JP7607289B2 - 新規の抗ｂ型肝炎ウイルス抗体及びその使用 - Google Patents

Description

本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療の分野に関する。具体的には、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体及び該抗体をコードする核酸、並びにそれらの使用に関する。本発明の抗ＨＢｓＡｇ抗体は、ＨＢｓＡｇに対して酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い結合親和性を有する。この新規の抗体は、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）を予防及び／又は治療するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、又は被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるために使用することができる。したがって、本発明は、ＨＢＶ感染若しくはＨＢＶ感染に関係する疾患（例えばＢ型肝炎）を予防及び／又は治療するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するための医薬組成物の製造における抗体及びその変異体の使用に更に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス感染、特に慢性ＨＢＶ感染は、世界的に最も重要な公衆衛生問題の１つである（非特許文献１）。慢性ＨＢＶ感染は、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）、肝硬変（ＬＣ）及び原発性肝細胞癌（ＨＣＣ）等の一連の肝疾患を引き起こす恐れがある（非特許文献２）。報告によると、現在、全世界で約２０億人がＨＢＶに感染しており、現時点で約３億５０００万人が慢性Ｂ型肝炎ウイルス感染を有し、これらの感染者がＨＢＶ感染に関連する肝疾患によって最終的に死亡するリスクは、１５％～２５％に達する可能性があり、毎年全世界で１００万人超がかかる疾患によって死亡している（非特許文献１及び非特許文献２）。

現在の慢性ＨＢＶ感染の治療薬は、インターフェロン（ＩＦＮ）とヌクレオシド又はヌクレオチド類似体（ＮＡ）とに分けることができる（非特許文献１、非特許文献３及び非特許文献２）。しかしながら、単独又は組合せでの上述の薬物による治療は、感染者におけるＨＢＶウイルスを完全に除去することができず、それによるＨＢｓＡｇ陰性化又はＨＢｓＡｇセロコンバージョン（感染者における完全なＨＢＶウイルスクリアランスの証拠）の奏効率は、通常は５％未満である（非特許文献３）。

免疫学的手段に基づく慢性ＨＢＶ感染の治療のための新薬の開発は、この分野における重要な研究の方向の１つである。慢性ＨＢＶ感染の免疫療法は、通常は能動免疫療法（ワクチン等を含むその対応する薬物形態）及び受動免疫療法（抗体等を含むその対応する薬物形態）の２つの方法で行われる。能動免疫療法とは、慢性ＨＢＶ感染者の身体を刺激して、細胞性免疫応答（ＣＴＬ効果等）及び／又はＨＢＶに対する液性免疫応答（抗体等）を能動的に引き起こし、ＨＢＶを阻害又は除去する目的を達成するための治療ワクチン（タンパク質ワクチン、ペプチドワクチン、核酸ワクチン等を含む）の投与を指す。現在、慢性ＨＢＶ感染の治療に使用することができる明らかに重要かつ効果的な能動免疫療法薬／ワクチンはない。受動免疫療法（抗体を例として挙げる）とは、ＨＢＶ感染者に対する治療特性を有する抗体の投与を指し、治療効果は、ＨＢＶが新生児の肝細胞に感染するのを阻止する抗体を介したウイルス中和、又はウイルス及び感染した肝細胞を身体から除去する抗体を介した免疫クリアランスによって達成することができる。現在、予防Ｂ型肝炎ワクチンに応答を示した患者又はＨＢＶ感染から回復した患者の血清／血漿から精製された抗ＨＢｓポリクローナル抗体、すなわち高力価Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）が、ＨＢＶの母子垂直感染を阻止し、慢性ＨＢＶ感染患者における肝移植後のＨＢＶ再感染を予防し、偶然にＨＢＶに曝露された人々の感染を防ぐために広く使用されている。しかしながら、ＨＢＶ感染患者（例えばＣＨＢ患者）の治療にＨＢＩＧを直接適用することは、明白な効果がなく、高力価血漿の供給源の少なさ、高価格、不安定な性質及び潜在的な安全性の問題等の多くの制限を有する。

Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500 Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582-592 Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May;8(5): 275-284

したがって、ＨＢＶウイルス、特にＨＢｓＡｇをより効果的に除去することができるＨＢＶ感染者に対する革新的な治療方法及び薬物を開発することが緊急であり、必要とされている。

本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＢＶの毒性を中和し、ＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができる、優れた特性を有する抗ＨＢｓＡｇヒト化抗体を以前に開発している。本発明者らは、以前の研究に基づき、多くの創造的な作業を行い、ヒト化抗体の徹底的な研究及び改変を行うことで、ｐＨ依存抗原結合能を有する抗ＨＢｓＡｇ抗体を開発した。本発明の抗ＨＢｓＡｇ抗体は、ＨＢｓＡｇに対して酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性を有するため、抗体の再利用が実現され、抗体の半減期が大幅に延長され、ＨＢＶクリアランスの効率が高まる。さらに、本発明者らは、上述の抗体のＦｃ領域に突然変異を導入し、中性条件下でのｈＦｃＲｎ又はｍＦｃγＲＩＩに対するその親和性を高めることによって、スカベンジャー抗体を得て、抗体の半減期を更に延長する。

本発明の抗体は、ＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させる活性を保持するだけでなく、抗原抑制時間がより長いために治療の注射量及び投与頻度が大幅に低減され、大きな臨床的価値を有することから極めて有利である。

本発明の抗体
したがって、一態様において、本発明は、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することが可能な抗体又はその抗原結合フラグメントであって、酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性でＨＢｓＡｇに結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

或る特定の実施の形態においては、中性ｐＨはｐＨ６．７～ｐＨ７．５、例えばｐＨ７．４である。

或る特定の実施の形態においては、酸性ｐＨはｐＨ４．０～ｐＨ６．５、例えばｐＨ６．０である。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントの酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）でのＨＢｓＡｇへの結合のＫ_Ｄと中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）でのＨＢｓＡｇへの結合のＫ_Ｄとの比率（すなわち、Ｋ_Ｄ（酸性ｐＨ）／Ｋ_Ｄ（中性ｐＨ）の値）は、１超、例えば１．５以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、３００以上、５００以上、８００以上、１０００以上、２０００以上、５０００以上又は１００００以上である。幾つかの実施の形態においては、Ｋ_Ｄ（酸性ｐＨ）／Ｋ_Ｄ（中性ｐＨ）の値は、１超かつ１００００以下、例えば５０００以下、２０００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下又は１０以下である。Ｋ_Ｄは、当該技術分野で既知の手法、例えばＳＰＲ技法（例えばＢｉａｃｏｒｅ）によって測定することができる。

幾つかの実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントのｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへの結合のＫ_ＤとｐＨ７．４でのＨＢｓＡｇへの結合のＫ_Ｄとの比率は、１超、例えば１．５以上、２以上である。或る特定の実施の形態においては、中性ｐＨでの抗体又はその抗原結合フラグメントのＫ_Ｄ値は、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ以下であり得る。幾つかの実施の形態においては、酸性ｐＨでの本発明の抗体のＫ_Ｄ値は、１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ以上であり得る。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントの酸性ｐＨ（例えばｐＨ６．０）でのＨＢｓＡｇへの結合のＥＣ５０と中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）でのＨＢｓＡｇへの結合のＥＣ５０との比率（すなわち、ＥＣ５０（酸性ｐＨ）／ＥＣ５０（中性ｐＨ）の値）は、１超、例えば１．５以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、３００以上、５００以上、８００以上、１０００以上、２０００以上、５０００以上又は１００００以上である。幾つかの実施の形態においては、ＥＣ５０（酸性ｐＨ）／ＥＣ５０（中性ｐＨ）の値は、１超かつ１００００以下、例えば５０００以下、２０００以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下又は１０以下である。幾つかの実施の形態においては、ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡ法によって測定され、例えばＥＬＩＳＡ法によって作成された用量応答曲線の回帰分析によって算出される。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントのｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへの結合のＥＣ５０とｐＨ７．４でのＨＢｓＡｇへの結合のＥＣ５０との比率は、１超、例えば１．５以上、又は２以上である。

或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗ＨＢＶヒト化抗体Ｍ１Ｄに由来する（中国特許出願第２０１８１０３０７１３６．５号に詳細に記載されている）。

或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＢｓＡｇのａａ１１８～１２４に対して酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性で結合する。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特徴の１つ以上を有する、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む：
（ｉ）ＨＣＤＲ１が、配列番号２０に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する；
（ｉｉ）ＨＣＤＲ２が、配列番号２１に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する；及び／又は、
（ｉｉｉ）ＨＣＤＲ２が、配列番号１６に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の特徴の１つ以上を有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＬ）を含む：
（ｉ）ＬＣＤＲ１が、配列番号１１に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する；
（ｉｉ）ＬＣＤＲ２が、配列番号１２に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する；及び／又は、
（ｉｉｉ）ＬＣＤＲ２が、配列番号４６に示される配列と比較してヒスチジンに置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸）を有する。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）以下の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）ＧＧＳＩＸ_１Ｘ_２ＮＦＷ（配列番号５０）（ここで、Ｘ_１はＴ又はＨから選択され、Ｘ_２はＳ又はＨから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｘ_３ＧＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｔ（配列番号５１）（ここで、Ｘ_３はＳ又はＨから選択され、Ｘ_４はＰ、Ｓ又はＹから選択され、Ｘ_５はＧ又はＤから選択され、Ｘ_６はＴ又はＨから選択され、Ｘ_７はＹ又はＨから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＡＲＳＨＸ_８ＹＧＸ_９Ｘ_１０ＤＹＡＦＤＦ（配列番号５２）（ここで、Ｘ_８はＤ又はＨから選択され、Ｘ_９はＳ又はＨから選択され、Ｘ_１０はＨ又はＮから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ３、
及び／又は、
（ｂ）以下の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）ＱＤＩＸ_１１Ｘ_１２Ｓ（配列番号５３）（ここで、Ｘ_１１はＳ又はＨから選択され、Ｘ_１２はＳ、Ｙ又はＨから選択される）の配列を有するＬＣＤＲ１、
（ｖ）ＹＡＮ（配列番号１２）の配列を有するＬＣＤＲ２、及び、
（ｖｉ）ＱＱＹＨＸ_１３ＬＰＬＴ（配列番号５４）（ここで、Ｘ_１３はＳ又はＹから選択される）の配列を有するＬＣＤＲ３、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）以下の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号８、１４、１７、２０から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９、１５、２１、１８から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）配列番号１０、１６、２２から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ３、
及び／又は、
（ｂ）以下の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）配列番号１１、１９、２３から選択される配列から構成されるＬＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１２に示される配列から構成されるＬＣＤＲ２、及び、
（ｖｉ）配列番号１３に示される配列から構成されるＬＣＤＲ３、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、Ｘ_１はＴ又はＨから選択され、Ｘ_２はＳから選択され、Ｘ_３はＳから選択され、Ｘ_４はＰ又はＳから選択され、Ｘ_５はＧから選択され、Ｘ_６はＴ又はＨから選択され、Ｘ_７はＹ又はＨから選択され、Ｘ_８はＤ又はＨから選択され、Ｘ_９はＳ又はＨから選択され、Ｘ_１０はＨ又はＮから選択され、Ｘ_１１はＳから選択され、Ｘ_１２はＳ又はＹから選択され、Ｘ_１３はＹから選択される。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）以下の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号８、２０から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９、２１から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）配列番号１０、２２から選択される配列から構成されるＨＣＤＲ３、
及び／又は、
（ｂ）以下の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）配列番号１１、２３から選択される配列から構成されるＬＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１２に示される配列から構成されるＬＣＤＲ２、及び、
（ｖｉ）配列番号１３に示される配列から構成されるＬＣＤＲ３、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（１）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号８に示されるＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
（２）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
（３）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号２０に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるＨＣＤＲ２、配列番号２２に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号２３に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、又は、
（４）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１７に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１９に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（例えば、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれるフレームワーク領域）を更に含み、該フレームワーク領域は、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の復帰突然変異を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト重鎖生殖細胞系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれる重鎖フレームワーク領域、及び／又はヒト軽鎖生殖細胞系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれる軽鎖フレームワーク領域を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩＧＨＶ４－４^＊０８によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）に含まれる重鎖フレームワーク領域及びＩＧＫＶ１－３９^＊０１によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５６）に含まれる軽鎖フレームワーク領域を含み、該重鎖フレームワーク領域及び／又は該軽鎖フレームワーク領域は、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の復帰突然変異を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨは、配列番号２４に示されるＶＨ ＦＲ１、配列番号２５に示されるＶＨ ＦＲ２、配列番号２６に示されるＶＨ ＦＲ３及び配列番号２７に示されるＶＨ ＦＲ４を含む。

幾つかの実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＬは、配列番号２８に示されるＶＬ ＦＲ１、配列番号２９に示されるＶＬ ＦＲ２、配列番号３０に示されるＶＬ ＦＲ３及び配列番号３１に示されるＶＬ ＦＲ４を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号１、３、４及び６のいずれか１つに示される配列、
（ｉｉ）配列番号１、３、４、６のいずれか１つに示される配列と比較して１個若しくは幾つかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は、
（ｉｉｉ）配列番号１、３、４、６のいずれか１つに示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
並びに、
（ｂ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）配列番号２、５及び７のいずれか１つに示される配列、
（ｖ）配列番号２、５、７のいずれか１つに示される配列と比較して１個若しくは幾つかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は、
（ｖｉ）配列番号２、５、７のいずれか１つに示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される置換は、保存的置換である。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号１に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
（２）配列番号３に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
（３）配列番号４に示される配列を有するＶＨ及び配列番号５に示される配列を有するＶＬ、又は、
（４）配列番号６に示される配列を有するＶＨ及び配列番号７に示される配列を有するＶＬ、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を更に含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖は、ヒト免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）に由来する重鎖定常領域を含み、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖は、ヒト免疫グロブリン（例えばκ又はλ）に由来する軽鎖定常領域を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）若しくはその変異体であって、該変異体が、それが由来する野生型配列と比較して１個以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、若しくはそれらの任意の組合せ（例えば、多くとも２０個、多くとも１５個、多くとも１０個若しくは多くとも５個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、又はそれらの任意の組合せ；例えば１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、又はそれらの任意の組合せ）を有する、及び／又は、
（ｂ）ヒト免疫グロブリンの軽鎖定常領域（ＣＬ）若しくはその変異体であって、該変異体が、それが由来する野生型配列と比較して１個以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、若しくはそれらの任意の組合せ（例えば、多くとも２０個、多くとも１５個、多くとも１０個若しくは多くとも５個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、又はそれらの任意の組合せ；例えば１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸の置換、欠失若しくは付加、又はそれらの任意の組合せ）を有する、
を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含む。或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５７に示される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。

