JP7543311B2 - 創傷治療のための新規な多糖類をベースとしたヒドロゲルスキャフォールド - Google Patents
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Description
本発明のヒドロゲルの調製は、コラーゲンを含む溶媒中への多糖類の溶解と、網状化するための架橋メカニズムの使用とを含む。
別の態様では、本発明は、本発明のヒドロゲルを含む創傷被覆材に関する。創傷被覆材によって、本発明のヒドロゲルを創傷と接触させて配置することができる。特定の実施形態では、創傷被覆材は、吸収性材料としての本発明のヒドロゲル及びバッキング層を含む。バッキング層は、創傷被覆材を通る微生物の通過に対するバリアを提供する。バッキング層は、液体不透過性であっても半透過性であってもよい。好ましくは、バッキング層は、酸素及び水蒸気に対しては透過性であるが、液体の水又は創傷滲出物に対しては透過性ではない。バッキング層はまた、微生物不透過性である。創傷被覆材はまた、吸収層に面するバッキング層上に接着剤層を含んでもよい。好ましくは、接着剤層は、吸収層から外向きに拡がり、バッキング層上に接着剤でコーティングされた縁部を形成する。接着剤層及び/又はバッキング層は、吸収パッドを創傷上に保持し、創傷の周囲の無菌環境の維持に役立つ。一般に、接着剤及びバッキング層は薄くて可撓性である。
本発明のヒドロゲル又は創傷被覆材は、創傷治療においてそれを必要とする対象に使用することができる。
本発明のヒドロゲルは、細胞の培養及び支持に好適である。したがって、本発明はまた、本発明のヒドロゲルと、藻類成長因子を含む培養培地とを含む細胞培養系にも関する。具体的には、細胞培養系は、多糖類ポリマーネットワーク及びコラーゲンを含むヒドロゲルと、藻類成長因子を含む培養培地とを含む。
低アシルジェランガム(Gelzan(商標)CM、G1910)、塩化マグネシウム(MgCl2、208337)、リン酸一ナトリウム(NaH2PO4、S8282)、水酸化ナトリウム(NaOH、S8045)、重炭酸ナトリウム(NaHCO3、S5761)、塩化カリウム(KCl、P9541)、低グルコース(D5523)及び高グルコース(D1152)ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、Accutase(登録商標)溶液(A6964)、ペニシリン/ストレプトマイシン(P4333)、パラホルムアルデヒド(PFA、P6148)、及び腫瘍壊死因子α(TNF-α)は、シグマ・アルドリッチ(米国ミズーリ州セントルイス)から購入した。塩化ナトリウム(NaCl、S34900)は、ユニケム社(インドマハーラーシュトラ州ムンバイ)から入手し、全ての塩は無水の形態で受領した。ラット尾由来1型コラーゲン(SC-136157)は、Santa Cruz Biotechnology,Inc.(米国テキサス州ダラス)から購入した。ウシ胎児血清(FBS)は、Hyclone(米国ユタ州サウスローガン)から入手した。脱イオン水は、Adrona Crystalのmultipurpose water pirification system(ラトビア、リガ)製の濾液であった。超高純度グレードのリン酸緩衝生理食塩水(10x PBS)は、Vivantis Technologies Sdn Bhd(マレーシアセランゴール州スバン・ジャヤ)から購入した。0.22μmのフィルターユニットは、ザルトリウス社(ドイツ、ゲッティンゲン)から入手した。CellTiter96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(MTS)は、プロメガ(米国ウィスコンシン州マディソン)から購入した。Triton-Xは、バイオ・ラッド ラボラトリーズ(米国カリフォルニア州ハーキュリーズ)から入手した。Phalloidin-iFluor 488試薬(ab176753)は、アブカム(英国ケンブリッジ)から入手した。4-ウェルチャンバスライド及びそれらのそれぞれのチャンバガラスカバーは、サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)から購入した。TSG-6 ELISAキットは、レイバイオテック(米国ジョージア州ピーチツリー・コーナーズ)から入手した。
