍のＣＤＣ薬物に対する治療敏感性を予測することによって、癌の性格に合わせたオーダーメード型治療戦略を早期に樹立する際に有用に利用可能である。
本明細書において、「診断用組成物」という用語は、対象体の癌発病の有無を判断したり、ＣＤＣ薬物に対する治療敏感性を予測するために、ＣＤ５５タンパク質の発現量測定手段として本発明の抗体を含む統合的な混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）又は装備（ｄｅｖｉｃｅ）を意味し、これは、「診断用キット」として表現されることもある。
本明細書において、「生物学的試料」という用語は、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、脊髓液、組織剖検試料（脳、皮膚、リンパ節、脊髓など）、細胞培養上澄み液、破裂された真核細胞及び細菌発現系を含むが、これに制限されない。
生物学的試料において、ＣＤ５５タンパク質の検出は、比色法（ｃｏｌｏｒｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）又は閃光計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を用いた抗原－抗体複合体形成の検出を通じて行うことができる。本明細書において、「検出」という用語は、抗原－抗体複合体の形成有無を判定するための一連の過程を意味する。検出は、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子又は放射性同位元素を含む多様な標識体を用いて実施することができる。
検出標識体として使用される酵素は、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ及びβ－ラクタマーゼを含み、蛍光物としては、フルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレート又はクリプテートなどを含み、リガンドとしてはビオチン誘導体などを含み、発光物としては、アクリジニウムエステル及びイソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としては、金コロイド及び着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素としては、５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ及び１２５Ｉ－ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）試薬などを含むことができる。
本発明の一具現例によると、抗原－抗体複合体は、酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検出することができる。本発明の抗体は検出標識を有することができ、検出標識を有さない場合は、本発明の抗体を捕獲することができ、検出標識を有する更に他の抗体を処理して確認することができる。
本発明の更に他の様態によると、本発明は、上述した本発明の抗原結合断片、及びＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体又はその機能的断片を提供する。
本明細書において、「二重特異的抗体」という用語は、相違するアミノ酸配列によって定義される相違する２個の抗原－結合領域を含む抗体を意味する。典型的には、二重特異的抗体に含まれた２個の抗原結合領域は、それぞれ相違する抗原又はエピトープに対して特異的である。
本発明の二重特異的抗体は、上述した本発明のＣＤ５５特異的な抗原結合断片と、ＣＤ２０を特異的に認識する更に他の抗原結合断片とが結合された一つの抗体（ＣＤ２０ ｘ ＣＤ５５）分子であって、本発明によると、それぞれの抗ＣＤ５５抗体（例えば、後述する実施例のＥＰ－１０Ｈ）と抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）を併用投与した場合に比べて、リツキシマブ抵抗性腫瘍に対してさらに優れた治療効果を示す。
本発明の具体的な具現例によると、前記二重特異的抗体に含まれた抗ＣＤ５５抗体の抗原結合断片はｓｃＦｖ形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記ＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片はｓｃＦｖを含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記ＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記二重特異的抗体に含まれた抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片はＦａｂ形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片はＦａｂを含む。
本発明の具体的な具現例によると、前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、ＶＬ－ＣＫ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３形態である。
本発明の具体的な具現例によると、前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体はリツキシマブである。
本発明の二重特異的抗体は、安定的に会合できる第１及び第２サブユニットからなるＦｃ領域を含むことができる。本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、全長抗体の定常領域のうち少なくとも一部分を含有する抗体重鎖のＣ－末端領域を意味し、これは、野生型配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域を全て含む。ＩｇＧのＦｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。本発明の二重特異的抗体のＣＨ３領域は、野生型又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その一つの鎖に導入された「突出部」（「ノブ」）及びその他の鎖に相応する導入された「空洞（ｃａｖｉｔｙ）」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメインであり得る。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の二重特異的抗体は、ＣＤ２０ ＸＣＤ５５の重鎖同士の所望でないペアの結合を防止するためにノブ－イントゥ－ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）方法を使用することができる。「ノブ－イントゥ－ホール」方法［ＵＳ５，７３１，１６８；ＵＳ７，６９５，９３６；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）；Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）］は、異種二量体の生成を促進し、同種二量体の生成を阻害するために、突出部が空洞に位置し得るように第１ポリペプチドの界面に突出部（「ノブ」）を、第２ポリペプチドの界面には相応する空洞（「ホール」）を導入する。突出部は、第１ポリペプチドの界面から小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例、チロシン又はトリプトファン）に置換することによって構成される。大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例、アラニン又はトレオニン）に置換することによって、突出部と同一又は類似する大きさの相互補完的空洞が第２ポリペプチドの界面に生成される。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の二重特異的抗体は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３形態の抗ＣＤ５５抗体の抗原結合断片と、ＶＬ－ＣＫ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３形態の抗ＣＤ２０抗体の抗原結合断片とが結合された形態であり得る。