或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）の変異体を含み、該変異体は、ｈＦｃＲｎ又はｍＦｃγＲＩＩに対して中性ｐＨ（例えばｐＨ７．４）で、それが由来する野生型配列と比較して増強された親和性を有する。かかる実施の形態においては、変異体は概して、それが由来する野生型配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸の置換を有する。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の変異体を含み、該変異体が、それが由来する野生型配列と比較して以下の置換：（ｉ）Ｍ２５２Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ４３４Ｙ、又は（ｉｉ）Ｋ３２６Ｄ、Ｌ３２８Ｙを有し、ここで、上述のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う位置である。或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７又は４８に示される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。

或る特定の実施の形態においては、軽鎖定常領域はκ軽鎖定常領域である。或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５８に示される軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。

或る特定の実施の形態においては、抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（１）配列番号１に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（２）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（３）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（４）配列番号３に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（５）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（６）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（７）配列番号４に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（８）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（９）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（１０）配列番号６に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（１１）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、又は、
（１２）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
を含む。

抗体の作製
本発明の抗体は、当該技術分野で既知の様々な方法によって作製することができ、例えば遺伝子工学的組み換え技術によって得ることができる。例えば、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、化学合成又はＰＣＲ増幅によって得られる。得られたＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入した後、宿主細胞にトランスフェクトする。次いで、トランスフェクトされた宿主細胞を特定の条件下で培養し、本発明の抗体を発現させる。

本発明の抗原結合フラグメントは、完全な抗体分子を加水分解することによって得ることができる（Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照されたい）。加えて、これらの抗原結合フラグメントは、組み換え宿主細胞によって直接産生させることもできる（Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999)、Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)に概説される）。例えば、Ｆａｂ’フラグメントを宿主細胞から直接得ることができ、Ｆａｂ’フラグメントを化学的に結合して、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを形成することができる（Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)）。加えて、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２フラグメントを組み換え宿主細胞培養培地から直接単離することもできる。当業者は、これらの抗原結合フラグメントを作製する他の手法を十分認識している。

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。或る特定の好ましい実施の形態においては、単離核酸分子は、本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする。

別の態様において、本発明は、本発明の単離核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）を提供する。或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明のベクターは、例えばプラスミド、コスミド、バクテリオファージ等である。

別の態様において、本発明は、本発明の単離核酸分子又は本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。かかる宿主細胞としては、大腸菌（E. coli）細胞等の原核細胞、並びに酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例えばマウス細胞、ヒト細胞等の哺乳動物細胞等）等の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の好ましい実施の形態においては、本発明の宿主細胞は、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ ＤＧ４４）等の哺乳動物細胞である。

別の態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞培養物から抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することとを含む、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法が提供される。

誘導抗体
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば別の分子（例えば、別のポリペプチド又はタンパク質）に連結して誘導体化することができる。概して、抗体又はその抗原結合フラグメントの誘導体化（例えば標識化）は、ＨＢｓＡｇとの結合に悪影響を与えない。したがって、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、かかる誘導体化形態を含むことも意図される。例えば、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、別の抗体（例えば、二重特異性抗体を形成するため）、検出試薬、医薬試薬、及び／又は抗体若しくは抗原結合フラグメントと別の分子（例えば、アビジン又はポリヒスチジンタグ）との結合を媒介することが可能なタンパク質若しくはポリペプチド等の１つ以上の他の分子群と機能的に連結することができる（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合又は他の手段による）。

したがって、或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは標識されている。幾つかの実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、酵素、放射性核種、蛍光色素、発光性物質（例えば化学発光物質）又はビオチン等の検出可能な標識を有する。本発明の検出可能な標識は、蛍光、分光法、光化学、生化学、免疫学、電気的、光学的又は化学的手段によって検出することができる任意の物質であり得る。かかる標識は、当該技術分野で既知であり、その例としては、酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等）、放射性核種（例えば^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ又は^３２Ｐ）、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、テキサスレッド、ローダミン、量子ドット又はシアニン染料誘導体（例えばＣｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０））、発光性物質（例えば、アクリジンエステル化合物等の化学発光物質）、磁性ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、コロイド金又は着色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、等）ビーズ等の熱量測定マーカー、及び上述のマーカーで修飾されたアビジン（例えばストレプトアビジン）をライゲートするために使用されるビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。或る特定の実施の形態においては、かかる標識は、免疫学的検出（例えば酵素結合免疫測定、放射免疫測定、蛍光免疫測定、化学発光免疫測定等）に適したものであり得る。或る特定の実施の形態においては、潜在的な立体障害を低減するために、上記の検出可能な標識を異なる長さのリンカーによって本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントにライゲートしてもよい。

医薬組成物及び治療用途
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）を予防又は治療するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染又は慢性Ｂ型肝炎の患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するために使用することができる。

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、付加的な薬学的活性剤を含んでいてもよい。或る特定の実施の形態においては、付加的な薬学的活性剤は、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）の予防又は治療に使用される薬物、例えばインターフェロン又はペグ化インターフェロン等のインターフェロン薬である。

別の態様において、本発明は、被験体におけるＨＢＶ感染（例えばヒト）若しくはＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）の予防及び／又は治療のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、及び／又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染又は慢性Ｂ型肝炎の患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するための薬剤の製造への本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。

別の態様において、本発明は、本発明による抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明による医薬組成物を、それを必要とする被験体に有効量投与することを含む、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ感染若しくはＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）を予防若しくは治療し、ｉｎ ｖｉｖｏ若しくは被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和し、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させ、及び／又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染又は慢性Ｂ型肝炎の患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化する方法を提供する。

本発明によって提供される薬物及び医薬組成物は、単独又は組合せで使用することができ、他の薬学的活性剤（例えば他の抗ウイルス剤、例えばインターフェロン又はペグ化インターフェロン等のインターフェロン薬）と組み合わせて使用することもできる。

本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物は、経口、口腔内、舌下、眼内、局所、非経口、直腸、髄腔内、小胞体内（intracytoplasmic reticulum）、鼠径部、膀胱内、局所（例えば粉末、軟膏又は点滴剤）、又は経鼻経路を含むが、これらに限定されない従来の投与経路によって投与することができる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、当該技術分野で既知の様々な方法によって投与することができる。しかしながら、多くの治療用途について好ましい投与経路／投与方法は、非経口投与（例えば静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射）である。当業者であれば、投与経路及び／又は投与方法が意図される目的に応じて異なることを理解するはずである。好ましい実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、静脈内注入又は注射によって投与される。

本発明の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は本発明の医薬組成物は、様々な剤形、例えば液体、半固体及び固体形態、例えば溶液（例えば注射剤）、分散液又は懸濁液、錠剤、粉末、顆粒、エマルション、丸薬、シロップ、粉末、リポソーム、カプセル及び坐剤に製剤化することができる。好ましい剤形は、意図される投与方法及び治療用途によって異なる。

例えば、好ましい剤形の１つは注射剤である。かかる注射剤は、滅菌注射液であってもよい。例えば、滅菌注射液は、以下の方法によって調製することができる：必要量の本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントを好適な溶媒に組み込み、任意に他の期待される成分（ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤又はそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない）を同時に組み込んだ後、濾過減菌を行う。加えて、滅菌注射液は、簡便な保存及び使用のために滅菌粉末に調製することができる（例えば、真空乾燥又は凍結乾燥による）。かかる滅菌粉末を使用前に滅菌パイロジェンフリー水等の好適なビヒクルに分散させることができる。

別の好ましい剤形は、分散液である。分散液は、以下の方法によって調製することができる：本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントを、基本分散媒及び任意に他の期待される成分（ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、等張剤、防腐剤、希釈剤又はそれらの任意の組合せを含むが、これらに限定されない）を含む滅菌ビヒクルに組み込む。加えて、期待される薬物動態特性を得るために、モノステアリン酸塩及びゼラチン等の吸収遅延剤を分散液に組み込んでもよい。

別の好ましい剤形は、カプセル、錠剤、粉末、顆粒等を含む経口固形剤形である。かかる固形剤形は概して、（ａ）クエン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム等の不活性の薬物賦形剤（又はビヒクル）、（ｂ）デンプン、ラクトース、スクロース、マンノース及びケイ酸等の充填剤、（ｃ）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及びアラビアゴム等の結合剤、（ｄ）グリセロール等の湿潤剤、（ｅ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン等の崩壊剤、（ｆ）オレフィン等の遅延剤、（ｇ）第四級アンモニウム化合物等の吸収促進剤、（ｈ）セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセリル等の保湿剤、（ｉ）カオリン及びベントナイト等の吸着剤、（ｊ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ドデシル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つを含む。錠剤及びカプセルの剤形の場合、緩衝剤が含まれることもある。

加えて、放出調節又はパルス放出剤形を得るために、放出速度調整剤（すなわち、薬物放出速度を変化させることが可能な作用物質）を経口固形剤形に添加してもよい。かかる放出速度調整剤としては、カルボキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース、ポリエチレンオキシド、キサンタンガム、イソアクリル（isoacrylic）アミノコポリマー、水素添加芳香油、カルナウバワックス、パラフィン、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー又はそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。放出調節又はパルス放出剤形は、１つ又は一群の放出速度調整剤を含み得る。

別の好ましい剤形は、エマルション、溶液、懸濁液、シロップ等を含む経口液体剤形である。かかる経口液体剤形は、活性成分に加えて、当該技術分野で一般に使用される不活性溶媒、例えば水又は他の溶媒、例えばエチルアルコール、イソプロパノール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、油（綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、オリーブ油、芳香油及びゴマ油等）、グリセロール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル及びそれらの任意の組合せを更に含み得る。かかる経口液体剤形は、これらの不活性溶媒に加えて、保湿剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、香料等を更に含み得る。

加えて、本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、簡便な投与のために医薬組成物中の単位剤形で存在していてもよい。本発明による医薬組成物は、滅菌されており、製造条件及び保存条件下で安定しているのが望ましい。

本発明において提供される薬剤及び医薬組成物は、単独若しくは組合せで使用することができ、又は付加的な薬学的活性剤（例えば、他の抗ウイルス剤、例えばインターフェロン又はペグ化インターフェロン等のインターフェロン型剤）と組み合わせて使用してもよい。幾つかの好ましい実施の形態においては、本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＢＶ感染に関連する疾患を予防及び／又は治療するために他の抗ウイルス剤（複数の場合もある）と組み合わせて使用される。本発明による抗体又はその抗原結合フラグメント及びかかる抗ウイルス剤（複数の場合もある）は同時、別個又は順次に投与することができる。かかる抗ウイルス剤（複数の場合もある）としては、インターフェロン型剤、リバビリン、アダマンタン、ヒドロキシウレア、ＩＬ－２、Ｌ－１２及びペンタカルボキシサイトゾル酸等が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による医薬組成物は、「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。「予防有効量」は、疾患（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患等）を予防するか、抑制するか、又はその進行を遅らせるのに十分な量を指す。「治療有効量」は、疾患を有する患者において疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑制するのに十分な量を指す。本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量は、以下の要因：治療すべき疾患の重症度、患者の免疫系の全体的な状態、年齢、体重及び性別等の患者の一般条件、薬物の投与方法、同時に用いられる付加的な療法等に応じて異なる場合がある。

投与計画は、最適な所望の効果（例えば、治療効果又は予防効果）が得られるように調整することができる。例えば、単回投与を行っても、又は一定期間内に複数回投与を行っても、又は治療状況の要件によって指定されるように用量を比例的に減少若しくは増加させてもよい。

本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントについて、治療有効量又は予防有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇである。治療すべき疾患のタイプ及び重症度に応じて用量が変わり得ることに注目すべきである。加えて、任意の特定の患者について、患者のニーズ及び医師による専門的な評価に応じて特定の投与計画を経時的に調整する必要があり、本明細書に提示される用量範囲が、本発明による医薬組成物の用途又は範囲を定義するのではなく、例示目的でのみ与えられることが当業者には理解される。

キット及び検出用途
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＨＢｓＡｇに特異的に結合することができるため、サンプル中のＨＢｓＡｇの存在又はレベルの検出に使用することができる。

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットを提供する。幾つかの実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を有する。他の実施の形態においては、キットは、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを特異的に認識する第２の抗体を更に含む。第２の抗体が検出可能な標識を更に含むのが好ましい。かかる検出可能な標識は、当業者に既知であり、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色物質及び酵素（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）等が含まれるが、これらに限定されない。

別の態様において、本発明は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することを含む、サンプル中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出する方法を提供する。幾つかの実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を更に含む。他の実施の形態においては、方法は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを検出するために検出可能な標識を有する第２の抗体を使用することを更に含む。方法を診断目的又は非診断目的（例えば、サンプルが患者に由来するサンプルではなく、細胞サンプルである）で用いることができる。

幾つかの実施の形態においては、方法は、（１）サンプルと本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントとを接触させることと、（２）抗体若しくはその抗原結合フラグメントとＨＢｓＡｇタンパク質との間の複合体の形成を検出するか、又は複合体の量を検出することとを含む。複合体の形成は、ＨＢｓＡｇタンパク質及び／又はＨＢＶの存在を示す。

別の態様において、本発明は、被験体に由来するサンプル中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在を検出するために本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することを含む、被験体がＨＢＶに感染しているかを診断する方法を提供する。幾つかの実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、検出可能な標識を更に含む。他の実施の形態においては、方法は、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを検出するために検出可能な標識を有する第２の抗体を使用することを更に含む。

