JP7611397B2 - 間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤 - Google Patents

間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤 Download PDF

Info

Publication number
JP7611397B2
JP7611397B2 JP2023537987A JP2023537987A JP7611397B2 JP 7611397 B2 JP7611397 B2 JP 7611397B2 JP 2023537987 A JP2023537987 A JP 2023537987A JP 2023537987 A JP2023537987 A JP 2023537987A JP 7611397 B2 JP7611397 B2 JP 7611397B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mesenchymal stem
cells
inducer
stem cells
estradiol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2023537987A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2024522418A (ja
Inventor
陳梦梦
張炳強
Original Assignee
青島瑞思徳生物科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 青島瑞思徳生物科技有限公司 filed Critical 青島瑞思徳生物科技有限公司
Publication of JP2024522418A publication Critical patent/JP2024522418A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7611397B2 publication Critical patent/JP7611397B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0037—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は、生物医学の分野に属し、間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤に関する。
エストロゲンは、女性の生涯においていかなるホルモンでも取って代わることができないほど大きな作用を発揮し、女性の第二次性徴の発達や維持を主導し、女性の体内環境の安定性を調整し、女性のライフサイクルを制御し、女性の周期的な月経、女性の生殖能力、女性らしい丸みのある体形などは、すべてエストロゲンの作用と関係がある。体内に生理的に存在するエストロゲンは主に、卵巣、卵胞、黄体及び胎盤から生成されるエストラジオール（Ｅ２）、エストロン及びエストリオールの３種類があり、エストロゲンが不足すると、女性の多くの器官の機能低下を引き起こす恐れがある。
早発卵巣不全（ＰＯＦ）とは、卵巣機能が低下して４０歳未満で月経がなくなる状態を指す。症状としては、原発性又は続発性の無月経による血中性腺刺激ホルモン濃度の上昇やエストロゲン濃度の低下、また、ほてり、多汗症、顔面紅潮、性欲低下などの異なる程度の一連の低エストロゲン症状を伴うことである。現在、ＰＯＦ女性に対して、エストロゲン濃度低下による様々な合併症を改善するために、ホルモン補充療法を用いるのが一般的であり、ＰＯＦ患者に外因性ステロイドホルモンを投与して人工周期を作ることにより、子宮内膜が正常に戻り、妊娠に有利に働く。しかし、長期にわたるホルモン補充療法は、適切な投与量を達成することができず、副作用や潜在的なリスクが存在する可能性があり、卵巣機能の回復効率が低いため、この問題を解決する別の方法を探すことが急務となっている。
生殖細胞（ＰＣＧｓ）は、多細胞生物の体内で子孫を残すことができる細胞の総称であり、始原生殖細胞から最終分化した生殖細胞まで含み、精子及び卵細胞を含む。胚胎の発育後期において、生殖細胞は分裂増殖せず、小部分の卵原細胞だけは成長し、一次卵母細胞に分化し、一連の過程を経て原始卵胞を形成した後、前胞状卵胞を経て胞状卵胞になり、最後に成熟卵胞を形成する。女性が生まれてから、卵母細胞は継続的に減少し、卵母細胞の数が所定数まで減少すると、閉経が起こり、さらに、閉経によってエストロゲン濃度の減少も伴い、エストロゲンの低下により、心血管、脳血管、内分泌、骨、神経系などの多くの疾患を引き起こす可能性が高くなる。
幹細胞を機能的な卵母細胞に分化する過程では、新しく生成された卵胞が同時に発育するため、性ホルモン（エストロゲン、アンドロゲンなど）の合成が必然的に行われ、そして、性ホルモンが卵母細胞に作用し、卵母細胞の発育を促進する。莢膜細胞からアンドロゲンが産生されるため、アンドロゲンは、顆粒膜細胞に転送されてエストロゲンに転換され、患者自身の視床下部－下垂体前葉－標的腺軸の調節によって、フィードバック機構及びネガティブフィードバック機構により生体の生理活動に必要なホルモンを補充し、これにより、ホルモン補充療法による過剰補充又は補充不足を防止することができ、これは、従来の外因性ホルモン補充療法とは異なり、その最大の利点でもある。現在の幹細胞誘導法には、主にｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導、遺伝子改変、タンパク質導入及び組織微小環境誘導が含まれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導は、様々な刺激因子の組み合わせを使用して、幹細胞を目的細胞に分化誘導する。各実験室の分化誘導の条件が異なり、分化誘導のメカニズムがまだ明確でなく、分化誘導の効率が低く、誘導過程が複雑で、誘導時間が長く、得られる細胞数が少なく、機能が低い。