本発明の具体的な具現例によると、本発明の二重特異的抗体は、ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５の重鎖同士の所望でないペアの結合を防止するために、１０個乃至１００個、より具体的には１５個乃至６０個のＧｌｙ及びＳｅｒで構成されたリンカーを使用することができる。
具体的には、本発明の二重特異的抗体は、ＣＤ５５－ｓｃＦｖ－ノブ（ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ２０－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３）と、ＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－ＣＫ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）とが結合された形態であり得る。
ｌｉｎｋｅｒ２０は、前記Ｇｌｙ又はＳｅｒを２０個含むものであって、その例としては、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒを含み得るが、これに制限されるものではない。
ｌｉｎｋｅｒ４０は、前記Ｇｌｙ又はＳｅｒを２０個含むものであって、その例としては、Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒを含み得るが、これに制限されるものではない。
本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）本発明は、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片；及びこれを含む癌の予防、治療及び／又は診断用組成物を提供する。
（ｂ）本発明の抗体は、補体免疫メカニズムを抑制し、腫瘍の増殖を促進するＣＤ５５タンパク質に対して高い結合力及び抑制力を示すことによって、ＣＤ５５で媒介される多様な疾患の効率的な治療組成物として利用可能である。
（ｃ）また、本発明の抗体は、ＣＤ５５の過剰発現により、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を作用メカニズムとする治療剤に対する耐性が誘導された多様な疾患において薬物の耐性を根本的に除去し、治療反応性を著しく改善する効率的な治療補助剤として有用に利用可能である。
４－１ＨとＧ４－１ＨのＣＤ５５に対する親和度を測定したＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。 Ｇ４－１Ｈ可変領域の遺伝子に無作為突然変異が導入されたライブラリから選別して製作した抗体のＣＤ５５に対する親和度を測定したＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。 結合力向上核心部位を疎水性アミノ酸に置換して製作した抗体のＣＤ５５に対する親和度を測定したＥＬＩＳＡ分析結果を示す図である。 リツキシマブとＥＰ－１０Ｈ併用処理によるＢＪＡＢ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 ＲａｍｏｓとＲａｍｏｓ－ＲＲにおいてＣＤ２０及びＣＤ５５の発現量を比較分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 リツキシマブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理によるＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 Ｋ５６２とＫ５６２－ＩＲにおいてＣＤ５５発現量を比較分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 イマチニブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理による５６２－ＩＲ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 ＰＣ９とＰＣ９－ＧＲにおいてＣＤ５５発現量を比較分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 イマチニブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理によるＰＣ９－ＧＲ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 本発明のＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体であるＳＢＵと、Ｍａｃｏｒが報告した二重抗体形態とを比較した抗体の模式図である。 本発明のＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体に対するＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。 ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体のＣＤ２０（図１０ａ）及びＣＤ５５（図１０ｂ）に対する親和度を測定したＥＬＩＳＡ分析結果をそれぞれ示す図である。 ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体のＣＤ２０（図１０ａ）及びＣＤ５５（図１０ｂ）に対する親和度を測定したＥＬＩＳＡ分析結果をそれぞれ示す図である。 ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体によるＢＪＡＢ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 リツキシマブ単独処理、リツキシマブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理及びＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体処理時のそれぞれのＢＪＡＢ細胞死滅率を比較した結果を示す図である。 ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体によるＲａｍｏｓ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 リツキシマブ単独処理、リツキシマブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理及びＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体処理時のそれぞれのＲａｍｏｓ細胞死滅率を比較した結果を示す図である。 ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体によるＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞の死滅効果を分析したＦＡＣＳアッセイ結果を示す図である。 リツキシマブ単独処理、リツキシマブとＥＰ－１０Ｈ抗体の併用処理及びＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体処理時のそれぞれのＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞死滅率を比較した結果を示す図である。 Ｒａｍｏｓ－ＲＲ細胞にリツキシマブ、ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体を処理した上澄み液内のＣ４ｄ生産量を確認した結果を示す図である。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の要旨により、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：４－１Ｈのヒト化