ジェランガム溶液を、乾燥ジェランガム(Gelzan(商標)CM、G1910、シグマ・アルドリッチ)を0.762%(w/v)の濃度で水に溶解させて調製する。315μLのジェランガム溶液を、乾式熱浴上、90℃で30分間インキュベートする。次いで、ジェランガム溶液を、乾式熱浴上、37℃で少なくとも15分間インキュベートする。
3.1 流動測定法
ヒドロゲルのレオロジー特性評価は、プレート-プレート形状(直径=8mm、作業間隙=1mm)を使用した振動式レオメーター(MCR302、オーストリア、アントンパール)を用いて行った。各試験の前に、100μLの新たに調製したヒドロゲルをレオメーターのベースプレート上に迅速に移した。ヒドロゲル組成物当たり3つの異なる試料を使用して試験を行った。上部コーンプレートをベースプレートと1mmの間隔に下げた後、ヒドロゲル試料を1分間安定化させた。全ての測定は25℃で行った。
ゲル収率については、600μLのヒドロゲル(n=3)を拭き取り乾燥して、凍結乾燥の前に秤量した(Wi)。凍結乾燥したヒドロゲルを、37℃の脱イオン水600μLに60rpmで一定に撹拌しながら3日間浸漬した。次に、再構成された湿潤ヒドロゲルを、拭き取り乾燥して、再秤量した(Wr)。ゲル収率の百分率を、以下の等式に従って決定した。
細胞の挙動は、ヒドロゲルスキャフォールドの剛性に大きく影響される(Bischofs,I.B.及びU.S.Schwarz.PNAS,2003,100(16):9274~9279;Fratzl,P.及びF.G.Barth.Nature,2009,462(7272):p.442;Aheame,M.Interface focus,2014,4(2):p.20130038)。G’(貯蔵弾性率)が高くなるほど、材料は硬い。Engerらは、3,000Pa未満の貯蔵弾性率を有するより軟らかい材料では、自発的な分化が誘導されないことを示唆している(Engler,A.J.ら.Cell,2006.126(4):p.677~689)。一方、より軟らかいゲルは、細胞の付着を促進する細胞のコンテクストを確立しない場合があり(Discher,D.E.ら.Science,2005.310(5751):1139~1143)、2,000~3,000Paを超える貯蔵弾性率を有するヒドロゲルのみが、細胞の付着及び拡散を促進した(Yeung,T.ら.Cell motility and the cytoskelton,2005.60(1):24~34)。また、以前の研究では、既存のヒドロゲルネットワークへのゼラチン(コラーゲンの化学誘導体)の組み込みによって、その貯蔵弾性率が2.4~3.4倍増大することが示されている(Miao,Tetら.Journal of Materials Chemistry B 2015,3(48),9242~9249)。したがって、得られる相互貫入ポリマーネットワーク(IPN)ヒドロゲルの貯蔵弾性率が、細胞の拡散及び非自発的な分化に最適な範囲の中にあることを確実にするために、0.4%(w/v)のジェランガムと0.02%(w/v)のMgCl2の濃度を選択した(表1)。
3.4.1 方法
凍結乾燥したヒドロゲル試料を、まず液体窒素中で凍結させた後、それらの横断面で分割した。次いで、切開したヒドロゲルを、それらの断面が電子放射源に面した状態で、ピンスタブ上に迅速に載せた。その後、試料を金でスパッタコーティングして、JEOL JSM 6510走査電子顕微鏡(日本電子株式会社、日本東京都昭島)で検査した。最大の孔径を、内蔵スケールバーを参照して計算した。各標本の断面の少なくとも3つの異なる位置を撮像した。このプロセスを、3つの異なる光学ズームで繰り返した。
IPNヒドロゲルの多孔質構造は、封入された細胞と細胞外の培地との間の栄養素、代謝産物、及びその他の重要な調節分子の輸送を可能にする(図2A~C)。
3.5.1 方法
0.35gのNaH2PO4、0.68gのNaCl、2.5gのNaHCO3及び0.22gのKClを100mLの脱イオン水(pH=8.00±0.05)に溶解させて、疑似傷口液(SFW)を調製した。
質量変化%=(Wd/Wi)×100 (1)
