JP7584536B2 - 新規なポリペプチドおよびこれを利用したｌ－ロイシンの生産方法 - Google Patents

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Description

KCCM KCCM12709P
関連出願との相互引用
本出願は、２０２０年５月２０日付大韓民国特許出願第１０－２０２０－００６０５７８号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として組み含まれる。
本出願は、イソプロピルマレートシンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する新規な変異型ポリペプチド；これをコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；前記変異型ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、前記ベクター、またはその組み合わせを含む微生物；および前記微生物を培養してＬ－ロイシンを生産する方法に関する。
Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸生産能を有するコリネ型（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）細菌または腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属するアミノ酸生産菌を用いて発酵法により工業生産されている。これらアミノ酸生産菌としては、生産性を向上させるために自然界から分離された菌株または当該菌株の人工変異株、または遺伝子組換えによりＬ－アミノ酸生合成酵素が増強された組換え体などが使用されている。
Ｌ－アミノ酸のうちＬ－ロイシンは、必須アミノ酸の一種で医薬、食品、飼料添加物および工業薬品などに広範囲に使用される高価のアミノ酸であり、主に微生物を利用して生産される。Ｌ－ロイシンの発酵生産は、主にエシェリキア属微生物またはコリネバクテリウム属微生物を通じて行われ、ピルビン酸から多段階を経て２－ケトイソカプロン酸（２－ｋｅｔｏｉｓｏｃａｐｒｏａｔｅ）を前駆体として生合成されると知られている。しかし、Ｌ－ロイシンの生合成に関与する酵素は、最終産物であるＬ－ロイシンまたはその誘導体によるフィードバック阻害が発生して工業的にＬ－ロイシンを大量製造するには困難がある。
そこで、本出願の発明者らは、イソプロピルマレートシンターゼの特定位置を変異させて得られた変異株が酵素活性を最適化して高収率のＬ－ロイシン生産に利用され得ることを確認して本発明を完成した。
ＵＳ２０１８－０２５１７７２Ａ１
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）アミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルマレートシンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記ポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含むベクターからなる群より選択された１種以上を含む、微生物を提供する。
本出願は、前記微生物を培地で培養する工程を含むＬ－ロイシンの生産方法を提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記微生物（例えば、本出願の変異型ポリペプチド、本出願のポリヌクレオチド、および／または本出願のベクターを含む微生物（組換え細胞））からなる群より選択された１種以上を含む、Ｌ－ロイシン生産用組成物を提供する。
本出願は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および前記微生物（例えば、本出願の変異型ポリペプチド、本出願のポリヌクレオチド、および／または本出願のベクターを含む微生物（組換え細胞））からなる群より選択された１種以上のＬ－ロイシンの生産に使用するための用途を提供する。
本出願の一態様は、配列番号１のイソプロピルマレートシンターゼ蛋白質のアミノ酸配列でＮ－末端から２４７番目またはこれに相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルマレートシンターゼ活性を有する変異型ポリペプチド（または変異体）を提供することができる。
本明細書において、「イソプロピルマレートシンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、α－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、２－ケトイソ吉草酸（２－ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ、３－メチル－２－オキソブタノエート、２－エキソイソ吉草酸）とアセチル－ＣｏＡのアセチル基との縮合を触媒してＬ－ロイシンの前駆体のうちの一つであるイソプロピルマレート（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ、３－カルボキシ－３－ヒドロキシ－４－メチルペンタノエート）に転換する酵素を意味し、前記イソプロピルマレートシンターゼは、前記転換活性を有する酵素であれば微生物由来に関係なく含まれ得、例えば、コリネバクテリウム属微生物由来の酵素であり得る。
前記イソプロピルマレートシンターゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。また微生物の由来に関係なく配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または９９％以上、９９．５％以上または９９．８％以上の相同性を有するポリペプチドであって、イソプロピルマレートシンターゼと同一または相応する転換活性を有する酵素であれば配列番号１のアミノ酸配列で一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも前記イソプロピルマレートシンターゼとして本出願の範囲内に含まれ得る。
つまり、本出願で「特定の配列番号で記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド（または蛋白質）」、「特定の配列番号で記載されたアミノ酸配列からなるポリペプチド（または蛋白質）」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチド（または蛋白質）と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（または蛋白質）も本出願の変異対象になる蛋白質またはポリペプチドとして使用することができる。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」と同一あるいは相応する活性を有するポリペプチドは、「配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド」に属することができる。
前記イソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列およびイソプロピルマレートシンターゼをコードする遺伝子の塩基配列は、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のような当業界における公知のデータベースから容易に得ることができる。
本明細書において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を含む」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列からなるか、これを必須で含むことを意味し得、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた配列を含むもの（または前記変異を排除しないもの）と解釈され得る。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列を含む」とは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが（ｉ）前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列からなるかこれを必須で含む、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列（塩基配列）またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の相同性を有する核酸配列またはアミノ酸配列からなるかこれを必須で含み、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味し得る。