現在、間葉系幹細胞を用いて胚様体を作製し、卵胞液及び白血病阻止因子（ＬＩＦ）と共に培養することが多く研究されている。一方、中山大学の松陽洲教授は、胚性幹細胞から生殖細胞を分化誘導する誘導剤としてレチノイン酸（ＲＡ）を使用し、前にもＲＡによる臍帯幹細胞からＰＣＧｓへの分化誘導に関する文献を報告した。しかし、ＲＡが幹細胞から生殖細胞を分化誘導するか又は幹細胞からＥ２などのエストロゲンの分泌を促進することができ、しかも分化率がブランク群と比べて有意差がないと報告された文献は１つだけある。
骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）は、卵胞エストロゲンに対する顆粒膜細胞の反応性を高め、Ｅ２の産生を促進し、プロゲステロンの生成を抑制することができる、エストロゲンとプロゲステロンの生成を調節する重要な調節因子である。研究により、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）と骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７）は、パラクリン作用によりプロゲステロンの分泌を抑制し、Ｅ２の分泌を増加させ、その作用機序が原始卵胞から一次卵胞への移行を促進する可能性があることを発見した。Ｋｅｈｋｏｏｉ ＫｅｅやＫａｔｓｕｈｉｋｏらは、胚性幹細胞からＰＧＣｓを分化誘導する誘導剤としてＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＢＭＰ８ｂを用いることについて、それぞれＮａｔｕｒｅやＳｃｉｅｎｃｅなどのジャーナルで類似した論文を発表した。
上記をまとめると、本発明は、胚性幹細胞から生殖細胞への分化誘導剤及び間葉系幹細胞から生殖細胞への分化誘導剤を組み合わせて、間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に分化誘導する高効率な誘導剤を見つけようとする。本発明者らは、文献を参考にし、実験を繰り返した結果、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＲＡを基に、ベンズアミド、塩化白金酸六水和物及びエタノールアミンと組み合わせることで、間葉系幹細胞からＥ２分泌細胞への分化誘導効率を大幅に向上させることができ、抗酸化剤であるレスベラトロール、イカリイン、及び成長因子であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と組み合わせることで、誘導後に得られるＥ２分泌細胞の生存率及び増殖能力を大幅に向上させることができることを予想外に発見した。
本発明は、従来技術に存在する上記問題を解決するために、ヒト間葉系幹細胞無血清培地を基質とし、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４） ２０～６０ｍｇ／Ｌ、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ７） ２０～６０ｍｇ／Ｌ、レチノイン酸（ＲＡ） ２～８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ２～８ｍｇ／Ｌ、イカリイン ２～８ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ２～８ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ２～８ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ２～８ｕｇ／Ｌ、エリスロポエチン（ＥＰＯ） ２～１０ｕｇ／Ｌ、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ） ２～１０ｕｇ／Ｌからなる、間葉系幹細胞をエストラジオール（Ｅ２）分泌細胞に分化誘導する誘導剤を提供することを目的とする。本発明の誘導剤は、分化誘導に必要な工程が少なく、時間が短く、誘導効率が高い。
上記の目的を実現するために、本発明は、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ＲＡ、レスベラトロール、イカリイン、ベンズアミド、塩化白金酸六水和物、エタノールアミン、ＥＰＯ及びＶＥＧＦからなる、間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に分化誘導する誘導剤という技術的手段を採用する。
前記誘導剤の各成分の質量濃度比は、ＢＭＰ４ ２０～６０ｍｇ／Ｌ、ＢＭＰ７ ２０～６０ｍｇ／Ｌ、ＲＡ ２～８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ２～８ｍｇ／Ｌ、イカリイン ２～８ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ２～８ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ２～８ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ２～８ｕｇ／Ｌ、ＥＰＯ ２～１０ｕｇ／Ｌ、ＶＥＧＦ ２～１０ｕｇ／Ｌである。
好ましくは、前記誘導剤の各成分の質量濃度比は、ＢＭＰ４ ５０ｍｇ／Ｌ、ＢＭＰ７ ５０ｍｇ／Ｌ、ＲＡ ８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ６ｍｇ／Ｌ、イカリイン ６ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ４ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ６ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ４ｕｇ／Ｌ、ＥＰＯ ５ｕｇ／Ｌ、ＶＥＧＦ ５ｕｇ／Ｌである。