別の態様において、サンプル中のＨＢｓＡｇタンパク質の存在又はレベルを検出するため、又は被験体がＨＢＶに感染しているかを診断するためのキットの製造への本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が提供される。

用語の定義
本発明において、他に規定のない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、細胞培養、生化学、核酸化学、免疫学の研究室及び本書において用いられる他の操作工程は全て、対応する分野において広く用いられる日常的な工程である。加えて、本発明をより良好に理解するために、関連用語の定義及び説明を下に提示する。

本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、通例、２対のポリペプチド鎖から構成され、各対が軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を有する免疫グロブリン分子を指す。抗体軽鎖は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）軽鎖に分類することができる。重鎖はμ、δ、γ、α又はεに分類され、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義される。軽鎖及び重鎖において、可変領域及び定常領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約３アミノ酸以上の「Ｄ」領域も含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は、ドメインＣＬから構成される。定常ドメインは、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合の媒介等の様々なエフェクター機能を示す。また、ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的保存された領域が組み入れられた超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に細分することができる。ＶＨ及びＶＬは各々、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。各重鎖／軽鎖対の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ抗原結合部位を形成する。各領域又はドメインにおけるアミノ酸の割当ては、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))又はChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196 :901-917、Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883の定義に従うものであり得る。

本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合に関与する抗体の可変領域中のアミノ酸残基を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々がＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と名付けられた３つのＣＤＲを含む。これらのＣＤＲの正確な境界は、当該技術分野で既知の様々なナンバリングシステム、例えばＫａｂａｔナンバリングシステム（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム（Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917、Chothia et al. (1989) Nature 342:878-883）又はＩＭＧＴナンバリングシステム（Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003）に従って定義することができる。所与の抗体について、各ナンバリングシステムによって定義されたＣＤＲが当業者には容易に特定される。さらに、異なるナンバリングシステム間の対応は、当業者には既知である（例えば、Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27:55-77, 2003を参照されたい）。

本発明において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれるＣＤＲは、当該技術分野で既知の様々なナンバリングシステムに従って決定することができる。或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＩＭＧＴナンバリングシステムによって決定されることが好ましい。或る特定の実施の形態においては、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントに含まれるＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによって決定されることが好ましい。

本明細書において使用される場合、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基という用語は、上で定義されたＣＤＲ残基以外の抗体の可変領域中のアミノ酸残基を指す。

「抗体」という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法によって限定されない。例えば、組み換え抗体、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。抗体は種々のアイソタイプの抗体、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ抗体であり得る。

本明細書において使用される場合、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、完全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を保持し、及び／又は抗原に特異的に結合するために完全長抗体と競合する、完全長抗体のフラグメントを含むポリペプチドを指し、「抗原結合部分」とも呼ばれる。概して、Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989)（その全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。抗体の抗原結合フラグメントは、組み換えＤＮＡ技術又は無傷抗体の酵素的若しくは化学的切断によって作製することができる。抗原結合フラグメントの非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、シングルドメイン抗体、キメラ抗体、線状抗体、ナノボディ（Domantisの技術）、プロボディ（probody）、及びポリペプチドに対して特異的な抗原結合能を与えるのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドが挙げられる。改変抗体変異体は、Holliger et al., 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136に概説されている。

本明細書において使用される場合、「完全長抗体」という用語は、２つの「完全長重鎖」及び２つの「完全長軽鎖」から構成される抗体を指す。「完全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に重鎖可変領域（ＶＨ）、重鎖定常領域ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域（ＨＲ）、重鎖定常領域ＣＨ２ドメイン及び重鎖定常領域ＣＨ３ドメインから構成されるポリペプチドを指す。また、完全長抗体がＩｇＥアイソタイプである場合、任意に重鎖定常領域ＣＨ４ドメインも含まれる。「完全長重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向にＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３から構成されるポリペプチド鎖であるのが好ましい。「完全長軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成されるポリペプチド鎖である。２対の完全長抗体鎖は、ＣＬとＣＨ１との間のジスルフィド結合及び２つの完全長重鎖のＨＲの間のジスルフィド結合によって連結される。本発明の完全長抗体は、ヒト等の単一種に由来していても、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。本発明の完全長抗体は、それぞれＶＨ及びＶＬ対によって形成される２つの抗原結合部位を含み、２つの抗原結合部位が同じ抗原を特異的に認識／結合する。

本明細書において使用される場合、「Ｆｄ」という用語は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成される抗体フラグメントを指す。「ｄＡｂフラグメント」という用語は、ＶＨドメインから構成される抗体フラグメントを指す（Ward et al., Nature 341:544 546 (1989)）。「Ｆａｂフラグメント」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される抗体フラグメントを指す。「Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント」という用語は、ヒンジ領域上のジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントから構成される抗体フラグメントを指す。「Ｆａｂ’フラグメント」という用語は、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント中の２つの重鎖フラグメントを連結するジスルフィド結合を還元することによって得られたフラグメントを指し、無傷軽鎖と重鎖のＦｄフラグメント（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる）とから構成される。

本明細書において使用される場合、「Ｆｖ」という用語は、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから構成される抗体フラグメントを指す。Ｆｖフラグメントは概して、完全な抗原結合部位を形成することができる最小の抗体フラグメントとみなされる。一般に、６つのＣＤＲによって抗体に抗原結合特異性が与えられると考えられている。しかしながら、親和性が完全な結合部位よりも低い可能性があるが、１つの可変領域（例えば、３つの抗原特異的ＣＤＲしか含まないＦｄフラグメント）であっても抗原を認識及び結合することができる。

本明細書において使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、抗体の第１の重鎖の第２、第３の定常領域と第２の重鎖の第２、第３の定常領域とをジスルフィド結合によって連結することで形成された抗体フラグメントを指す。抗体のＦｃフラグメントは、多くの異なる機能を有するが、抗原結合には関与しない。

本明細書において使用される場合、「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＬ及びＶＨドメインを含み、ＶＬ及びＶＨがリンカーによって連結された単一のポリペプチド鎖を指す（例えば、Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)、及びPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Roseburg and Moore eds, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい）。かかるｓｃＦｖ分子は、全体構造：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有し得る。好適な従来技術のリンカーは、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はその変異体からなる。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）_４を有するリンカーを使用することができるが、その変異体を使用してもよい（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448）。本発明において使用することができる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731、Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56及びRoovers et al. (2001), Cancer Immunolに記載されている。場合によっては、ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬの間にもジスルフィド結合が存在し得る。

本明細書において使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現しているが、使用されるリンカーが、同じ鎖の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるため、１つのドメインが別の鎖の相補的なドメインと強制的に対合し、２つの抗原結合部位が生成することを指す（例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)及びPoljak RJ et al., Structure 2:1121-1123 (1994)を参照されたい）。

上述の抗体フラグメントは各々、完全長抗体が結合する同じ抗原に特異的に結合する能力を維持し、及び／又は抗原に特異的に結合するために完全長抗体と競合する。

当業者に既知の従来の手法（例えば、組み換えＤＮＡ技術又は酵素的若しくは化学的断片化）を用いて、所与の抗体（例えば、本発明によって提供される抗体）から抗体の抗原結合フラグメント（例えば、上述の抗体フラグメント）を得ることができ、無傷抗体をスクリーニングするのと同じ方法で特異性についてスクリーニングすることができる。

本明細書において、文脈上明らかに他の指示がない限り、「抗体」という用語に言及する場合、完全な抗体だけでなく、抗体の抗原結合フラグメントも含まれる。

本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」、「ＭｃＡｂ」及び「ｍＡｂ」という用語は、同じ意味を有し、区別なく使用することができる。この用語は、高度の相同性を示す抗体分子の集団、すなわち自発的に生じる可能性がある自然突然変異を除いて完全に同一の抗体分子の集団からの抗体又は抗体のフラグメントを指す。モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープに対して高い特異性を有する。ポリクローナル抗体は概して、モノクローナル抗体と比べて、概して抗原上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つ以上の異なる抗体を含む。加えて、「モノクローナル」という修飾語は、抗体の高度に均一な集団から得られる抗体の特徴を示すにすぎず、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈すべきではない。

本明細書において使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、軽鎖又は／及び重鎖の一部が或る抗体（特定の種に由来していても、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属していてもよい）に由来し、軽鎖又は／及び重鎖の別の部分が別の抗体（同じ若しくは異なる種に由来していても、又は同じ若しくは異なる抗体クラス若しくはサブクラスに属していてもよい）に由来する抗体を指すが、いずれの場合も依然として標的抗原に対する結合活性を保持する（Cabilly et al.に対する米国特許第４，８１６，５６７号、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 6855 (1984)）。例えば、「キメラ抗体」という用語は、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が第１の抗体（例えばマウス抗体）に由来し、抗体の重鎖及び軽鎖定常領域が第２の抗体（例えばヒト抗体）に由来する抗体（例えば、ヒト－マウスキメラ抗体）を含む場合がある。キメラ抗体を作製するためには、当該技術分野で既知の方法を用いて、免疫動物の免疫グロブリン可変領域をヒト免疫グロブリン定常領域に連結することができる（例えば、Cabilly et al.に対する米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。例えば、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結して、完全長重鎖遺伝子を得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、概してＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域であるのが好ましい。例えば、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に操作可能に連結して、完全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）を得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得るが、概してκ定常領域であるのが好ましい。

本明細書において使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体の配列との相同性を高めるためにアミノ酸配列が修飾された、遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。概して、ヒト化抗体のＣＤＲ領域の全部又は一部が非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）の全部又は一部がヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）に由来する。幾つかの実施の形態においては、ヒト化抗体のＣＤＲ領域が非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）の全部又は一部がヒト免疫グロブリン（レセプター抗体）に由来する。ヒト化抗体は概して、抗原特異性、親和性、反応性等を含むが、これらに限定されない、ドナー抗体の期待される特性を保持する。ドナー抗体は、所望の特性（例えば抗原特異性、親和性、反応性等）を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）抗体であり得る。ヒト化抗体を作製するためには、当該技術分野で既知の方法を用いて、免疫動物のＣＤＲ領域をヒトフレームワーク配列に挿入することができる（Winterに対する米国特許第５，２２５，５３９号；Queen et al.に対する米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号及び同第６，１８０，３７０号；並びにLo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004を参照されたい）。

本明細書において使用される場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「生殖細胞系列抗体遺伝子セグメント」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現について遺伝子再配列及び突然変異を引き起こす可能性がある成熟プロセスを経ていない、免疫グロブリンをコードする生物のゲノム中に存在する配列を指す。本発明において、「重鎖生殖細胞系列遺伝子」という表現は、Ｖ遺伝子（可変）、Ｄ遺伝子（多様性）、Ｊ遺伝子（接合）及びＣ遺伝子（定常）を含む、免疫グロブリン重鎖をコードする生殖細胞系列抗体遺伝子又は遺伝子フラグメントを指す。同様に、「軽鎖生殖細胞系列遺伝子」という表現は、Ｖ遺伝子（可変）、Ｊ遺伝子（接合）及びＣ遺伝子（定常）を含む、免疫グロブリン軽鎖をコードする生殖細胞系列抗体遺伝子又は遺伝子フラグメントを指す。本発明において、生殖細胞系列抗体遺伝子又は生殖細胞系列抗体遺伝子フラグメントによってコードされるアミノ酸配列は、「生殖細胞系列配列」とも称される。生殖細胞系列抗体遺伝子又は生殖細胞系列抗体遺伝子フラグメント及びそれらの対応する生殖細胞系列配列は、当業者に既知であり、専門データベース（例えば、ＩＭＧＴ、ｕｎｓｗａｇ、ＮＣＢＩ又はＶＢＡＳＥ２）から取得又は検索することができる。

本明細書において使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体とそれが対象とする抗原との間の反応等の２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。特異的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって表すことができる。本発明において、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指し、抗体と抗原との間の結合親和性を説明するために用いられる。平衡解離定数が小さいほど、抗体－抗原結合が強力となり、抗体と抗原との間の親和性が高くなる。２つの分子間の特異的結合特性は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えばＢＩＡＣＯＲＥ機器の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定することができる。

本明細書において使用される場合、「酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性で結合する」という表現又は「ｐＨ依存結合」という同等の表現は、本発明の抗体の酸性ｐＨでのＨＢｓＡｇへの結合についてのＫ_Ｄ値又はＥＣ５０値が、中性ｐＨでのＨＢｓＡｇへの結合についてのＫ_Ｄ値又はＥＣ５０値よりも高いことを指す。Ｋ_Ｄは、当該技術分野で既知の手法、例えばＳＰＲ法（例えばＢｉａｃｏｒｅ）によって測定することができる。本発明において、「ＥＣ５０」という用語は、抗体－抗原半数影響濃度（half maximum effect concentration）、すなわち、特定の抗体－抗原間の最大結合効果の５０％に達するのに必要とされる抗体濃度を指し、抗体と抗原との間の結合能を説明するために用いられる。ＥＣ５０が小さいほど、抗体と抗原との間の結合能が高くなる。抗体－抗原半数影響濃度（ＥＣ５０）は、当該技術分野で既知の方法を用いて、例えば抗原を固相担体に結合させ、抗体を抗原に特異的に結合させる酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて決定することができる。

本明細書において使用される場合、「中和抗体」は、標的ウイルスの毒性（例えば、細胞に感染する能力）を大幅に低下させるか、又は完全に阻害することができる抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。概して、中和抗体は、標的ウイルスを認識及び結合し、標的ウイルスが被験体の細胞に侵入／感染するのを防ぐことができる。本発明の抗体は、中和抗体である。

しかしながら、本願においては、抗体のウイルス中和能が抗体のウイルス除去能と全く同等というわけではないことを理解すべきである。本明細書において使用される場合、「ウイルスを中和する」とは、標的ウイルスが被験体の細胞に侵入／感染するのを阻害することによって標的ウイルスの毒性を中和する（すなわち、標的ウイルスの毒性を大幅に低下させるか、又は完全に阻害する）ことを意味する。本明細書において使用される場合、「ウイルスを除去する」とは、標的ウイルス（細胞に感染しているか否かを問わない）が生物から除去されることで、生物がウイルスに感染する前の状態に変わる（例えば、ウイルスの血清学的検査の結果が陰性になる）ことを意味する。したがって、概して、中和抗体は、必ずしもウイルス除去能を有するわけではない。しかしながら、本願においては、本発明者は驚くべきことに、本発明による抗体がＨＢＶを中和するだけでなく、ウイルスを除去することもでき（すなわち、ＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇをｉｎ ｖｉｖｏで除去し、ＨＢＶ及びＨＢＶ感染細胞をｉｎ ｖｉｖｏで除去することができる）、したがって重要な臨床的価値を有することを見出した。