本明細書において、野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（例えば、ＡＴＣＣ１３０３２）に由来するイソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列は、配列番号１に表示し、野生型菌株に由来するイソプロピルマレートシンターゼをコードするｌｅｕＡ遺伝子の塩基配列は、配列番号２に表示した。イソプロピルマレートシンターゼは、配列番号１では６１６個のアミノ酸からなるものと表示したが、文献によっては翻訳開始コドンを３５個後に表記して５８１個のアミノ酸からなるものと公知されている場合もあり、５８１個のアミノ酸からなるイソプロピルマレートシンターゼのアミノ酸配列は、配列番号１６に表示した。５８１個のアミノ酸からなるイソプロピルマレートシンターゼは、前記イソプロピルマレートシンターゼとして本出願の範囲内に含まれ得、このような場合、前記２４７番目位置は２１２番目位置と解釈されて本出願の範囲に含まれ得る。
一例による変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で５５８番目（またはこれに相応する位置）アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がアルギニン以外の他のアミノ酸残基に置換、
配列番号１のアミノ酸配列で５６１番目（またはこれに相応する位置）グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換、またはこれら全てによりさらに変異されたものであり得る。
一例において、配列番号１６の５８１個のアミノ酸からなるイソプロピルマレートシンターゼの場合、前記５５８番目位置は５２３番目位置に解釈され、前記５６１番目位置は５２６番目位置に解釈されて本出願の範囲に含まれ得る。
本明細書において、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドモイエティ間の同一性のパーセントを意味する。一つのモイエティから他の一つのモイエティまでの配列間の相同性は知られた当該技術により決定され得る。例えば、相同性は、配列情報をアラインメントし、容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用して二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報、例としてはスコア（ｓｃｏｒｅ）、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および類似度（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）などの媒介変数（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を直接アラインメントして決定され得る。前記コンピュータプログラムは、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）、ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＣＬＣ ｂｉｏ）、ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ）などであり得る。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解させて分解された断片の大きさを確認することによって決定することができる。
一態様は、配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目（またはこれに相応する位置）プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）アミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルマレートシンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有する変異型ポリペプチドを提供することができる。
他の態様は、配列番号１６のアミノ酸配列で２１２番目プロリンアミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換された、イソプロピルシンターゼ活性を有する変異型ポリペプチドを提供することができる。
本明細書において、「配列番号～のアミノ酸配列で～番目」は、「配列番号～のアミノ酸配列から構成される（またはなる）ポリペプチドのＮ－末端から～番目」と同一な意味で使用され得る。
前記プロリン以外の他のアミノ酸は、アルギニン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含むことができる。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目（またはこれに相応する位置）プロリンがシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に置換されたものであり得る。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、配列番号３のアミノ酸配列からなるものであり得る。
一例による変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または９９％以上、９９．５％以上、または９９．８％以上の相同性を有するポリペプチドのアミノ酸配列で前記２４７番目位置（配列番号１６の場合は２１２番目位置）に相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものであり得る。
一具体例による変異型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目プロリン（または配列番号１６のアミノ酸配列で２１２番目プロリン）またはこれに相応する位置のアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されて、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列を含むポリペプチドよりＬ－ロイシン生産活性が増加したものであり得る。
一具体例によれば、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性を有するポリペプチドのアミノ酸配列で、２４７番目プロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）アミノ酸残基またはこれに相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された、変異型ポリペプチドは、イソプロピルマレートシンターゼ活性を有することができる。前記他のアミノ酸残基は、置換される前に前記位置（配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目またはこれに相応する位置）に存在していたアミノ酸（例えば、プロリン）以外の他の種類のアミノ酸残基を意味し得る。
一具体例による変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）プロリンまたはこれに相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されて、野生型菌株に由来するイソプロピルマレートシンターゼ（例えば、配列番号１または配列番号１６のアミノ酸配列を含む（またはなる）イソプロピルマレートシンターゼ）よりＬ－ロイシン生産活性が増加したものであり得る。
一具体例による変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）プロリンまたはこれに相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されて、野生型菌株に由来するイソプロピルマレートシンターゼ（例えば、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列からなるイソプロピルマレートシンターゼ）よりイソプロピルマレートシンターゼの酵素活性が増加したものであり得る。
本明細書において、「イソプロピルマレートシンターゼの活性が増加」されたことは、イソプロピルマレートへの転換活性増加を意味するため、一具体例による変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列を含むイソプロピルマレートシンターゼの活性を有するポリペプチドに比べてより高い水準のイソプロピルマレートへの転換活性を有することができる。
本明細書において、「活性増加」は、「活性強化」と併用して使用することができる。なお、イソプロピルマレートは、Ｌ－ロイシンの前駆体のうちの一つであるため、一具体例による変異型ポリペプチドを利用する場合、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列を含むイソプロピルマレートシンターゼの活性を有するポリペプチドに比べて結果的により高い水準でＬ－ロイシンを生産することができる。
前記イソプロピルマレートへの転換活性は、生成されるイソプロピルマレートの水準を測定して直接確認したり、または生成されるＣｏＡの水準を測定して間接的に確認することができる。イソプロピルマレートシンターゼの酵素活性は、公知の方法で測定することができ、例えば、文献［Ｋｏｈｌｈａｗ ｅｔ ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６６：４２３－９（１９８８））］に記載された方法により測定することができ、生成されるＣｏＡを利用した還元によりＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸）、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬）から形成されたチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）による４１２ｎｍでの吸光変化を測定してイソプロピルマレートシンターゼ酵素の活性を測定することができる。
