JP7541370B2 - 効率的な遺伝子送達用途のための非毒性hsvベクター及びその製造のための補完細胞 - Google Patents
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Description
本願は、2013年7月17日に出願された米国仮特許出願第61/847,405号の優先権を主張し
、該出願の内容全体が、全体として、本明細書中に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号PO1DK044935及び5RO1NS064988に基づく政府のサポートを利用してなされた。政府は、本発明における所定の権利を有
する。
多数のウイルス性及び非ウイルス性遺伝的ベクターシステムのうち、単純ヘルペスウイルス(Herpes Simplex Virus, HSV)をベースとするベクターは、ヒトの患者における可
能性のある治療上の使用を含め、遺伝子移入(transfer)ベクターとしての使用のために調査されてきた。HSVは、極めて広範囲のヒト及び動物細胞に感染可能な、複雑な非統合
(non-integrating)DNAウイルスである。ウイルスゲノムは、80を超える遺伝子を含み、2つの固有のセグメント、UL及びUsで構成され、それぞれ重要な(critical)ディプロイド(diploid)遺伝子をコードする逆位リピート(inverted repeats)に隣接する。HSV複製の重要な特徴は、その遺伝子が次々に(in waves)発現することであり、カスケード調節(cascade regulation)と呼ばれる(Rajcani, Virus Genes, 28: 293-310 (2004)
)。不可欠な前初期(immediate-early, IE)遺伝子ICP27及びICP4の除去(removal)に
より、ウイルスの完全欠損(virus completely defective)状態、並びに、ウイルスゲノム複製に関与する初期(E)遺伝子及び子孫ウイルス粒子の組み立て(progeny virion assembly)において働く後期(L)遺伝子を発現できない状態となる。これらの複製欠損ウ
イルス(replication-defective viruses)は、補完細胞(complementing cells)において培養することができ、該補完細胞は、欠落したICP4及びICP27遺伝子産物を発現し(補
完し(complement))、ウイルスゲノムが安定な核エピソーム(nuclear episome)とし
て定着する(takes residence)非補完細胞にその後、感染させるために使用することが
可能である。しかしながら、ICP0及びICP22 IE遺伝子を保存するベクターは、細胞に毒性(toxic)があるが、これらの遺伝子、特にICP0遺伝子の不活化(inactivation)又は欠
失(deletion)は、導入遺伝子発現を妨げる。
となく、任意の組織又は細胞においてインビトロ(in vitro)又はインビボ(in vivo)
で導入遺伝子を発現可能なHSVベクターの必要性が依然としてある。
本発明は、多種多様な組織又は細胞(特に哺乳類)において、有害なウイルス遺伝子を全く発現することなく、導入遺伝子をインビトロ又はインビボで発現するための機会をもたらす、HSVベクター操作(engineering)におけるブレイクスルーに関する。本発明のHSVベクターは、非補完細胞において有害なウイルス遺伝子を全く発現せず、それにもかか
わらず活発な(vigorous)、持続性の(例えば、少なくとも28日間、及び好ましくは少なくとも60日間等、少なくとも14日間)導入遺伝子発現が可能である。HSVは、一般的な(general)又は細胞特異的なプロモータによって制御された大きなただ一つ又は複数の導入
遺伝子発現カセットを、ベクターの統合(vector integration)をすることなく、高効率の感染特性で運ぶという性能(capability)に結び付く唯一のベクターであるため、それ自体が、ベクター技術における極めて重要なニッチ(niche)を埋める。本発明のベクタ
ーは、効率的なベクターがこれまでのところ全く利用可能でない肝臓等の組織への効率的な遺伝子の搬送を可能にするだろう。
し、ベクターは、非補完細胞において少なくとも28日間、導入遺伝子を発現することができる。本発明のベクター(vctor)は、ゲノム内において1以上のインシュレーター配列
(insulator sequences)に作動可能(in operable)に連結して(connection with)挿
入された導入遺伝子を含み得、ベクターは、前初期遺伝子(immediate early genes)と
してICP0、ICP4、ICP22、ICP27及びICP47を発現しない。導入遺伝子を制御するプロモー
タの活性に応じて、本発明のベクターは、ウイルス遺伝子発現に関連付けられた細胞毒性(cytotoxicity)を伴わずに、感染し得る任意のタイプの哺乳動物(特にヒト)細胞において導入遺伝子を発現し得る。
以下の特許及び刊行物は、様々なHSVベクター技術に関するものであり、参照すること
によって本明細書中に組み込まれる。米国特許第5,658,724号は、ICP4及びICP27を欠損するHSV株、並びにその製造、増殖、及び使用のための方法に関する。米国特許第5,804,413号は、ICP4、ICP27、及びICP0をコードするDNAを含む細胞株に関する。米国特許第5,849,571号は、潜在活性(latency active)ヘルペスウイルスプロモータ及びその使用に関す
る。米国特許第5,849,572号は、LATプロモータを含むHSV-1ベクターに関する。米国特許
第5,879,934号は、ICP4及びICP27遺伝子産物が欠損を有する(defective)ように、ICP4
及びICP27遺伝子内にゲノム変異を含む組み換えHSVベクターに関する。米国特許第5,998,174号は、HSVベクターを作製する方法に関する。米国特許第6,261,552号は、天然の(native)TAATGARAT配列内に欠失又は変異を有するHSVゲノムを含み、これにより、前記ゲノ
ムがHSV ICP4遺伝子産物を含む細胞内にある場合に、前記欠失又は変異が前記ゲノム内の天然の前初期遺伝子の発現の動態を遅延させるHSVベクターに関する。米国特許第7,078,029号は、ICP4遺伝子産物の存在下では、天然の前初期遺伝子が遅延された動態でゲノムから発現されるように、TAATGARAT配列に変異があるゲノムを有するHSVに関する。米国特許第7,531,167号は、ICP4、ICP27、及びUL55遺伝子のみに欠失を含むHSVベクターに関する
。米国特許出願公開第2013/0096186号は、変異gB及び/又は変異gH糖タンパク質を含むHSVベクターに関する。国際特許出願公開第WO1999/06583号は、非天然のリガンドを含むエ
ンベロープ(envelope)を含むHSVに関する。
かつ、導入遺伝子の持続性(persistent)発現が可能な単純ヘルペスウイルス(HSV)ベ
クターを提供する。例えば、本発明のHSVベクターは、培養されたヒト皮膚線維芽(HDF)細胞において少なくとも28日間、及び好ましくは少なくとも60日間等の少なくとも14日間、導入遺伝子を発現することができる。望ましくは、本発明のベクターからの導入遺伝子のかかる発現は、かかる細胞内にICP0遺伝子産物が全く存在しない状態等、かかる細胞内に測定可能な(measurable)ICP0遺伝子産物が存在しない状態で起こる。具体的な実施態様では、LAT P2エレメント及びCTRL2エレメントの間であり、かつCTRL1及びCTRL2の両
方を有するLAT領域に挿入された導入遺伝子(例えば、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP
)又は別のマーカーをコードする)を有する本発明によるベクターが、同一の遺伝的変異を有するがかかる導入遺伝子がUL3及びUL4の間に挿入されるベクターが発現可能なレベルと比べて、感染7日後の定量RT-PCRによって決定される場合に、少なくとも20(又は少なくとも約20)倍の導入遺伝子を発現することができ、かつ、感染3日後の定量RT-PCRによ
って決定される場合に、少なくとも30(又は少なくとも約30)倍の導入遺伝子を発現することができる。図13及び32参照。かかるベクターは、望ましくはかかる導入遺伝子をかか
るレベルで、かつ、導入遺伝子がCMVエンハンサ/ニワトリベータ-アクチンプロモータ/キメライントロン(chimeric intron)の作動可能な制御(operable control)下であるか
かる期間、発現する。本発明のHSVベクターに感染したかかる期間、かかる細胞が培養可
能であることが、ベクターがかかる細胞に対して毒性を有していないことの証拠(evidence)でもある(すなわち、毒性の天然HSV遺伝子を細胞内に発現しない)。いうまでもな
く、非補完細胞(または複数の該細胞)が別の細胞タイプであってもよく、治療用途の対象であるインビボの細胞であってもよい。
、(a)潜伏関連転写(LAT)遺伝子領域内、(b)ICP4遺伝子座(及び好ましくは、本明
細書に説明されたように、ジョイントが欠失される場合、1つのみ)内及び/又は(c)
ゲノム内において1以上のインシュレーター配列に操作可能に連結されたベクターのゲノム内、に挿入される。好ましくは、ベクターは、前初期遺伝子として、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しない(いくつかの実施態様では、ICP47を発現することが、望ましくあり得るが)。理論に拘束されることを望むものではないが、導入遺伝子内のプロモータの活性に応じて、本発明のベクターが、ウイルス遺伝子発現に関連する細胞毒性を伴うことなく該ベクターに感染し得る任意のタイプの哺乳動物(特にヒト)細胞において導入遺伝子を発現し得ると思われる。本発明のベクターは、単離されたDNA、細胞内のDNA、又はウイルスのエンベロープにパッケージされた(packaged)DNAとして存在し得る
。
、本発明のベクターのゲノムは、これらの遺伝子の1又は全ての不活性化変異(inactivating mutations)(例えば、欠失)(例えば、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47遺
伝子のうちの1以上のコーディング配列内の欠失又は完全な該コーディング配列の欠失(好ましくは少なくともICP0、ICP4、及びICP27の不活化欠失を含み、より好ましくはICP0
、ICP4、ICP27及びICP47の不活性化欠失を含む)、あるいはかかる遺伝子(複数可)のプロモータ又は他の調節配列も代替的に含む欠失)を含むように操作され得る。あるいは、1以上のこれらのHSV遺伝子は、初期又は後期遺伝子として発現されるように操作され得
る。例えば、本発明のベクターのいくつかの実施態様のゲノムは、より多くのこれらの遺伝子のコーディング配列のうちの1つ(one of more)を保持するが、ただし、該遺伝子
を、初期(ベータ)又は後期(ガンマ)として発現されるが前初期(アルファ)遺伝子としては発現されない状態にするプロモータで、そのプロモータを置き換えるように操作され得る。例えば、かかる遺伝子は、ICP4に対して応答性のプロモータの制御下に置かれ得る(少なくともICP22を、前初期遺伝子ではなく初期遺伝子として発現するための、ICP22に関する好ましいアプローチ)。初期(ベータ)動態でかかる遺伝子を発現するための適切なプロモータは、HSV tkプロモータである。ICP22プロモータは、切断(truncation)
、言い換えれば、TAATGARATを含む調節配列の欠失によって初期動態に転換され得る。完
全なICP47プロモータ及び開始コドンは、欠失され得る。あるいは、いくつかの実施の態
様では、ICP47遺伝子は、前初期遺伝子として発現されて、感染した細胞を免疫認識(immune recognition)から保護し得る(Hill er al, Nature 1995, 375(6530): 411-415
; Goldsmith et al, J Exp Med. 1998; 187(3): 341-348)。
くは本発明のベクターは、UL41(すなわち、宿主シャットオフ(host shut-off)(vhs)遺伝子)も発現しない。UL41は、多数のホストmRNA及びウイルスmRNAを分解するRNA分解
酵素(RNAse)であり、ホスト細胞のタンパク質合成の急速なシャットオフを引き起こし
、ビリオンテグメントコンポーネント(virion tegument component)として細胞に進入
する。従って、例えば、UL41をコードする遺伝子は、本発明のベクターのゲノムから欠失
され得る。理論によって拘束されることを望むものではないが、かかる操作は、補完するための(complementing)ICP4及びICP27 mRNAをとっておく(sparing)ことにより、補完細胞において増殖させるための本発明のベクターの能力を更に強め、導入遺伝子mRNAをとっておくことにより、非補完細胞において導入遺伝子の発現を強めると思われる。
例えば、MacDonald, J Virol, 86(11): 6371 (2012); McGeoch, J. Gen. Virol, 69: 1531-1574 (1988); GenBank Accession No. JQ673480; NCBI Reference Sequence: NC_001806.1 ; MacDonald, J Virol 86(17); 9540 (2012); GenBank Accession No. JX 142173、該文献は、参照することによって本明細書中に組み込まれる)。それゆえに、HSV遺伝子及び遺伝子座の配列の操作は、通常の技術のレベルの範囲内である。
これらの公開された配列は、単なる例であり、他の株、又はHSVの変異型(variants)が
、本発明のベクターの操作においてソースゲノム(source genome)として使用され得る
ことも留意する必要がある。
ターのゲノムをバクテリア内において増やすこと(propagation)及び操作することが容
易になる。BACカセットは、細菌株の使用を補助する、細菌によって発現される(bacterially-expressed)配列、例えば、抗生物質(antibiotics)又は毒素(toxins)に対する
細菌の耐性を付与する遺伝子(例えば、好ましくはクロラムフェニコールだが、他の耐性遺伝子(例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ゼオシン(zeocin)等のための耐性遺伝子)も採用され得る)等、選択可能な遺伝子を含み得る。BACカセットは、構成的(constitutive)哺乳動物プロモータ(例えば、SV40、RSV、CMV、ユビキチンC(ubiquitinC, UbC)、CAG、又はβ-アクチンプロモータ等)等の真核性(eukaryotic)プロモータの
制御下において、レポーター遺伝子(例えば、LacZ(ベータガラクトシダーゼ(beta-galactosidase)をコードする)、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子(例えば、gfp(
緑色蛍光タンパク質をコードする)、yfp(黄色蛍光タンパク質をコードする)、rfp(赤色蛍光タンパク質をコードする)、及びそのアナログ(analogues)(例えば、iRFP、EGFP等をコードする))を更に含み得る。
部位/コンセンサス配列(例えば、cre、dre、flp、KD、B2、B3、R等の酵素によって認識
される配列)等の、BACカセットの除去を促進する配列に隣接する(flanked)。BAC配列
が培養細胞におけるウイルスの増殖量を減少させることが示されているため、望ましくは、かかる部位を含めることにより、BACカセットの切除(excision)が容易になる(例え
ば、Gierash, J Virol. Meth., 135: 197-206 (2006))。また、BACカセットは約11kbのオーダーであるため、BACカセットの切除により、1以上の導入遺伝子を組み込むベク
ターの性質が向上し得る。本発明のベクターは、リコンビナーゼ酵素のためのコンセンサス配列(例えば、loxP)、特にHSVゲノムにとって天然ではない配列、例えば、リコンビ
ナーゼ酵素のための1コピーのコンセンサス配列をHSVゲノム内(例えば、かかる配列がBACカセット挿入位置であったなら、UL37-UL38遺伝子間領域内)に残すような、適切な部
位特異的リコンビナーゼを発現する細胞株を用いてBACカセットを切除した(excizing)
結果の配列、も有し得ることが理解されるだろう。
ーター配列に操作可能に連結して挿入された少なくとも1の導入遺伝子を含み得る。「操
作可能に連結される(operably connected)」ことにより、HSVゲノム内に存在する遺伝
的エレメント(すなわち、「遺伝子(genes)」)が転写においてサイレント(transcriptionally silent)である細胞環境において、1以上のインシュレーター配列が、導入遺
伝子を発現することを可能にするということは理解すべきである。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、かかるインシュレーター配列がかかるインシュレーター配列及びその約1kbから約5kbの範囲内の部位におけるヘテロクロマチン形成を防止すると思われる。(該ヘテロクロマチンは、形成されれば、遺伝子発現を抑制(silences)する。)従って、本発明のベクターにおける使用のためのインシュレーター配列は、通常、ヘテロクロマチンの結合又は形成を阻害する配列であり、該ヘテロクロマチンは、そうでなければ、導入遺伝子の発現を抑制するだろう。適切なインシュレーター配列の限定されない例としては、HSVクロマチン境界(CTRL/CTCF結合/インシュレーター)エレメントCTRL1及びCTRL2(本明細書中に説明された通り、LAT遺伝子座に対する天然のものであり得、又はゲノム内において異所位置(ectopic location)に移動(moved)され得る)、ニワトリ高
感受性部位(chicken hypersensitive site)4インシュレーター(cHS4)、ヒトHNRA2B1--CBX3ユビキタスクロマチンオープニング(ubiquitous chromatin opening)エレメント
(UCOE)、及びヒトインターフェロンベータ遺伝子(IFNB1)からのスキャッフォールド
(scaffold)/マトリックス結合領域(matrix attachment region)(S/MAR)が挙げられる(Emery, Hum. Gene Ther. 22, 761- 74 (2011); Antoniou et al, Hum. Gene Ther.