本明細書において使用される場合、「単離された」という用語は、人工的な手段によって自然状態から得られた状態を指す。或る特定の「単離された」物質又は成分が天然に存在する場合、これは自然環境が変化するか、若しくは物質が自然環境から単離されたか、又はその両方であることから可能である。例えば、或る特定の単離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドが或る特定の生きている動物の体内に自然に存在する場合、かかる自然状態から高純度で単離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、混入した人工又は合成物質も、単離された物質の活性に影響を及ぼさない他の不純物も排除するものではない。

本明細書において使用される場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸ビヒクルを指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、このベクターは、発現ベクターと称される。ベクターは、ベクターによって運ばれる遺伝物質の要素が宿主細胞において発現され得るように形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞に導入することができる。ベクターは当業者に既知であり、プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体；λファージ又はＭ１３ファージ等のバクテリオファージ、及び動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。ベクターとして使用することができる動物ウイルスとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素及びレポーター遺伝子を含むが、これらに限定されない、発現を制御する様々な要素を含み得る。加えて、ベクターは複製開始部位を含み得る。

本明細書において使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入することができる細胞を指し、大腸菌（Escherichia coli）若しくは枯草菌（Bacillus subtilis）等の原核細胞、酵母細胞若しくはアスペルギルス等の真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ細胞若しくはＳｆ９等の昆虫細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞若しくはヒト細胞等の動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較される２つの配列が、或る特定の部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が或る特定の部位にアデニンを有するか、又は２つのポリペプチドの各々が或る特定の部位にリジンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較される部位の総数に対する２つの配列で共通する同一の部位の数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位のうち６個が一致している場合、これら２つの配列は、６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を有する（６個の部位のうち３個が一致している）。概して、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。かかるアラインメントは、Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.）等のコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いて決定することもできる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))のアルゴリズムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用い、ギャップ重量１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を用いて決定することができる。

本明細書に関わる２０個の従来のアミノ酸は、日常的な方法で表される。例えば、Immunology-A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))（引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。本開示においては、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、同じ意味を有し、区別なく使用される。また、本開示においては、アミノ酸は概して、当該技術分野で既知の１文字及び３文字の略号によって表される。例えば、アラニンはＡ又はＡｌａによって表すことができる。加えて、本明細書において使用される場合、「モノクローナル抗体」及び「ＭｃＡｂ」という用語は、同じ意味を有し、区別なく使用され得る。「ポリクローナル抗体」及び「ＰｃＡｂ」という用語は、同じ意味を有し、区別なく使用され得る。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤」という用語は、当該技術分野で既知の被験体及び活性物質に薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照されたい）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧制御剤、吸収遅延剤及び防腐剤を含むが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤としては、リン酸緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤としては、陽イオン、陰イオン又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０が挙げられるが、これらに限定されない。イオン強度増強剤としては、塩化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤としては、パラベン、クロロブタノール、フェノール及びソルビン酸等の様々な抗菌剤及び抗真菌剤が挙げられるが、これらに限定されない。浸透圧制御剤としては、糖、ＮａＣｌ及びそれらの類似体が挙げられるが、これらに限定されない。吸収遅延剤としては、モノステアレート及びゼラチンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において使用される場合、「予防／予防する」という用語は、被験体における疾患、障害又は症状（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患等）の発症を抑制するか又は遅らせるために行われる方法を指す。本明細書において使用される場合、「治療／治療する」という用語は、有益な又は所望の臨床転帰を得るために行われる方法を指す。本発明の目的上、有益な又は所望の臨床転帰としては、検出可能であるか又は検出可能でないかを問わず、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の進行の遅延又は減速、並びに症状の軽減（部分的又は完全のいずれも）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「治療」は、期待される生存期間（治療が認められない場合）と比較した生存期間の延長も指す。本願においては、本発明による抗体は、ＨＢＶを中和する能力を有し、したがって罹患していない被験体又はその細胞をＨＢＶによる感染から予防／保護するために使用することができる。加えて、本発明による抗体は、ＨＢＶを除去する能力を有し（すなわち、ＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇをｉｎ ｖｉｖｏで除去し、ＨＢＶ及びＨＢＶに感染した細胞をｉｎ ｖｉｖｏで除去することができる）、したがって感染被験体においてＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患を治療するために使用することができる。

本明細書において使用される場合、「被験体」という用語は、霊長類哺乳動物、例えばヒト等の哺乳動物を指す。

本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、期待される効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量を指す。例えば、疾患（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患等）の予防に効果的な量は、疾患（ＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染と関連する疾患等）の発症を予防、抑制又は遅延させるのに効果的な量を指す。疾患の治療に効果的な量は、疾患を有する患者において疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に阻止するのに効果的な量を指す。かかる有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。例えば、治療用途に効果的な量は、治療すべき疾患の重症度、患者の免疫系の全体的な状態、年齢、体重及び性別等の患者の一般条件、薬物の投与方法、同時に用いられる付加的な療法等に応じて異なる。

本発明の有益な効果
本発明の抗体は、ＨＢｓＡｇを特異的に認識／結合することができ、ＨＢＶの毒性を中和することができ、被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることができ、体内のＨＢＶ及びＨＢＶ感染細胞を効果的に除去することができるだけでなく、大幅に向上した抗原クリアランス効果及び抗原抑制時間を有する。特に驚くべきことに、慢性Ｂ型肝炎患者が、体内の高レベルのＨＢｓＡｇのためにＨＢＶに対して免疫枯渇（寛容）を生じることで感染が長引く傾向があるが、本発明の抗体は、ＨＢＶに対する液性免疫応答を回復するように被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染患者又は慢性Ｂ型肝炎患者）を活性化することで、臨床的治癒率を高めることができることが当該技術分野で既知である。したがって、本発明の抗体は、ＨＢＶ感染及びＨＢＶ感染と関連する疾患（例えばＢ型肝炎）の予防及び治療に特に適している。加えて、本発明の抗体は、ｐＨ依存抗原結合特性を有し、抗体の単一分子が抗原の複数の分子に結合することができるため、投与頻度及び投与量を減少させることもでき、大きな臨床的価値を有する。

本発明の実施形態を添付の図面及び実施例と併せて以下で詳細に説明する。しかしながら、以下の図面及び実施例が本発明を説明するためにのみ用いられ、本発明の範囲を限定するものではないことが当業者には理解される。添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明により、本発明の様々な目的及び有利な態様が当業者に明らかとなる。

ｐＨ依存抗原結合活性を有する抗体の作用原理の概要図である。ヒト血漿はｐＨ約７．４の中性であるが、細胞内環境はｐＨ約６．０の酸性である。ｐＨ依存抗原結合活性を有する抗体は、血漿中の抗原に結合することができ、抗原－抗体複合体が続いて細胞に内在化する。ｐＨ依存抗体は、エンドソームの酸性環境で抗原から解離する。抗原から解離した抗体は、ＦｃＲｎによって捕捉され、細胞外に循環する。細胞外の中性環境においては、ＦｃＲｎが抗体を放出し、血漿中に戻った抗体が再び他の抗原に結合することができるため、抗体のサイクル使用が実現される。 Ｍ１Ｄ可変領域の三次元構造のシミュレーションを示す図である。棒状の構造はＣＤＲ領域を表し、青色はＶＫ ＣＤＲを表し、緑色はＶＨ ＣＤＲを表し、赤色は表面アミノ酸を表す。合計２５個の表面アミノ酸をＣＤＲ領域に見ることができる。 ｓｃＦｖ抗体をコードする組み換えベクター（ｐＣＧＭＴ－ｓｃＦｖ）の概要図である。ここで、ｓｃＦｖ抗体の構造は、ＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨである。 図４Ａ～図４Ｃは、Ｍ１Ｄに由来するｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体及び抗原ＨＢｓＡｇを提示するファージライブラリーのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。図４Ａ：３回目のスクリーニング後のＭ１Ｄに由来するｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体のファージライブラリーについてのｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへの結合の検出結果であり、横座標はファージ抗体番号又は希釈倍率を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、これらの単一クローンが全て強い抗原結合活性を有し、ｐＨ６．０で結合活性が大幅に減少することが示される。図４Ｂ：３回目にｐＨ７．４で高いＯＤ_{（４５０／６３０）}値を有し、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＯＤ_{（４５０／６３０）}値の最も大きい差を示す６つの単一クローンについてのＨＢｓＡｇへのｐＨ依存結合の８つの勾配及び３倍希釈での検出結果であり、横座標は希釈倍率を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、ｐＨ依存抗原結合効果が勾配希釈後により良好に示され、中でもＡ３１－７３が最良の効果を示すことが示される。図４Ｃ：４つの勾配及び５倍希釈を用いた４回目のスクリーニング後のファージｓｃＦｖの２４個の優れた候補についてのＨＢｓＡｇへのｓｃＦｖ抗体ファージのｐＨ依存結合検出の予備的結果であり、横座標は希釈倍率を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、Ａ４１－８、Ａ４２－１２及びＡ４２－２３がＡ３１－７３よりも良好であり、Ａ４４－１及びＡ４４－２０がＡ３１－７３と同等であることが示される。 Ａ３１－７３、Ａ４２－１３、Ａ４２－２３及びＡ４１－８の突然変異部位の概要を示す図である。 実施例２におけるＡ３１－７３、Ａ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８のＨＰＬＣ結果を示す図である。ここで、Ｍ１Ｄ－Ｃ／Ｓは陽性対照であり、Ｍ１Ｄ抗体の異なるバッチを参照し、結果から４つの抗体が単一成分であることが分かる。 実施例３におけるＡ３１－７３、Ａ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８についてのｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへの結合の検出結果を示す図である。ここで、横座標は抗体濃度（Ｌｏｇ１０ ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、４つの抗体が全て中性ｐＨで親抗体と同等の抗原結合活性を維持することができ、いずれもｐＨ６．０の条件下で抗原結合活性が有意に減少し、Ａ３１－７３がＡ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８よりも良好であることが示される。 実施例３のＨＢＶトランスジェニック雌性マウスにおけるＡ３１－７１、Ａ４１－８、Ａ４２－１２及び親Ｍ１Ｄの治療効果の結果を示す図である。図８Ａ：マウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はクリアランス後のマウス血清中のＨＢｓＡｇのレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図８Ｂ：マウス血清中の抗体濃度の変化であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標は抗体濃度（Ｌｏｇ１０ ｎｇ／ｍｌ）を表す。結果から、Ｍ１ＤのＨＢｓＡｇレベルが約１０日後にベースラインまで回復する一方で、本発明者らの修飾抗体が約１５日後にベースラインまで回復することが示される。血清中の抗体濃度に関しては、Ｍ１Ｄが１０日目に最低の抗体濃度を有するのに対し、３つの修飾抗体は、１５日目にも依然として検出することができ、ｐＨ依存修飾抗体が親と同等のＨＢｓＡｇを除去する能力を示し、親よりも長い抗原阻害時間を有し、すなわち、それらのクリアランス効果がより長時間発揮され得ることが示される。 スカベンジャー抗体の作用原理を示す図である。ｐＨ依存抗原結合活性は、細胞内で役割を果たす。このため、細胞侵入の最初の制限要因が破られなければ、その後にｐＨ依存抗原結合特性は適用されず、修飾の利益が大幅に低下する。Ｆｃ領域中のアミノ酸の更なる突然変異によって得られたスカベンジャー抗体は、中性ｐＨでのｈＦｃＲｎ受容体への結合を増強するか、又はＦｃγＲｓ受容体への結合を増強することができる。図９に示されるように、スカベンジャー抗体は、細胞外に位置し、抗原を細胞内に相互に輸送することで抗体半減期を極度に延長し得る「輸送ヘルパー」として作用し、抗原に再び結合することができ、それにより抗原の細胞侵入効率を改善し、クリアランス効率を大幅に改善する。 実施例４における２つの分子Ａ３１－７３及びＡ４１－８のＨＰＬＣ結果を示す図である。ここで、赤色及び緑色は無関連の陽性対照を表す。結果から全ての抗体が単一成分であることが分かる。 実施例４におけるＡ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４についてのｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへの結合の検出結果を示す図である。ここで、横座標は抗体濃度（Ｌｏｇ１０ ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、両方の分子が中性ｐＨで親抗体の抗原結合活性及びｐＨ依存抗原結合活性を維持することができ、ｐＨ依存抗原結合活性が僅かに増強されることが示される。 実施例４におけるＡ３１－７３ Ｖ４及びＡ３１－７３（図１２Ａ）、並びにＡ４１－８ Ｖ４及びＡ４１－８（図１２Ｂ）のＭＤＣＫ細胞上での免疫蛍光結果を示す図である。緑色の蛍光はｈＦｃＲｎを表し、青色の蛍光は核を表し、赤色の蛍光はＨＢｓＡｇを表す。結果から、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４変異体で処理した細胞における抗原蛍光強度がＡ３１－７３及びＡ４１－８で処理した細胞よりも顕著に高く、Ｖ４修飾を有するスカベンジャー抗体がより多くの抗原を細胞内に効率的に輸送し得ることが示される。スカベンジャー抗体におけるＶ４突然変異が中性条件下でのｈＦｃＲｎへの抗体の結合を増強し得ることが確認される。抗原－抗体複合体が細胞内に侵入した後、僅か約６．０の細胞内ｐＨ下で抗原－抗体複合体が解離し、抗体が細胞表面に戻り、再び抗原結合機能を果たす。スカベンジャー抗体が中性条件下でｈＦｃＲｎに結合する能力の増強により、その後のｐＨ依存抗原結合特性が改善し得る。 実施例４の安定したＨＢＶウイルス価を有するｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスにおける２０ｍｇ／ｋｇの用量での尾静脈を介した単回注射による２つのスカベンジャー抗体Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４、Ｍ１Ｄ並びに陰性対照１６Ｇ１２の治療効果を示す図である。図１３Ａ：マウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はマウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランスレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図１３Ｂ：マウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はマウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡのクリアランスレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図１３Ｃ：マウス血清中の抗体濃度の変化であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標は抗体濃度（Ｌｏｇ１０ ｎｇ／ｍｌ）を表す。結果から、スカベンジャー抗体がＭ１Ｄと同等の抗原クリアランス能力を有するが、より長い阻害時間を有することが示される。Ｍ１Ｄが最大の抗原クリアランス効果を発揮した後、抗原が急速に回復を開始し、Ｍ１Ｄが１４日目に失効し始め、血清中のＨＢｓＡｇはベースラインレベル（陰性対照１６Ｇ１２に基づく）まで戻る。しかしながら、２つのスカベンジャー抗体は、最大のクリアランス効果を発揮した後も長時間にわたって低い抗原レベルを維持し、ゆっくりと回復することができる。Ａ４１－８ Ｖ４処理群においては、ＨＢｓＡｇは約３０日でベースラインまで回復する。Ａ３１－７３ Ｖ４は、より良好な性能を示した。予定された実験の終了後も、ＨＢｓＡｇはベースラインレベルまで戻らず、これは血清中の抗体半減期の検出結果と一致する。 実施例４におけるＡ３１－７３ ＤＹのタンパク質ゲルの結果を示す図である。Ｍ１Ｄは陽性対照である。結果から全ての抗体が単一成分であることが分かる。 実施例４におけるｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＨＢｓＡｇへのＡ３１－７３ ＤＹ結合の検出結果を示す図である。ここで、横座標は抗体濃度（Ｌｏｇ１０ ｎｇ／ｍｌ）を表し、縦座標はＯＤ値を表す。結果から、Ａ３１－７３ ＤＹが中性ｐＨで親抗体の抗原結合活性及びｐＨ依存抗原結合活性を維持することができ、ｐＨ依存抗原結合活性が僅かに増強されることが示される。 実施例４におけるマウス初代マクロファージ上でのＡ３１－７３ ＤＹ及びＡ３１－７３についての免疫蛍光実験の結果を示す図である。ここで、緑色の蛍光はｈＦｃＲｎを表し、青色の蛍光は核を表し、赤色の蛍光はＨＢｓＡｇを表す。結果から、ＤＹ修飾がマウスマクロファージによる抗原－抗体複合体の食作用を増強することが示される。 ＨＢＶトランスジェニックマウスにおける５ｍｇ／ｋｇの用量での尾静脈を介した単回注射後の実施例４のＡ３１－７３ ＤＹスカベンジャー抗体及びＭ１Ｄの治療効果を示す図である。図１７Ａ：マウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はクリアランス後のマウス血清中のＨＢｓＡｇのレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図１７Ｂ：マウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はマウス血清中のＨＢＶ ＤＮＡのクリアランスレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図１７Ｃ：マウス血清中の抗体濃度の変化であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標は抗体濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す。結果から、ＤＹ修飾を有するスカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが抗原クリアランスにおいてＭ１Ｄよりも１桁超強いことが示される。Ａ３１－７３ ＤＹは、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＨＢｓＡｇを急速に除去するだけでなく、マウスにおけるＨＢＶ ＤＮＡ価を効果的に低下させることができ、これは血清における抗体半減期の検出結果と一致している。血清中の抗体濃度を比較すると、Ａ３１－７３ ＤＹの半減期はＭ１Ｄよりもほぼ８日長く、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが抗原を相互に結合する機能を有するため、抗原クリアランスの時間が増加することが示される。 アデノ随伴ウイルスのトランスフェクションによって得られるＨＢＶマウスモデルにおいて５ｍｇ／ｋｇの用量で５回のスカベンジャー抗体の注射後の実施例４のスカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹ及び陰性対照１６Ｇ１２の治療効果を示す図である。図１８Ａ：本動物実験の概要図であり、数字は日数を表し、赤色の矢印は血液採取の時点を表し、白色の矢印は投与の時点を表す。図１８Ｂ：マウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランス効果であり、横座標は抗体注射後の日数（ｄ）を表し、縦座標はマウス血清中のＨＢｓＡｇのクリアランスレベル（ｌｏｇ１０ ＩＵ／ｍｌ）を表す。図１８Ｃ：マウス血清中の抗ＨＢｓの相対価であり、横座標は抗体名を表し、縦座標は抗ＨＢｓの相対価（ｌｏｇ１０ ＯＤ４５０／ＯＤ６３０）を表す。結果から、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが従来の抗体の限界を打ち破り、低用量、低頻度での治療を達成し、マウスにおけるＨＢｓＡｇ価が１００ＩＵ／ｍＬ未満のレベルに長期間阻害され、治療後にマウスにおける液性免疫応答が活性化し、抗ＨＢｓの産生が可能となることが示される。