一具体例による変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）プロリンまたはこれに相応する位置のアミノ酸配列が他のアミノ酸に置換されて、野生型菌株に由来するイソプロピルマレートシンターゼ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるイソプロピルマレートシンターゼ）よりＬ－ロイシンおよび／またはその誘導体によるフィードバック抑制を減少させることができる。
本明細書において、「フィードバック抑制（ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ、フィードバック阻害）」は、酵素系の終産物がその酵素系の初期段階にある反応を阻害することを意味する。例えば、前記フィードバック阻害は、Ｌ－ロイシンおよび／またはその誘導体がその生合成経路の第１段階を媒介するイソプロピルマレートシンターゼの活性を抑制することであり得る。したがって、イソプロピルマレートシンターゼのフィードバック抑制を減少（または解除）する場合、そうではない場合に比べてＬ－ロイシンの生産性を高めることができる。
本明細書において、「誘導体」は、本発明の最終産物であるＬ－ロイシンの生合成に関連してフィードバック阻害を誘発して微生物からＬ－ロイシンの生産能を阻害させることができると公知となっている化合物を意味し得、例えば、イソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、テルロイシン（ｔｅｒｌｅｕｃｉｎｅ）、ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）、および／またはシクロロイシン（ｃｙｃｌｏｌｅｕｃｉｎｅ）などを含むことができる。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）以外の他の位置が追加的に変異されて（１）Ｌ－ロイシン生産活性の増加；（２）イソプロピルマレートシンターゼの酵素活性の増加；および（３）Ｌ－ロイシンおよび／またはその誘導体によるフィードバック抑制の減少からなる群より選択される１種以上の効果が相乗的に増加したものであり得る。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、（１）Ｌ－ロイシン生産活性の増加；（２）イソプロピルマレートシンターゼの酵素活性の増加；および（３）Ｌ－ロイシンおよび／またはその誘導体によるフィードバック抑制の減少からなる群より選択される１種以上の効果を有することができる変異を追加的に含むものであり得る。
前記変異型ポリペプチドは、
配列番号１のアミノ酸配列で５５８番目（またはこれに相応する位置）アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がアルギニン以外の他のアミノ酸残基に置換、
配列番号１のアミノ酸配列で５６１番目（またはこれに相応する位置）グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換、またはこれら全てによりさらに変異されたものであり得る。
前記変異型ポリペプチドは、
配列番号１６のアミノ酸配列で５２３番目（またはこれに相応する位置）アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がアルギニン以外の他のアミノ酸残基に置換、
配列番号１６のアミノ酸配列で５２６番目（またはこれに相応する位置）グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換、またはこれら全てによりさらに変異されたものであり得る。
前記アルギニン以外の他のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含むものであり得、前記グリシン以外の他のアミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含むものであり得、これに制限されるのではない。
一具体例によれば、前記アルギニン以外の他のアミノ酸は、ヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）であり得る。
一具体例によれば、グリシン以外の他のアミノ酸は、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）であり得る。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、
配列番号１のアミノ酸配列で５５８番目アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）アミノ酸残基に置換、
配列番号１のアミノ酸配列で５６１番目グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）アミノ酸残基に置換、または、
これら全てによりさらに変異されたものであり得る。
一具体例によれば、前記変異型ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、配列番号５のアミノ酸配列からなるものであり得る。
一具体例により、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）アミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換された変異型ポリペプチドにおいて、
配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で５５８番目（または５２３番目）アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がアルギニン以外の他のアミノ酸残基に置換、５６１番目（または５２６番目）グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がグリシン以外の他のアミノ酸残基に置換、またはこれら全てによりさらに変異された変異型ポリペプチドは、
（ｉ）野生型菌株に由来するイソプロピルマレートシンターゼ（例えば、配列番号１または配列番号１６のアミノ酸配列を含むイソプロピルマレートシンターゼ）または（ｉｉ）配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）プロリンアミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換された変異型ポリペプチドより、
下記（１）～（３）からなる群より選択された１種以上の効果が増加したものであり得る：
（１）Ｌ－ロイシン生産活性の増加；
（２）イソプロピルマレートシンターゼの酵素活性の増加；および
（３）Ｌ－ロイシンおよび／またはその誘導体によるフィードバック抑制の減少。
一具体例によれば、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目、５５８番目、および／または５６１番目（または２１２番目、５２３番目、および／または５２６番目）位置のアミノ酸が他の種類のアミノ酸に置換される変異の組み合わせにより、一例による変異型ポリペプチドは、下記（１）～（３）からなる群より選択された１種以上の効果が相乗的に増加したものであり得る：
（１）Ｌ－ロイシン生産活性の増加；
（２）イソプロピルマレートシンターゼの酵素活性の増加；および
（３）Ｌ－ロイシンおよび／またはその誘導体によるフィードバック抑制の減少。
前記（１）～（３）の効果については前述したとおりである。
他の態様は、前記変異型ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを提供することができる。本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖模様でつながっているヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）で、一定長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖として、より具体的には前記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味し得る。
前記変異型ポリペプチドについては前述したとおりである。
前記ポリヌクレオチドには、本出願の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は制限なしに含まれ得る。