24, 363-74 (2013))。
して(LAT領域内のCTRL1及びCTRL2配列等)、インシュレーター配列は、任意の適切な部
位においてベクターゲノムに挿入され得る。これらのインシュレーター/境界エレメント
は、標準的な方法によって本発明のベクターのゲノムに導入され得、既定の(given)導
入遺伝子カセットを挟み、又はそうでなければ既定の導入遺伝子カセットに操作可能に連結されるように、導入遺伝子と同じカセットに含まれ得、又は別々にゲノムに導入され得る。従って、例えば、導入遺伝子に隣接するLAT領域、又はそうでなければ導入遺伝子に
操作可能に連結されたLAT領域において、天然に発見されたインシュレーター配列と機能
的に同様の1以上の異所性(ectopic)インシュレーター配列を含む遺伝的カセットを挿
入することができる。本発明のベクターは、多数のインシュレーター配列に操作可能に連結された多数の導入遺伝子を含み得、該インシュレーター配列は、LATに対して異所性の
部位を含むと理解されるだろう。1以上の導入遺伝子がLAT以外の部位に挿入され、かつ
、CTRL1及び/又はCTRL2に操作可能に連結された実施の態様では、LATから欠失させ、又
はLAT内のCTRL1及び/又はCTRL2配列を突然変異させて、LAT内の天然の配列と本発明のベクターの異所性(非LAT)部位内において導入遺伝子に操作可能に連結するように操作さ
れた配列との間の組み換えの発生を最小限にし、又は除去(eliminate)することが望ま
しい。CTRL1及びCTRL2がLAT内に残ったとしても異所に移動したとしても、導入遺伝子が
本発明のベクターのゲノムに挿入されるための好ましい部位は、CTRL1及びCTRL2の間である(例えば、CTRL1及びCTRL2のそれぞれの約1~4kb内において、CTRL1及びCTRL2が、導入遺伝子に隣接する)。
発現されるように、本発明のベクター内において、1以上のかかるインシュレーター配列が、導入遺伝子に操作可能に連結される。通常、導入遺伝子及びインシュレーター配列(複数可)が、約5 kb未満、又は約4 kb未満、又は約3 kb未満、又は約2 kb未満、あるいは約1 kb未満だけ離れるように等、ゲノム内においてごく接近している必要がある。インシュレーター配列が対象の導入遺伝子(複数可)に隣接するように、発現カセット(導入遺伝子を含む)が、機能的には2つのインシュレーター配列の間であることも望ましくあり得る(例えば、Emery, Hum. Gene Ther. 22, 761-74 (2011); Antoniou et al., Hum.
Gene Ther. 24, 363- 74 (2013)参照)。
シュレーター)エレメントの間に挿入されたベクターゲノムのLAT遺伝子領域内における
インシュレーター配列の間である(Amelio et al, J Virol 2006, 80(5): 2358-2368
; Bloom, Biochim. Biophys. Acta, 1799: 246-256 (2010))。この領域は、本明細
書中においてLAT(遺伝子)領域又は遺伝子座と呼ばれる。従って、望ましくは、本発明
のベクターのゲノムは、CTRL1及びCTRL2を含む(例えば、保持する)(図7、最上段参照
)。理論に拘束されることを望まないが、CTRL1及びCTRL2があることが、ヘテロクロマチン形成から領域を保護し、ひいては、導入遺伝子の発現のための特別な部位(privileged
site)としてのLAT遺伝子領域に寄与すると思われる。従って、ベクターは、非補完細胞においてLAT遺伝子領域に挿入された導入遺伝子を発現する。好ましい実施態様では、ベ
クターは、LAT遺伝子領域内に複数の導入遺伝子カセットを含み、各LAT遺伝子領域が別個のプロモータ及びコーディング領域を含み、それぞれがモノシストロニック又はポリシストロニック(mono- or polycistronic)であり得る。
が好ましい。再び理論に拘束されることは望まないが、LATP2又はLAP2エンハンサエレメ
ントがあることが、コーディング配列(複数可)を長期間発現するというLAT遺伝子領域
内の導入遺伝子の能力に寄与すると思われる(Goins, J. Virol., 73: 519-532 (1999
); Lilley, J. Virol, 75: 4343-4356 (2001))。特に好ましい実施の態様では、LAT遺伝子領域内における導入遺伝子(複数可)がLATP2又はLAP2エンハンサエレメントの下流に挿入される。しかしながら、本発明は、導入遺伝子(複数可)がLATP2又はLAP2エン
ハンサエレメントの上流(LAT転写の方向に対して)に挿入される実施の態様を予期する
(contemplate)。望ましくは、導入遺伝子が、LAT遺伝子領域内においてLATP2又はLAP2
エレメントから離れた方向を向く(points)(例えば、図7、最上段参照)。
て少なくとも短期間、活性がある。
性のインシュレーター配列を含む遺伝的カセットを挿入することが可能である。本発明のベクターが多数の導入遺伝子を含み得ることが理解されるだろう。
節(regulate)するために望ましい任意のプロモータであり得る。例えば、プロモータは、特異的又は選択的に(preferentially)規定の細胞タイプにおいて(例えば、肝細胞、肺細胞、上皮細胞、心臓細胞、神経細胞、骨格筋細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、又は他の幹細胞、癌細胞等内において)遺伝子を発現するプロモータ等、細胞特異的又は
組織特異的プロモータであり得る(例えば、EOS、OCT4、Nanog(ESC/iPSC用)、SOX2(神経幹細胞用)、αMHC、Brachyury、Tau、GFAP、NSE、Synapsin I(ニューロン用)、Apo A-I、アルブミン(Albumin)、ApoE(肝臓用)、MCK、SMC α-Actin、ミオシン重鎖(Myosin heavy chain)、ミオシン軽鎖(Myosin light chain)(筋肉用)等)。感覚ニュー
ロンにおける使用のための好ましいプロモータとしては、TRPV1、CGRP、及びNF200が挙げられる。他の実施態様では、本発明のベクターに挿入された導入遺伝子内のプロモータが、誘導プロモータであり得る(例えば、LATにおいて別個のプロモータからのrtTA3G発現
と組合せられた(combined)TRE3G、又は当分野において知られた他の誘導プロモータ)
。いうまでもなく、本発明のベクターに挿入された導入遺伝子発現カセット内のプロモータは、当分野において知られたもの等(例えば、SV40、CMV、CAG、EF1α、UbC、RSV、β
アクチン(β-actin)、PGK等)の構成的哺乳動物プロモータであり得る。
部位(4個が典型的である)等のかかるmicroRNAのためのタンデム結合部位(tandem binding sites)を含む。かかる部位、特にかかるmicroRNAのためのタンデム結合部位があることにより、いくつかの細胞タイプにおいて導入遺伝子発現の下方調節(down-regulation)が促進される。従って、例えば、癌又は腫瘍細胞において発現させることが望ましい
導入遺伝子を含むベクター(多くの細胞タイプに対する毒性があり得る)は、導入遺伝子の発現が、悪性でない(non-malignant)細胞において抑制されるように、「正常な(normal)」(すなわち、悪性でない)細胞のmicroRNAの結合部位を含み得る。
モノシストロニック又はポリシストロニック導入遺伝子ユニット(units)(好ましくは2の別々の導入遺伝子ユニットだが、場合によりそれより多い(例えば、3、4、5、又はよ
り多い別々のユニット))を含み得、それぞれの導入遺伝子ユニットが、それ自身の各プロモータ、翻訳される配列(複数可)又は非翻訳RNA配列(複数可)、及び他の調節エレ
メントを有する。
配列は、ベクターが導入される予定の、既定の細胞内に発現されることが望ましい任意の配列であり得る。本発明のベクター内における導入遺伝子中に存在し得る転写される配列の限定されない例としては、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、L-myc、ドミナントネガティブp53、Nanog、Glis1、Lin28、TFIID、GATA4、Nkx2.5、Tbx5、Mef2C、Myocd、Hand2、SRF、Mesp1、SMARCD3、SERCA2a、Pax3、MyoD、Lhx2、FoxG1、FoxP2、Isl1、Ctip2、Tbr1、Ebf1、Gsx2、Srebp2、Factor VIII、Factor IX、Dystrophin、CFTR、GlyRα1、エンケファリン
、GAD67(又は他のGADアイソフォーム(isoforms)、例えば、GAD 65)、TNFα、IL-4、
神経栄養因子(neurotrophic factor)(例えば、NGF、BDNF、GDNF、NT-3)、Ascl1、Nurr1、Lmx1A、Brn2、Myt1l、NeuroD1、FoxA2、Hnf4α、Foxa1、Foxa2又はFoxa3、任意のmicroRNA又はmiRNAの組みあわせ(例えば、hsa-mir-302/367遺伝子クラスター(cluster);hsa-miR200c;hsa-miR369;hsa-mir-124)及び/又は1以上の他のノンコーディング(non-coding)RNA(「ncRNA(複数可)」)あるいは、LacZ(ベータガラクトシダーゼをコー
ドする)、CAT (クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(acetyltransferase)をコードする)、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝子(例えば、GFP、YFP、RFP、及びiRFP、EGFP等のそのアナログ等)等の、哺乳動物細胞における発現のためのレポーター遺伝子が挙げられる。
レーター配列の近く以外の部位に挿入された発現カセットも所望により含み得る。かかる発現カセットのための好ましい部位は、ICP4である。例えば、ベクターがICP4遺伝子の完全な欠失又は不活性化欠失を含む場合、発現カセットは、ICP4欠失の部位に挿入され得る。望ましくは、LAT領域以外の部位に挿入された発現カセットのコーディング配列は、構
成的哺乳動物プロモータによって制御されるが(例えば、SV40、CMV、CAG、EF1α、UbC、RSV、β-アクチン、PGK等)、必要に応じて、他のプロモータ(本明細書中において説明
され、そうでなければ当分野において知られているように)が使用され得る。1の例示的発現カセットとしては、欠失したICP4遺伝子座に操作されたmCherry発現を引き起こす(driving)UbCpが挙げられる。いうまでもなく、かかる導入遺伝子は、治療上の対象である因子も同様にコードし得る。
部リピート(ジョイント)領域の欠失を含む。この領域を欠失することは、ベクターゲノムの安定性に寄与し得、HSV DNAのこの配列を欠失することは、ベクターを大きな導入遺
伝子(少なくとも15 kb)に適合させ(accommodate)、それでも成熟ウイルス粒子(mature virions)に正確にパッケージ(packaged)することも可能にする。ジョイントの欠失は、残るコピーが容易に操作され得るように、IE遺伝子ICP0及びICP4のそれぞれ1コピーを除去する。そのことは、ICP22又はICP47前初期遺伝子のためのプロモータも欠失させる。必要に応じて、ICP47遺伝子の発現は、前初期プロモータ、好ましくはICP0プロモータ
又はHCMV主要(major)IEプロモータの挿入によって復元(restored)されて、感染した
細胞の免疫認識を最小限にし得る(Hill er al, Nature 1995, 375(6530): 411-415;
Goldsmith et al, J Exp Med. 1998; 187(3): 341-348)。
、幅広い適用可能性(applicability)を有する。しかしながら、感染性(infectivity)を強めるため、望ましくは本発明のベクターのエンベロープとしては、野生型糖タンパク質と比較して感染性及び/又は水平伝播性(lateral spread)を強化する変異糖タンパク質が更に挙げられ得る。別の方法として又は加えて、本発明のベクターのエンベロープが、非古典的受容体を介する細胞へのHSVの進入を誘導する(directs)変異糖タンパク質を更に含み得る。例えば、かかる変異糖タンパク質(複数可)は、gB、gC、gD、gH、又はgKであり得、いうまでもなく、ベクターは、1より多いかかる変異(進入性(penetration)又は展開性が強められた)糖タンパク質(例えば、2、それ以上、又はその全てすら組み
合わせたもの)を有し得る。更に、かかる糖タンパク質を突然変異させてHSV感染性及び
/又は水平展開性を強化するための技術は知られており、任意のかかる技術が本発明の関連において採用され得る(例えば、米国特許出願公開番号2013-0096186A1 ;国際特許出
願公開番号WO/1999/006583、Uchida, J. Virol., 84: 12200-12209 (2010), Uchida et al., J. Virol., 87(3). 1430-42 (2013)、及びUchida, Mol. Ther., 21: 561-569 (2013)参照。該文献は、参照することによって本明細書に組み込まれる)。更に、本発明のベクターのゲノムは、かかる変異糖タンパク質(複数可)をコードする変異遺伝子を含み得る。
のLAT領域に挿入され得ることが予期される(例えば、図7、最上段参照)と理解される。
多能性幹細胞を作り出すことである。幹細胞は、近年の生物医学研究の最前線であり、ヒトの発生、遺伝的疾患(genetic disease)の理解及び再生医療において新たな治療法を
作り出すことのための多くの明るい見通しを支えてきた。2006年には、Yamanakaらが、成体(adult)線維芽細胞を初期化することにより、ES細胞のような幹細胞(embryonic-like stem cells)を作り出す方法を発見した(Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663-76, 2006)。これらの新規な細胞は、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem, iPS)と呼ばれ、機能的にはES細胞と同様であり(Wernig et al, Nature 448: 318-24, 2007)、ヒト体細胞に由来する場合(Takahashi et al, Cell 131 : 861-72, 2007; Yu et al, Science 318: 1917-20、 2007)、ヒトES細胞の使用に伴う倫理的な問題を回避
する。最初は、4の初期化遺伝子がiPS細胞の作製のために用いられた(Takahashi and Yamanaka, Cell 126: 663-76, 2006; Takahashi et al, Cell 131 : 861-72, 2007、が
これらの又は他の遺伝子を用いる初期化の効率は、効率の悪い遺伝子移入法に起因して問題があるままであった。本発明のベクターシステムは、多くの細胞タイプのための高い導入効率をただ1つのベクターから同時に多数の導入遺伝子を発現することができることと
組み合わせることにより、この問題点に対処する。例えば、本明細書中に説明されたJΔNI7及びJΔNI8ベクターは、5のウイルス性IE遺伝子の発現動態を欠失又は変更することに起因して、複製欠損(replication-defective)があって非毒性である。これらは細胞ゲ
ノム(cellular genome)と一体化しないので、かかるベクターは、細胞分裂の間に希釈
され、一時的効果のみを対象とする(hit-and-run)遺伝子送達システムをもたらす。