Wi-初期の湿潤ヒドロゲルの重量
Wd-各タイムポイントにおける湿潤ヒドロゲルの重量
定性的な反転試験から、ジェランガム及びジェランガム-コラーゲンが透明な自由流動性溶液であることが示された。ジェランガム-コラーゲン混合物を37℃で30分間加熱した場合、その重さを保持することができる固体の塊が形成された。後続のMgCl2による架橋によって同じ固体の質量が保持された。エッペンドルフチューブを反転させた時に透明な内容物が流れなかった場合に、IPNヒドロゲルのゲル化が定性的に示された(図2D~E)。
4.1 封入された細胞の細胞付着の評価方法
形態学的検討のために、1000細胞/μLを含有する200μLのヒドロゲルを、8チャンバ(HDF)及び4チャンバ(幹細胞)のガラススライド(n=2)の各ウェルに加えた。400μLの培地を各HDF担持ヒドロゲルに添加し、一方、800μLの培地を各幹細胞担持ヒドロゲルに添加した。細胞を染色し、同じ日(0日目)に画像化した。様々な継続時間でインキュベートした細胞を可視化するために、それらをカウントダウン様式で播種した。
コラーゲンを含まないジェランガムヒドロゲル上で培養された高密度線維芽細胞(HDF)(下パネル)は、0日目から7日目まで顕著には広がらず、増殖しない。対照的に、コラーゲンを含むジェランガムヒドロゲル上で培養されたHDFは、広がって増殖することができる(細胞密度の増加によって示される)。
5.1 封入された細胞の細胞増殖の評価方法
ヒドロゲル中に封入された哺乳類細胞株の細胞生存率を決定するために、MTS(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5(3-カルボキシメトキシフェニル)-2(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム)アッセイを行った。生存した、したがって代謝活性な細胞は、それらのミトコンドリアの脱水素酵素によって、MTSを褐色のホルマザン生成物に変換することができる。
図4に示すように、HDFを純粋なジェランガムヒドロゲル(全血清)中に封入した場合、細胞の成長は阻害されたが、細胞死は観察されなかった。CGFは、細胞の生存率を改善したが、それを有意には改善しなかった。
6.1 スクラッチアッセイの方法
IPNヒドロゲル中に封入されたADSCが、TNF-αのような炎症性サイトカインに曝露された際にパラクリン創傷治癒因子を分泌できるかどうかを評価するために、in vitroで2Dスクラッチアッセイを行った。まず、6×105個の封入されたADSCを含有するIPNヒドロゲル600μLを、2mLの無血清DMEM中で72時間インキュベートして、ADSC平衡化培地を調製した。合計10mLのADSC平衡化培地を、透明で円形の平底6ウェルプレートの5つの別個のウェルから回収した。ゲル平衡化培地を、無細胞IPNヒドロゲルを使用して同じ方法で調製した。培地を回収した後、それらを1500rpmで10分間遠心分離して、上澄みを次に使用するまで-80℃で保存した。FBSを補充した非平衡化培養培地を、陽性対照(通常培地)として使用し、FBSを含まない非平衡化培養培地を陰性対照(無血清培地)として使用した。全ての培養培地は、TSG-6の分泌を誘導するために10ng/mLのTNF-αを含有する。
%創傷閉鎖=(Li-Lc)/Li×100;
Liは、創傷の間隙の初期の長さを表し、
Lcは、各時点における創傷の間隙の長さを表す。
血清中に見られる生化学的前駆体に応答して、HDFはインキュベーションの48時間後に「創傷領域」の82.4±2.57%まで移行して被覆した。一方、血清の補充がない場合、HDFの移行は有意に阻害され、18.9±3.93%のみの創傷閉鎖率であった。対照的に、ADSC平衡化無血清培地は、HDFに対して走化性の刺激を与えるように思われ、実験の継続時間にわたって71.5±2.08%まで「創傷閉鎖」を促進した(図7A~B)。無細胞IPNヒドロゲルは、細胞増殖又は移行を促進することができる何の基質も提供しなかった。48時間のインキュベーションの後、ゲル平衡化培地に曝露されたHDFの創傷閉鎖率(%)は22.1±6.21%のみであった。これらの結果は、IPNヒドロゲル中に封入されたADSCが、有意にHDFの成長及び移行を誘導する生理活性因子を分泌したことを示唆した。このことは、生理学的な創傷治癒プロセスにおける創傷の閉鎖速度の向上と相関する可能性がある。