大韓民国特許出願第１０－２０１６－０１３２３３３号に開示された４－１Ｈの免疫原性を減少させるために、次のような方法でヒト化を行った：
４－１Ｈのヒト化のために、４－１Ｈの軽鎖可変領域内の３個のＦＲ（ＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３）をＩＧＬＶ３－１＊０１のＦＲに置換し、重鎖可変領域内の３個のＦＲ（ＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３）をＩＧＨＶ３－２３Ｄ＊０２のＦＲに置換した。その後、アミノ酸の物理化学的性質の類似性又は非類似性を考慮した上で、特定のアミノ酸を親抗体（４－１Ｈ）のアミノ酸に再び置換した。親抗体（４－１Ｈ）に再び置換されたアミノ酸は、軽鎖可変領域ではＬ４６Ｔ、Ｎ６６Ｋで、重鎖可変領域ではＦ６８Ａであった。抗体ドメインのアミノ酸残基番号は、当業界で通常使用されるカバットＥＵナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ ＥＵ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１と同じＥＵ指数番号に従う）によってナンバリングした。軽鎖可変領域のＪ ｇｅｎｅは、ＵＳ２０１０－００５６３８６を参考にしてＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬで固定し、重鎖可変領域のＪ ｇｅｎｅは、ＵＳ２０１４－０２０６８４９を参考にしてＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳで固定した。ヒト化４－１Ｈ抗体をＧ４－１Ｈと命名し、その塩基配列を表１に表示した。
Ｇ４－１Ｈの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列
前記表において、下線を引いた文字はＣＤＲ領域を示し、ボールド体は、親抗体（４－１Ｈ）に再び置換されたアミノ酸を示す。
実施例２：Ｇ４－１Ｈクローンの完全抗体の転換及び発現／精製
実施例１で製作したＧ４－１Ｈ抗体の可変領域のＤＮＡをｓｃＦｖ形態で合成し（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）、ＰＣＲを通じて完全抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ）に転換した。まず、ｓｃＦｖを含むｐＵＣベクター（Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈ、韓国）から、重鎖及び軽鎖の可変領域と定常領域の切片を下記表２のＶＨ、ＣＨ及びＶＬ、ＣＫプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲを通じて収得した。収得した抗体の可変領域と定常領域を用いて、下記表２のＨＣ及びＬＣプライマーの組み合わせを使用してＰＣＲを行った結果、Ｇ４－１Ｈの重鎖と軽鎖を確保した。重鎖は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）酵素を用いて処理し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＣＭＶベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にライゲーションした。また、軽鎖は、ＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）酵素を用いて処理し、同様に、同一の制限酵素で処理されたｐＣＭＶベクターにライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５αコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換し、確保したコロニーを大量培養することによってプラスミドを収得した。
Ｇ４－１Ｈ完全抗体クローニングに使用されたプライマー
完全抗体に転換した重鎖と軽鎖のそれぞれのプラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で３７℃、８％のＣＯ２及び５５％の湿度条件下でＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコで７日間浮遊培養した。発現細胞培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を採取してから０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過された上澄み液は、４℃でＭａｂＳｅｌｅｃｔ ｓｕｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）レジン１ｍｌに結合するように誘導した。結合されたレジンは、１０ｃｖ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）の２０ｍＭの第二リン酸ナトリウムと５００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）溶液で洗浄し、１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）溶液を用いて結合された抗体を溶出した後、１Ｍのトリス－ＨＣＬ（ｐＨ９．０）で中和した。Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いてｐＨ７．２－７．４のＰＢＳで緩衝液の交換を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて精製された抗体の軽鎖と重鎖の大きさ及び純度を最終的に確認した結果、理論的計算値と一致する分子量と高い純度を確認できた。
実施例３：ＣＤ５５に対する４－１ＨとＧ４－１Ｈの親和度分析
前記実施例２で製作したＧ４－１Ｈ単クローン抗体のＣＤ５５に対する結合力を間接ＥＬＩＳＡで確認した。間接ＥＬＩＳＡは、５０μｌのＰＢＳに１μｇ／ｍｌで組換えヒトＣＤ５５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を希釈してから９６ウェル免疫プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に入れ、４℃で保管して一晩中吸着させた。３％のウシ血清アルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）が含まれた緩衝溶液で常温で１時間反応させた後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄し、順次的濃度（０．０００１、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０ｎＭ）で希釈したそれぞれの抗体を１ウェル当たり５０μｌずつ処理した。抗原に抗体が結合できるように常温で２時間反応させた後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した。抗ヒト免疫グロブリンＦｃ－ＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、米国）を１：３，０００で希釈してから１ウェル当たり５０μｌずつ処理した後、常温で１時間反応させた。反応が終了した後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で３回洗浄した後、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を５０μｌずつ入れて１０分間発色させた。分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した結果、Ｇ４－１Ｈは、４－１Ｈに比べてＣＤ５５に対して低い親和力を示した（図１）。