は、ICP0の補完は、HSV ICP0を発現することなく成し遂げられて、補完細胞内の毒性を減少させる。従って、本発明による好ましい補完細胞は、U2OS細胞等、HSV ICP0機能を天然に補完する細胞タイプに由来する(Yao, J. Virol., 69: 6249-6258 (1995)、該文献
は、参照することによって本明細書中に組み込まれる)。かかる細胞は、当分野において知られた方法によって(例えば、細胞染色体(cellular chromosomes)等のHSVゲノム以
外の遺伝学的コンストラクトから細胞がICP4及びICP27をそれぞれ発現するように、ICP4
あるいは、ICP4及びICP27発現カセットを細胞内に導入することによって)、ICP4あるい
は、ICP4及びICP27を発現するように操作され得る。望ましくは、細胞株は、それぞれICP4及びICP27をトランスに(in trans)発現する。望ましくは、導入されたICP4又はICP4/ICP27コーディング配列は、その同種(cognate)のウイルス性プロモータの制御下にある
。また、ICP4及びICP27を補完するコーディング配列の一方又は両方が、HSVの感染に応答してかかる細胞内に誘導可能に発現され得る。
む。それゆえに、本発明の補完細胞は、ベクター内の認識配列に対する適切な部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を更に発現するように操作され得、これによってリコンビナーゼタンパク質を産生する。従って、本発明の補完細胞は、cre、dre、flp、KD、
又はB2、B3、R等、あるいは必要に応じて、その派生変異体(mutant derivative)を発現及び産生し得る。かかる細胞株による継代(Passage)が、それゆえに、導入遺伝子のた
めの余地(room)(約11 kb)を回復し、25倍超等の10倍超、又は約100倍超等の50倍超だけウイルスの増殖を向上し得る。ウイルス増殖の向上は、(増殖曲線を作製するための)標準的な手順により、リコンビナーゼを欠く細胞と比較して測定され得る。このことは、低MOIでの複製ウェル(replicate wells)の細胞への感染、感染後の異なる時点でのウイ
ルス回収(collection)、及び通常、プラークアッセイ(plaque assay)による生産量のタイトレーション(titration)を含む。
(foreign)遺伝子を発現する細胞を操作することにおいて通常採用されるマーカー等、
選択可能なマーカーをコードする遺伝子を発現するように操作され得る。適切な選択可能な遺伝子としては、ネオマイシン(neomycin)/G418、ハイグロマイシン(hygromycin)
、ブラストサイジン(blasticidin)、ピューロマイシン(puromycin)、ゼオシン等に対する耐性を付与するものが挙げられる。
現コンストラクトを含む(contain)ように操作するための方法は、当業者に知られてい
ると理解されるだろう。例えば、選択可能なマーカーを有する対象遺伝子は、レンチウイルスのベクターにサブクローニングされ得(subcloned)、レンチウイルスベクターに感
染したソース細胞は、マーカーの発現(例えば、ブラストサイジン耐性)で選択され、その後、対象の導入遺伝子の発現(例えば、HSV ICP27)が確認される。
なわち、補完細胞株を含み、あるいは補完細胞株からなり、又は基本的に補完細胞株からなる細胞株を提供する。
、本発明は、本発明のHSVベクターを増やす方法を提供する。本発明の方法に従って、補
完細胞株は、ベクターDNAを導入され、その後、プラークが形成するまで培養される。ウ
イルス性DNAは、上述の通り、BACを有し得、その場合、その後、パッケージされたベクターにおいてBACを含みたくないと望む場合には、本発明の細胞は、ウイルスゲノムからBACを切除するのに適したリコンビナーゼを発現し得る。ウイルス集団(viral population)は、次第に大きさを増す(increasingly large)、新鮮な補完細胞の集団に感染粒子(infectious particles)を繰り返し移入することによって増幅される。この繰り返し移入(repeated transfers)のための、感染の多重度(MOI)は、約0.001 pfu/細胞及び約0.03 pfu/細胞の間であり得る。最終的に、本発明のベクター(パッケージされたウイルスとして)は、90%の細胞変性効果(cytopathic effect)における細胞から精製される。
、十分なウイルスが細胞集団に送達され得るときが、通常、本発明のHSVベクターは、最
も有効である。従って、本発明は、ストックを提供し、好ましくは、本発明のHSVベクタ
ーを含む均質な(homogeneous)ストックを提供する。HSVストックの作製及び分析法は、当分野において周知である。例えば、ウイルスストックは、HSVベクターで形質導入され
た(transduced)細胞を含むローラーボトル(roller bottles)において製造され得る。ウイルスストックは、その後、連続的なニコデンツ勾配(continuous nycodenze gradient)において精製され、等分され(aliquotted)、必要になるまで保管され得る。ウイル
スストックは、ウイルスの遺伝子型(genotype)及びプロトコール並びにこれらを作製するために使用された細胞株に大きく依存して、力価(titer)において大幅に変化する。
好ましくは、かかるストックは、約106pfu/ml又は更により好ましくは約107 pfu/ml(又
は少なくともほとんど同様の値)のウイルスの力価(viral titer)を有する。更にいっ
そう好ましい実施態様では、力価は、約108pfu/ml、又は約109 pfu/ml(又は少なくとも
ほとんど同様の値)、及び約1010pfu/ml又は約1011 pfu/mlであり、あるいは更には約1012 pfu/ml(あるいは少なくともほとんど同様の値)の高い力価ストック(high titer sto
cks)が最も好ましい。従って、本発明によるHSVストックの力価は、約106 pfu/mlから約1012 pfu/ml(好ましくは約109から約1011 pfu/mlの間)で変わり得る。ゲノムコピー(gc)数は、細胞株に依存しないウイルス粒子数の測定をもたらすが、欠損粒子(defective
particles)を含み得る。通常、野生型HSV-1に関するgc値は、同じストックのpfu値の数倍から20x、最大100x高い。変異ウイルス、特に補完細胞において増殖した欠損ウイルス
に関しては、この値は、10,000x又はより一層高く増加し得る。Gc及びpfu値は、ストックのサイズと比例的に増加する。
である。医薬的に許容可能な担体は、周知であり、容易に利用可能である。担体の選択は、少なくとも部分的には、組成物を投与するために使用される特定のベクター及び特定の方法によって決定されるだろう。組成物は、特に組成物の安定性を向上させるために及び/又はその最終用途(end-use)のために、任意の他の適切な成分を更に含み得る。それ
に応じて、本発明の組成物の多種多様な適切な剤型(formulations)がある。以下の剤型及び方法は、単なる例示であり、全く限定するものではない。
衝剤(buffers)、静菌薬(bacteriostats)を含み得る、水性(aqueous)及び非水性(nonaqueous)の無菌等張注射水溶液(isotonic sterile injection solutions)、並びに
剤型を意図したレシピエント(intended recipient)の血液と等張にする溶質(solutes
)、並びに水性及び非水性無菌懸濁液(suspensions)が挙げられ、該無菌懸濁液(suspensions)としては、懸濁化剤(suspending agents)、可溶化剤(solubilizers)、増粘
剤(thickening agents)、安定化剤(stabilizers)、及び保存料(preservatives)が
挙げられ得る。剤型は、アンプル及びバイアル等の、単位用量(unit-dose)又は複数回
用量(multi-dose)の密封された容器においてもたらされ得、使用直前に、注射のために、無菌の液体賦形剤、例えば、水の付加のみを必要とするフリーズドライ(freeze-dried)(凍結乾燥された(lyophilized))状態において保管され得る。即時注射溶液(Extemporaneous injection solutions)及び懸濁液は、上述された種類の無菌粉末、顆粒(granules)、及び錠剤(tablets)から作製され得る。
ボでの投与に関連する腫れ(swelling)及び炎症並びに生理学的苦痛(physiological distress)を減少させるための組成物の一部であり得る。免疫系抑制剤は、ベクター自体への免疫応答、又は疾病(disorder)に関連する任意の免疫応答を軽減するための合成方法(composition method)で投与され得る。別の方法として、疾患に対する身体の天然の防御(natural defenses)を上方調節(up-regulate)するために、免疫エンハンサ(immune enhancers)が組成物に含まれ得る。抗生物質、すなわち、殺菌剤(microbicides)及
び殺かび剤(fungicides)が、遺伝子移入手順及び他の疾病に関連する感染リスクを軽減させるために存在し得る。
況下で細胞に曝露される。導入遺伝子内のプロモータが、細胞において活性があり、かつ、導入遺伝子が別の調節機構(例えば、本明細書中に説明されたmicroRNA)によって抑制されていないプロモータであれば、細胞が感染した時点で、ベクターのLAT領域内に挿入
された導入遺伝子が、細胞内において転写されるだろう(発現されるだろう)。言い換えれば、本発明のベクターは、哺乳動物細胞内において遺伝子移入及び発現ベクターとして役立つ。
等)、外胚葉由来細胞(例えば、角質化上皮細胞(keratinizing epithelial cells)(
例えば、皮膚及び髪を作り出す)、湿性重層障壁上皮細胞(wet stratified barrier epithelial cells)(例えば、角膜、舌、口腔、消化管(gastrointestinal tract)、尿道
(urethra)、膣(vagina)等の)、神経系細胞(例えば、末梢(peripheral)及び中枢
ニューロン(central neurons)、グリア等))、中胚葉由来細胞、多数の内蔵器官の細
胞(腎臓、肝臓、膵臓、心臓、肺等)骨髄細胞、及び腫瘍(tumors)又はそうでないもののいずれかの内部の癌性細胞(cancerous cells)等の所望の細胞の任意のタイプであり
得る。本発明のベクターによる感染に適した細胞の好ましく、かつ非限定的な例としては、肝細胞、肺細胞、上皮細胞、心臓細胞、筋細胞、幹細胞、及び癌細胞(cancer cells)が挙げられる。
他の因子(例えば、siRNA又はmiRNA等のノンコーディングRNA(ncRNA))をコードする場合に、本発明の方法が、被験体内の疾患又は状態を治療し得ることが観察されるだろう。従って、本発明は、導入遺伝子が被験体の細胞内に発現されるように、被験体の細胞に感染するのに十分な(sufficient)量及び位置において本発明のベクターを被験体へ投与することを含み、導入遺伝子が、1以上の予防的又は治療的活性を有するタンパク質、ポリペプチド又はncRNAをコードする、被験体における疾患又は状態を治療する方法を提供す
る。例えば、疾患又は状態は、導入遺伝子が腫瘍殺傷活性(tumor killing activity)(TRAIL又は腫瘍壊死因子(tumor necrosis factor, TNF)等)を強める物質をコードし得
る、ある種の癌であり得る。非限定的な追加的な例として、導入遺伝子は、筋ジストロフィー(muscular dystrophy)(適切な導入遺伝子が、ジストロフィン(Dystrophin)をコードする)、循環器疾患(cardiovascular disease)(適切な導入遺伝子として、例えば、SERCA2a、GATA4、Tbx5、Mef2C、Hand2、Myocd等が挙げられる)、神経変性疾患(neurodegenerative disease)(適切な導入遺伝子として、例えば、NGF、BDNF、GDNF、NT-3等
が挙げられる)、慢性痛(chronic pain)(適切な導入遺伝子が、GlyRα1、エンケファ
リン(enkephalin)、又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase
)(例えば、GAD65、GAD67、又は別のアイソフォーム)、肺疾患(例えば、CFTR)、又は血友病(hemophilia)(適切な導入遺伝子が、例えば、第VIII因子又は第IX因子をコードする)等の状態の治療のための適切な物質をコードし得る。
現を引き起こすためにインビトロで使用され得る。かさねて、幹細胞並びに、ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)又はヒト肺線維芽細胞(HLF)等の線維芽細胞など、任意のタイプの細胞が本発明の方法を用いてインビトロで感染し得る。インビトロでの使用のための他の好ま
しいタイプの細胞としては、角化細胞、末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear
cells)、造血幹細胞(hematopoietic stem cells)(CD34+)、又は間葉幹(mesenchymal stem)/前駆(progenitor)細胞が挙げられる。1の実施態様では、導入遺伝子(複数可)が、細胞の分化をもたらし得る1以上の因子をコードする。例えば、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、L-Myc、ドミナントネガティブp53、Nanog、Glis1、Lin28、TFIID、mir-302/367、又は他のmiRNAの1以上の発現が、細胞を、人工多能性幹(iPS)細胞とし得る。Takahashi and Yamanaka, Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, Cell, 131: 861-872 (2007); Wernig, Nature, 448: 318-324 (2007);及び Yu, Science, 318: 1917-1920 (2007)も参照。該開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
別の方法としては、本発明のベクター内の導入遺伝子(複数可)が、細胞を分化転換(transdifferentiating)するための因子をコードし得る(例えば、GATA4、Tbx5、Mef2C、Myocd、Hand2、SRF、Mesp1、SMARCD3(心筋細胞(cardiomyocytes)用);Ascl1、Nurr1、Lmx1A、Brn2、Myt1l、NeuroD1、FoxA2(神経細胞用)、Hnf4α、Foxa1、Foxa2又はFoxa3(肝細胞用)の1以上)
細書中に記載した通り、本発明のベクターは、ウイルスエンベロープ糖タンパク質を突然変異させることにより、その天然の親和性(natural tropism)を変更し、かつ、感染性
を強めるように操作され得る。従って、ベクターは、多くの哺乳動物種の細胞に感染するために採用され得る。本発明の方法は、外来遺伝子の発現又は牛、馬、羊、山羊、豚等の動物における欠損遺伝子(deficient genes)の補足(supplement)のため等、農耕(agriculture)において適用され得ると思われる。同様に、本発明の方法は、猫、犬等の伴侶動物(companion animals)のための獣医学的背景(veterinary context)において採用
され得る。