7.1 方法
TNF-αで刺激したADSC担持IPNヒドロゲル(n=5)から放出された抗炎症TSG-6タンパク質の定量を、製造元のプロトコルを使用して、RayBiotech(米国ジョージア州ピーチツリー・コーナーズ)のELISA試験キットで試験した。
TSG-6は、ADSCによって分泌される強力な抗炎症性パラクリンである。IPNヒドロゲル中に封入されたヒトADSCからのヒトTSG-6の検出は、全体的な生物学的創傷被覆材構築物が、適用されて熱傷上で創傷サイトカイン、TNF-αに曝露されると、抗炎症性パラクリンを放出し、潜在的な抗炎症性パラクリン活性を示すことを示唆している。
5%イソフルラン(Attane(商標)、JD Medical、米国)で吸入誘導麻酔を行い、1.5%のイソフルランを維持した。Veet(商標)の除毛クリーム(Reckit Benckiser Group、英国)を使用して、マウスの右下後背部領域の毛髪をきれいに除去した。完全な厚さの熱傷を形成した。術前に、皮下(SC)でブプレノルフィン(0.1mg/KgBW)を、熱傷創傷形成の30分前に投与した。次に、ステンレス鋼製バー(96.2g)を100℃の水浴中で15分間熱した後、6mm×5mmのテンプレート熱表面を各マウスの剃毛した後背部に30秒間置いた。術後に、SCでブプレノルフィンを、8時間毎に48時間投与した。その後、痂皮を除去して熱傷を切除し、次いで創傷を60μLのヒドロゲルで処置した。コントロールを含む全ての創傷を、その上から続発性のテガダームの創傷被覆材で被覆した。鎮痛用のSCのブプレノルフィンを、獣医による次の評価まで12時間毎に投与した。実験を通して、マウスは環境エンリッチメントなケージに別々に収容した。参照された時点で、それらをCO2吸入させ、頚椎脱臼を行って安楽死させた。
Claims (12)
- 創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための、ジェランガムポリマーネットワークとコラーゲンとを含む、ヒドロゲルであって、
前記ヒドロゲルは、架橋コラーゲンとジェランガムポリマーとを含む完全な相互貫入ポリマーネットワークを含み、
前記ヒドロゲルは、0.2%(w/v)~5%(w/v)のジェランガム及び0.2%(w/v)未満のコラーゲンを含み、
前記コラーゲンが前記ジェランガムポリマーの架橋の前に架橋されている、ヒドロゲル。 - 25℃、1Hzで測定されたヒドロゲルの貯蔵弾性率(G’)が、100~5000Paである、請求項1に記載のヒドロゲル。
- 0.1%(w/v)以上0.2%(w/v)未満のコラーゲンを含む、請求項1又は2に記載の使用のためのヒドロゲル。
- 0.2%(w/v)~2.5%(w/v)のジェランガムを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の使用のためのヒドロゲル。
- 前記ジェランガムヒドロゲルがMg2+によって架橋されている、請求項1~4のいずれか一項に記載の使用のためのヒドロゲル。
- 前記ヒドロゲルが藻類成長因子を更に含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の使用のためのヒドロゲル。
- 前記藻類成長因子がクロレラ成長因子である、請求項6に記載の使用のためのヒドロゲ
ル。 - 0.1~1%のクロレラ成長因子を含む、請求項7に記載の使用のためのヒドロゲル。
- 請求項1~8のいずれか一項に記載のヒドロゲルを含む、創傷被覆材。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のヒドロゲルと、藻類成長因子、好ましくはクロレラ成長因子と、を含む創傷被覆材。
- 薬学的に許容される担体を更に含む、請求項9又は10に記載の創傷被覆材。
- 創傷治療においてそれを必要とする対象に使用するための、請求項9~11のいずれか一項に記載の創傷被覆材。
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