実施例４：可変領域の遺伝子に無作為突然変異が導入されたライブラリ製作
Ｇ４－１ＨのＣＤ５５に対する親和度を改善するために、Ｇ４－１Ｈ抗体の可変領域遺伝子に、エラープローン（Ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ過程を通じて無作為突然変異が導入されたライブラリを構築した。具体的には、Ｇ４－１Ｈ ｓｃＦｖを含むｐＣｏｍｂ３ｘベクターにｓｃＦｖシーケンシングプライマー１とプライマー２、校正機能のない重合酵素（Ｔａｋａｒａ、日本）、重合酵素緩衝液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰを入れ、塩濃度及びマンガン量を調節することによって変異頻度を調節した。エラープローンＰＣＲは、９４℃での５分間の事前予熱、９１℃での１分間の二重らせん分離、５５℃での１分間のプライマー結合、７２℃での３分間のＤＮＡ合成反応の手順を３０回繰り返し行い、最後に７２℃で５分間ＤＮＡ合成反応を行った。精製されたＰＣＲ産物とファージミドベクターであるｐＣｏｍｂ３ｘベクターをＳｆｉＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）制限酵素を用いて切断した後、これをライゲーションし、ＥＲ２７３８大腸菌に形質転換した後で培養した。
エラープローンＰＣＲに使用されたプライマー
実施例５：４－１Ｈに比べてＣＤ５５に対する親和度が改善されたクローンの選別
前記実施例４で製作したライブラリを用いたバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を通じて、Ｇ４－１Ｈ及び４－１ＨよりＣＤ５５に対する親和度が改善されたクローンを選別した。
まず、マグネチックビード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に組換えヒトＣＤ５５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２００９－ＣＤ／ＣＦ、米国）２．５μｇを接合させた。ファージライブラリとマグネチックビードに接合されたＣＤ５５を常温で２時間にわたって反応させることによって、ＣＤ５５に対して親和力を有するファージを結合した後、これを４－１Ｈ抗体と常温で３０分間反応させることによって４－１Ｈと競争させた。その後、０．５％のＴｗｅｅｎ ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、米国）が含まれた緩衝溶液で洗浄し、酸性溶液を用いて溶出した。溶出されたファージは、次のラウンドパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）のために大腸菌ＥＲ２７３８に感染させた後、一晩中培養して増殖させた。このような過程を４回繰り返し、バイオパニングを行った。１次で１回、２次～３次で３回、４次で５回洗浄し、パニング回数が増加するほど洗浄回数を増加させ、結合力の高いファージを蓄積した。
３次と４次バイオパニング結果物のプレートから選別された１９２個のクローンを、９６ディープウェル（ｄｅｅｐ ｗｅｌｌ）プレートで１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン、７０μｇ／ｍｌのカナマイシン及びＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを入れてから３７℃で一晩中培養し、抗体が発現されたファージの増殖を誘導した。前記収得した培養液の遠心分離を通じてファージを含む培地上澄み液を獲得し、これを組換えヒトＣＤ５５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２００９－ＣＤ／ＣＦ、米国）がコーティングされているＥＬＩＳＡプレートに入れてから３７℃で２時間にわたって培養し、ＨＲＰが接合されている抗Ｍ１３抗体（Ｍｅｒｃｋ、米国）を二次抗体として用いて、ＣＤ５５に結合する抗体をＥＬＩＳＡで確認した。対照群として４－１Ｈクローンのファージを使用し、これより結合力の高い５個のクローンを選別した。
実施例６：選別されたクローンの完全抗体の転換及び発現／精製
ＥＰ－１Ｅ、ＥＰ－１Ｆ、ＥＰ－９Ｂ、３Ｒ－２－１Ｈ及びＥＰ－１０Ｈを全長の完全ＩｇＧ形態に作るためのクローニングを行った。前記ＥＰ－１Ｅ、ＥＰ－１Ｆ、ＥＰ－９Ｂ、３Ｒ－２－１Ｈ及びＥＰ－１０Ｈは、下記表４のＣＤＲ配列を有する。
選別されたクローンの軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列
前記表で下線を引いた部分はＣＤＲ領域を示し、ボールド体は、Ｇ４－１Ｈと互いに異なるアミノ酸をそれぞれ示す。前記実施例５で選別された抗体であるＥＰ－１Ｅ、ＥＰ－１Ｆ、ＥＰ－９Ｂ、３Ｒ－２－１Ｈ及びＥＰ－１０ＨはｓｃＦｖ形態であるので、これらを完全抗体に転換し、完全抗体の転換及び発現／精製は、上述した実施例２と同一の方法で行った。
選別されたクローンの完全抗体クローニングに使用されたプライマー
実施例７：選別して製作した完全抗体のＣＤ５５に対する親和度分析
前記実施例６で製作した抗体のＣＤ５５に対する親和度を間接ＥＬＩＳＡで確認した。間接ＥＬＩＳＡは、上述した実施例３と同一の方法で行った。
ＥＬＩＳＡの結果、実施例６の抗体は、４－１Ｈに比べて高いＣＤ５５に対する親和度を示した（図２）。ＥＰ－１Ｅ、ＥＰ－１Ｆ、３Ｒ－２－１Ｈ及びＥＰ－１０Ｈは、類似する親和度を示し、ＥＰ－９Ｂは、４－１Ｈよりは高いが、他の抗体より低い親和度を示した。４－１Ｈに比べてＣＤ５５に対する親和度が高い各抗体は、各種の癌診断や薬学的治療組成物の製造に非常に有用に使用され得る。
実施例８：結合力向上核心部位のアミノ酸置換
表４に記載の各クローンにおいては、いずれもＧ４－１ＨでカバットＥＵナンバリングシステムによるＨ１００Ａ位置のＧがＶに置換された。この部分は、抗体の抗原結合に重要なＨＣＤＲ３領域に含まれる。本発明者等は、この部位を結合力向上のための核心部位として把握し、その部位をＶ以外の疎水性アミノ酸に置換するためにクローニングを行った。Ｈ１００Ａ位置のみがＧ４－１Ｈと異なるＥＰ－１０Ｈを基本バックボーンとして製作した１０Ｈ（Ａ）、１０Ｈ（Ｉ）、１０Ｈ（Ｌ）、１０Ｈ（Ｆ）及び１０Ｈ（Ｍ）は、下記のＣＤＲ配列を有する（表６）。
動物細胞発現用ベクターであるｐＣＭＶベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にクローニングされた完全ＩｇＧ形態であるＥＰ－１０Ｈの重鎖可変領域のうち、Ｇ４－１Ｈと異なる突然変異が起こった重鎖の相補性決定領域のアミノ酸を疎水性アミノ酸に置換した。