本実施例は、本発明のHSVベクターを複製し、製造するための補完細胞株の開発(development)を説明する。
ら及び他のIE遺伝子は、様々な細胞タイプに毒性効果をもたらす。これらの遺伝子の除去によってベクターの毒性を抑制しつつ、感染性ウイルス粒子を産生するために不可欠な産物が供給される必要がある。U2OSヒト骨肉種(osteosarcoma)細胞をベースとする新規の細胞株を、条件付きで(conditionally)不可欠なIE遺伝子ICP4及びICP27を発現するように操作した。これらの遺伝子を、レトロウイルスを介する挿入により、該遺伝子の同種のウイルスプロモータの制御下で導入した。HSV感染によりHSVテグメントタンパク質VP16が核へ送達され、該タンパク質が、そのプロモータの活性化によって、一体化された(integrated)ICP4及びICP27遺伝子の高レベル発現を促進するまで、これらの遺伝子自体は、
依然としてサイレントのままであり得る。従って、HSV感染より前に、これらの遺伝子は
、不適当な毒性を有することなく、操作されたU2OS細胞中に安定して維持され得る。HSV
増殖は、また、ICP0の発現に依存するが、このタンパク質は細胞複製を阻害し、細胞周期停止(cell cycle arrest)及びプログラム細胞死(programmed cell death)を引き起こす。意外なことに、U2OS細胞は、天然にICP0機能を補完し、それゆえICP4及びICP27の導
入は、3個全てのIE遺伝子を欠失させたベクターの効率の良い製造のための細胞環境を提供するのに十分である。この新規の操作された細胞株は、安定であり、培養液でよく増殖し、かつ、非毒性HSVベクターの臨床製造(clinical production)のために使用可能である。
を感染させた。3日後、細胞上清(cell supernatants)におけるウイルスを、U2OS-ICP4/27細胞に関してタイトレーションした。
で増殖したが、JDQOZEH1(ICP0、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した)は、U2OS-ICP4/27細胞において増殖することのみ可能であったことを示す。7b上清におけるJDQOZEH1の力価は、おそらく7b感染からの残りのインプット(residual input)を示している。
本実施例は、LAT遺伝子領域内に挿入された導入遺伝子を含むゲノムを含むHSVベクターであって、前初期遺伝子としてICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47を発現しないベク
ターの実施態様を説明する。
また、ICP4欠失の位置においてユビキチン(UbC)プロモータ-mCherryレポーター遺伝子
発現カセットを含む。非補完細胞では、インシュレーター(CTRL)エレメントの間に位置し、該インシュレーター(CTRL)エレメントが、ヘテロクロマチン形成から保護する、潜伏関連転写(LAT)プロモータ領域は、活性なままである。この領域は、エンハンサエレ
メント、LAT P2又はLAP2を含み、該エンハンサエレメントは、長期間の遺伝子発現を促進する。CAGプロモータ-GFP発現カセットを、LATP2及びCTRL2の間に挿入し、感染させたヒ
ト皮膚線維芽細胞(HDF)においてロバスト(robust)なGFP発現がみられ、一方、ゲノム中の他の位置に挿入された同一のGFPカセットから、又はmCherryカセットから見られた発現は最少だった(図1B)。従って、IE遺伝子発現の完全欠損(complete absence)において、LAT遺伝子座は、導入遺伝子発現のための特別な部位である。
本実施例は、様々なHSVベクターコンストラクトの構造及び特性を列挙する。
本実施例は、JΔNI7-GFP及びJΔNI6-CAGGFPに感染させた細胞における導入遺伝子発現
を実例で示す。JΔNI7-GFPにおけるCAG-GFPの位置を図1にLAT:CAG-GFPとして示し、JΔNI6-CAGGFPにおけるその位置をUL3/4:CAG-GFPとして図1に示す。更に、JΔNI7-GFP HSVのLAT領域の配列が、LAT領域内の様々な遺伝的エレメントの配列を含めて図8に説明される(
配列番号1)。これらのベクター内のGFPがEGFPをコードすることは留意されるだろう。
ー(gc)力価は、ウイルス糖タンパク質D遺伝子についての定量リアルタイムPCRによって決定した。JΔNI6-CAGGFP及びJΔNI7-GFPについて、粒子(gc)‐プラーク形成単位(particle-to-plaque forming units, PFU)比は同等だった。実施例8、表2参照。
較するために、各ウイルスに感染させた。LAT遺伝子座においてCAG-GFPカセットを含むJ
ΔNI7-GFPは、HDFにおいて強い、ウイルス用量依存的(dose-dependent)GFP発現を示し
、一方、JΔNI6-CAGGFPの最も高い用量は、最小のGFP発現のみを生み出した(図2A、左パネル、EGFP)。JΔNI7-GFPに感染させたHDFにおけるGFP発現は、感染2週間後に依然として検出可能だった(図2B、EGFP)。しかしながら、HDFにおけるいずれのウイルスからも
ほとんど又は全くmCherry発現がみられず(図2A、2B、mCherry)、LAT遺伝子座の外部の
遺伝子がHDFにおいてサイレンシングさせられることを示した。対照的に、U2OS細胞にお
いて低MOIの両方のウイルスについて豊富なGFP及びmCherry発現がみられ(図2A、右カラ
ム)、これらの細胞のICP0様活性によって、非LAT遺伝子座のサイレンシングがHDFにおいて起こることが抑制されるという解釈と整合する。全体として、これらの結果は、LAT遺
伝子座が複製欠損の、ICP0欠損ベクターからの導入遺伝子発現のために好ましい部位であるということを強く示した。
本実施例は、U2OS-ICP4/ICP27細胞におけるJΔNI7-miR302GFP BACの2つの単離株(isolates)の作製を示す。
現カセットを有する(Anokye-Danso, Cell Stem Cell, 8: 376-388 (2011))。miR302s/367遺伝子クラスタは、EF1αプロモータをGFPコーディング配列に連結させるイントロ
ンに位置する。JΔNI7-miR302GFP BAC DNAの2つの単離株を、精製し、U2OS-ICP4/ICP27
細胞に導入して、ウイルス増殖及び導入遺伝子発現の検査のためのウイルス粒子を作り出した。培養物における90%の細胞変性効果の観察時に、ウイルスを、細胞及び上清から収
集し、新鮮なU2OS-ICP4/ICP27細胞の感染に使用した。導入遺伝子発現及びウイルスの伝
播(spread)を、その後、日々測定した。図3に示す通り、感染3日後には、両方のBAC単離株が、プラーク形成ウイルスを産生し、両方のウイルスがEGFP及びmCherryを発現した
。
本実施例は、テトラサイクリン誘導プロモータ及びゲートウェイ組み換えカセットのHSVベクターのLAT遺伝子座への挿入のためのターゲッティングプラスミドの構築を説明する。
ルス増幅(expansion)中の遺伝子再配列(rearrangement)及びOKSM発現カセットの不活性化を抑制するために使用され得る。これらの戦略の一つは、OKSMカセットの構成的に活
性なCAGプロモータをテトラサイクリン誘導プロモータで置き換えることである。テトラ
サイクリン誘導プロモータは、そのトランス活性化因子(transactivator)(rtTA)及びテトラサイクリン/ドキシサイクリン(doxyxycline)の両方の存在下でのみ活性を有するため、ウイルス増幅中に、導入遺伝子発現は、厳重に(tightly)調節され(抑制され)
得る。
ラスミドを、開発した(図4)。テトラサイクリン誘導性TRE3Gプロモータを有するレンチウイルスコンストラクト(pLenti-CMVTRE3G-NeoDEST、Addgene)を、開始コンストラクト(starting construct)として使用した。TRE3Gプロモータを、pLenti-CMVTRE3G-NeoDESTからDraI-SpeIフラグメント(fragment)として単離し、プラスミドpCMV-GWのNruI及びSpeI部位の間に挿入し、内在性(resident)CMVプロモータを置き換えた。プラスミドpCMV-GWは、レンチウイルスプラスミドのゲートウェイ(GW)におけるクロラムフェニコール(Cm)選択可能遺伝子の代わりに、GWカセットにおいてゼオシン(Zeo)選択可能遺伝子を
含んだ。TRE3G-GW(Zeo)発現カセットを、単離し、LAT遺伝子座の一部を含むプラスミドにおいてLAT配列の間にクローニングして、「ホモロジーアーム(homology arm)」をBAC
DNAへの組み換えのためのTRE3G-GW(Zeo)カセットに加えた。
本実施例は、ICP27についての免疫蛍光(immunofluorescence)染色及び相補性分析(complementation assay)を実例で示す。
間で固定し(fixed)、染色した(図6A)。クローン#1及び#8は、ICP27欠損HSV(QOZHG)感染によるICP27発現のロバストな誘導を示した。相補性分析のために、ウイルス増殖を
測定し、写真を感染24、48、及び72時間後に撮影した(図6B)。U2OS-ICP4/27クローン#1及び#8は、QOZHGウイルス増殖を最も強くサポートすることができることを示した。
本実施例は、いくつかのHSVベクターの構築及び検査を示す。
細胞
ヒト骨肉種U2OS細胞(ATCC, Manassas, VA, USA)を、10%FBS及びペニシリン-ストレプトマイシン(penicillin-streptomycin)(P/S)を含有するDMEMにおいて増殖させた。ヒト新生児皮膚線維芽細胞(HDF)(ATCC、PCS-201-010)及びBJヒト包皮(foreskin)線維芽細胞(ATCC、CRL-2522)を10%胚性幹細胞適格(Qualified)FBS(Invitrogen)及びP/S含有DMEMにおいて培養した。Vero、Vero-7b(Krisky et al, Gene Ther. 5, 517-30 (1998))及び293T細胞を、5%FBS及びP/Sを含むDMEMにおいて培養した。ヒト肝細胞(hHEP)を単離し、説明された通りに培養した(Ueki et al., Hepatology 54, 216-28(2011);Yoshida et al., Hepatology 58, 163-75 (2013))。ヒト皮下前脂肪細胞(subcutaneous preadipocytes, hPAD)(PT-5020、Lonza)をPBM(商標)-2基礎培地(Basal Medium
)(Lonza)で維持した。ヒト筋肉由来幹/前駆細胞(hMDSCs)を、説明通り培養した(Gao et al, Cell Transplant 22, 2393-408 (2013))。ヒト新生児角化細胞(hEK)(Invitrogen)をヒト角化細胞増殖サプリメント(Growth Supplement)を添加されたEpiLife(登録商標)培地で培養した(いずれもInvitrogenからのもの)。後根神経節(Dorsal r
oot ganglia, rDRGs)を、15日目のラット胚から顕微解剖(micro-dissected)し、LeibovitzのL-15培地において30分間、37℃で一定の振盪を加えて3 mg/mlのI型コラゲナーゼ(type-I collagenase)(Sigma, St. Louis, MO)で解離し、ポリDリジン(lysine)(Sigma)コートされた(coated)カバースリップ(coverslips)上においてB27サプリメン
ト(supplement)、Glutamax-I、Albumax-II、及びP/S(Gibco/Invitrogen、Grand Island、NY)を含有し、かつ、100 ng/ml 7.0S NGF(Sigma)を添加された500μlの既知組成のニューロベイサル培地(Neurobasal medium)において24-ウェルプレート中に、約105細
胞/ウェルでプレーティングした(plated)。プレート後1~3日において、培養物(cultures)は、上記培地において1~2日間、10 μΜウリジン(uridine)及び10 μΜフルオ
ロデオキシウリジン(fluorodeoxyuridine)(Sigma)で処理して、線維芽細胞及びグリ
ア等の分裂細胞の増加を制限した。細胞を、その後、PBSで洗浄(wash)し、NGF-添加ニ
ューロベイサル培地を用いて上述の通りインキュベートした(incubated)。ウイルス感
染をプレーティングの10~15日後に行った。
ピューロマイシン耐性クローン(2 mg/ml)の単離、及び、0.5の多重度(MOI)でのICP4
欠損ウイルス(QOZHG)の感染後のICP4発現の免疫蛍光スクリーニングによって生成した
。U2OS-ICP4/27細胞を、同様に、精製されたICP27レンチウイルスを用いたU2OS-ICP4細胞への感染、ピューロマイシン及びブラストサイジン(10 mg/ml)への耐性についてのセレクション、並びにICP27免疫蛍光及びウイルス増殖についてのQOZHGに感染させたクローンのスクリーニング(図6)によって生成した。
レンチウイルスICP4発現プラスミドpCDH-ICP4-puroを、プラスミドpCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(Systembio)の完全なHCMV IEプロモータを、ICP4プロモータ及びプラスミドS3から
のコーディング領域で置き換えることによって構築した(該プラスミドS3は、pUC19のSphI部位に挿入されたpICP4-lox-pacからのSphIフラグメントからなる(Rasty et al., J Neurovirol. 3, 247-64 (1997))(GenBank JQ673480.1 HSV-1 KOS map positions 131 ,587-124,379; D. Krisky and J.C.G.,公表されていない))。レンチウイルスのICP27発現プラスミドpCDH-ICP27-SV40-blaを、最初に、pCDH-CMV-MCS-EF1-Puroのピューロマイシン耐性カセットをpcDNA6/BioEase(商標)-DEST(Invitrogen)のブラストサイジン耐性
カセットを用いて置き換えることによって構築して、pCDH-CMV-MCS-SV40-blaを作り出し
た(図5)。ICP27プロモータ及びコーディング領域を、その後、ICP27遺伝子及びEcoRV及びSacI部位の間の隣接配列(GenBank JQ673480.1 マップ位置110,580-115,666; D. Krisky and J.C.G.,公表されていない)を含むプラスミドPD7の、BamHI(マップ位置 113,244)及びSacIを用いた消化(digestion)によって単離し、単離されたフラグメントを、pCDH-CMV-MCS-SV40-blaにおいてCMVプロモータを置き換えるために使用した。もたらされた
プラスミド、pCDH-ICP27-SV40-blaを、図5に示す。
作製されたレンチウイルスは、ICP27レンチウイルスとして言及される。
本研究において生成され、かつ、ウイルス粒子に転換される全てのHSV-BACコンストラ
クトは、表2に列挙され、D. Leib(Dartmouth Medical School, NH)からの好意(kind g
ift)によるKOS-37 BAC(24)に由来した。全てのBAC操作を、説明通り、pRed/ET(Gene Bridges、 Heidelberg、 Germany)並びにpBAD-I-sceIプラスミド(kindly provided by N. Osterrieder, Free University of Berlin, Germany)又はE. coli株GS1783(from G.