配列情報
本発明に関わる一部の配列の情報を下記表１に提示する。

ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を限定することを意図するものではなく、本発明を例示することを意図するものである。

特段の指定がない限り、本発明において使用される分子生物学実験法及びイムノアッセイ法は、基本的にJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びFM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995を参照し、制限酵素は、製品の製造業者により推奨される条件に従って使用した。当業者は、実施例が本発明を例として説明し、本発明によって特許請求される保護範囲を限定することを意図しないことを理解している。

実施例１：ｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体のファージスクリーニング
１．１ ｐＨ依存抗体修飾のための突然変異部位の決定
研究室において以前に開発した抗ＨＢＶヒト化抗体Ｍ１Ｄ（中国特許出願公開第２０１８１０３０７１３６．５号に詳細に記載される）を親抗体として使用し、その可変領域をｐＨ依存抗原結合のために修飾した。図１に示されるように、修飾Ｍ１Ｄは中性条件下で抗原結合活性を維持することができたが、酸性条件下での抗原結合活性が大幅に減少していた。解離した修飾Ｍ１Ｄは、細胞内ＦｃＲｎに結合することができ、血漿中に戻り、再び抗原に結合することで、ｐＨ依存抗原結合修飾後のＭ１Ｄの１分子が抗原の複数の分子に繰り返し結合し、中和することができた。ヒスチジンは酸性条件下でプロトン化することができ、ｐＨ依存抗原結合特性をもたらす重要なアミノ酸であった。Ｍ１Ｄの可変領域の三次元構造をシミュレーションし（可変領域の三次元構造を可変領域のアミノ酸配列に従ってシミュレーションした）、図２に示した。棒状の構造はＣＤＲ領域を表し、青色はＶＫ ＣＤＲを表し、緑色はＶＨ ＣＤＲを表し、赤色は表面アミノ酸を表すものであった。合計２５個の表面アミノ酸がＣＤＲ領域に見られ、文献に開示されるアミノ酸から得られた経験と組み合わせることで、ヒスチジンについて２４個のランダム置き換え部位が存在することが決定された。

１．２ Ｍ１Ｄに由来するｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体のファージライブラリー構築
Ｍ１Ｄ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を鋳型として用いて、抗体可変領域ＣＤＲ中で決定された２４個の部位をヒスチジンに置き換え、表２のプライマーに従って標的フラグメントを増幅して、Ｍ１Ｄに由来するｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子フラグメントを得た。ＰＣＲ条件は、９５℃、５分；９５℃、３０秒；５７℃、３０秒；７２℃、３０秒；７２℃、１０分で２５回の増幅サイクルであり、ＳＯＥ－ＰＣＲ反応条件は、９５℃、５分；９５℃、３０秒；５７℃、３０秒；７２℃、３０秒；７２℃、１０分で５回の増幅サイクルであった。増幅産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、増幅産物をＤＮＡ精製及び回収キット（TianGen、ＤＰ２１４－０３）を用いて回収／精製することで、Ｍ１Ｄに由来するｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体をコードする遺伝子フラグメントＨ～Ｋを得た。ｓｃＦｖ抗体の構造はＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨであり、リンカー配列は（Ｇ_４Ｓ）_３とすることができた。遺伝子フラグメントＨ～Ｋの各々をＳｆｉＩで消化した後、１０：１（遺伝子フラグメント：ベクター）のモル比でベクターｐＣＧＭＴ（Scripps, Making chemistry selectable by linking it to infectivityによる）にライゲートした。ライゲーション産物をエレクトロポレーション（エレクトロポレーション条件：２５μＦ、２．５ＫＶ、２００Ω）によってコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８に形質転換した。形質転換した大腸菌をＳＯＣ培地中で４５分間回収した後、２００μＬの細菌溶液をＬＢプレート（１００ｇ／Ｌアンピシリン＋テトラサイクリン＋２ｇ／ｍＬグルコースを含む）にプレーティングし、３７℃で一晩静置することによってインキュベートした。プレート上の全てのコロニーが可変領域中の決定された突然変異部位を無作為にヒスチジンに突然変異させたライブラリーであり、これをその後のスクリーニングに使用した。モノクローナルコロニーをプレートから選び出し、シークエンシングして、ｓｃＦｖ抗体をコードする組み換えベクターの配列の正確さを確認した。ｓｃＦｖ抗体をコードする組み換えベクター（ｐＣＧＭＴ－ｓｃＦｖ）の概要図を図３に示した。

１．３ ｐＨ依存ｓｃＦｖ抗体のスクリーニング
先の工程において得られたライブラリーを複数回スクリーニングし、スクリーニングにおいて得られた陽性モノクローナルコロニーを、アンピシリン（１００ｇ／Ｌ）及びグルコース（２ｇ／ｍＬ）を含む２×ＹＴ培地でＯＤ値０．６に達するように培養した後、補助的な重複感染のためにＭ１３ＫＯ７を添加した。２時間後に１００ｇ／Ｌカナマイシンを添加し、重複感染を３７℃で行った。２時間後に培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、細胞ペレットを採取した。細胞ペレットを、アンピシリン及びカナマイシン（１００ｇ／Ｌ）を含む培地に再懸濁し、振盪しながら３０℃で一晩培養した。続いて、培養物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞及び上清を採取し、試験のために４℃で保管した。

ＨＢｓＡｇ（２００ｎｇ／ｍＬ）抗原をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを取り、１００μＬの試験対象の上清を各ウェルに添加し、インキュベーションを３７℃で１時間行った（各上清につき２つのウェル）。続いて、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄した後、１２０μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ及びｐＨ６．０のＰＢＳを各上清の２つのウェルにそれぞれ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。対応するｐＨのＰＢＳＴで５回洗浄を行い、５０００倍希釈した抗Ｍ１３－ＨＲＰを１００μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、基質ＴＭＢ溶液を添加した。１５分間の発色後に呈色反応をＨ_２ＳＯ_４で停止し、読取りをＯＤ_{４５０／６２０}で測定した。３回目のＥＬＩＳＡ試験の結果を図４Ａ～図４Ｃに示した。図４Ａ～図４Ｃの結果から、これらのｓｃＦｖ抗体を提示するファージが全てＥＬＩＳＡ検出において反応性を有し、ｐＨ６．０で抗原に弱く結合し得ることが示された。良好な効果を有する４株のｐＨ依存ファージ抗体が初めに得られ、Ａ３１－７３、Ａ４２－１３、Ａ４２－２３及びＡ４１－８と名付けられた。

実施例２：ｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体の作製
２．１ 真核生物発現のための組み換えベクターの構築
本発明において、多量の抗体組換えを行う必要があることから、抗体を効率的に組み換えることができる軽鎖及び重鎖ベクターのセットを構築する必要があった。本発明において、研究室内の既存の真核生物発現ベクターｐＴＴ５を特別に修飾して、二重プラスミド同時トランスフェクションのために軽鎖及び重鎖組み換えベクターのセットを構築した。ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号４９）を軽鎖及び重鎖のシグナルペプチドとして使用した。ヒト抗体の軽鎖及び重鎖の定常領域をコードする配列を別個にシグナルペプチドの下流にライゲートして、抗体組換えを容易にする一連の真核生物発現ベクターｐＴＴ５－ＣＨ、ｐＴＴ５－Ｃκ及びｐＴＴ５－Ｃλを構築した。

１．３において得られた４つのｓｃＦｖ抗体を用い、軽鎖及び重鎖可変領域フラグメントを表３のプライマーによって増幅した。具体的な増幅反応条件は、９５℃、５分；９５℃、３０秒；５７℃、３０秒；７２℃、３０秒；７２℃、１０分で２５回の増幅サイクルであった。また、増幅産物をゲルから回収した。

研究室で作製したギブソンアセンブリ溶液を用いて、上記の構築した真核生物発現ベクターに抗体可変領域遺伝子の回収されたＰＣＲ産物をライゲートし（プライマーはベクターと相同の配列を有する）、組み換えベクターＶＨ＋ｐＴＴ５－ＣＨ（配列番号５７に示される重鎖定常領域を含む）及びＶＨ＋ｐＴＴ５－Ｃκ（配列番号５８に示される軽鎖定常領域を含む）を得た。組み換えベクターを大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、ＬＢプレート上にプレーティングし、３７℃のインキュベーター内で一晩培養した。モノクローナルコロニーをプレートから選び出し、シークエンシングし、シークエンシング結果を、ＭＥＧＡを用いる配列比較に供することで、その遺伝子の正確さを確認し、情報が誤っている遺伝子を除外した。

２．２ 抗体遺伝子の小規模及び大規模発現
構築した組み換えベクターＶＨ＋ｐＴＴ５－ＣＨ及びＶＨ＋ｐＴＴ５－ＣκをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、小規模発現のための二重プラスミドを２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬで同時トランスフェクトした。小規模発現の細胞上清が抗原活性を有する場合、トランスフェクションシステムを１００ｍＬ（使用する抗体の量によって決まる）のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標） ２９３Ｆ懸濁細胞（細胞密度は約２×１０^６細胞／ｍｌであった）まで拡大した。トランスフェクト細胞を３２℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内の振盪フラスコにおいて培養し、７日間の発現後に上清を採取した。