まず、ＥＰ－１０Ｈの重鎖可変領域を含むｐＣＭＶベクターから、表４のＨＣ１、ＨＣ２プライマーの組み合わせを用いて重鎖の可変領域と定常領域をＰＣＲを通じて収得した。ＰＣＲを通じて得られた重鎖可変領域と定常領域は、ＨＣ３正方向プライマーとＨＣ２逆方向プライマーを用いてオーバーラップＰＣＲ過程を経ることによってＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３形態を得た。このように得た重鎖は、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）制限酵素を用いて切断し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＣＭＶベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）にライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５α大腸菌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換した後、大量培養することによってプラスミドを得た。
結合力向上核心部位のアミノ酸置換のために使用したプライマー
クローニングを完了した後、ＥＰ－１０Ｈ軽鎖プラスミドと表６の重鎖プラスミドを用いた完全抗体の発現／精製は、上述した実施例２と同一の方法で行った。
実施例９：結合力向上核心部位を置換して製作した完全抗体のＣＤ５５に対する親和度分析
前記実施例８で製作した抗体のＣＤ５５に対する親和度を間接ＥＬＩＳＡで確認した。間接ＥＬＩＳＡは、上述した実施例３と同一の方法で行った。
ＥＬＩＳＡ分析の結果、結合力核心部位を疎水性アミノ酸に置換して製作した抗体は、４－１Ｈに比べて高いＣＤ５５に対する親和度を示した（図３）。しかし、１０Ｈ（Ａ）、１０Ｈ（Ｉ）、１０Ｈ（Ｌ）、１０Ｈ（Ｆ）及び１０Ｈ（Ｍ）は、ＥＰ－１０Ｈより低い親和度を示した。これは、Ｈ１００Ａ位置においてＧがＶに置換されることが、結合力向上に最も効率的な結果を示すことを意味する。
実施例１０：ＣＤ５５が過剰発現された薬剤耐性癌細胞株でのＥＰ－１０Ｈの治療効果
実験例１０－１：バーキットリンパ腫細胞株ＢＪＡＢでのリツキシマブとＥＰ－１０Ｈの併用効果
ＢＪＡＢは補体－抵抗性を有し、これは、ＣＤ５５の発現に起因する（Ｇｏｌａｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９５（１２）：３９００－８，２０００）。このような理由により、ＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が主な治療メカニズムであるリツキシマブに対する反応性が低い。Ｂ細胞リンパ腫のうち悪性として知られているバーキットリンパ腫に対するリツキシマブの治療効果の改善可能性を確認するために、バーキットリンパ腫細胞株であるＢＪＡＢにおいてＥＰ－１０Ｈとの併用を通じた細胞死滅能を確認した。１サンプル当たり５×１０５個のＢＪＡＢ細胞には、リツキシマブを２０μｇ／ｍｌの濃度で、そして、併用投与効果の確認のために４－１Ｈ又はＥＰ－１０Ｈとリツキシマブをそれぞれ５０μｇ／ｍｌと２０μｇ／ｍｌの濃度で５０％の補体血清ヒト（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｅｒａ ｈｕｍａｎ）（Ｓｉｇｍａ、米国）が添加されたＲＰＭＩ培地で希釈し、最終的に１００μｌを処理した後、３７℃、５％のＣＯ２条件下で１時間にわたって培養した。その後、ＦＩＴＣアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖアポトーシス検出キット（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ） ｗｉｔｈ ７－ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、米国）を用いてＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で死滅細胞を確認し、ＣＤＣを観察した（図４）。従来に報告されたように、ＢＪＡＢ細胞は、リツキシマブに対する反応性が低かったが、抗ＣＤ５５抗体（４－１Ｈ及びＥＰ－１０Ｈ）との併用投与時にその効果が増加し、増加した効果の幅は、リツキシマブと４－１Ｈとを組み合わせた場合に比べてリツキシマブとＥＰ－１０Ｈとを組み合わせた場合にさらに大きかった。このような結果は、ＣＤ５５の発現がリツキシマブのＣＤＣ効果を阻害するが、抗体を用いてＣＤ５５を抑制した場合に阻害された効果が回復されることを意味し、このような効果は、ＣＤ５５に対する親和度にさらに優れたＥＰ－１０Ｈによってより著しく発揮されることを示す。
実験例１０－２ａ：リツキシマブ耐性細胞株であるＲａｍｏｓ－ＲＲでのＣＤ５５の発現確認
Ｒａｍｏｓは、リツキシマブ反応性Ｂ細胞リンパ腫細胞株としてＲａｍｏｓを用いて製作したリツキシマブ耐性細胞株であるＲａｍｏｓ－ＲＲでのＣＤ５５発現を確認するために、下記のように実験を行った。
１サンプル当たり５×１０５個のＲａｍｏｓ及びＲａｍｏｓ－ＲＲを、１０μｇ／ｍｌの濃度のＥＰ－１０Ｈ単クローン抗体が含まれたり又は含まれていないＰＢＳで懸濁し、４℃で１時間にわたって培養した。培養液を４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ＰＢＳ １００μｌで洗浄し、４，０００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。ＰＢＳを用いて１：１００の比率で希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を細胞に処理し、遮光した状態で４℃で３０分間培養した。蛍光染色された細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ ４００μｌで懸濁し、ＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いて分析し、その結果を図５ａに示した。
その結果、Ｒａｍｏｓに比べてＲａｍｏｓ－ＲＲのＣＤ５５の発現が増加することを確認できた。これは、リツキシマブの薬剤耐性にＣＤ５５が関与することを意味する。
実験例１０－２ｂ：リツキシマブ耐性細胞株であるＲａｍｏｓ－ＲＲに対するリツキシマブとＥＰ－１０Ｈの併用効果
ＣＤ５５が過剰発現され、リツキシマブに対する耐性を示すＲａｍｏｓ－ＲＲにおいて、実験例１０－１の方法でリツキシマブとＥＰ－１０Ｈの併用投与を通じて細胞死滅能を確認した（図５ｂ）。リツキシマブはＲａｍｏｓで細胞死滅を誘導した一方で、Ｒａｍｏｓ－ＲＲでは細胞死滅誘導程度がＲａｍｏｓに比べて低かった。しかし、ＥＰ－１０Ｈと４－１Ｈの併用は、Ｒａｍｏｓ－ＲＲで細胞死滅を増加させ、ＢＪＡＢと同様に、ＥＰ－１０Ｈとの併用が４－１Ｈとの併用に比べてリツキシマブの細胞死滅能をさらに著しく増加させた。このような結果は、Ｂ細胞リンパ腫での原発癌（ＢＪＡＢ細胞株は、原発癌細胞株である）のみならず、既存の治療法に対して耐性を獲得した癌腫でもＥＰ－１０Ｈが治療効果を示すことを意味する。
実験例１０－３ａ：イマチニブ耐性細胞株であるＫ５６２－ＩＲでのＣＤ５５の発現確認
Ｋ５６２は、チロシンキナーゼ抑制剤であるイマチニブに対して反応性を有する白血病細胞株である。Ｋ５６２を用いて製作したイマチニブ耐性細胞株であるＫ５６２－ＩＲにおいて、ＣＤ５５発現を実験例１０－２ａと同一の方法で確認した。その結果、Ｋ５６２に比べてＫ５６２－ＩＲのＣＤ５５発現が増加することを確認できた（図６ａ）。これは、イマチニブの薬剤耐性にＣＤ５５が関与することを意味する。
実験例１０－３ｂ：Ｋ５６２－ＩＲ細胞株でのイマチニブとＥＰ－１０Ｈの併用効果確認
Ｋ５６２とＣＤ５５が過剰発現され、イマチニブに対する耐性を示すＫ５６２－ＩＲを１２ウェル細胞培養プレートに１ウェル当たり２×１０５個で分注した直後、イマチニブを２μＭの濃度で、そして、併用投与効果を確認するためにイマチニブ２μＭと４－１Ｈ又はＥＰ－１０Ｈをそれぞれ１０μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ培地で希釈し、最終的に５００μｌを処理し、３７℃、５％のＣＯ２条件下で２４時間にわたって培養した。その後、７－ＡＡＤとＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いてＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴで死滅細胞を分析した（図６ｂ）。