Smith, Northwestern University, Chicago, IL)のいずれかを用いたスカーレスレッド組み換え(scarless Red recombination)(Tischer et al., Methods Mol. Biol 634, 421-30(2010);Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97 (2006))、あるいはゲ
ートウェイテクノロジーマニュアル(Gateway Technology Manual)(Invitrogen)(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/gatewayman.pdf)によるインビ
トロゲートウェイ(GW)組み換えによって行った。全てのコンストラクトを、PCR分析、
制限酵素消化物(restriction enzyme digests)のFIGE分析、及びターゲットされた(targeted)DNAシークエンシング(sequencing)によって確認した。レッド組み換えのため
のターゲッティングプラスミドを記載された通り構築した(Tischer et al, Biotechniques, 40, 191-97 (2006))。I-SceI制限酵素認識部位(restriction site)(I-SceI-aphAIフラグメント)に隣接したカナマイシン耐性遺伝子を、以下に特定し、かつ、表1に列挙された異なるターゲッティングプライマーを用いるPCRによってpEPkan-S2(N. Osterriederから)(Tischer et al., Biotechniques, 40, 191-97(2006))から増幅した。ウ
イルスゲノムを標的とするプライマー部分(Primer portions)を、HSV-1株-17(GenBank
JN555585.1)の配列に基づいて設計した。レッド組み換えのための全てのターゲッティ
ングフラグメントを、Qiagenゲル抽出キット(extraction kit)(Qiagen)又はSpinSmart核酸準備及び精製カラム(Nucleic Acid Prep & Purification Columns)(Denville Scientific)によって精製した。以下に提供されたヌクレオチド部位(Nucleotide positions)は、HSV-1 KOS株のGenBank JQ673480配列に言及する。
内部リピート(ジョイント)領域を欠失させた。I-SceI-aphAIフラグメントを、プラスミドpgB1:D285N/A549TのSnaBI部位にクローニングした(Uchida et al., J. Virol., 84, 12200-09(2010))。もたらされたプラスミド、pgB:N/T-kanを、プライマー61及び62(表1)を用いる増幅のためのテンプレート(template)として使用し、産物を、KOS-37 BAC
の天然のgB遺伝子で組み換え、続いてpBAD-I-sceIプラスミドで形質転換された(transformed)細菌においてaphAI遺伝子の欠失をI-SceIによって促進(I-SceI-enhanced deletion)させた。次に、I-SceI-aphAIを、ゲノムの隣接する固有短鎖(unique short, Us)セ
グメントの最初の14ヌクレオチド(nucleotides, nts)を有するジョイント領域(GenBank JQ673480 位置 117,080-132,466)のレッドを介する欠失のために、ネステッド(nested)フォワードプライマー46, 48及びリバースプライマー47を用いて増幅し、続いて、aphAI遺伝子を除去した。KOS-37 BACにおけるUsは、HSVゲノムの典型的表示(typical representation)に関して逆方向(reverse orientation)であり、ジョイントに直接的に隣接したUs 12(ICP47)遺伝子及びUsターミナルリピート(terminal repeat)に隣接したUs1遺伝子を配置する。ジョイントの域を超えた(beyond the joint)14-ntの欠失(GenBank
JQ673480 位置 145,377-145,390)は、それによってICP47翻訳開始コドンを除去した。
置き換えを、以下の通り実現した。プラスミドpUbC-mCherry-SV40pAを、pBluescriptUB-Flag-mArtからのヒトユビキチンCプロモータ(UbCp)(Oregon Health & Science University, Portland, ORのH. Nakaiの好意による)、pEP-miRからのmCherry遺伝子(Cell Biolabs, San Diego, CA)、及びpEP4-EO2SCK2M-EN2LからのSV40ポリアデニル化(polyadenylation, polyA or pA)領域(Addgene plasmid 20924)(Yu et al., Science 324, 797-801 (2009))のpBluescript KS+(Stratagene)へのクローニングによって構築した。I-SceI-aphAIフラグメントを、その後、UbCp及びmCherryの間の境界(boundary)においてpUbC-mCherry-SV40pAのBamHI部位にクローニングして、pUbC-mCherry-SV40pA-KANを生成し
た。インサートを、ICP4標的遺伝子座とのレッドを介する組み換えのためにプライマー51及び52(表1)を用いてPCR増幅した。もたらされたコンストラクトを、ICP22プロモータ
のTAATGARATモチーフを含むGenBank JQ673480配列のHSV-1 KOS位置146,113-151,581につ
いて欠失させた。
のTKプロモータを通るPCR、pCRblunt(Invitrogen)へ各反応の産物をクローニングしてpCRBlunt-β0及びpCRBlunt-β27をそれぞれ作製すること、pCRBlunt-β0のBglII部位及びpCRBlunt-β27のHpaI部位へI-SceI-aphAIを挿入してpCRBlunt-β0-KAN及びpCRBlunt-β27-KANを生み出すこと、並びにジョイントを欠失したUbCp-mCherry gB:N/T BACとレッド組み換えするために、プライマー対85/86及び87/88をそれぞれ用いてインサートをPCR増幅す
ることによって行った。JΔNI3を、I-SceI-aphAI増幅のためのネステッドターゲッティングフォワードプライマー41, 42及びリバースプライマー43を用いたICP0コーディング配列のレッドを介する完全な(clean)欠失により、その後、JΔNI2から導出した(derived)。JΔNI5は、プライマーペア44/45を用いてICP27コーディング配列を完全に欠失させて、標的とするI-SceI-aphAIフラグメントを作製することにより、同様に、JΔNI3から導出した。
て生成した。最初に、プラスミドpPEP100(P. Spear, Northwestern Universityによる好意)(Pertel et al., Virology 279(1), 313-24 (2001))において、pEGFP-C1(Clontech)からのEGFP遺伝子で、CAGプロモータ(CMVエンハンサ/ニワトリベータアクチン
プロモータ/キメライントロン)及びウサギβグロビンポリA領域の間のgH遺伝子を置き
換えることによってプラスミドpCAG-GFPを構築した。I-SceI-aphAIを、その後、pCAG-GFPのSnaBI部位に挿入して、プラスミドpCAG-GFPKANを作り出した。別個に(Separately)、初期テンプレート(initial template)としてKOS-37 BAC DNAを用いる多段階の(multi-step)PCRを行って、以下の通り、UL3及びUL4ポリA領域の間に新規のクローニング部位(cloning sites)(MCS)を含むフラグメントを生成した。最初に、拡張(extension)PCRを行って、部分的に一致する(overlapping)MCS領域を各3'UTRフラグメントに加えるプ
ライマーペア57/58及び59/60をそれぞれ用いて、UL3及びUL4の3'UTRを増幅した。2のPCR
産物をゲル精製し(gel-purified)、それぞれの100ngを、プライマー57及び59を用いた
重複PCR(overlapping PCR)のために使用して、連続した(continuous)フラグメントを作り出した。この産物をpCRBlunt(Invitrogen)にクローニングし、プラスミドpCRBluntUL3-4リンカー(linker)を作り出した。pCAG-GFPKANのインサートを、その後、pCRBluntUL3-4リンカーのMCSにおいてAccI及びPsiI部位の間にクローニングした。もたらされたプラスミドを、MfeI及びPpuMIを用いて消化し(digested)、UL3-CAG-GFPKAN-UL4フラグメ
ントを、JΔNI5のUL3-UL4遺伝子間領域で組み換えるために単離し、続いてaphAI遺伝子を除去した。
グした。LATP2の一端近くからCTRL2の約250 bp下流まで延びる内部KpnI-SalIフラグメン
トをこの組み換え物(recombinant)から単離し、pSP72(Promega)のKpnI及びSalI部位
の間にクローニングして、pSP72KOS-LATを作り出した。マルチクローニング部位(multicloning site)を、その後、KpnI部位の約240及び約430 bp下流に位置する2のBstXI部位の間に導入し、pSP72KOS-LATリンカーを作り出した。別個に、プラスミドpCAG-GWを、PCR増幅された改変(modified)GW組み換えカセット[GW-Zeo;クロラムフェニコール耐性の代
わりのゼオシン耐性(Wolfe et al., J. Virol. 84, 7360-68 (2010))]で、pPEP100(Pertel et al., Virology 279(1)、313-24 (2001))のgH遺伝子を置き換えることに
よって構築した。pCAG-GWのインサートを、その後、pSP72KOS-LATリンカーのMCSにクローニングして、pSP72KOS-LATリンカー-GWを作り出した。プラスミドを、KpnI及びHpaIを用
いて消化して、ccdB耐性ヘルペスホッグス細菌(HerpesHogs bacteria)においてJΔNI5
のLAT遺伝子座でレッドを介して(Red-mediated)組み換えるために、隣接するLAT配列とともにCAG-GW領域を単離した(Wolfe et al, J. Virol. 84, 7360-68 (2010))。最終
的に、もたらされたJΔNI5組み換えBACにおけるGWカセットを、プラスミドpCAG-GFPKANのCAG及びpolyA配列を含むAatII-PsiIフラグメントでレッドを介して組み換えることにより、EGFP遺伝子で置き換えた。EGFPカセット外部の特定のLAT領域エレメントを(CTRL1、CTRL2、LATP2)欠失させたJΔNI7GFP派生物を、表1に列挙された各F1、F2及びRプライマー
(それぞれ63~65、66~68、及び69~71)を用いるPCRによって作製されたターゲットさ
れたI-SceI-aphAIカセットを用いた、JΔNI7GFP DNAのレッドを介する組み換えによって
作製した。
応の産物をJΔNI5ΔL BAC DNAと組み換えて、JΔNI9GW及びJΔNI10GWを作り出した。JΔNI7GFP BAC DNAを、XhoIで消化し、LAT遺伝子座からの約7.2-kb CAG-GFPを含むフラグメントを単離し、pENTR1A(pENTR-LAT-XhoI)にクローニングした。JΔNI7GFPΔC12LP2の対応する約5.3-kb XhoIフラグメントを、同様に単離し、pENTR1A(pENTR-LATΔ-XhoI)にクローニングし、最後に、pCAG-GFPの挿入物(上記参照)をpENTR1A(pENTR-CAG-GFP)に移入した。インビトロのLRクローナーゼ(Clonase)(Invitrogen)反応を、その後、行って
、種々のpENTRコンストラクト(constucts)をJΔNI10GW BAC DNAで組み替え、JΔNI10LAT-GFP、JΔNI10DC12LP2-GFP及びJΔNI10GFPをそれぞれ作製し、pENTR-LAT-XhoI及びpENTR-CAG-GFPを、JΔNI9GW BAC DNAで組み替えて、JΔNI9LAT-GFP及びJΔNI9GFPを生成した。
増幅によってターゲットされたI-SceI-aphAIとのレッド組み換えにより、KOS-BACのUL3及びUL4遺伝子座の間の遺伝子間領域にUbCp-mCherryカセットを導入することによって、KNTcを構築した。
JΔNI BAC DNAを、U2OSをベースとした補完細胞への導入によって感染性ウイルスに転
換した。500 μlのOptiMEM(Invitrogen)におけるDNAを、1 μlリポフェクタミンプラス試薬(Lipofectamine Plus Reagent)(Invitrogen)を用いて5分間、室温でインキュベ
ートし、6.25 μlリポフェクタミンLTX(Invitrogen)を加え、混合物を30分間、室温で
インキュベートし、細胞に加えた。37℃、6時間のインキュベーション後、トランスフェ
クションミックス(transfection mix)を除去し、細胞を、一晩(overnight)、37℃で
血清フリーの(serum-free)DMEMとともに培養し、33℃のインキュベータ(incubator)
に移し、100%の細胞変性効果(CPE)を測定した。上清をタイトレーションし、その後、0.001 PFU/細胞の多重度(MOI)において順次(sequentially)により大きな培養物に感染させることによって増幅した。KNTc感染性ウイルスを、3 μlリポフェクタミンプラス試
薬及び9μlのリポフェクタミンLTXを使用した4時間、37℃のVero細胞への導入によって作製し、0.01 PFU/細胞のMOIを、Vero細胞におけるKNTcウイルス増幅のために使用した。導入及び/又はウイルス増殖のための補完細胞は、以下の通りである:U2OS-ICP4(JΔNI2
、JΔΝΙ3)、U2OS-ICP4/27(JΔNI5及び派生物)、及びVero-7b[QOZHGウイルス(ΔICP
4, ΔICP27::HCMV IEp-GFP β-ICP22, β-ICP47 及びΔUL41::ICP0p-lacZ)(Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))]。U2OS-ICP4/27細胞に関して全てのウイルスス
トックをタイトレーションした(表2)。物理的力価(Physical titers)[ゲノムコピー
(gc)/ml]を、以下に説明した通り、定量リアルタイムPCRによって決定した。感染させ