本発明の間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に分化誘導する誘導剤は、１、遺伝子導入を必要としないため、遺伝子変異や発がんのリスクがなく、安全性が高い；２、誘導工程が少なく、誘導時間が短い；３、ベンズアミド、塩化白金酸六水和物及びエタノールアミンと組み合わせることで、間葉系幹細胞からＥ２分泌細胞への分化誘導効率を大幅に向上させることができる；４、抗酸化剤であるレスベラトロール、イカリイン、及び成長因子であるＥＰＯ、ＶＥＧＦと組み合わせることで、誘導後に得られるＥ２分泌細胞の生存率及び増殖能力を大幅に向上させることができる、という利点を有する。
以下の実施例における実験方法は、特に説明しない限り、いずれも常法である。実験に用いた器具、機器、試薬は、いずれも商業的に入手可能なものである。
実施例１
この実施例の間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に誘導する誘導剤は、ＢＭＰ４ ４０ｍｇ／Ｌ、ＢＭＰ７ ５０ｍｇ／Ｌ、ＲＡ ８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ２ｍｇ／Ｌ、イカリイン ６ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ４ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ８ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ４ｕｇ／Ｌ、ＥＰＯ １０ｕｇ／Ｌ、ＶＥＧＦ ２ｕｇ／Ｌからなる。上記の成分を、質量濃度比でヒト間葉系幹細胞無血清培地（又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ又は市販の他のタイプの間葉系幹細胞培地）に順次加え、よく混合し、濾過滅菌した。
本発明の誘導剤の各成分は、市販されているものであり、ヒト間葉系幹細胞無血清培地（ＬＯＮＺＡ社、製品番号００１９０６３２）、ＢＭＰ４（Ｇｉｂｃｏ社、製品番号ＰＨＣ９５３３）、ＢＭＰ７（Ｇｉｂｃｏ社、製品番号ＰＨＣ７２０４）、ＲＡ（Ｓｉｇｍａ社、製品番号Ｒ２６２５）、レスベラトロール（Ｓｉｇｍａ社、製品番号Ｒ５０１０－１００ＭＧ）、イカリイン（上海微晶生物、製品番号４８９－３２－７）、ベンズアミド（Ｓｉｇｍａ社、製品番号１３５８２８）、塩化白金酸六水和物（Ｓｉｇｍａ社、製品番号２０６０８３）、エタノールアミン（Ｓｉｇｍａ社、製品番号８００８４９０１００）、ＥＰＯ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号ＣＹＴ－２０１）、ＶＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、製品番号９６－１００－２０－２）である。
実施例２
この実施例の間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に誘導する誘導剤は、ＢＭＰ４ ５０ｍｇ／Ｌ、ＢＭＰ７ ２０ｍｇ／Ｌ、ＲＡ ２ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ２ｍｇ／Ｌ、イカリイン ２ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ４ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ６ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ４ｕｇ／Ｌ、ＥＰＯ ８ｕｇ／Ｌ、ＶＥＧＦ ８ｕｇ／Ｌからなる。上記の成分を、質量濃度比でヒト間葉系幹細胞無血清培地（又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ又は市販の他のタイプの間葉系幹細胞培地）に順次加え、よく混合し、濾過滅菌した。
実施例３
この実施例の間葉系幹細胞をＥ２分泌細胞に誘導する誘導剤は、ＢＭＰ４ ５０ｍｇ／Ｌ、ＢＭＰ７ ５０ｍｇ／Ｌ、ＲＡ ８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ６ｍｇ／Ｌ、イカリイン ６ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ４ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ６ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ４ｕｇ／Ｌ、ＥＰＯ ５ｕｇ／Ｌ、ＶＥＧＦ ５ｕｇ／Ｌからなる。上記の成分を、質量濃度比でヒト間葉系幹細胞無血清培地（又はＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に順次加え、よく混合し、濾過滅菌した。
実施例４
ヒト脂肪間葉系幹細胞を例に、本発明の誘導剤による間葉系幹細胞からＥ２分泌細胞への分化誘導効果を説明すると、第３世代のヒト脂肪間葉系幹細胞を９６ウェルプレートに１×１０４／ｃｍ２で播種し、細胞のコンフルエントが８０％近くに達して増殖が活発になったときに分化誘導を行い、誘導条件の分類を表１に示した。
表１ 誘導条件の分類
誘導過程における細胞の形態変化を注意深く観察し、誘導時間が１～９日後になった時、各群の培養液をそれぞれ採取し、２０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離した後、上清を－２０℃で保存し、その中のＥ２含有量をそれぞれ測定し、統計的分析を行った。エストラジオールＥＬＩＳＡキット（上海帛科生物技術有限公司製）の使用説明書に規定された操作に従い、Ｅ２含有量を測定し、結果を表２に示した。
表２ 異なる誘導剤の誘導効果の比較
表２の誘導結果から、本発明の誘導剤によるヒト脂肪間葉系幹細胞の誘導効率が最も高く、誘導された細胞からのＥ２分泌量が最も多いことがわかる。本発明の誘導剤を添加して２日後にＥ２が持続的に分泌され、分泌量が徐々に増加し、約５～７日目になると、Ｅ２の１日当たりの分泌量が最大になり、持続的に分泌することができる。