イマチニブは、Ｋ５６２細胞株で細胞死滅を誘導した一方で、Ｋ５６２－ＩＲでは効果を示さなかったが、ＥＰ－１０Ｈ又は４－１Ｈと併用投与すると、Ｋ５６２－ＩＲで細胞死滅を誘導した。また、ＥＰ－１０Ｈとイマチニブの併用は、４－１Ｈとイマチニブの併用に比べてさらに大きい細胞死滅効果を示した。このような結果は、チロシンキナーゼ抑制剤であるイマチニブの耐性の原因がＣＤ５５であることを実験例１０－３ａの結果と共に立証し、ＥＰ－１０Ｈを用いたＣＤ５５の阻害は、イマチニブの耐性を克服する効果的な戦略であることを意味する。イマチニブは、白血病の治療に広く使用される長期服用薬物であって、長期服用によって誘導され得る薬物の耐性克服戦略が切実に必要である。そこで、ＥＰ－１０Ｈを用いたイマチニブの耐性克服戦略は、白血病の治療に非常に効果的なものとして期待される。
実験例１０－４ａ：ゲフィチニブ耐性細胞株であるＰＣ９－ＧＲでのＣＤ５５の発現確認
ＰＣ９は、チロシンキナーゼ抑制剤であるゲフィチニブに対する反応性を有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株である。ＰＣ９を用いて製作したゲフィチニブ耐性細胞株であるＰＣ９－ＧＲにおいて、ＣＤ５５発現を実験例１０－２ａの方法で確認した結果、ＰＣ９に比べてＰＣ９－ＧＲのＣＤ５５発現が増加することを確認できた（図７ａ）。これは、ゲフィチニブの薬剤耐性にＣＤ５５が関与することを意味する。
実験例１０－４ｂ：ＰＣ９－ＧＲでのゲフィチニブとＥＰ－１０Ｈの併用効果確認
ＮＳＣＬＣ細胞株であるＰＣ９とＣＤ５５が過剰発現され、ゲフィチニブに対する耐性を示すＰＣ９－ＧＲを１２ウェル細胞培養プレートに１ウェル当たり１×１０５個で分注した後、３７℃、５％のＣＯ２条件下で培養した。分注してから２４時間後に、ゲフィチニブを５μｇ／ｍｌの濃度で、そして、併用投与効果を確認するためにゲフィチニブ５μｇ／ｍｌと４－１Ｈ又はＥＰ－１０Ｈをそれぞれ５μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ培地で希釈し、最終的に５００μｌを処理した後、３７℃、５％のＣＯ２条件下で２４時間にわたって再び培養した。その後、７－ＡＡＤとＦＩＴＣアネキシンＶアポトーシス検出キットを用いて、ＦＡＣＳ分析装備であるＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴで死滅細胞を分析した（図７ｂ）。
ゲフィチニブは、ＮＳＣＬＣ細胞株であるＰＣ９細胞株で細胞死滅を誘導した一方で、ＰＣ９－ＧＲでは効果を示さなかったが、ＥＰ－１０Ｈ又は４－１Ｈとゲフィチニブの併用は、ＰＣ９－ＧＲで細胞死滅を誘導した。また、ＥＰ－１０Ｈとゲフィチニブの併用は、４－１Ｈとゲフィチニブの併用に比べてさらに大きい細胞死滅効果を示した。このような結果は、標的抗癌剤のうちチロシンキナーゼ抑制剤であるゲフィチニブの耐性の原因がＣＤ５５であることを実験例１０－４ａの結果と共に立証し、ＥＰ－１０Ｈを用いたＣＤ５５の阻害は、ゲフィチニブの耐性を克服する効果的な戦略であることを意味する。ゲフィチニブは、治療剤が多くないＮＳＣＬＣに効果的な薬物であって、治療剤の他のオプションが多くない状況で薬物の耐性が現れると２次薬物の選択が難しいので、薬物の耐性を克服する戦略が切実に必要である。ＥＰ－１０Ｈを用いたゲフィチニブの耐性克服戦略は、ＮＳＣＬＣ治療に非常に効果的なものとして期待される。
実施例１１：ＥＰ－１０Ｈを用いた二重抗体の製作及び効能確認
実施例１０において、ＥＰ－１０Ｈと多様な薬物の併用効果を確認した。実施例１０の実験例１０－１、２で確認したリツキシマブとの併用効果結果に基づいて、互いに異なる抗原をターゲットとする二つの抗体を併用する方法と、一つの抗体で二つの抗原を同時にターゲットとし得る二重抗体の癌細胞死滅能とを比較するために、リツキシマブとＥＰ－１０Ｈを用いてＣＤ２０ ｘ ＣＤ５５二重抗体を製作し、二重抗体の癌細胞死滅能力を併用投与と比較して確認した。
実験例１１－１．動物細胞発現のための二重抗体（ＣＤ２０ ＸＣＤ５５）クローニング
本発明では、従来に報告されたＣＤ２０とＣＤ５５を同時にターゲットとする二重抗体（Ｍａｃｏｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２９（２）：４０６－１４，２０１４）とは相違する新規の二重抗体を開発したので、本発明者等は、二重抗体の形態による効能を比較するために、リツキシマブとＥＰ－１０Ｈの遺伝子を用いてＣＤ２０とＣＤ５５を同時にターゲットとする二重抗体をクローニングした。本発明で製作された二重抗体は、ＳＢＵ（ＳｐｅｃｉｆｉｃＢｉ－ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌＵｎｉｔ）と命名した（図８）。
ＳＢＵ形態のＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、重鎖同士の所望でないペアと結合することを防止するためにノブ－イントゥ－ホール技法を使用し、軽鎖同士の誤った結合を防止するためにはＧｌｙ及びＳｅｒで構成されたリンカーを使用した。ＣＤ５５－ｓｃＦｖ－ノブ（ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ２０－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３）とＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－ＣＫ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）形態でそれぞれクローニングを行い、ＣＤ５５－ｓｃＦｖ－ノブの場合は、実施例６で製作したＥＰ－１０Ｈを鋳型として使用し、表８のプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅された遺伝体は、ＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）酵素を処理し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換し、確保したコロニーを大量培養することによってプラスミドを収得した。
ＣＤ２０－Ｆａｂ－ホール（ＶＬ－ＣＫ－ｌｉｎｋｅｒ４０－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）形態の製作のために、Ｄｒｕｇ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに公開されたリツキシマブ配列に基づいて表９のプライマーの組み合わせを用いてＰＣＲを行った。増幅された遺伝体は、ＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ酵素を処理し、同様に、同一の制限酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭＡＺベクターにライゲーションした。ライゲーションが完了したプラスミドは、ＤＨ５αコンピテントセル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ、イギリス）に熱衝撃を加えて形質転換し、確保したコロニーを大量培養することによってプラスミドを収得し、配列分析（表１０）を完了した。
ＣＤ５５－ｓｃＦｖ－ノブクローニングに使用されたプライマー
ＣＤ２０－Ｆａｂ－ホールクローニングに使用されたプライマー
ＳＢＵ形態のＣＤ５５－ｓｃＦｖ－ノブとＣＤ２０－Ｆａｂ－ホールの可変領域のアミノ酸配列
実験例１１－２．動物細胞での発現及び精製