２．３ 抗体精製
細胞発現上清を採取し、プロテインＡカラムを用い、製造業者の使用説明書に従って精製した。具体的な工程は以下の通りであった：採取した細胞培養上清を８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を保持し、乾燥粉末Ｎａ_２ＨＰＯ_４でｐＨ値を８．４に調整した後、孔径０．２２μｍのフィルター膜で濾過した。プロテインＡを結合させたセファロース４Ｂ培地１０ｍＬをカラムに充填し、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００システムに接続し、ポンプＡを０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム溶液に接続し、ポンプＢを０．２Ｍクエン酸溶液に接続した。検出波長をＵＶ２８０ｎｍとし、流速を５ｍＬ／分とし、ポンプＡ／Ｂのサンプル注入比を調整した。カラムを初めに１００％のＢ（ｐＨ２．３）で洗浄してタンパク質不純物を除去し、１０％のＢ（ｐＨ８．０）でｐＨのバランスを取り、検出波長でのシグナルが安定してからゼロに戻った後にサンプルを充填した。フロースルーピークが過ぎた後に、検出波長でのシグナルがゼロまで下がり、安定するまで１０％のＢを使用してバランスを取り、７０％のＢ（ｐＨ４．０）を用いて溶出を行い、溶出ピークを収集した。溶出ピークサンプルをＰＢＳバッファーに透析し、濃度のアッセイ及びＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ分析に供して、ＩｇＧ抗体の純度を決定した。Ａ３１－７３、Ａ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８のＨＰＬＣの結果を図６に示した。４つの抗体が単一成分である。

実施例３：ｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体の特性分析及び機能評価
実施例１の方法による予備スクリーニングによって得られたＨＢｓＡｇへのｐＨ依存結合の特性を有する４株のファージ抗体を、それぞれＡ３１－７３、Ａ４２－１３、Ａ４２－２３及びＡ４１－８と名付けた。さらに、４株のファージ抗体を実施例２の方法による真核生物発現及び精製に供した。４つの抗体のＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を下記表に示した。加えて、４つの抗体のＣＤＲ配列を決定し、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を表５に示した。Ａ３１－７３、Ａ４２－１３、Ａ４２－２３及びＡ４１－８にＨＢｓＡｇへのｐＨ依存抗原結合の特性を与えた突然変異部位を表５にまとめた。

３．１ 異なるｐＨでのｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体の抗原結合活性の決定
本発明者らは、Ａ３１－７３、Ａ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８のそれぞれについてＨＢｓＡｇへのｐＨ依存抗原結合の能力をＥＬＩＳＡ法によって試験した。初めに、ＢＣＡタンパク質定量キットを用いて精製抗体の濃度を決定し、抗体濃度を希釈によって１１１１．１１ｎｇ／ｍＬに統一した。続いて、２０％ＮＢＳを用いて３倍勾配希釈による抗体濃度の勾配希釈を行い、合計８つの濃度を勾配希釈によって得た。続いて、希釈した抗体を市販のＨＢｓＡｇプレート（Beijing Wantaiから購入した）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした（上清１つにつき２つのウェル）。続いて、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳＴで１回洗浄し、回転乾燥した。次いで、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０の１２０μＬのＰＢＳを各上清の２つのウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを対応するｐＨのＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した。続いて、ＧＡＨ－ＨＲＰ標識二次抗体を添加し、３０分間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した。また、基質ＴＭＢ溶液を添加した。１５分間の発色後に呈色反応をＨ_２ＳＯ_４で停止し、読取りをＯＤ４５０／６３０で測定した。

結果を図７に示した。ｐＨ７．４においては、Ａ３１－７３、Ａ４２－１２、Ａ４２－２３及びＡ４１－８の全てがＭ１Ｄと同等の抗原結合活性を有していたが、ｐＨ６．０においては、それらの抗原結合活性が有意に低下した。ＥＣ５０の結果を表６にまとめた。

３．２ 動物モデルにおけるｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体の治療効果の決定
ＨＢＶトランスジェニックマウスを用いて、動物におけるＨＢＶウイルスを除去する上述のｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体の能力を評価した。ｐＨ依存抗ＨＢｓＡｇ抗体及び親抗体Ｍ１ＤをＨＢＶトランスジェニックマウス（国立台湾大学のChen Peizhe教授により提供された）に、１群当たり４匹又は５匹のＨＢＶトランスジェニックマウスで、１０ｍｇ／ｋｇの用量での尾静脈注射によって投与した。続いて、血液サンプルをマウスの後眼窩静脈叢から採取し、マウス血清中のＨＢｓＡｇ及び抗体レベルの変化を検出した。

３．２．１ ＨＢｓＡｇの定量的検出
（１）反応プレートの準備：マウスモノクローナル抗体ＨＢｓ－４５Ｅ９を２０ｍＭ ＰＢバッファー（Ｎａ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４バッファー、ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬのコーティング溶液を化学発光プレートの各ウェルに添加して、２℃～８℃で１６時間～２４時間、続いて３７℃で更に２時間コーティングを行い、プレートをＰＢＳＴ洗浄溶液で１回洗浄し、回転乾燥した。洗浄後に２００μＬのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、３７℃で２時間のブロッキングを行った。続いて、ブロッキング溶液を捨て、プレートを乾燥室内で乾燥させ、後に使用するために２℃～８℃で保管した。
（２）サンプルの希釈：採取したマウス血清を、２０％ＮＢＳ（新生児ウシ血清）を含むＰＢＳ溶液で希釈し、その後の定量的検出のために１：３０及び１：１５０の２つの勾配を形成した。
（３）サンプルの変性処理：１５μＬの上記の希釈血清サンプルを７．５μＬの変性バッファー（２０ｍＭ ＰＢ７．４に溶解した１５％ＳＤＳ）と十分に混合し、３７℃で１時間反応させた。次いで、９０μＬの停止バッファー（２０ｍＭ ＰＢ７．４に溶解した４％ＣＨＡＰＳ）を添加し、よく混合した。
（４）サンプルの反応：１００μＬの上述の変性血清サンプルを反応プレートに添加し、３７℃で１時間反応させた。続いて、反応プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した。
（５）酵素標識反応：ＨＢｓ－Ａ６Ａ７－ＨＲＰ反応溶液を化学発光プレートに１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃で１時間反応させた。次いで、プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した。
（６）発光反応及び測定：発光溶液を化学発光プレートに添加し（１００μＬ／ウェル）、光強度検出を行った。
（７）マウス血清サンプル中のＨＢｓＡｇ濃度の算出：標準品を用いて並列実験を行い、標準品の測定結果に基づいて標準曲線を描いた。次いで、マウス血清サンプルの光強度測定値を標準曲線に代入し、試験対象の血清サンプル中のＨＢｓＡｇの濃度を算出した。

３．２．２ 血清中の抗体の定量的検出
（１）サンプルの希釈：血清サンプルを２０％ＮＢＳで１０００倍、１００００倍、１０００００倍の３つの勾配に希釈した。対応する対照抗体を最初のウェルにおいて２０％ＮＢＳで２０ｎｇ／ｍＬに希釈した後、６つの勾配に３倍希釈した。
（３）サンプルの添加：１００μＬ／ウェルの先の工程で希釈したサンプル及び対応する抗体希釈液を市販のＨＢｓＡｂプレート（Beijing Wantaiから購入した）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（４）洗浄：プレートをプレートウォッシャーによって３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した；
（５）酵素標識二次抗体の添加：１００μＬ／ウェルのＧＡＨ－ＨＲＰ標識二次抗体希釈液を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした；
（６）洗浄：プレートをプレートウォッシャーによって３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した。
（７）発色：１００μＬ／ウェルの発色溶液、３７℃、１０分～１５分；
（８）停止及び読取り：５０μＬ／ウェルの停止溶液を添加し、読取り値を１０分以内にマイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０／６３０で測定した。
（９）マウス血清サンプル中の抗体濃度の算出：対応する標準抗体の測定結果に基づいて標準曲線を描いた。次いで、マウス血清サンプルの光強度測定値を標準曲線に代入し、試験対象の血清サンプル中の抗体濃度を算出した。

抗体処理後のマウスの血清中のＨＢｓＡｇ及び抗体レベルの検出結果を図８Ａ及び図８Ｂに示した。結果から、親抗体Ｍ１ＤのＨＢｓＡｇレベルが約１０日後にベースラインまで回復した一方で、ｐＨ依存抗体のＨＢｓＡｇレベルが約１５日後にベースラインまで回復したことが示された。血清中の抗体濃度を比較すると、Ｍ１Ｄが１０日目に最低の抗体濃度を示したのに対し、３つのｐＨ依存抗体は、１５日目にも依然として検出することができ、ｐＨ依存抗体が親抗体と同等のＨＢｓＡｇを除去する能力を維持した上で親抗体よりも長い抗原阻害時間を有し、すなわち、ｐＨ依存抗体のクリアランス効果がより長時間発揮され得ることが示された。Ａ３１－７３、Ａ４２－１２及びＡ４１－８によるＨＢｓＡｇのクリアランス結果を図８Ａに示し、Ａ３１－７３、Ａ４２－１２及びＡ４１－８の血清濃度の結果を図８Ｂに示した。動物の治療効果の結果から、Ａ３１－７３、Ａ４２－１２及びＡ４１－８がＨＢＶ感染又はＨＢＶ感染に関連する疾患（例えばＢ型肝炎）を治療する可能性を有することが示された。

実施例４：スカベンジャー抗体の構築及び機能評価
ｐＨ依存抗体は、そのｐＨ依存抗原結合活性を発揮するために細胞内に侵入する必要がある。したがって、細胞侵入の最初の制限要因が破られなければ、その後のｐＨ依存抗原結合特性が「作用」する機会はない。したがって、本実施例においては、中性ｐＨでのｈＦｃＲｎ受容体への結合を増強するか、又はＦｃγＲｓ受容体への結合を増強することができるスカベンジャー抗体をＦｃ領域中のアミノ酸の更なる突然変異によって得た。図９に示されるように、スカベンジャー抗体は、細胞外に位置し、抗原を細胞内に相互に輸送することで抗体半減期を極度に延長する「輸送ヘルパー」の役割を果たし、抗原に再び結合することができ、それにより抗原の細胞侵入の効率を改善し、クリアランス効率を大幅に改善した。

４．１ ｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体
４．１．１ ｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体の構築、発現及び精製
実施例３のＨＢＶトランスジェニックマウスにおいて最高の性能を有するＡ３１－７３及びＡ４１－８を、中性条件下でのｈＦｃＲｎに対する親和性を高めるためにＦｃ領域中のＶ４（Ｍ２５２Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ４３４Ｙ）突然変異に供した（この作業はGeneral Biologyに委託した；注文番号：Ｇ１２０４６０）。２つのスカベンジャー抗体Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４が得られ、突然変異後の重鎖定常領域を配列番号４７に示した。上記の２つの抗体を大規模真核生物発現及び精製に供し、その具体的な操作工程を実施例２．２及び２．３に示した。Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４のＨＰＬＣ結果を図１０に示し、結果から抗体が単一成分であることが示された。

４．１．２ ｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性検出
４．１．２．１ 異なるｐＨでのｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体の抗原結合活性の決定
ｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＡ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４の抗原結合活性をそれぞれ検出し、その具体的な操作工程を実施例３．１に示した。結果を図１１に示した。結果から、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４の両方が中性ｐＨで親と同等の抗原結合活性を維持することができ、酸性ｐＨでの抗原結合活性が更に弱まったことが示され、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４のｐＨ依存抗原結合活性が或る程度増強されたことが示された。

４．１．２．２ ｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体の細胞レベルでの機能検証
４．１．２．２．１ ４８８蛍光によるＨＢｓＡｇの標識
１ｍｇのＨＢｓＡｇの標識を例とし、プロセス全体を光から保護した。
（１）１ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ ＨＢｓＡｇをホウ酸塩緩衝剤（ＰＨ８．５、５００ｍＬ）に４℃で４時間透析した；
（２）ＨＢｓＡｇと４８８標識とのモル比を１：５とし、算出により０．１９８８ｍｇの４８８蛍光が必要とされた；
（３）１０ｍｇ／ｍＬの４８８蛍光溶液をＤＭＦで調製し、よく混合した；
（４）１９．８８μＬの４８８蛍光を１ｍＬの透析ＨＢｓＡｇに添加し、よく混合し、室温で１時間インキュベートした；
（５）インキュベーション混合物をＰＢＳに４℃で一晩透析した。

４．１．２．２．２ ＭＤＣＫ細胞に基づく免疫蛍光実験
（蛍光標識サンプルを用いる全ての工程を暗環境で操作した）
（１）細胞プレーティング：２×１０^５細胞／ｍＬの密度の細胞を細胞イメージング用の２４ウェルガラス底培養プレートにおいて２５０μＬ／ウェルで一晩培養した；
（２）対応する蛍光で標識した抗体及び抗原を無血清培地で希釈した：抗原については８００ｎｇ／ｍＬ、抗体については２μｇ／ｍＬ；
（３）各１２５μＬの抗原及び抗体を均一に混合した後、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で１時間静置した；
（４）細胞イメージング培養プレート内の細胞上清を捨て、抗原－抗体複合体を添加し、均一に振盪し、ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２時間静置した；
（５）上清を捨て、予め３７℃でインキュベートした１ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて細胞表面を３回～５回「洗浄」し、ピペッティングによって除去した；
（６）１ｍＬの１０％パラホルムアルデヒドを添加し、光から保護した３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で０．５時間静置した；
（７）パラホルムアルデヒドを捨て、予め３７℃でインキュベートした１ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて細胞表面を３回～５回「洗浄」し、ピペッティングによって除去した；
（８）０．５ｍＬのＤＡＰＩ（滅菌ＰＢＳで１０００倍希釈した）を添加し、光から保護した３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で１５分間静置した；
（９）ＤＡＰＩ希釈液を捨て、予め３７℃でインキュベートした１ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて細胞表面を３回～５回「洗浄」し、ピペッティングによって除去し、０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、イメージングのためにハイコンテントイメージャーに入れた。