一例によれば、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）プロリンアミノ酸残基がプロリン以外の他のアミノ酸残基に置換されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得、または配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または９９％以上、９９．５％以上、または９９．８％以上の相同性を有して前記配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列で２４７番目（または２１２番目）位置に相応する位置のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたポリペプチドやその一部の配列が欠失、改変、置換または付加されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。
一具体例によれば、前記ポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造され得るプローブ、例えば、前記ポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、配列番号１（または配列番号１６）のアミノ酸配列の２４７番目（または２１２番目）またはこれに相応する位置のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された蛋白質変異体をコードする配列に相応する配列を含むプローブであれば制限なしに含むことができる。前記「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的ハイブリダイゼーションが形成され、非特異的ハイブリダイゼーションが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い遺伝子同士で、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または９９％以上、９９．５％以上、または９９．８％以上の相同性を有する遺伝子同士でハイブリダイズし、それより相同性が低い遺伝子同士でハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件を列挙することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （２００１） ）。
前記ハイブリダイゼーションに使用されたプローブは、塩基配列の相補配列の一部であり得る。このようなプローブは、公知の配列に基づいて作られたオリゴヌクレオチドをプライマーとし、このような塩基配列を含む遺伝子断片を鋳型とするＰＣＲにより作製され得る。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さの遺伝子断片を使用することができる。より具体的には、約３００ｂｐ程度の長さのプローブを使用する場合に、ハイブリダイゼーションの洗浄条件としては、５０℃、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳが提示され得る。
一具体例によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４または配列番号６の塩基配列を含むか、配列番号４または配列番号６の塩基配列からなるものであり得、コドン縮重（ｃｏｄｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により一具体例による変異型ポリペプチドと翻訳され得るポリヌクレオチドも本出願の範囲に含まれ得る。
他の態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することができる。
本明細書において、「ベクター」は、宿主細胞に塩基のクローニングおよび／またはトランスファーのための任意の媒介物をいう。ベクターは、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得る。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、つまり、自己調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を言う。
一例において、ベクターは、適した宿主内で目的蛋白質を発現させることができるように適した調節配列に作動可能に連結された前記目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物であり得る。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および解読の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムと関係なく複製されたり機能することができ、ゲノムそれ自体に統合され得る。
本明細書において、「作動可能に連結」されたとは、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始および媒介するようにするプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
前記ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られた任意のベクターを利用することができる。例えば、前記ベクターは、天然状態であるか、組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージであり得、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、および／またはＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＤＣ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＤＺ系、および／またはｐＥＴ系などを使用することができる。例えば、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＣＲ２．１、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８および／またはｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。
他の態様は、前記変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含むベクターからなる群より選択された１種以上を含む、微生物（または組換え細胞）を提供することができる。
前記変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターについては前述したとおりである。
前記微生物（または組換え細胞）は、追加的にＬ－ロイシンの生産が増加するようにする変異を含むことができ、前記変異の位置および／または変異対象になる遺伝子の種類はＬ－ロイシンの生産が増加するようにするものであれば制限なしに含まれ得る。
前記微生物（または組換え細胞）は、追加的にＬ－ロイシンの生合成に関与する酵素の活性が強化されるようにする変異を含むことができる。酵素の活性が強化されるということは前述したとおりである。
前記微生物（組換え細胞）は、形質転換が可能な細胞であれば制限なしに使用可能である。
前記微生物（または組換え細胞）は、Ｌ－ロイシン生産能を有するものであり得る。前記微生物（または組換え細胞）は、組換え前の細胞、親菌株、および／または野生型菌株が有していないＬ－ロイシン生産能を有するようになるか、またはＬ－ロイシン生産能がより向上したものであり得る。
前記微生物（または組換え細胞）は、イソプロピルマレートシンターゼに相応するアミノ酸配列が変異されてその活性が組換え前の細胞、親菌株、および／または野生型菌株と比較して増加したり、Ｌ－ロイシンおよびその誘導体に対するフィードバック阻害が解除されたり、酵素の活性増加およびフィードバック阻害の解除が全てなされたものであり得る。
前記微生物（または組換え細胞）は、一具体例によるポリヌクレオチドが染色体内に統合されたものであり得、例えば、一具体例によるポリヌクレオチドは、染色体内の遺伝子部位で天然（ｎａｔｉｖｅ）ｌｅｕＡ遺伝子（イソプロピルマレートシンターゼをコードする遺伝子）に対して交換されたり、追加の遺伝子部位に統合されたものであり得る。
本明細書において、「Ｌ－ロイシン生産能を有する」とは、自然にロイシン生産能を有する細胞および／または微生物、またはロイシン生産能がない細胞および／または微生物にロイシン生産能が付与された微生物を意味する。例えば、Ｌ－ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型微生物自体またはロイシン生産機構と関連した外部遺伝子が挿入されたり内在的遺伝子の活性を強化させたり不活性させて向上したＬ－ロイシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。
前記微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）微生物であり得る。
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アルカノリティクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｋａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・リリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｌｉｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、および／または、コリネバクテリウム・ハーキュリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ）などであり得る。