た細胞の蛍光画像を、Nikon Diaphot蛍光顕微鏡(fluorescence microscope)(Nikon, Melville, PA)を用いて40xの倍率(magnification)で撮影した。
24-ウェルプレートにおけるVero-7b、U2OS、U2OS-ICP4及びU2OS-ICP4/27細胞のレプリ
ケートのウェルに、0.001の多重度(MOI)で2時間、感染させ、0.1 Mグリシン(glycine
)(pH 3.0)で1分間処理して細胞外のウイルスを不活性化し、37℃及び5%CO2でインキュベートした。培地を日々採取し、標準プラーク分析(standard plaque assay)によってU2OS-ICP4/27細胞に関してタイトレーションした。
5 x 103 HDF及びVero細胞を96-ウェルプレートにおいて播種し、KOS、QOZHG又はJΔNI
ウイルスに25,000 gc/細胞で感染させた。細胞の生存率を、5日後に、基本的には説明さ
れた通りのMTT分析によって決定した(Uchida et al, J Virol. 87, 1430-42 (2013))。
説明した通り、細胞溶解物の調製(Cell lysate preparation)及びウェスタンブロッ
ティングを行った(Miyagawa et al., PLoS One 4, e4634 (2009))。抗-ICP0ウサギポリクローナル(Polyclonal)抗体を、本発明者らの研究室(laboratory)において作製し、抗-ICP27(10-H44)は、フィッツジェラルドインダストリーズインターナショナル(Fitzgerald Industries International)(Concord, MA)からのものであり、抗-ICP22は、John Blahoからの好意によっており(Mt Sinai School of Medicine, NY)、抗-ICP4(10F1)は、サンタクルーズ生命工学(Santa Cruz Biotechnology)からのものであり、抗-
α-チューブリン(T6793)は、シグマ(Sigma)からのものであった。同じICP4及びICP27抗体を用いる免疫蛍光を、基本的には説明された通り行い(Uchida et al, J. Virol. 83, 2951-61 (2009))、Nikon蛍光顕微鏡下で検証した。
qRT-PCRのため、全RNAを、一般的に、RNeasy kit(Qiagen)によって抽出した(extracted)。cDNAを、RETROscript(登録商標)Kit(Ambion)を用いて合成した(synthesized)。ステップワンプラス(StepOnePlus)リアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)によってリアルタイムPCRを行った。少数の細胞のために、Cells-to-cDNA(商標)II Kit (Ambion)を、細胞の溶解及び逆転写のために使用した。18Sリボソームの(ribosomal)(r)RNAのための結果を使用して、データを正規化した。本研究において使用された
全てのqRT-PCRプライマーを、表1に列挙する。
核ウイルス性(nuclear viral)DNAの量を、感染後2時間(2 hpi)での細胞のリンス(rinsing)、説明された通りの核の単離(Dignam et al., Nucleic Acids Res. 11, 1475-89
(1983); Suzuki et al., BMC Res. Notes 3, 294 (2010))、 DNeasy Blood & Tissue Kitを用いたDNA抽出、及び、上述の通り、gD遺伝子のためのqPCRによって決定した。
細胞の18SリボソームDNAのレベルを、TaqMan(登録商標)リボソームRNAコントロール試
薬(Control Reagents)(Invitrogen)を使用して測定し、ウイルスDNA量を正規化する
ために使用した。
全ての値が平均(mean)+/-SDとして示される。ペアの間の違いを、マイクロソフトエ
クセル14.4.1を用いたスチューデントのt検定(Student's t test)によって分析した。0.05(P < 0.05)未満のP値を、統計的に有意であるとみなした。
ベクター操作及びウイルス増殖
細胞への検出可能な損傷(detectable damage)なく、欠損HSVベクター、JDββをマウス胚性幹細胞(mESC)へ効率的に形質導入することが、報告されている(Craft et al, Stem Cells 26, 3119-25 (2008))。JDββについて、HSVゲノムの内部リピート領域(
「ジョイント」)及び2のIE遺伝子(ICP4及びICP22)を欠失させた。加えて、2の他のIE遺伝子(ICP0及びICP27)のプロモータを、ウイルスのチミジンキナーゼ(TK)初期(E
又はβ)遺伝子プロモータのコピーで置き換えた。JDββを感染させた非補完細胞が示したIE遺伝子発現は極めて低かったが、ベクターは、胚様体(embryoid body)形成又は発
生の転写プログラム(developmental transcription programs)を妨げることなく、mESCにおいて効率的な導入遺伝子発現が可能であった。多様な遺伝子の移入用途のための本ベクター骨格の利用を促進するために、レッドを介する組み換え(recombineering)を、細菌において行って(Tischer et al, Biotechniques 40, 191-97 (2006))、KOS-37 BAC、HSV-1株KOSの完全なゲノムを含む細菌人工染色体(BAC)から骨格であるJΔNI2(図9A
)を導出した(Gierasch et al., Virol. Methods 135: 197-206(2006))。JΔNI2は、JDββと同じICP0及びICP27プロモータの置換配列に含まれるICP47プロモータを含むICP4及びジョイントを欠失させられ、及びICP22調節領域におけるコンセンサスVP16-結合(TAATGARAT)モチーフを欠失させて、ICP22発現の動態を初期遺伝子の発現動態に変化させた。感染を可視化し、ウイルス転写活性を測定するために、mCherryレポーター遺伝子発現
カセットを、欠失されたICP4遺伝子座の位置に導入した。加えて、糖タンパク質B遺伝子
を、高活性アリル(allele)である、gB:N/Tで置き換えて(Uchida et al., J. Virol 84: 12200-9(2010))、細胞へのウイルスの進入を増進させた(enhance)。非補完細胞における毒性ICP0及びICP27タンパク質の低レベル産生(low-level production)の可能性
を除くため、ICP0(JΔNI3)あるいはICP0及びICP27(JΔNI5)(図9A)のための完全な
コーディング配列を欠失させることによって、JΔNI2の2つの派生物も構築した。
後、使用して、ICP4/ICP27を欠失したウイルスの感染時に追加的にICP27を発現する細胞
株である、U2OS-ICP4/27を選択した(図9B及び図6)。U2OS細胞が、ウイルスのVP16タン
パク質の非存在下でICP4プロモータを活性化することができ、かつ、持続したICP4発現を許容する(tolerate)ことができることは予期されていなかったが、これらの特徴がこれらの細胞の、天然にICP0を補完する活性に関連しているかは解明されていない。U2OS-ICP4/27細胞に導入された場合のみ、JΔNI5コンストラクトからのDNAが感染性粒子を生み出
すが、BACコンストラクトJΔNI2及びJΔNI3からのDNAは、U2OS-ICP4細胞への導入によっ
て感染性ウイルスに転換され得る(データは示さず)。図9Cは、JΔNI2又はJΔNI5 BAC D
NAをそれぞれU2OS-ICP4又はU2OS-ICP4/27細胞へ導入することによって、JΔNI2及びJΔNI5ウイルスの増殖が最初に引き起こされたことを示す。ウイルスは、改変されていない(unmodified)U2OS細胞、又はICP4及びICP27を補完するVero-7b細胞のいずれにおいても増
殖し得なかったが、ICP0を補完する細胞では増殖し得た。JΔNI2は、U2OS-ICP4細胞にお
いてICP27の補完なしで増殖可能であったが、JΔNI5の増殖は、この更なる補完活性を必
要とした。U2OS-ICP4/27細胞のJΔNI5補完特性(JΔNI5-complementing properties)の
安定性を、異なる細胞の継代(cell passages)におけるプラーク分析によって検査し、
少なくとも20の継代を通してプラーク形成効率(plaquing efficiency)における有意な
減少は全く見られなかった(表3)。これらの結果は、これらのウイルスにおける操作さ
れたIE遺伝子改変と整合し、これらの生物学的特性の比較を可能にした。
等量のウイルスDNAを感染させた細胞の核へ送達するために必要な各ウイルスの相対量
が評価された。様々なウイルスストックの生物学的及び物理的な力価を、U2OS-ICP4/27細胞における標準的なプラーク分析(standard plaquing assay)及びウイルス性糖タンパ
ク質D遺伝子のためのqPCRによってそれぞれ決定し、プラーク形成単位(PFU)に対するゲノムコピー(gc)の約3倍の割合の差が、JΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5のウイルスストック
の間においてみられた(表2)。HDFを、等量のPFU又は等量のgcの3のウイルスに感染させ、感染後2時間(h)(pi)の細胞核におけるHSVゲノムの数を、qPCRによって決定した。
等量のgcを感染のために使用した場合、2 hpiの核におけるウイルスゲノムの数は、JΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5に感染させた細胞の間で同様であった(図10A)。これに対し、等量のPFUの感染は、核においてJΔNI2又はJΔNI3のゲノムと比較してより多数のJΔNI5のゲ
ノムをもたらした(図10B)。従って、本調査の後半(the remainder)においては、gc数を、ウイルスインプットを標準化するために使用した。
野生型KOSウイルス及び前の、IE遺伝子を欠失したベクターである、QOZHG(ICP4-/ICP27-/β-ICP22/β-ICP47;(Chen et al., J. Virol. 74, 10132-41 (2000))と比較した
非補完HDF及びVero細胞の生存率におけるJΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5感染の効果を最初に
検証した。5日目(d)piに、KOS又はQOZHGに感染させた培養物におけるよりも約4~5倍多い、25,000 gc/細胞の生存(viable)細胞が、JΔNIに感染させたHDF培養物に残ったが、JΔNI及びQOZHGに感染させたVero細胞の間には、より小さな差がみられた(図11A)。JΔNIウイルスのうち、JΔNI2は、JΔNI3(p = 0.0017)及び5(p = 0.0430)と比較して、HDFに対して多少毒性が強く、一方、Vero細胞に対する毒性は、JΔNI2からJΔNI3(p < 0.001)、JΔNI5(p < 0.001)へと減少した。これらの知見(findings)をIE遺伝子発現と関連づけるため、24 hpiにおける感染させたHDFのウェスタンブロットを、5のIEタンパク質のうちの4に対する抗体でプローブした(図11B)。JΔNI2及びJΔNI3は、いずれも残留(residual)ICP27発現を示し、両方のベクターにおけるICP27遺伝子の直前のTKプロモータは、これらの細胞においてサイレントではないが、IEタンパク質が、2~3倍多いgc/細
胞の使用にもかかわらず、JΔNI 5に感染させた細胞において全く検出されないことを示
した(等量のPFU/細胞、表2参照)。KOS及びQOZHGパターンは、報告されたICP4によるICP0発現の下方調節と整合した(Douville et al, Virology 207, 107-16 (1995); Resnick et al., J. Virol. 63, 2497-503 (1989))。定量逆転写PCR(qRT-PCR)分析を使用
して、ICP0 mRNAを、JΔNI2に感染させたHDFにおいて検出し、等量のgc/細胞でJΔNI2、JΔNI3及びJΔNI5に感染させた12 hpiの細胞の間においてICP22及びICP27 mRNAのレベルが減少することを検出した(図11C)。これらの結果は、JΔNI2が、十分なレベルのICP0を
製造して、ICP22及びICP27発現を強めたということを示唆し、IE遺伝子の漸進的な(progressive)欠失が、HSVベクターの細胞毒性を減少させるということを確認した(Krisky et al, Gene Ther. 5, 1593-603 (1998); Samaniego et al, J. Virol. 72, 3307-20 (1998); Samaniego et al, J. Virol. 71, 4614-25 (1997))。
遺伝子の欠失により、劇的に(drastically)残留遺伝子発現が減少したことを示した。
JΔNIベクターの、欠失したICP4遺伝子座へmCherryレポーター遺伝子を導入された外来ヒトユビキチンC(UbC)プロモータ(p)の活性が、JΔNI2に感染させた細胞と比較して
、JΔNI3及びJΔNIに感染させた細胞においても下方調節されるかを決定するために、感
染させたHDFにおけるmCherry発現を検証した。5,000 gc/細胞での24 hpiには、mCherry蛍光がJΔNI2を感染した細胞において容易に検出可能であったが、JΔNI3を感染した細胞やJΔNI5を感染した細胞においては容易に検出可能でなかった(図12A)。qRT-PCRによる6 hpiにおけるmCherry mRNAレベルの測定により、JΔNI2に感染させた細胞及びJΔNI3に感
染させた細胞の間における、UbCプロモータからの約(some)100倍の転写活性の減少、並びにJΔNI5に感染させた細胞における約5倍の更なる減少が明らかになった(図12B)。本実験において使用されたKNTcコントロールウイルス(control virus)は、複製可能(replication-competent)であり、UL3及びUL4の間の遺伝子間領域においてUbCp-mCherryカセットを含んでいた。これらのデータは、JΔNI2からの残留ICP0及びICP27発現(図11C)が、ウイルスゲノムの全体的な転写のサイレンシングを妨げるために十分であるが、これらの2つの遺伝子の欠失が、全ての天然のプロモータ活性(図11D)も外来(図12A、12B)