実験結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示した。結果から、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４で処理した細胞における抗原蛍光強度がＡ３１－７３及びＡ４１－８で処理した細胞よりも顕著に高いことが示され、上記のスカベンジャー抗体がより多くの抗原を細胞内に効率的に輸送し得ることが示された。この結果から、スカベンジャー抗体におけるＶ４突然変異が中性条件下でのｈＦｃＲｎへの抗体の結合を増強し得ることが確認された。抗原－抗体複合体が細胞内に侵入した後、細胞内ｐＨは僅か約６．０であり、抗体が抗原－抗体複合体から解離し、細胞表面に戻り、再び抗原結合機能を果たした。スカベンジャー抗体が中性条件下でｈＦｃＲｎに結合する能力の増強により、その後のｐＨ依存抗原結合特性の「利便性の扉」が開かれ得る。

４．１．３ 動物モデルにおけるｈＦｃＲｎに結合することが可能なスカベンジャー抗体の治療効果の決定
Ｖ４修飾は、ｈＦｃＲｎ受容体を対象とするものであった。ＨＢＶトランスジェニックマウスの受容体は、修飾の効果の評価に用いることができないｍＦｃＲｎであった。したがって、ｒＡＡＶ－ＨＢＶ ａｄｒを感染させたｈＦｃＲｎトランスジェニックマウスのモデルを採用した。６週齢～８週齢のｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（Biosaituから購入した）を、尾静脈を介した適切な用量のｒＡＡＶ－ＨＢＶ ａｄｒ（Beijing Wujiahe Molecular Medicine Institute Co., Ltd.から購入した）の単回注射に供した。マウスにおけるＨＢＶウイルス価を４週間続けてモニタリングした。ウイルス価が安定した後、ＨＢＶウイルス価が安定したｈＦｃＲｎトランスジェニックマウス（各群４匹）に、尾静脈を介して２つのスカベンジャー抗体Ｍ１Ｄ及び陰性対照１６Ｇ１２をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇの単回用量で注射し、液性免疫応答を抑制するために抗ＣＤ４抗体の腹腔内注射で補助した。次いで、血清中のＨＢｓＡｇ、抗体及びＨＢＶ ＤＮＡの濃度を測定し、スカベンジャー抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗原クリアランス速度及び抗体半減期を分析した。

４．１．３．１ ＨＢｓＡｇの定量的検出
具体的な工程を実施例３．２．１に示し、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４の検出結果を図１３Ａに示した。

４．１．３．２ 血清中の抗体の定量的検出
具体的な工程を実施例３．２．２に示し、Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４の検出結果を図１３Ｂに示した。

４．１．３．３ ＨＢＶ ＤＮＡの定量的検出
ＨＢＶ ＤＮＡの定量的検出をＨＢＶ ＤＮＡリアルタイム蛍光定量的検出キットの使用説明書に従って行った（キットはBeijing Jinmaige Biotechnology Co., Ltd.から購入した）。

本実施例においては、動物におけるＡ３１－７３ Ｖ４、Ａ４１－８ Ｖ４及び参照抗体Ｍ１Ｄのウイルスクリアランス能力を決定した。実験結果を図１３Ｃに示した。

図１３Ａ～図１３Ｃの結果から、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ Ｖ４及びＡ４１－８ Ｖ４がＭ１Ｄと同等の抗原クリアランス能を有するが、より長い阻害時間を有することが示された。Ｍ１Ｄが最大の抗原クリアランス効果を発揮した後、抗原の回復が急速に開始し、Ｍ１Ｄが１４日目に失効し始め、血清中のＨＢｓＡｇはベースラインレベル（陰性対照１６Ｇ１２に基づく）まで戻った。しかしながら、２つのスカベンジャー抗体は、最大のクリアランス効果を発揮した後も長期にわたってより低い抗原レベルを維持し、ゆっくりと回復することができた。Ａ４１－８ Ｖ４処理群においては、ＨＢｓＡｇは約３０日でベースラインまで回復した。Ａ３１－７３ Ｖ４処理群においては、予定された実験の終了後もベースラインレベルまで戻らなかった。これらは、血清中の抗体半減期の検出結果と一致していた。かかる技術的効果は注目すべき、予期せぬものである。

４．２ ｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体
４．２．１ ｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体の構築、発現及び精製
実施例３のＨＢＶトランスジェニックマウスにおいて最高の性能を有するＡ３１－７３及びＡ４１－８をＦｃ領域上のＤＹ（Ｋ３２６Ｄ、Ｌ３２８Ｙ）突然変異に供し（この作業はGeneral Biologyに委託した；注文番号：Ｇ１２０４６０）、それぞれＡ３１－７３ ＤＹ及びＡ４１－８ ＤＹが得られ、突然変異後の重鎖定常領域を配列番号４８に示した。抗体を大規模真核生物発現及び精製に供し、その具体的な操作工程を実施例２．２及び２．３に示した。Ａ３１－７３ ＤＹのタンパク質ゲルの結果を図１４に示した。結果から抗体が単一成分であることが示された。

４．２．２ ｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性検出
４．２．２．１ 異なるｐＨでｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体の抗原結合活性の決定
ｐＨ７．４及びｐＨ６．０でのＡ３１－７３ ＤＹの抗原結合活性をそれぞれ検出した。その具体的な操作工程を実施例３．１に示す。結果を図１５に示した。Ａ３１－７３ ＤＹは、中性ｐＨで親抗体と同等の抗原結合活性及びｐＨ依存抗原結合活性を維持することができ、酸性ｐＨでの抗原結合活性が更に弱まり、Ａ３１－７３ ＤＹのｐＨ依存抗原結合活性が或る程度増強されたことが示された。

４．２．２．２ ｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体の細胞レベルでの機能検証
４．２．２．２．１ ４８８蛍光によるＨＢｓＡｇの標識
具体的な工程を４．１．２．２．１に示した。

４．２．２．２．２ マウス初代マクロファージに基づく免疫蛍光実験
（１）実験の４日前に、１．５ｍＬの３％チオグリコール酸ナトリウム溶液を各マウスの腹腔内に注射したが、腸内には注射しなかった；
（２）２匹のマウスを屠殺し、７５％アルコールに３分間浸漬した；
（３）マウスを発泡ボード上に水平固定し、腹部を露出させた。腹部皮膚を組織用ハサミで切り、腹膜を消毒し、切開して腹腔を露出させ、左手に持った２本の有鉤攝子で腹部切開部の皮膚を引っ張って固定し、右手に持ったパスツールピペットによって１６４０培養培地をピペッティングし、４ｍＬ／回で計２回の腹腔洗浄を行った。洗浄をより完全かつ徹底的にするために、ピペットを用いて腹腔内を静かにかつ十分にかき回した。約２分かけて十分に撹拌し、約５分間静置してマクロファージを十分に単離した後、洗浄溶液をピペッティングし、遠心分離管に移した；
（４）４℃、１１００ｇ、５分間；
（５）上清を慎重に捨て、細胞を１６４０培地で２回洗浄し、４℃、１１００ｇで５分間遠心分離し、上清を捨て、細胞をＲＰＭ１６４０に再懸濁した；
（６）細胞を計数した後、１０^６細胞／ｍＬの密度を有するように細胞を調整し、２４ウェルガラス底細胞イメージング培養プレート上にて２５０μＬ／ウェルで培養し、２時間後に培地を交換し、ＲＰＭ１６４０で１回洗浄を行い、非接着性細胞を捨てた後、インキュベーションを３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で一晩行った；
（７）対応する蛍光で標識した抗体及び抗原を無血清培地で、抗原については８００ｎｇ／ｍＬ、抗体については２０μｇ／ｍＬまで希釈した；
（８）各１２５μＬの抗原及び抗体を均一に混合した後、３７℃のＣＯ_２インキュベーター内で１時間静置した；
（９）細胞イメージング培養プレート内の細胞上清を捨て、抗原－抗体複合体を添加し、均一に振盪し、ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で２時間静置した；
（１０）上清を捨て、予め３７℃でインキュベートした１ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて細胞表面を３回～５回「洗浄」し、ピペッティングによって除去した；
（１１）Ｄｉｏを２０００倍希釈し、細胞が隠れるような量で添加し、室温で２０分間静置した；
（１２）上清を捨て、予め３７℃でインキュベートした１ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて細胞表面を３回～５回「洗浄」し、ピペッティングによって除去した；
（１３）生細胞核色素（１ｍＬ容量に２滴添加した）を添加し、室温で２０分間静置し、イメージングのためにハイコンテントイメージャーに入れた。

実験の結果を図１６に示した。結果から、マウスマクロファージによる抗原－抗体複合体の食作用がＤＹ修飾によって増強され、より多くの抗原分解がもたらされることが分かった。

４．２．３ 動物モデルにおけるｍＦｃγＲＩＩに結合することが可能なスカベンジャー抗体の治療効果の決定
４．２．３．１ トランスジェニックマウスにおけるスカベンジャー抗体の治療効果の評価
６週齢～８週齢のＨＢＶトランスジェニックマウスを選択し、尾静脈を介してＡ３１－７３ ＤＹスカベンジャー抗体及びＭ１Ｄを５ｍｇ／ｋｇの単回用量で注射した（１群当たり４匹のマウス）。血清中のＨＢｓＡｇ、抗体及びＨＢＶ ＤＮＡの濃度を検出することによって、スカベンジャー抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗原クリアランス速度及び抗体半減期を分析した。

４．２．３．１．１ ＨＢｓＡｇの定量的検出
具体的な工程を実施例３．２．１に示し、Ａ３１－７３ ＤＹの検出結果を図１７Ａに示した。

４．２．３．１．２ ＨＢＶ ＤＮＡの定量的検出
ＨＢＶ ＤＮＡの定量的検出をＨＢＶ ＤＮＡリアルタイム蛍光定量的検出キットの使用説明書に従って行った（キットはBeijing Jinmaige Biotechnology Co., Ltd.から購入した）。

本実施例においては、動物におけるＡ３１－７３ ＤＹ及び参照抗体Ｍ１Ｄのウイルスクリアランス能力を決定した。実験結果を図１７Ｂに示した。

４．２．３．１．３ 血清中の抗体の定量的検出
具体的な工程を実施例３．２．２に示し、Ａ３１－７３ ＤＹの検出結果を図１７Ｃに示した。

図１７Ａ～図１７Ｃの結果から、ＤＹ修飾を有するスカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹの抗原クリアランス能力がＭ１Ｄよりも１桁超強いことが示された。Ａ３１－７３ ＤＹは、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＨＢｓＡｇを急速に除去するだけでなく（図１７Ａ）、マウスにおけるＨＢＶ ＤＮＡ価を効果的に低下させることができ（図１７Ｂ）、これは血清における抗体半減期の検出結果と一致していた（図１７Ｃ）。血清中の抗体濃度を比較すると、Ａ３１－７３ ＤＹの半減期はＭ１Ｄよりもほぼ１２日長く、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが抗原を相互に結合する機能を有するため、抗原クリアランスの時間が増加することが示された。

４．２．３．２ アデノ随伴ウイルスをトランスフェクトしたＨＢＶマウスモデルにおけるスカベンジャー抗体の治療効果の評価
図１８Ａに示されるように、４週齢～６週齢のＣ５７マウスに１×１０^１１のｒＡＡＶ８－１．３ＨＢＶ ａｄｒを注射し、アデノ随伴ウイルスのトランスフェクションによって得られるＨＢＶマウスモデルを確立し（－２８日目）、マウスウイルス価を連続的にモニタリングした。ウイルス価が安定した後、マウスにおけるベースラインＨＢｓＡｇレベルを検出し、マウスを群に分けた（－１日目）。スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹ（略して７３ ＤＹ）及び陰性対照１６Ｇ１２を５ｍｇ／ｋｇの用量で５回注射した。５回目の処理の２週間後に全てのマウスを屠殺し、マウス血清を採取し、血清ＨＢｓＡｇ及び抗ＨＢｓレベルを分析した。

４．２．３．２．１ ＨＢｓＡｇの定量的検出
具体的な工程を実施例３．２．１に示し、Ａ３１－７３ ＤＹの検出結果を図１８Ｂに示した。

４．２．３．２．２ 抗ＨＢｓの定性的検出
（１）サンプルの希釈：血清サンプルを２０％ＮＢＳで１００倍、５００倍、２５００倍、１２５００倍及び６２５００倍の５つの勾配に希釈した；
（３）サンプルの添加：１００μＬ／ウェルの先の工程で希釈したサンプル及び対応する抗体希釈液を市販のＨＢｓＡｂプレート（Beijing Wantaiから購入した）に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
（４）洗浄：プレートをプレートウォッシャーによって３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した；
（５）酵素標識二次抗体の添加：１００μＬ／ウェルのＧＡＭ－ＨＲＰ標識二次抗体希釈液を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした；
（６）洗浄：プレートをプレートウォッシャーによって３００μＬ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、回転乾燥した；
（７）発色：１００μＬ／ウェルの発色溶液、３７℃、１０分～１５分；
（８）停止及び読取り：５０μＬ／ウェルの停止溶液を添加し、読取り値を１０分以内にマイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０／６３０で測定した。
（９）マウス血清サンプル中の抗ＨＢｓ濃度の算出：０．１～１の間の読取り値に希釈倍率を乗算し、その対数値（ｌｏｇ_１０）を取った。

抗体処理後のマウス血清中の抗ＨＢｓレベルの検出結果を図１８Ｃに示した。

図１８Ｂの結果から、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが、アデノ随伴ウイルスによって得られるＨＢＶマウスモデルにおいてＨＢｓＡｇレベルを５ｍｇ／ｋｇの用量及び１５日／注射の投与頻度にて長時間にわたって１００ＩＵ／ｍｌ未満に制御し得ることが示された。図１８Ｃの結果は０日目、７日目、３７日目、５２日目、６７日目及び８２日目のマウスにおける抗ＨＢｓレベルを示し、Ａ３１－７３ ＤＹ抗体で処理したマウスがより高い抗ＨＢｓレベルを有し、４匹のマウスのうち３匹が明らかな抗ＨＢｓを産生した（最後まで処理を継続したマウスのみを計数した）ことが分かり、抗ＨＢｓの産生がＨＢｓＡｇの連続的阻害と関連し得ることが示された。これにより、スカベンジャー抗体Ａ３１－７３ ＤＹが従来の抗体の限界を打ち破り、低用量、低頻度での治療を達成し、より重要なことには、長期治療後にマウスにおける液性免疫応答が活性化し、抗ＨＢｓの産生が可能となることが示された。