前記微生物（または組換え細胞）は、形質転換を通じて人工的に製造されたり、または自然に発生するものを全て含むことができる。例えば、前記微生物（または組換え細胞）は、一具体例による変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこれを含むベクターに形質転換されたものであり得る。
本明細書において、「形質転換」は、遺伝子またはポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができるようにすることであり、形質転換された遺伝子またはポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現されることができれば宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものを制限なしに含まれ得る。
本明細書において、形質転換させる方法は、遺伝子を細胞内に導入する方法であれば制限なしに含まれ、宿主細胞により当該分野で公知となったとおり適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈澱、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈澱、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポゾーム法、および／または酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などを使用することができるが、これに限定されない。
前記微生物（または組換え細胞）は、一具体例によるポリヌクレオチド配列が染色体内に統合されたものであり得る。相同組換えは、一例によるベクターの使用と共に、ベクターにより細胞内に伝達される一例によるポリヌクレオチドに対する染色体上のＤＮＡ断片の交換を許容する。ベクターの環状ＤＮＡ分子および染色体上の標的ＤＮＡの間の効率的な組換えのために、一例によるポリヌクレオチドを含有する交換されるＤＮＡ領域には、末端に標的部位に相同性であるヌクレオチド配列が提供され；これらはベクターの統合およびＤＮＡの交換部位を決定する。例えば、一具体例によるポリヌクレオチドは、染色体内で天然遺伝子部位で天然ｌｅｕＡ遺伝子に対して交換されるか、追加の遺伝子部位に統合され得る。
他の態様は、前記微生物（または組換え細胞）を培地で培養する段階を含む、Ｌ－ロイシンの生産方法を提供することができる。
一例において、前記方法は、培養された培地または微生物（または組換え細胞）でＬ－ロイシンを回収する工程を追加的に含むことができる。
前記培養は、当業界に知られた適切な培地と培養条件により行われ得、適切な方式で特定菌株の要件を充足しなければならず、通常の技術者により適切に改変され得る。
前記培養方法は、例えば、回分式培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続式培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加式培養（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはこれらの組み合わせの培養を含むことができるが、これに限定されるのではない。
微生物（または組換え細胞）を培養するための培地は、公知の文献（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ． Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ＵＳＡ， １９８１）を参照することができるが、これに限定されるのではない。
一具体例によれば、培地に多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含むことができ、前記組換え細胞を適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地内で温度および／またはｐＨなどを調節しながら培養することができる。使用され得る炭素源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、および／またはセルロースのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ひまし油、および／またはココナッツ油などのような油類および脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、および／またはリノレン酸のような脂肪酸、グリセロール、および／またはエタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これら物質は、個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるのではない。使用することができる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆粉および尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムが含まれ得る。窒素源も個別的にまたは混合物として使用することができるが、これに限定されるのではない。使用され得るリンの供給源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム－含有塩が含まれ得、これに限定されるのではない。また、培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有することができ、これに限定されるのではない。その他に、アミノ酸およびビタミンのような必須成長物質が含まれ得る。また培地に適切な前駆体を使用することができる。前記培地または個別成分は、培養過程で培養液に適切な方式により回分式でまたは連続式で添加され得るが、これに限定されるのではない。
一具体例によれば、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を微生物培養液に適切な方式で添加して培養液のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。追加的に、培養液の好気状態を維持するために、培養液内に酸素または酸素－含有気体（例、空気）を注入することができる。培養液の温度は２０℃～４５℃、２５℃～４０℃、または３０℃～３７℃であり得る。培養期間は有用物質（例えば、Ｌ－ロイシン）が望む生産量で得られる時まで続けることができ、例えば、１０～１６０時間であり得る。
前記培養された微生物（または組換え細胞）および／または培養培地でＬ－ロイシンを分離または回収する工程は、培養方法により当該分野における公知の適した方法を利用して行うことができる。例えば、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈澱、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えばアンモニウムスルフェート沈澱）、および／またはクロマトグラフィー（例えばイオン交換、親和性、疎水性およびサイズ排除）などの方法を使用することができるが、これに制限されない。前記培養培地は、微生物（または組換え細胞）を培養した培地を意味する。
一具体例によれば、Ｌ－ロイシンを分離または回収する工程は、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄液をイオン交換クロマトグラフィーを通じて分離することができる。
前記Ｌ－ロイシンの生産方法は、Ｌ－ロイシンを精製する工程を追加的に含むことができる。
他の態様は、本出願の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および本出願の微生物（例えば、本出願の変異型ポリペプチド、本出願のポリヌクレオチド、および／または本出願のベクターを含む微生物（組換え細胞））からなる群より選択された１種以上を含む、Ｌ－ロイシン生産用組成物を提供することができる。
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適した賦形剤を追加的に含むことができ、このような賦形剤は、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤などであり得るが、これに限定されるのではない。
本出願の組成物において、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、および培地などは前記他の態様で記載したとおりである。
また他の態様は、本出願の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、および／または本出願の微生物（例えば、本出願の変異型ポリペプチド、本出願のポリヌクレオチド、および／または本出願のベクターを含む微生物（組換え細胞））のＬ－ロイシンの生産に使用するための用途を提供することができる。
本出願の用途において、変異型ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物、および培地などは前記他の態様で記載したとおりである。