前記実験例１１－１で製作したＤＮＡの発現は、上述した実施例２と同一の方法で行った。ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、配列番号４７、４８のそれぞれのプラスミドをポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）と１５０ｍＭのＮａＣｌを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質導入し、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）で３７℃の温度、８％のＣＯ２及び５５％の湿度条件下で７日間培養した。ＳＢＵと類似する形態の二重抗体が報告されたが（Ｍｏｏｒｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｂｕｓｔ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｆｏｒｍａｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５４：３８－５０）、前記文献に開示された二重抗体の場合、発現時に３種のＤＮＡが必要である。３種のＤＮＡが必要である従来の二重抗体の製造方法と異なり、本発明のＳＢＵは、軽鎖同士の誤った結合を防止するためにＧｌｙ及びＳｅｒで構成されたリンカーを使用することによって、２種のＤＮＡで二重抗体の発現が可能である。発現細胞培養液を４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を採取してから０．２２μｍのフィルターを通じてろ過した。ろ過された上澄み液は、４℃でＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）レジン１ｍｌに結合するように誘導した。結合されたレジンは、１０ｃｖ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）のＰＢＳ溶液で洗浄した後、１００ｍＭのグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）溶液を用いて結合された抗体を溶出した後、１Ｍのトリス－ＨＣＬ（ｐＨ９．０）で中和した。ｐＨ７．２－７．４のＰＢＳで緩衝液の交換を行った後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを通じて精製された抗体の軽鎖と重鎖の大きさ及び純度を確認した結果、理論的計算値と一致する分子量及び高い純度を確認できた（図９）。ＳＢＵ形態の二重抗体は、ＣＤ２０結合部位がＦａｂで、ＣＤ５５結合部位がｓｃＦｖであるヘテロ形態である。ＦａｂのＣカッパ（ｋａｐｐａ）部分を用いてプロテインＬで精製すると、二重抗体の精製時に生成可能性が最も高いと知られているノブ－ノブホモダイマー又はノブモノマー（Ｇｉｅｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ，３４（２）３９７－４０４）の生成を抑制し、所望の形態であるヘテロダイマーのみを得ることができる。
実験例１１－３．ＥＬＩＳＡを通じた二重抗体の結合力確認
前記実験例１１－２で製作したＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体がターゲットとするそれぞれの抗原であるＣＤ２０及びＣＤ５５に対する親和度を間接ＥＬＩＳＡで確認した。間接ＥＬＩＳＡは、前記実施例３の方法で行い、ＣＤ２０とＣＤ５５の全てにおいて優れた結合力を示した（図１０ａ及び図１０ｂ）。特に、ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、ＣＤ２０に対してＭａｃｏｒが著述した先行文献に開示された形態のＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体より高い親和度を示し、ＣＤ５５に対してＭａｃｏｒが著述した先行文献に開示された形態であるＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体と類似する親和度を示した。ＣＤ２０が過剰発現される血液癌治療剤として使用可能なＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体としては、ＣＤ２０に対する親和度がさらに高いＳＢＵ形態のＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体がさらに効果的である。
実験例１１－４．ＢＪＡＢでのＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能確認
前記実験例１０－１の方法でＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能を確認した。１サンプル当たり５×１０５個のＢＪＡＢ細胞にリツキシマブを２０μｇ／ｍｌの濃度で、併用投与効果を確認するためにＥＰ－１０Ｈとリツキシマブのそれぞれを２０μｇ／ｍｌの濃度で、そして、ＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体のうちＭａｃｏｒが著述した先行文献に開示された形態とＳＢＵ形態をそれぞれ２０μｇ／ｍｌの濃度で２０％の補体血清ヒト（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｅｒａ ｈｕｍａｎ）（Ｓｉｇｍａ、米国）が添加されたＲＰＭＩ培地で希釈し、最終的に１００μｌを処理した。それ以外は、実験例１０－１と同一の方法で行った。
その結果、リツキシマブに対して反応性が低いＢＪＡＢ細胞でのＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、補体血清ヒト（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｅｒａ ｈｕｍａｎ）のみを処理した対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意な差の細胞死滅能を示し、ＳＢＵは、特にリツキシマブに比べて有意な差の細胞死滅能を示した（図１１ａ及び図１１ｂ）。このような結果は、互いに異なる抗原をターゲットとする二つの抗体を併用投与する場合に比べて、二つの抗原を同時にターゲットとし得る一つの二重抗体が癌細胞に対するＣＤＣ誘導により効果的であり、代表的なＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体であるＭａｃｏｒの二重抗体よりも本発明のＳＢＵが癌細胞に対するＣＤＣ誘導により適していることを意味する。また、ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、Ｂ細胞リンパ腫のうち悪性と知られているバーキットリンパ腫の効果的な治療剤になり得る。
実験例１１－５．ＲａｍｏｓでのＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能確認
前記実験例１１－４の方法を用いてＲａｍｏｓ細胞株でのＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能を確認した（図１２ａ及び図１２ｂ）。その結果、リツキシマブ反応性Ｒａｍｏｓ細胞でのＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、リツキシマブに比べて有意な差の細胞死滅能を示した。また、Ｍａｃｏｒの二重抗体より本発明のＳＢＵが優れた細胞死滅能を示した。このような結果は、ＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体が、リツキシマブ反応性癌腫でリツキシマブより効果的な抗癌効果を示すことができ、ＣＤ２０が発現された血液癌でのＳＢＵは、ＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体のうち効果的な治療剤として適用され得ることを意味する。