Claims (2)

  1. ヒト間葉系幹細胞無血清培地を基質とし、骨形成タンパク質４ ２０～６０ｍｇ／Ｌ、骨形成タンパク質７ ２０～６０ｍｇ／Ｌ、レチノイン酸 ２～８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ２～８ｍｇ／Ｌ、イカリイン ２～８ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ２～８ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ２～８ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ２～８ｕｇ／Ｌ、エリスロポエチン ２～１０ｕｇ／Ｌ、血管内皮細胞増殖因子 ２～１０ｕｇ／Ｌからなる、ことを特徴とするヒト脂肪間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤。
  2. ヒト間葉系幹細胞無血清培地を基質とし、骨形成タンパク質４ ５０ｍｇ／Ｌ、骨形成タンパク質７ ５０ｍｇ／Ｌ、レチノイン酸 ８ｍｇ／Ｌ、レスベラトロール ６ｍｇ／Ｌ、イカリイン ６ｍｇ／Ｌ、ベンズアミド ４ｕｇ／Ｌ、塩化白金酸六水和物 ６ｕｇ／Ｌ、エタノールアミン ４ｕｇ／Ｌ、エリスロポエチン ５ｕｇ／Ｌ、血管内皮細胞増殖因子 ５ｕｇ／Ｌからなる、ことを特徴とする請求項１に記載のヒト脂肪間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤。
JP2023537987A 2022-05-26 2023-01-04 間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤 Active JP7611397B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210579694.3A CN117165516B (zh) 2022-05-26 2022-05-26 一种将间充质干细胞诱导分化为雌二醇分泌细胞的诱导剂
CN202210579694.3 2022-05-26
PCT/CN2023/070348 WO2023226441A1 (zh) 2022-05-26 2023-01-04 一种将间充质干细胞诱导分化为雌二醇分泌细胞的诱导剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2024522418A JP2024522418A (ja) 2024-06-21
JP7611397B2 true JP7611397B2 (ja) 2025-01-09

Family

ID=88918326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023537987A Active JP7611397B2 (ja) 2022-05-26 2023-01-04 間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤

Country Status (7)

Country Link
US (1) US12559727B2 (ja)
EP (1) EP4321610B1 (ja)
JP (1) JP7611397B2 (ja)
KR (1) KR102865825B1 (ja)
CN (1) CN117165516B (ja)
WO (1) WO2023226441A1 (ja)
ZA (1) ZA202310324B (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165516B (zh) * 2022-05-26 2026-04-28 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种将间充质干细胞诱导分化为雌二醇分泌细胞的诱导剂

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293873A (zh) 2013-07-16 2015-01-21 复旦大学附属华山医院 一种制备雌二醇的方法
CN106929466A (zh) 2015-12-30 2017-07-07 中国医学科学院基础医学研究所 诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的方法及其用途
US20170258842A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Augusta University Research Institute, Inc. Methods and Compositions for Treating Ovarian Failure

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030224345A1 (en) * 2001-08-24 2003-12-04 Advanced Cell Technology Screening assays for identifying differentiation-inducing agents and production of differentiated cells for cell therapy
WO2008020815A1 (en) * 2006-08-15 2008-02-21 Agency For Science, Technology And Research Mesenchymal stem cell conditioned medium
EP2698365B8 (en) * 2011-04-15 2018-02-14 National University Corporation Tottori University Synthesis and analysis of novel compound capable of inducing differentiation of human mesenchymal stem cell into hepatocyte
CN103609522B (zh) * 2013-11-19 2015-07-15 陕西师范大学 一种定向诱导大鲵幼体雌性化生长的方法
US11439668B2 (en) 2014-05-23 2022-09-13 JangoBio, LLC Methods to differentiate stem cells into hormone-producing cells
CN105132362A (zh) * 2014-05-29 2015-12-09 成都中医药大学 维甲酸诱导干细胞分化的用途
CN113106054B (zh) * 2020-01-13 2022-10-14 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种将间充质干细胞诱导分化为胰岛细胞的诱导剂
KR102361431B1 (ko) * 2020-06-12 2022-02-09 이화여자대학교 산학협력단 줄기세포로부터 에스트로겐 분비 세포의 분화 방법
CN117165516B (zh) * 2022-05-26 2026-04-28 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种将间充质干细胞诱导分化为雌二醇分泌细胞的诱导剂
CN115820540B (zh) * 2022-12-21 2024-11-08 青岛瑞思德生物科技有限公司 一种间充质干细胞内皮分化诱导剂