一具体例による変異型ポリペプチドを使用するとＬ－ロイシンを高収率で生産することができる。
本発明は、下記の実施例を挙げてより詳細に説明するが、下記の実施例の権利範囲が限定される意図ではない。
実施例１．変異されたイソプロピルマレートシンターゼをコードするＤＮＡライブラリーの作製
実施例１－１．ｌｅｕＡを含むベクターの作製
イソプロピルマレートシンターゼ活性を有する変異体をコードするｌｅｕＡ変異ライブラリーを作製するために、まずｌｅｕＡを含む組換えベクターを作製した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミクム由来のＬｅｕＡ（２－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）蛋白質（配列番号１、Ｕｎｉｐｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：Ｐ４２４５５）をコードするｌｅｕＡ遺伝子（配列番号２）を増幅するために、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２野生株の染色体を鋳型として配列番号７および８のプライマーを利用して９４℃で１分間変性、５８℃で３０秒間結合、７２℃で１分間Ｐｆｕ ＤＮＡ重合酵素で重合する条件を２５回繰り返すＰＣＲ方法を行った。使用したプライマーの具体的な配列は表１に記載した。
増幅されたＰＣＲ産物をＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して、製造会社のマニュアルにより、大腸菌ベクターｐＣＲ２．１にクローニングして「ｐＣＲ－ｌｅｕＡ」を得た。
Figure 0007584536000001
実施例１－２．ｌｅｕＡ変異ライブラリーの作製
前記実施例１－１で作製されたベクターを基盤としてｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（登録商標）ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ）を利用してｌｅｕＡ変異ライブラリーを作製した。１０００ｂｐ当たり０～３個の変異が発生し得る条件で、ｐＣＲ－ｌｅｕＡベクターを鋳型として配列番号７および配列番号８のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。具体的に、１０００ｂｐ当たり０～３個の変異が発生する条件として、９４℃で３０秒間プレヒーティング（ｐｒｅ－ｈｅａｔｉｎｇ）後、９４℃で３０秒、６８℃で１分３０秒の過程を２５回（ｃｙｃｌｅ）繰り返してＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をメガプライマー（ｍｅｇａｐｒｉｍｅｒ）（５０～１２５ｎｇ）として９５℃で５０秒、６０℃で５０秒、６８℃で１２分の過程を２５回繰り返してＰＣＲ反応を行った後、ＤｐｎＩ処理し、ＤｐｎＩが処理されたＰＣＲ産物を大腸菌ＤＨ５αにヒートショック法を通じて形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得して塩基配列を分析した結果、２ｍｕｔａｔｉｏｎｓ／ｋｂ頻度に互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーを取ってプラスミドを抽出し、これを「ｐＴＯＰＯ－ｌｅｕＡ－ライブラリー」と命名した。
実施例２．作製したライブラリーの評価および変異体の選別
実施例２－１．Ｌ－ロイシン生産量が増加された変異菌株の選別
前記実施例１－２で作製されたｐＴＯＰＯ－ｌｅｕＡ－ライブラリーを野生型コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、形質転換された菌株をカナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有する栄養培地（表２）に塗抹して変異遺伝子が挿入された菌株１０，０００個のコロニーを選別した。選別された各コロニーをＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）１～ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）１０，０００と命名した。確保された１０，０００個のコロニー中のＬ－ロイシン生産量が増加されたコロニーを確認するためにそれぞれのコロニーに対して下記のような方法で発酵力価評価を行った。
Figure 0007584536000002
加圧殺菌した生産培地（表２）２５ｍｌに２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各コロニーを白金耳を利用して接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ＳＨＩＭＡＺＤＵ ＬＣ２０Ａ）を利用した方法によりＬ－ロイシン生産量を測定した。確保された１０，０００個のコロニー中の野生型コリネバクテリウム・グルタミクム菌株（ＡＴＣＣ１３０３２）に比べてＬ－ロイシン生産能が最も向上した菌株（ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６）１種を選別した。選別された菌株（ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６）で生産されたＬ－ロイシンの濃度は下表３のとおりである。
Figure 0007584536000003
前記表３に示されているように、ｌｅｕＡ遺伝子に変異があるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６菌株は、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシン生産能が約１．５倍向上した。
実施例２－２．Ｌ－ロイシン生産量が増加された変異菌株の変異確認
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異を確認するために、表４に記載された配列番号９と配列番号１０のプライマーを利用してＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６菌株のＤＮＡを鋳型として９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行ってＤＮＡシーケンシングを行った。
Figure 0007584536000004
シーケンシング結果、ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＴＯＰＯ＿ｌｅｕＡ（ｍｔ）５３０６菌株は、ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目ヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換されていることを確認した。これはＬｅｕＡ蛋白質の２４７番目（翻訳開始コドンを３５個後に表記してＬｅｕＡ蛋白質が５８１個のアミノ酸からなるもの（配列番号１６）で公知の文献に基づく場合は２１２番目；以下、２４７番目でだけ表記）アミノ酸であるプロリンがシステインに置換された変異体（以下、Ｐ２４７Ｃ）をコードできることを意味する。前記ＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ）のアミノ酸配列およびこれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４のとおりである。
以下、実施例では、前記変異（Ｐ２４７Ｃ）がコリネバクテリウム属微生物のＬ－ロイシン生産量に影響を与えるか否かを確認しようとした。
実施例３．選別された変異菌株のＬ－ロイシン生産能の確認
実施例３－１．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの作製
本実施例では部位指定突然変異生成（Ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）方法を用いて選別された変異（Ｐ２４７Ｃ）を菌株内に導入するために、挿入用ベクターを作製しようとした。コリネバクテリウム・グルタミクム野生型（ＡＴＣＣ１３０３２）の染色体を鋳型として配列番号１１および１２のプライマーと配列番号１３および１４のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。具体的に、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分の条件でＰＣＲを行った。使用したプライマーの具体的な配列は表５に記載した。
Figure 0007584536000005
その結果で得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＺベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を利用してＤＮＡ断片間の末端１５ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングしてＬｅｕＡの２４７番目アミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換するベクター「ｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ）」を作製した。