プロモータ活性も実質的に除去するという解釈と整合した。HDFと対照的に、JΔNI3又はJΔNI5に感染させた標準的なU2OS細胞は、強いmCherry発現(図12C)を示し、U2OS細胞のICP0を補完する活性が、そうでなければサイレントなこれらのゲノムを活性化するために
十分であったことを示す。ウイルスのICP0タンパク質が同じ活性を有することを確認するために、JΔNI5に感染させたHDFをICP0+QOZHGウイルス(図11B参照)に重複感染させた。図12Dに示すように、重複感染は、mCherry発現を誘導し、一方、モックの重複感染は、mCherry発現を誘導しなかった。総合すると、これらの結果は、ICP27は、少なくとも豊富なICP0発現又は補完活性の存在下においてサイレントなJΔNI5ゲノムを抑圧解除(derepress)するために必須ではないことを示し、JΔNI2に感染させたHDFにおける最小量のICP0発現は、ウイルスゲノムの至る所における制限された(limited)転写活性を維持するのに
十分である(suffice)ことを示唆した。
神経細胞への感染時には、HSVは、ウイルスゲノムがLAT遺伝子座を除いて転写的にサイレントな潜伏状態(latent state)に入る。そうでなければサイレントなウイルスゲノムとの関係においてLAT遺伝子座が非神経細胞において同様に活性なままであるか否かを調
べた。この目的を達成するために、CAGエンハンサ/プロモータ及びEGFP遺伝子(CAGp-GFP)からなる発現カセットを、JΔNI5のLATの2-kbイントロン領域に導入し、JΔNI7GFP(
図13A)と呼ばれるベクターコンストラクトを作り出した。コントロールとして、同じCAGp-GFPカセットをJΔNI5のUL3-UL4遺伝子間領域に導入し、ベクターJΔNI6GFP(図13A)を作製した。UL3-UL4遺伝子間領域を導入遺伝子カセットの非破壊的挿入(non-disruptive insertion)のために使用し(Baines et al., J. Virol. 65, 938-44(1991); Menotti et al, J. Virol. 76, 5463-71 (2002))、該UL3-UL4遺伝子間領域は、LAT遺伝子座に
近接するが、LAT遺伝子座の外部である。明細書中の他のところには、「JΔNI6GFP」を「JΔNI6-CAGGFP」として言及する(図1Aも参照)。感染性ウイルスをU2OS-ICP4/27細胞に
おいて作製し、新規のウイルスストックのgc:PFUの割合は、JΔNI5のそれと同様だった(表2)。JΔNI6-CAGGFP及びJΔNI7GFPの両方が、U2OS-ICP4/27細胞における増幅の間、豊
富な緑色及び赤色蛍光を生じ、その導入遺伝子発現カセットの完全性(integrity)を確
認した。これらのウイルスが非補完細胞においてEGFP導入遺伝子を発現することが可能であることを検証するために、HDFに感染させるgc/細胞を増加させていき、EGFP蛍光を、3 dpiに記録した(図13B)。JΔNI7GFPに感染させた細胞は、豊富な、ウイルス用量依存的EGFP発現を示し、一方、JΔNI6-CAGGFP感染では、最も高用量においてさえ、引き起こされた発現は限定的だった。より初期のJΔNI5感染に比べて、より高いウイルスインプットが用いられたにもかかわらず、mCherry発現は、極めて少ないままであった。これらの結果
を、3及び5 dpiにおけるEGFP及びmCherry mRNAレベルのqRT-PCR測定によって確認し(図13C)、これらの結果は、JΔNI6-CAGGFP及びJΔNI7GFPウイルスゲノムは、JΔNI5ゲノムと同様に、感染させたHDFにおいてサイレントであるが、LAT遺伝子座は、転写的に活性のままであるという示唆と整合した。JΔNI7GFPに感染させた細胞におけるEGFP mRNAレベルは、少なくとも5 dpiにおいて3 dpiと同じくらい高いため(図13C)、細胞が十分に接触阻
止(contact-inhibited)されている場合に、発現をより後期(later times)に検出可能であるかを調査した。結果は、発現がいくつかの細胞において少なくとも4週間持続され
得るということを示した(図13D)。総合すると、これらの観察結果は、LAT遺伝子座が、全てのIE遺伝子発現の機能的な欠失に起因して非毒性であるHSVゲノムからの、持続性の
ある(durable)導入遺伝子発現のための特別な部位であることを示した。
潜伏期間中のLAT発現は、潜伏関連プロモータ(LAP)1及び2によって制御されるということが示された(Goins et al., J. Virol. 68, 2239-52 (1994); Zwaagstra et al., Virology 182, 287-97 (1991))。LAP1は、安定な2-kb LATイントロンに加工される(processed)約8.7-kbの、不安定なLATの一次転写産物の転写開始部位の上流に位置し、一
方、LAP2は、第1エキソンにおいてLAP1の下流に位置し、2-kbイントロン領域に延びる。イントロンまで多少遠くに延びる、LAP2を含む領域は、LATP2と呼ばれている。プロモー
タとして作用するのに加え、LAP2/LATP2領域は、ニューロンにおける導入遺伝子発現のための位置に依存しない(position-independent)長期間の発現/エンハンサエレメントと
して作用し得ることが示された(Berthomme et al, J. Virol. 74, 3613-22 (2000); Palmer et al., J Virol. 74, 5604-18 (2000))。しかしながら、LAT遺伝子座は、CTRLと呼ばれるCTCF結合部位が豊富な領域によって、潜伏の間、ウイルスゲノムの全体的なサイレンシングから保護され、該CTRLの1つは、LAP1の上流に位置し(CTRL1)、他のもの
は、LATP2のちょうど下流の2-kbイントロンに位置する(CTRL2)ことも報告されている(Blooom et al., Biochim. Biophys. Acta 1799, 246-56 (2010))。従って、JΔNI7GFPを感染させたHDFにおいて観察されたEGFP発現を可能にするLATP2及びCTRLエレメントの潜在的な役割が探索された。3のエレメントを、別々に、及び組み合わせにおいてJΔNI7GFPゲノム(図14A)から欠失させ、感染させたHDFにおけるレポーター遺伝子発現を検証した(図14B, 14C)。CTRL1(ΔC1)又はLATP2(ΔLP2)のいずれかの欠失は、緑色蛍光及びEGFP mRNAレベルにおける際立った減少を引き起こし、一方、CTRL2(ΔC2)の欠失は、小
規模な(minor)効果のみがあった。両方のCTRL(ΔC12)の欠失は、CTRL1単独の欠失と
同じ効果があるが、全ての3のエレメント(ΔC12LP2)の欠失は、JΔNI6-CAGGFPを感染させた細胞においてみられたレベルまで更に発現を減少させた。mCherry蛍光は、いかなる
感染させた細胞においても全く検出されず(図14B)、異なる欠失がウイルスゲノムにお
いて他の部位の抑圧解除(derepression)を引き起こさないことを示唆した。これらの結果は、ウイルスゲノムが全てのIE遺伝子を機能的に欠いているという状況で、転写のサイレンシングから連結された(linked)導入遺伝子を保護することにおいてCTRL1及びLATP2領域の両方が重要な役割を果たすことを示した。
IE遺伝子産物の非存在下におけるサイレンシングに対して、組み込まれた(embedded)導入遺伝子発現カセットを保護するために、LAT遺伝子座に結合した配列が十分であるか
を決定するために、2のCTRL、LAP1及びLATP2を含む、JΔNI7GFPのLAT:CAGp-GFP領域に対応する制限フラグメント(restriction fragment)を、同じLAT領域を欠失させて天然の
部位と新たな部位との間の組み換えを回避したJΔNI5派生物における2の異所性位置の1つに挿入した。第1に、ゲートウェイ(GW)組み換えカセットを、UL45及び46(JΔNI9GW)
の間、あるいはLATを欠失させたJΔNI5ゲノムのUL50及びUL51(JΔNI10GW)の間の遺伝子間領域に導入し、その後、LAT:CAGp-GFPフラグメント又はLAT配列を有していないCAGp-GFPのみを、GWカセットとの組み換えによって導入した(図15A)。U2OS-ICP4/27細胞(表2
)におけるウイルス作製に続いて、ベクターを、感染させたHDFにおけるレポーター遺伝
子発現について検査した。3 dpiには、レポーターカセット(JΔNI9GFP及びJΔNI10GFP)の周囲(surrounding)にLAT配列を欠くベクターが、JΔNI6-CAGGFPコントロールベクタ
ーと同様に、感染させた細胞において低いレベルのEGFP蛍光(Fig15B)及びmRNA(図15C
)を示し、2の遺伝子間の挿入部位が、UL3及びUL4の間の遺伝子間領域と同様に(図13)
、転写的に抑制されることを示唆した。しかしながら、レポーターカセットがLAT配列に
両側で隣接していた場合(ベクターJΔNI9LAT-GFP及びJΔNI10LAT-GFP)、EGFP発現がJΔNI7GFPに感染させた細胞にみられるレベルまで増加し(図15B)、LATに由来する領域の抗サイレンシング活性が、位置に依存しない態様で機能的(functional)であることを示した。この活性がLATP2及びいずれか又は両方のCTRLに依存するか(dependence)を確認す
るために、LATP2及びCTRLを欠失させた型(version)のLAT:CAGp-GFPフラグメントを、GW組み換えによってJΔNI10GWゲノムに導入した。欠失は、より初期のJΔNI7GFPΔC12LP2ベクター(図14A)のLAT領域におけるそれと同じであった。LATフリー(LAT-free)JΔNI 10GFPベクターを用いてみられたレベル(図15C、15D)まで十分に減少したわけではないが、欠失により、感染させたHDFにおけるEGFP発現が減少した。なぜΔC12LP2欠失が、JΔNI7GFP(約50倍、図14C)におけるものに比べて、ここではより小さな効果(約3.5倍)があるようにみえるのかは明確でない。しかしながら、これらの結果は、2のCTRL、LAP1及びLATP2を含むLAT遺伝子座の一部が、IE遺伝子発現の非存在下でウイルスゲノムの全体的な
サイレンシングに対して位置に依存しない態様で組み込まれた導入遺伝子発現カセットを保護し得ることを明示し、少なくともCTRL1及びLATP2がこの活性において役割を果たすことを示す。
HDF以外のこれらの知見の適用可能性を評価するために、選択したベクターからのEGFP
及びmCherry発現を他の細胞タイプにおいて検査した。qRT-PCRにより、3 dpiにおいて、JΔNI6-CAGGFPに感染させたヒト細胞に比べてより高いEGFP mRNAレベルが、JΔNI7GFPに感染させたヒト細胞においてみられた(図16B)。最も大きな差が、BJヒト包皮線維芽細胞
(約35倍)においてみられ、HDF(約30倍、図13C)及びヒト肝細胞(hHEP)(約40倍)における差と同様であった。ヒト新生児角化細胞(hEK)が最も小さな差(約4.5倍)を示し、中間値(intermediate values)が、筋肉由来幹細胞(muscle-derived stem cells, hMDSC)(約10倍)及び前脂肪細胞(hPAD)(約7倍)においてみられた。胎児ラット(fetal rat)後根神経節(rDRG)ニューロンにおける2のベクターの比較で明らかになったのは、たったの約2.5倍の差だった。図16Aは、同じ感染条件下で行われた独立した実験からの3 dpiの典型的な蛍光画像を示す。図16Bにおけるドナーとは異なるここでのドナー(donor)からのhHEPを例外として、結果は、大部分が、qRT-PCRデータと整合した。興味深いことに、ヒト細胞は、どれも有意なmCherry蛍光を示さなかったが、JΔNI6-CAGGFPに感染させたラットDRG培養物及びJΔNI7GFPに感染させたラットDRG培養物の両方において豊富なmCherry発現がみられた。この観察結果が、神経細胞に特有であり、かつ、mCherry遺伝子
の直前のプロモータ、ウイルスゲノムにおける発現カセットの位置、及び/又はラット起源の細胞の影響であり得るかはまだ分かっていない。hMDSCを、長期間、維持し、JΔNI7GFPに感染させた細胞において長期間(over time)EGFP発現を測定することを可能にした
。図16Cに示す通り、EGFPは、JΔNI7GFPに感染させた細胞において感染後少なくとも4週
間、容易に検出可能であったが、JΔNI6GFPに感染させた細胞においては、JΔNI7GFPに感
染させたHDF(図13D)の観察結果と同様に、そうではなかった。
い抗サイレンシング活性が、HDFに限定されず、様々な非神経のヒト細胞タイプにおいて
作用する(operative)ことを示した。
本実施例は、JΔNI8の構築及び特性を実例で示す。
一である。図20も参照。
いてJΔNI8の増殖をJΔNI5と比較して評価した。補完細胞を、1細胞当たり1ウイルスゲ
ノムコピー(gc)で各ベクターに感染させた。図18に図示する通り、プラーク形成ユニット(PFU)、ゲノムコピー(gc)及びmCherry導入遺伝子の発現によって測定されたように、JΔNI8は、JΔNI5よりもロバストな増殖を示した。その上、JΔNI5と対照的に、JΔNI8からの補完細胞における感染の間には、天然のHSV遺伝子がより初期に発現されることが
みられた(図19、値1(value of 1)を任意に割り当てた、各JDNI5遺伝子の6 hpiと比較
した発現倍率を示す)。
ゲノムコピー(gc)当たりにより多くのプラーク(補完細胞において)を作り出す。このことは、JΔNI8及びJΔNI8GFP調製(preparations)における欠損粒子に対する機能的粒
子の割合(品質の測定(measure of quality))は、JΔNI5及びJΔNI7GFP調製における
ものより高いことを明らかにする。
のXライン)が、5又は10PFU/細胞(M.O.I. = 5 又は =10)において任意の他のベクター
よりも測れる程度に(measurably)毒性が低い(感染させていないコントロール細胞の生存率に近く又はこれを超える)ことを示した。各グラフにおける下部のXラインは、JΔNI5についての結果を示す。これらのデータは、また、無傷のICP0遺伝子を有するベクター
が、βプロモータ(JΔBBB3(JDBBB3又はJΔβββ3又はJDβββ3とも呼ばれる))の下でさえ、あるいはUL41(QOZHG)を有することなく、JΔNI5又はJΔNI8よりも毒性を有す
ることを明らかにする。予想通り、ウイルス(KOS)を複製することにより、細胞が殺傷
される。HDFを用いた追加的なMTT実験は、JΔNI8が、より高いMOIでわずかな(slight)
毒性を示したが、3倍低いMOI(等しいgc/細胞)でのJΔNI5よりずっと低かったことを明