実施例５：Ｍ１Ｄ、Ａ３１－７３及びＡ４１－８の親和性決定
ＨＢｓＡｇを酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に５μｇ／ｍＬで溶解し、チップコーティングプログラムをＢｉａｃｏｒｅ ３０００装置で実行し、ＨＢｓＡｇをＣＭ５チップにコーティングした。ＨＢｓＡｇのコーティング量を２４００ＲＵとした。分析物を１００ｎＭから２倍希釈して、７つの濃度のサンプルを調製した。親和性決定プログラムをＢｉａｃｏｒｅ ３０００装置で実行し、流速を５０μｌ／分に設定し、結合時間を９０秒に設定し、解離時間を６００秒に設定し、サンプルチャンバーの温度を１０℃に設定し、再生溶液を５０ｍＭ ＮａＯＨとし、再生流速を５０μＬ／分に設定し、再生時間を６０秒に設定した。結果を表７にまとめた。

本発明の特定の実施形態を詳細に説明したが、開示した全ての教示に従い、細部に様々な修正及び変更を加えることができ、これらの変更が本発明の保護範囲内であることが当業者には理解される。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
本明細書は以下の発明を開示する。
［１］
ＨＢｓＡｇに特異的に結合することが可能な抗体又はその抗原結合フラグメントであって、酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性でＨＢｓＡｇに結合し、
（ａ）以下の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）ＧＧＳＩＸ ₁ Ｘ ₂ ＮＦＷ（配列番号５０）（ここで、Ｘ ₁ はＴ又はＨから選択され、Ｘ ₂ はＳ又はＨから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ１、
（ｉｉ）Ｘ ₃ ＧＸ ₄ Ｘ ₅ Ｘ ₆ Ｘ ₇ Ｔ（配列番号５１）（ここで、Ｘ ₃ はＳ又はＨから選択され、Ｘ ₄ はＰ、Ｓ又はＹから選択され、Ｘ ₅ はＧ又はＤから選択され、Ｘ ₆ はＴ又はＨから選択され、Ｘ ₇ はＹ又はＨから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）ＡＲＳＨＸ ₈ ＹＧＸ ₉ Ｘ ₁₀ ＤＹＡＦＤＦ（配列番号５２）（ここで、Ｘ ₈ はＤ又はＨから選択され、Ｘ ₉ はＳ又はＨから選択され、Ｘ ₁₀ はＨ又はＮから選択される）の配列を有するＨＣＤＲ３、
及び／又は、
（ｂ）以下の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）ＱＤＩＸ ₁₁ Ｘ ₁₂ Ｓ（配列番号５３）（ここで、Ｘ ₁₁ はＳ又はＨから選択され、Ｘ ₁₂ はＳ、Ｙ又はＨから選択される）の配列を有するＬＣＤＲ１、
（ｖ）ＹＡＮ（配列番号１２）の配列を有するＬＣＤＲ２、及び、
（ｖｉ）ＱＱＹＨＸ ₁₃ ＬＰＬＴ（配列番号５４）（ここで、Ｘ ₁₃ はＳ又はＹから選択される）の配列を有するＬＣＤＲ３、
を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２］
（ａ）以下の３つのＣＤＲを含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号８、１４、１７、２０から選択される配列からなるＨＣＤＲ１、
（ｉｉ）配列番号９、１５、２１、１８から選択される配列からなるＨＣＤＲ２、及び、
（ｉｉｉ）配列番号１０、１６、２２から選択される配列からなるＨＣＤＲ３、
及び／又は、
（ｂ）以下の３つのＣＤＲを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）配列番号１１、１９、２３から選択される配列からなるＬＣＤＲ１、
（ｖ）配列番号１２に示される配列からなるＬＣＤＲ２、及び、
（ｖｉ）配列番号１３に示される配列からなるＬＣＤＲ３、
を含む、［１］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３］
（１）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号８に示されるＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
（２）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
（３）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号２０に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるＨＣＤＲ２、配列番号２２に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号２３に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、又は、
（４）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１７に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１９に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
を含む、［１］又は［２］に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４］
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（例えば、ヒト生殖細胞系列抗体遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれるフレームワーク領域）を更に含み、該フレームワーク領域が、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の復帰突然変異を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト重鎖生殖細胞系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれる重鎖フレームワーク領域、及び／又はヒト軽鎖生殖細胞系列遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に含まれる軽鎖フレームワーク領域を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＧＨＶ４－４ ^* ０８によってコードされるアミノ酸配列に含まれる重鎖フレームワーク領域及びＩＧＫＶ１－３９ ^* ０１によってコードされるアミノ酸配列に含まれる軽鎖フレームワーク領域を含み、該重鎖フレームワーク領域及び／又は該軽鎖フレームワーク領域が、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上（例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の復帰突然変異を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨが、配列番号２４に示されるＶＨ ＦＲ１、配列番号２５に示されるＶＨＦＲ２、配列番号２６に示されるＶＨ ＦＲ３及び配列番号２７に示されるＶＨＦＲ４を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＬが、配列番号２８に示されるＶＬ ＦＲ１、配列番号２９に示されるＶＬ ＦＲ２、配列番号３０に示されるＶＬ ＦＲ３及び配列番号３１に示されるＶＬ ＦＲ４を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５］
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
（ａ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）：
（ｉ）配列番号１、３、４及び６のいずれか１つに示される配列、
（ｉｉ）配列番号１、３、４、６のいずれか１つに示される配列と比較して１個若しくは幾つかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は、
（ｉｉｉ）配列番号１、３、４、６のいずれか１つに示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
並びに、
（ｂ）以下から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）：
（ｉｖ）配列番号２、５及び７のいずれか１つに示される配列、
（ｖ）配列番号２、５、７のいずれか１つに示される配列と比較して１個若しくは幾つかのアミノ酸の置換、欠失若しくは付加（例えば１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸の置換、欠失又は付加）を有する配列、又は、
（ｖｉ）配列番号２、５、７のいずれか１つに示される配列と比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくは１００％の配列同一性を有する配列、
を含み、好ましくは、（ｉｉ）又は（ｖ）に記載される置換が保存的置換である、［１］～［４］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［６］
（１）配列番号１に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
（２）配列番号３に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
（３）配列番号４に示される配列を有するＶＨ及び配列番号５に示される配列を有するＶＬ、又は、
（４）配列番号６に示される配列を有するＶＨ及び配列番号７に示される配列を有するＶＬ、
を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［７］
前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を更に含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖がヒト免疫グロブリン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）に由来する重鎖定常領域を含み、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖がヒト免疫グロブリン（例えばκ又はλ）に由来する軽鎖定常領域を含み、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが配列番号５８に示される軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［８］
前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の変異体を含み、該変異体が、それが由来する野生型配列と比較して以下の置換：（ｉ）Ｍ２５２Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ４３４Ｙ、又は（ｉｉ）Ｋ３２６Ｄ、Ｌ３２８Ｙを有し、ここで、上述のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う位置であり、
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合フラグメントが配列番号４７又は４８に示される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、［１］～［７］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［９］
配列番号５７に示される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、［１］～［７］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１０］
（１）配列番号１に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（２）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（３）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（４）配列番号３に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（５）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（６）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（７）配列番号４に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（８）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（９）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（１０）配列番号６に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
（１１）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、又は、
（１２）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１１］
前記抗体又はその抗原結合フラグメントがｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'） ₂ 、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、プロボディ、キメラ抗体又はヒト化抗体からなる群から選択され、好ましくは、該抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、［１］～［１０］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１２］
ＨＢｓＡｇに特異的に結合し、ＨＢＶの毒性を中和し、並びに／又は被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／若しくはＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることが可能である、［１］～［１１］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１３］
［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はその重鎖可変領域及び／若しくは軽鎖可変領域をコードする単離核酸分子。
［１４］
［１３］に記載の核酸分子を含み、好ましくはクローニングベクター又は発現ベクターである、ベクター。
［１５］
［１３］に記載の核酸分子又は［１４］に記載のベクターを含む、宿主細胞。
［１６］
抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で［１５］に記載の宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することとを含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法。
［１７］
［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
［１８］
被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ感染若しくはＨＢＶ感染関連疾患（例えばＢ型肝炎）の予防及び／又は治療のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、並びに／又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するための薬剤の製造への［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は［１７］に記載の医薬組成物の使用。
［１９］
被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ感染若しくはＨＢＶ感染関連疾患（例えばＢ型肝炎）の予防及び／又は治療に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するために使用され、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるために使用され、並びに／又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するために使用される、［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は［１７］に記載の医薬組成物。
［２０］
［１］～［１２］のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は［１７］に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に有効量投与することを含む、被験体におけるＨＢＶ感染若しくはＨＢＶ感染関連疾患（例えばＢ型肝炎）の予防及び／又は治療のため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体（例えばヒト）におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、並びに／又は被験体（例えば、慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者）におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するために用いられる方法。

Claims (25)

1. ＨＢｓＡｇに特異的に結合することが可能な抗体又はその抗原結合フラグメントであって、酸性ｐＨよりも中性ｐＨにおいて高い親和性でＨＢｓＡｇに結合し、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
   （１）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号８に示されるＨＣＤＲ１、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
   （２）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
   （３）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号２０に示されるＨＣＤＲ１、配列番号２１に示されるＨＣＤＲ２、配列番号２２に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号２３に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、又は、
   （４）以下の３つのＣＤＲを含むＶＨ：配列番号１７に示されるＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるＨＣＤＲ２、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３、及び以下の３つのＣＤＲを含むＶＬ：配列番号１９に示されるＬＣＤＲ１、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３、
   を含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域を更に含み、該フレームワーク領域が、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上の復帰突然変異を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＩＧＨＶ４－４^*０８によってコードされるアミノ酸配列に含まれる重鎖フレームワーク領域及びＩＧＫＶ１－３９^*０１によってコードされるアミノ酸配列に含まれる軽鎖フレームワーク領域を含み、該重鎖フレームワーク領域及び／又は該軽鎖フレームワーク領域が、任意にヒト残基からマウス残基への１個以上の復帰突然変異を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨが、配列番号２４に示されるＶＨ ＦＲ１、配列番号２５に示されるＶＨ ＦＲ２、配列番号２６に示されるＶＨ ＦＲ３及び配列番号２７に示されるＶＨ ＦＲ４を含み、
   前記抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＬが、配列番号２８に示されるＶＬ ＦＲ１、配列番号２９に示されるＶＬ ＦＲ２、配列番号３０に示されるＶＬ ＦＲ３及び配列番号３１に示されるＶＬ ＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. （１）配列番号１に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
   （２）配列番号３に示される配列を有するＶＨ及び配列番号２に示される配列を有するＶＬ、
   （３）配列番号４に示される配列を有するＶＨ及び配列番号５に示される配列を有するＶＬ、又は、
   （４）配列番号６に示される配列を有するＶＨ及び配列番号７に示される配列を有するＶＬ、
   を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒト免疫グロブリンに由来する定常領域を更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４重鎖定常領域を含み、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖がヒトκ又はλ軽鎖定常領域を含む、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが配列番号５８に示される軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む、請求項６に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがヒトＩｇＧ１重鎖定常領域の変異体を含み、該変異体が、それが由来する野生型配列と比較して以下の置換：（ｉ）Ｍ２５２Ｙ、Ｎ２８６Ｅ、Ｎ４３４Ｙ、又は（ｉｉ）Ｋ３２６Ｄ、Ｌ３２８Ｙを有し、ここで、上述のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従う位置である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. 前記重鎖定常領域が配列番号４７又は４８に示されるとおりである、請求項９に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
11. 配列番号５７に示される重鎖定常領域（ＣＨ）を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
12. （１）配列番号１に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （２）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （３）配列番号１に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （４）配列番号３に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （５）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （６）配列番号３に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号２に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （７）配列番号４に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （８）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （９）配列番号４に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号５に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （１０）配列番号６に示されるＶＨと配列番号５７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    （１１）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４７に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、又は、
    （１２）配列番号６に示されるＶＨと配列番号４８に示されるＣＨとを含む重鎖及び配列番号７に示されるＶＬと配列番号５８に示されるＣＬとを含む軽鎖、
    を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
13. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントがｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、（Ｆａｂ'）₂、Ｆｖフラグメント、ダイアボディ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、プロボディ、キメラ抗体及びヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. ＨＢｓＡｇに特異的に結合し、ＨＢＶの毒性を中和し、並びに／又は被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／若しくはＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させることが可能である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント、又はその重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする単離核酸分子。
16. 請求項１５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
17. 請求項１５に記載の核酸分子又は請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。
18. 抗体又はその抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと、培養された宿主細胞培養物から前記抗体又はその抗原結合フラグメントを回収することとを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法。
19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤とを含む、医薬組成物。
20. 被験体におけるＨＢＶ感染若しくはＢ型肝炎の予防及び／又は治療のため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは被験体におけるＨＢＶの毒性を中和するため、被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるため、並びに／又は被験体におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するための薬剤の製造への請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
21. 前記被験体はヒトである、請求項２０に記載の使用。
22. 前記被験体が慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者である、請求項２０に記載の使用。
23. 被験体におけるＨＢＶ感染若しくはＢ型肝炎の予防及び／又は治療に使用され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくは被験体におけるＨＢＶの毒性を中和するために使用され、被験体におけるＨＢＶ ＤＮＡ及び／又はＨＢｓＡｇの血清レベルを低下させるために使用され、並びに／又は被験体におけるＨＢＶに対する液性免疫応答を活性化するために使用される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は請求項１９に記載の医薬組成物。
24. 前記被験体はヒトである、請求項２３に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は医薬組成物。
25. 前記被験体が慢性ＨＢＶ感染者又は慢性Ｂ型肝炎患者である、請求項２３に記載の抗体若しくはその抗原結合フラグメント又は医薬組成物。

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