実施例３－２．ＡＴＣＣ１３０３２菌株内ｌｅｕＡ遺伝子に変異導入
前記実施例３－１で作製したｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ）ベクターをＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子に変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異導入の有無は配列番号９と配列番号１５のプライマーを利用してＰＣＲ（９４℃で５分後、９４℃で３０秒／５５℃で３０秒／７２℃で９０秒の３０回反復、７２℃で５分）行った後、塩基配列分析を通じて確認した。塩基配列分析の結果、菌株染色体内ｌｅｕＡ遺伝子の７３９番目、７４０番目ヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換されて、２４７番目アミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）がシステイン（Ｃｙｓ）に置換されたＬｅｕＡをコードするｌｅｕＡ変異が菌株内に導入されたことを確認した。作製された菌株は「ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃ」と命名した。使用したプライマーの具体的な配列は表４および表６に記載した。
Figure 0007584536000006
実施例３－３．変異菌株のＬ－ロイシン生産能の評価
前記実施例３－２で作製されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃ菌株のＬ－ロイシン生産能を評価するために、前記実施例２の方法と類似に、フラスコ発酵力価評価を行った。生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２およびＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃをそれぞれ１白金耳ずつ接種した後、３０℃で６０時間２００ｒｐｍで振とう培養してＬ－ロイシンを生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでＬ－ロイシンの生産量を測定して、各菌株に対する培養液中のＬ－ロイシン濃度は下記表７に記載した。
Figure 0007584536000007
前記表７に示されているように、ＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃは、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシンの収率が約１．５５倍向上した。
実施例４．ロイシン生産変異菌株でロイシン生産能の評価
コリネバクテリウム属野生型の菌株は、Ｌ－ロイシンを微量生産するため、ＡＴＣＣ１３０３２由来のロイシン生産菌株を作製し、前記実施例２で選別した変異（Ｐ２４７Ｃ）を導入してＬ－ロイシン生産能を確認した。具体的な実験は次のとおりである。
実施例４－１．Ｌ－ロイシン生産菌株（ＣＪＬ－８１００菌注）の製造
高濃度のＬ－ロイシン生産のための菌株として（１）ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目ヌクレオチドであるＧがＡに置換されてＬｅｕＡ蛋白質の５５８番目アミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換される変異（Ｒ５５８Ｈ）と（２）ｌｅｕＡ遺伝子の１６８２番目、１６８３番目ヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換されて５６１番目アミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換される変異（Ｇ５６１Ｄ）を含むＡＴＣＣ１３０３２由来の菌株を製造した。
具体的に前記のｌｅｕＡ遺伝子変異を含むｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）ベクター（大韓民国公開特許第１０－２０１８－００７７００８号）をコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法で形質転換し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地で相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株を選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、ｌｅｕＡ遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株の変異導入の有無は配列番号７と配列番号１３のプライマーを利用してＰＣＲ（９４℃で５分後、９４℃で３０秒／５５℃で３０秒／７２℃で９０秒の３０回反復、７２℃で５分）を行い、塩基配列を分析してＲ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ変異が導入されたことを確認した。使用したプライマーの具体的な配列は表１および表５に記載した。ｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）ベクターに形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２＿ｌｅｕＡ＿（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）菌株を「ＣＪＬ－８１００」と命名した。
実施例４－２．ｌｅｕＡ変異を含む挿入ベクターの作製
本実施例ではＬｅｕＡに２個の変異（Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）が導入されたＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００に前記実施例２で選別された変異（Ｐ２４７Ｃ）を導入するために挿入用ベクターを作製しようとした。
ＣＪＬ－８１００菌株の染色体を鋳型として配列番号９および１０のプライマー、配列番号１１および１２のプライマー対を利用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。その結果で得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素で切断させた線状のｐＤＺベクターとＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ酵素を利用してＤＮＡ断片間の末端１５ｂａｓｅの相同配列をｆｕｓｉｏｎさせてクローニングして、野生型菌株のＬｅｕＡアミノ酸配列で５５８番目アミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換され、５６１番目アミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換されたＬｅｕＡ変異体をコードするｌｅｕＡ変異を含み、ＬｅｕＡの２４７番目アミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）をシステイン（Ｃｙｓ）に置換するベクターｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）を作製した。
実施例４－３．ＣＬＪ－８１００菌株内ＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ）の導入および評価
Ｌ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００を前記実施例４－２で作製したｐＤＺ－ｌｅｕＡ（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）ベクターに形質転換し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有する培地で選別した。選別された１次菌株は再び２次交差（ｃｒｏｓｓ－ｏｖｅｒ）を経て、目標遺伝子の変異が導入された菌株を選定した。最終的に形質転換された菌株のｌｅｕＡ遺伝子変異導入の有無は配列番号９と配列番号１５のプライマーを利用してＰＣＲ（９４℃で５分後、９４℃で３０秒／５５℃で３０秒／７２℃で９０秒の３０回反復、７２℃で５分）を行った後、塩基配列を分析した。塩基配列分析の結果、菌株染色体内ｌｅｕＡ遺伝子の１６７３番目ヌクレオチドであるＧがＡに置換され、１６８２番目、１６８３番目ヌクレオチドであるＧＣがＡＴに置換され、７３９番目、７４０番目ヌクレオチドであるＣＣがＴＧに置換されてＬｅｕＡ蛋白質の５５８番目アミノ酸であるアルギニンがヒスチジンに置換され、５６１番目アミノ酸であるグリシンがアスパラギン酸に置換され、２４７番目アミノ酸であるプロリン（Ｐｒｏ）がシステイン（Ｃｙｓ）に置換されたＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）をコードするｌｅｕＡ変異が菌株内に導入されたことを確認した。作製されたＣＪＬ８１００＿ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃを「ＣＡ１３－８１０５」と命名し、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に２０２０年４月２９日付で寄託して寄託番号ＫＣＣＭ１２７０９Ｐが付与された。前記総３種の変異を含むＬｅｕＡ変異体（Ｐ２４７Ｃ、Ｒ５５８Ｈ、Ｇ５６１Ｄ）のアミノ酸配列およびこれをコードするｌｅｕＡ変異体の塩基配列は、それぞれ配列番号５および配列番号６のとおりである。