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293873A (zh) 2013-07-16 2015-01-21 复旦大学附属华山医院 一种制备雌二醇的方法
CN106929466A (zh) 2015-12-30 2017-07-07 中国医学科学院基础医学研究所 诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的方法及其用途
US20170258842A1 (en) 2016-03-09 2017-09-14 Augusta University Research Institute, Inc. Methods and Compositions for Treating Ovarian Failure

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell and Tissue Biology，2016年，Vol.10, No.2，pp.95-99

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023226441A1 (zh) 2023-11-30
US12559727B2 (en) 2026-02-24
KR20230165195A (ko) 2023-12-05
US20250092367A1 (en) 2025-03-20
EP4321610A1 (en) 2024-02-14
EP4321610C0 (en) 2025-10-22
ZA202310324B (en) 2024-04-24
CN117165516B (zh) 2026-04-28
EP4321610B1 (en) 2025-10-22
KR102865825B1 (ko) 2025-09-26
EP4321610A4 (en) 2024-10-30
JP2024522418A (ja) 2024-06-21
CN117165516A (zh) 2023-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106906182B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基
US6162643A (en) Hepes based basal nutrient medium for the isolation and culturing of stem cells
CN101490245A (zh) 无血清培养基及其在软骨细胞扩增中的用途
Kidwai et al. Differentiation of human embryonic stem cells into clinically amenable keratinocytes in an autogenic environment
Beliard et al. Role of endocrine status and cell type in adhesion of human endometrial cells to the peritoneum in nude mice
MXPA04004309A (es) Celulas estromales derivadas de tejido adiposo para la reparacion de defectos corneales e intraorbitales y usos de las mismas.
CN111643526A (zh) 一种用于延缓卵巢衰老及防治老年痴呆和抑郁的间充质干细胞制剂
JP5227024B2 (ja) 毛包真皮毛根鞘細胞の培養法
JP2024522418A (ja) 間葉系幹細胞をエストラジオール分泌細胞に分化誘導する誘導剤
Westphal et al. Human neurocytoma cells in culture show characteristics of astroglial differentiation
CN101054572B (zh) 人脐血干细胞培养及定向分化为多巴胺能神经细胞的方法及得到的多巴胺能神经细胞的应用
Ishizeki et al. Meckel's cartilage chondrocytes in organ culture synthesize bone-type proteins accompanying osteocytic phenotype expression
EP4613850A1 (en) Uterine treatment composition, uterine environment-improving agent, implantation aid, embryo transplantation liquid, sperm transplantation liquid, and implantation rate-improving agent
CN115786247B (zh) 一种无血清培养基及其在维持毛囊活性、毛发养护及移植方面的应用
Lu et al. Therapeutic potential of super activated platelet lysate (sPL), and mesenchymal stem cells (MSCs) in a rat model with immune premature ovarian failure
Tsang et al. Effect of phenol red and steroid hormones on cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in mouse endometrial epithelial cells
Broussard et al. Effect of media substitutes on bovine granulosa cell function and proliferation during in vitro culture
JP2023520523A (ja) 組成物
Kostadinova et al. Improved Procedures for Human Granulosa Cell Isolation and Long-term in Vitro Expansion
WO2020205464A1 (en) Ovarian follicle cells and constructs for fertility treatment and hormone replacement therapy
Canciello et al. The inhibition of Epithelial-mesenchymal transition enhances pro-regenerative properties of ovine amniotic-derived stem cells
Taga et al. Transforming growth factor-α, like epidermal growth factor, stimulates cell proliferation and inhibits prolactin secretion in the human decidual cells in vitro
De et al. Stimulation of rat placental cell DNA synthesis by transferrin
Sheffield et al. Control of mammary gland fibroblast growth by insulin, growth hormone and prolactin
CN120966745A (zh) 一种无血清培养基及其在间充质干细胞培养中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230621

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240815

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240909

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20241217

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20241223

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7611397

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150