らかにする(図23)。他のMTTデータは、JΔNI8が、いくつかの細胞種(HDF、ヒト新生児角化細胞、及びヒト神経幹細胞)においてJΔNI5よりも毒性が小さいが、全ての細胞種(Vero、ヒト前脂肪細胞、及びヒト肝細胞)でJΔNI5よりも毒性が小さいわけではないことを示した(図24参照)。
図25)とともに増加したが、JΔNI7GFPについては横ばい状態になる(leveled off)ことがみられた。理論に拘束されることを望まないが、JΔNI7GFPからの発現についてみられ
た横ばい状態(leveling-off)は、HDF細胞におけるベクターの高用量毒性(high-dose toxicity)によるものであり得、このことがかかる毒性がJΔNI8GFPにおいてより低いことを暗示する(implies)と思われる。また、顕著な(notable)mCherryが、JΔNI8GFPに感染させたHDF細胞からみられたが、JΔNI7GFPに感染させたHDF細胞によっては見られなか
った。同様の実験を、一定用量の、JΔNI7GFP又はJΔNI8GFP(25,000 gc/細胞)のいずれかを用いて行い、EGFP又はmCherry蛍光のレベルを、長い時間をかけて分析した(感染後2、4、及び6日(図26))。JΔNI8GFPに感染させた培養物におけるレポーターシグナルは
、4及び6 dpiの間、減少し、おそらく損なわれていない(unimpaired)細胞分裂によるウ
イルスゲノム希釈(dilution)の結果だろう。シグナルは、おそらく細胞分裂の減少に起因して、JΔNI7GFPに感染させた培養物においてより安定であった。
又はmCherry)発現も調査された。図27に図示するように、2つの測定された用量(12,500 gc/細胞及び25,000 gc/細胞)において、JΔNI8GFPは、ヒト新生児角化細胞において、JΔNI7GFPよりも多くのGFPを発現した。
させたラット後根神経節(DRG)細胞からの導入遺伝子発現を分析した。図28に図示する
ように、JΔNI7GFPからのmCherry(両方のベクターのICP4を欠失した遺伝子座に挿入された)発現は、GFPに関連して、非神経細胞(non-neuronal cells)と比較して、ラットDRGニューロンにおいて強められ、JΔNI7GFPに感染させた細胞においてよりもJΔNI8GFPに感染させた細胞において比較的強い。これらの結果は、JΔNI8が非毒性であり、かつ、LAT
及びICP4遺伝子座の両方からニューロンにおける導入遺伝子発現をもたらすことを明らかにする。
本実施例は、長期間の試験におけるJΔNI7-GFPベクターからのインビボの発現を実例で示す。
ラットの海馬(AP:-1.8;ML:-1.7;P:+3.5)に定位的に(sterotactically)に注入した。動物を、ベクター導入後6、15又は30日(dpi)に安楽死させ、かん流し、脳低温切開片(brain cryosections)を蛍光顕微鏡下で画像撮影した。図29は、EGFP及びmCherryの
両方のロバストな発現の、海馬内の同じ細胞内での共局在(co-localized)を明らかにする。図29上段において、感染後、表示された日数(dpi)でのEGFP及びmCherry蛍光の別々の(左;40x)又はマージされた(中央、右;20x)画像を;下段において、別々の及びマージされた画像を15 dpi(10x)において図示する。
本実施例は、感染させた初代星状膠(astrocytes)内のJΔNI7-GFPベクターからのmCherry導入遺伝子の発現に関する。
な抗体(該抗体へのポジティブな結合(positive binding)によって星状膠細胞が同定される)に曝露した。免疫蛍光イメージング(imaging)は、JΔNI7-GFPが、非毒性であり
、星状膠において持続性発現をもたらすことを明らかにした。
本実施例は、本発明のHSVベクターを補完し、かつ、ウイルスを増やす間、loxPに隣接
する(loxP-flanked)BACカセットの切除も促進するための細胞株の生成を実例で示す。
伝子の機能を除く、ベクターJDNI5, 7, 8及びそれらの派生物における全ての欠損HSV IE
遺伝子の機能を補完し、ウイルス増殖の間に、BACカセットを除去する。
ICP4/27細胞に感染させることによって生成した。レトロウイルスベクターの構築のため
に、プラスミドpCX4Hyg(PNAS 2003, 100: 13567-13572; GenBank 受入番号 AB086387)
を、マルチクローニング部位へのゲートウェイ組み換えカセットの挿入によって改変して、pCX4Hyg-GWを作り出した。プラスミドpTurbo-Creからの完全なNLS-Creコーディング配
列(GenBank accession number AF334827.1)を、pENTR1A (Invitrogen)のattL1及びattL2部位の間に挿入し、その後、LRクローナーゼを介する(Clonase-mediated)ゲートウ
ェイ組み換えによってpCX4Hyg-GWに移入して、pCX4Hyg-Creを作り出した。このプラスミ
ド及びその構築法を概略的に図30及び31に図示する。レトロウイルス粒子を、Makino et al.(Exp Cell Res 2009, 315: 2727-2740)によって説明される通り、作製した。簡潔には、pCX4Hyg-Creを、Gag-Pol及びVSV-G発現プラスミドとともに293T細胞へ共導入し(co-transfected)、上清を48時間後に集め、0.45ミクロンフィルター(micron filter)を通して濾過し、遠心分離によって濃縮した。適切なGag-Pol & VSV-Gプラスミドが、商業的
に利用可能である(例えば、Cell BiolabsからのpCMV-Gag-Pol(Cat. No. RV-111)及びAddgeneからのpCMV-VSV-G)。
イシン、ブラストサイジン及びハイグロマイシンへの耐性についてセレクションした。耐性コロニー(Resistant colonies)を単離し、増殖させ(amplified)、0.001-1PFU/細胞でJΔNI7-GFPに感染させ、β-ガラクトシダーゼ活性について感染2日後(dpi)に染色し
た。ほとんど青色細胞を示さないクローンが、急速な細胞毒性効果を被った(undergo)
(MOI = 0.01で導入後4 dpiにおける100%CPE)ことがわかったが、一方、親の(parental)U2OS-ICP4/27細胞は、9 dpiにおいて青色細胞のプラーク形成クラスタ及び約25%CPEを
示した。これらの結果は、JΔNI7-GFPにおいて連結されたLacZ発現カセットとともにBAC
エレメントを、Creを介して(Cre-mediated)除去することにより、ウイルス増殖が促進
されることを示した。JΔNI7-GFPのloxP部位間におけるBAC及びLacZ配列の正確な除去は
、セレクションされたU2OS-ICP4+/27+/Cre+クローンにおいて、個々のJΔNI7-GFPプラー
クからのウイルスDNAに関するPCRによって確認された。
、「the」及び「少なくとも1つの(at least one)」なる用語並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈されるべきである。1以上の項目の列挙に続く「少な
くとも1つ(at least one)」なる用語の使用(例えば、「A及びBのうちの少なくとも1つの(at least one of A and B)」)は、本明細書中に特に示されない限り、又は文脈と
明らかに矛盾しない限り、列挙された項目(A又はB)あるいは2以上の列挙された項目(A及びB)の任意の組み合わせから選択された1の項目を意味すると解釈すべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含む(containing)」なる用語は、他に示されない限り、オープンエンドな用語(すなわち、「含む
が、限定されない」を意味する)と解されるべきである。本明細書中に他に示されない限り、本明細書中の数値範囲の記載は、該範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に言及する省略方法として働くことを意図しているにすぎず、それぞれの別個の値は本明細書中に個
別に記載されているのと同程度に本明細書中に組み込まれる。本明細書中に他に示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本明細書中に記載される全ての方法は、任意の適切な順に行うことができる。特段特許請求されない限り、本明細書中に提供される任意の及び全ての例、又は例示的語句(例えば、「等(such as)」)の使用は、単に本
発明をより明確に説明することを意図するにすぎず、発明の範囲に限定を加えることはない。本明細書中のいずれの語句も、特許請求されていない任意の要素が本発明の実施に必須のものとして示すと解釈されるべきではない。
Claims (23)
- 1以上の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターであって、該HSVベクターが、前初期遺伝子としてICP0、ICP4、ICP22、及びICP27をコードする遺伝子またはコードする遺伝子を制御するプロモータ配列の不活性化変異を含み、1以上の前記導入遺伝子をコードする1以上のポリヌクレオチドがICP4遺伝子座内に挿入され、1以上の前記導入遺伝子をコードする1以上のポリヌクレオチドがLAT遺伝子領域内に挿入される、HSVベクター。
- 該HSVベクターが、前初期遺伝子としてICP47をさらに発現しない、請求項1に記載のHSVベクター。
- 該導入遺伝子が、非補完細胞内で転写されるものであり、該非補完細胞が、培養されたヒト皮膚線維芽(HDF)細胞である、請求項1または2に記載のHSVベクター。
- ICP0、ICP4、ICP22、及びICP27遺伝子座の1以上における不活化欠失を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- ICP0、ICP4、ICP22、及びICP27遺伝子座の1以上における該不活化欠失が、前記遺伝子座内のコーディング配列の完全欠失である、請求項4に記載のHSVベクター。
- ICP0、ICP4、ICP22、及びICP27遺伝子座の各々における不活化欠失を含む、請求項1に記載のHSVベクター。
- ICP0、ICP4、ICP22、及びICP27遺伝子の1以上が、初期又は後期遺伝子として発現される、請求項1~6のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- ICP22が、初期遺伝子として発現される、請求項1~7のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- ICP22が初期プロモータの制御下にある、請求項1~8のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 1以上の必須でない遺伝子における不活化欠失を更に含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 該1以上の必須でない遺伝子がUL41を含む、請求項10に記載のHSVベクター。
- 内部リピート(ジョイント)領域の欠失を更に含む、請求項1~11のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 野生型糖タンパク質を含むHSVベクターと比較してHSVベクターの感染性を強める、又は非古典的受容体を介する細胞へのHSVの進入を誘導する、変異糖タンパク質をコードする遺伝子を更に含み、前記糖タンパク質がgB、gC、gD、gH、及びgKから選択される、請求項1~12のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 1以上の導入遺伝子をコードする1以上の該ポリヌクレオチドが、哺乳動物の構成的なプロモータに操作可能に連結された、請求項1~13のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 1以上の導入遺伝子をコードする1以上の該ポリヌクレオチドが、細胞又は組織特異的プロモータに操作可能に連結された、請求項1~13のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 1以上の導入遺伝子をコードする1以上の該ポリヌクレオチドが、ポリシストロニックである、請求項1~15のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 1以上の導入遺伝子をコードする該ポリヌクレオチドが、microRNAのための1以上の結合部位を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 該1以上の導入遺伝子が、Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc、L-myc、ドミナントネガティブp53、Nanog、Glis1、Lin28、TFIID、GATA4、Nkx2.5、Tbx5、Mef2C、Myocd、Hand2、SRF、Mesp1、SMARCD3、SERCA2a、Pax3、MyoD、Lhx2、FoxG1、FoxP2、Isl1、Ctip2、Tbr1、Ebf1、Gsx2、Srebp2、第VIII因子、第IX因子、ジストロフィン、CFTR、GlyRα1、エンケファリン、GADアイソフォーム、神経栄養因子、Ascl1、Nurr1、Lmx1A、Brn2、Myt1l、NeuroD1、FoxA2、Hnf4α、Foxa1、Foxa2、Foxa3、microRNA、miRNAの組み合わせ、および1以上のノンコーディングRNA(s)(ncRNA(s))から選択される、請求項1~17のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 該HSVゲノムが、リコンビナーゼ酵素のための1又は2のコンセンサス配列を更に含む、請求項1~18のいずれか1項に記載のHSVベクター。
- 該リコンビナーゼ酵素のための該コンセンサス配列が、遺伝子間領域に挿入される、請求項19に記載のHSVベクター。
- 請求項1~20のいずれか1項に記載のHSVベクターを含むウイルスストック。
- 請求項1~20のいずれか1項に記載のHSVベクター及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
- 前記導入遺伝子の1以上が細胞内に発現されるように、非補完細胞を請求項1~20のいずれか1項に記載のHSVベクターに感染させることを含む、in vitroに細胞内で導入遺伝子を発現させる方法。
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