ＡＴＣＣ１３０３２、作製されたＣＪＬ－８１００、およびＣＡ１３－８１０５菌株のＬ－ロイシンの生産能を評価した。具体的に、実施例２－２のような方式でフラスコ培養を進行し、培養終了後、ＨＰＬＣを利用して、親菌株および変異菌株のＬ－ロイシン生産量を測定してその結果を表８に記載した。
Figure 0007584536000008
前記表８に示されているように、Ｌ－ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミクムＣＪＬ８１００は、親菌株であるＡＴＣＣ１３０３２に比べてＬ－ロイシン生産能が約１３０％向上した。ＣＪＬ８１００菌株内ｌｅｕＡ＿Ｐ２４７Ｃ変異を追加的に導入したＣＡ１３－８１０５菌株は、親菌株であるＣＪＬ８１００に比べてＬ－ロイシン生産能が約１５０％向上した。前記結果を通じて、ＬｅｕＡ蛋白質のアミノ酸配列のうち、前記２４７番目位置のアミノ酸がＬ－ロイシン生産活性に重要な位置であることを確認できる。
実施例４－４．ＬｅｕＡ変異体が導入された菌株でのイソプロピルマレートシンターゼの活性測定
前記実施例４－３で作製したＬ－ロイシン生産菌株であるＣＪＬ－８１００およびＣＡ１３－８１０５でイソプロピルマレートシンターゼの活性を測定するために、下記のような方法で実験を行った。
それぞれの種培地（表２の生産培地）２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに前記菌株（ＣＪＬ－８１００、ＣＡ１３－８１０５）および野生型ＡＴＣＣ１３０３２をそれぞれ１白金耳接種した後、３０℃で１６時間２００ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して上澄液は捨て、ペレットを溶菌緩衝溶液で洗浄および混濁してビーズ式破砕機で細胞を破砕した。溶菌液の蛋白質定量はブラッドフォード法に従い、１００μｇ／ｍｌの蛋白質が含まれている溶菌液を利用した。この時、生成されるＣｏＡを利用した還元によりＤＴＮＢ（５，５’－ジチオビス－（２－ニトロ安息香酸））、エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬から形成されたチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）による４１２ｎｍでの吸光変化を測定してイソプロピルマレートシンターゼ酵素の活性を測定した。
各菌株でのイソプロピルマレートシンターゼの活性測定結果は下記表９のとおりである。
Figure 0007584536000009
次に、前記酵素のロイシンに対するフィードバック阻害に対する解除程度を確認するために、ロイシンが２ｇ／ｌ添加された条件で１００μｇ／ｍｌの蛋白質が含まれている溶菌液を利用した時に生成されるＣｏＡを測定することによってイソプロピルマレートシンターゼの活性を測定した。各菌株でのイソプロピルマレートシンターゼの活性測定結果は下記表１０のとおりである。
Figure 0007584536000010
前記表９および１０に示されているように、ＬｅｕＡ変異体発現ベクターが形質転換されたＬ－ロイシン生産菌株ＣＪＬ－８１００およびＣＡ１３－８１０５は、対照群であるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２に比べてイソプロピルマレートシンターゼの活性がそれぞれ１．１３倍、１．２１倍向上することを確認した。また、前記Ｌ－ロイシン生産菌株は、ロイシンが２ｇ／ｌ添加された条件でもイソプロピルマレートシンターゼの酵素活性をそれぞれ７８％、８８％に維持することを確認してロイシンによるフィードバック阻害が解除されたことを確認した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的な思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体的な形態に実施可能であることを理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導き出される全ての変更または改変された形態が本出願の範囲に含まれると解釈されなければならない。
［受託番号］
寄託機関名：韓国微生物保存センター
受託番号：ＫＣＣＭ１２７０９Ｐ
受託日付：２０２００４２９
Figure 0007584536000011

Claims (16)

  1. イソプロピルマレートシンターゼ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｍａｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）活性を有し、配列番号１のアミノ酸配列と９４％以上の同一性を有する変異型ポリペプチドであって、
    配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目に対応する位置のプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）アミノ酸残基がシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に置換された、変異型ポリペプチド。
  2. 配列番号１のアミノ酸配列で２４７番目のプロリンアミノ酸残基がシステイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）に置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
  3. 配列番号１６のアミノ酸配列で２１２番目のプロリンアミノ酸残基がシステインに置換された、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
  4. 配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
  5. 前記変異型ポリペプチドは、
    配列番号１のアミノ酸配列で５５８番目アルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）アミノ酸残基がヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）アミノ酸残基に置換、
    配列番号１のアミノ酸配列で５６１番目グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）アミノ酸残基がアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）アミノ酸残基に置換、または、
    これら全てによりさらに変異されたものである、請求項１に記載の変異型ポリペプチド。
  6. 前記変異型ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の変異型ポリペプチド。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  9. 請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチドを含むベクターからなる群より選択された１種以上を含む、微生物。
  10. 前記微生物は、Ｌ－ロイシン生産能を有するものである、請求項９に記載の微生物。
  11. 前記微生物は、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）である、請求項９に記載の微生物。
  12. 前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、請求項１１に記載の微生物。
  13. 請求項９に記載の微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－ロイシンの生産方法。
  14. 前記方法は、培養された培地または微生物からＬ－ロイシンを回収する工程を追加的に含む、請求項１３に記載のＬ－ロイシンの生産方法。
  15. 請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド；前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；および前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、または前記ベクターを含む微生物からなる群より選択された１種以上を含む、Ｌ－ロイシン生産用組成物。
  16. 請求項１～６のいずれか一項に記載の変異型ポリペプチド；前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；前記ポリヌクレオチドを含むベクター；および前記ポリペプチド、前記ポリヌクレオチド、または前記ベクターを含む微生物からなる群より選択された１種以上の、Ｌ－ロイシンの生産のための使用方法。
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