実験例１１－６．Ｒａｍｏｓ－ＲＲでのＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能確認
前記実験例１１－４の方法を用いてＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞株でのＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の細胞死滅能を確認した（図１３ａ及び図１３ｂ）。その結果、リツキシマブに対して反応性を示さないＲａｍｏｓ－ＲＲ細胞でのＣＤ２０ Ｘ ＣＤ５５二重抗体は、リツキシマブに比べて有意な差の細胞死滅能を示した。ＢＪＡＢ細胞株の結果と同一に、二重抗体のうちＭａｃｏｒの二重抗体より本発明のＳＢＵが遥かに優れた細胞死滅能を示した。このような結果は、ＳＢＵ形態のＣＤ２０ ＸＣＤ５５二重抗体が、ＣＤ２０が発現された血液癌のうちリツキシマブ耐性を示す癌腫に効果的な治療剤として適用され得ることを意味する。
実験例１１－７．ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体のＣＤＣ活性化分析
前記実験例１１－５において、Ｒａｍｏｓ－ＲＲ細胞ペレットのフローサイトメトリー前のリツキシマブとＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体を処理した上澄み液を採取し、ＣＤＣ活性化を分析した（図１４）。ＣＤＣメカニズムは、Ｃ１ｑが抗体と結合することを媒介にして起こる反応であって、その副産物であるＣ４ｄの生産量に基づいて全体のＣＤＣ過程中の中間段階で活性化分析が可能である。それぞれの上澄み液でのＣ４ｄ生産量を確認できるＥＬＩＳＡキット（Ｑｕｉｄｅｌ、米国）を通じて分析したとき、ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体を処理した上澄み液では、リツキシマブを処理した上澄み液に比べて多くのＣ４ｄが生産され、その差は有意的であった。このような結果は、ＳＢＵ形態のＣＤ２０Ｘ ＣＤ５５二重抗体の優れた細胞死滅能がＣＤＣ活性化メカニズムによることを明らかに示す。
以上では、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は好適な具現例に過ぎないので、本発明の範囲がこれに制限されないことは明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びその等価物によって定義されると言えるだろう。

Claims (17)

  1. 下記一般式１で表されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１領域；配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２領域；及び下記一般式２で表されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３領域；を含む重鎖可変領域、並びに、
    配列表の配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１領域；下記一般式３で表されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２領域；及び配列表の配列番号３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３領域；を含む軽鎖可変領域を含む、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片：
    一般式１
    Ｄ－Ｒ－Ｇ－Ｍ－Ｘ１；
    一般式２
    Ｎ－Ａ－Ｘ２－Ａ－Ｇ－Ｇ－Ｗ－Ｈ－Ａ－Ａ－Ｙ－Ｉ－Ｄ－Ａ、
    一般式３
    Ｗ－Ｎ－Ｘ ３ －Ｋ－Ｒ－Ｐ－Ｓ
    前記一般式１におけるＸ１は、Ａｌａであり、前記一般式２におけるＸ２は、Ｖａｌであり、及び、前記一般式３におけるＸ ３ は、Ａｓｐである。
  2. 下記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む、ＣＤ５５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片：
    ａ）配列表の配列番号４の軽鎖可変領域、及び
    ｂ）配列表の配列番号１９の重鎖可変領域。
  3. 前記抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片又はＦｖ断片であることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
  4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片をコーディングする核酸分子。
  5. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物。
  6. 前記組成物は、抗ＣＤ２０抗体及びチロシンキナーゼ抑制剤で構成された群から選ばれる一つ以上の薬理成分をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブであることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記チロシンキナーゼ抑制剤は、イマチニブ及びゲフィチニブで構成された群から選ばれる一つ以上の抑制剤であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
  9. 前記癌は、ＣＤ５５陽性である癌であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
  10. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の診断用組成物。
  11. 前記癌は、ＣＤ５５陽性である癌であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
  12. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項のＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片、及びＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片を含む二重特異的抗体又はその機能的断片。
  13. 前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体は、リツキシマブであることを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異的抗体又はその機能的断片。
  14. 前記ＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、ｓｃＦｖを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異的抗体又はその機能的断片。
  15. 前記ＣＤ５５に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異的抗体又はその機能的断片。
  16. 前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異的抗体又はその機能的断片。
  17. 前記ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の抗原結合断片は、ＶＬ－ＣＫ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３形態であることを特徴とする、請求項１２に記載の二重特異的抗体又はその機能的断片。
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