JP7526498B2 - 細胞内のインビトロディスプレイライブラリのスクリーニング方法 - Google Patents

細胞内のインビトロディスプレイライブラリのスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、小分子化合物の細胞内で、ライブラリの結合実体(binding entity)を目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合させて、目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に細胞内で結合することができるライブラリの少なくとも１つの個々の化合物結合実体を同定するためのインビトロディスプレイライブラリをスクリーニングする方法に関する。
ディスプレイ技術は、核酸の情報保存及び増幅能力を他の化合物の機能活性と組み合わせるために開発されてきた。ディスプレイ技術は、機能的結合実体（すなわち、表現型）と、結合実体の構造に関する核酸配列情報（遺伝子型）との間の関係に依存する。注：表現型及び遺伝子型が同じ分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）からなるため特別な場合であるが、核酸アプタマ技術はディスプレイ技術と見なされる。
そのような方法の利点は、非常に大きなライブラリを構築でき、機能的結合実体の所望の活性についてプローブすることができることである。次いで、所望の活性を有するライブラリメンバを、所望の活性を有さないライブラリメンバから分けることができ、したがって、所望の活性を有するメンバの割合がより高い濃縮ライブラリを作製することができる。このプロセスは、選択又は濃縮(enrichment)と呼ばれる。いくつかのディスプレイ技術は、一巡の選択からの濃縮ライブラリが増幅され、新たな濃縮ディスプレイライブラリを調製するために使用され、次の選択の一巡で使用される等の選択の繰返しを可能にする。次いで、濃縮ライブラリ中のライブラリメンバの構造をそれらの同族核酸配列によって同定することができ、したがって、微量の物質からでさえも同定が可能になる。
本明細書では、関連するライブラリは、当技術分野に従って、「インビトロディスプレイライブラリ」と呼ぶことができる。
用語「インビトロディスプレイライブラリ」は、本明細書において、当技術分野に従って理解され、すなわち、ライブラリは数多くの異なる結合実体を含んでおり、各結合実体が核酸分子に結合し、核酸分子は結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含んでいるため、すなわち、核酸分子の特異的核酸配列情報がわかると、核酸分子に結合した特異的結合実体の構造が直接わかり、核酸分子に結合した結合実体（すなわち、表現型）の構造（遺伝子型）は、本明細書ではＢ構造体と呼ぶ。
結合した核酸分子がＤＮＡ分子である場合、用語「インビトロディスプレイライブラリ」は、当技術分野では「ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）」と呼ばれることがある。また、用語「結合実体」(binding entity)は、当技術分野では「リガンド」と呼ばれることがある。
先行技術は、そのようなインビトロディスプレイライブラリを作製するための多数の異なる方法を記載しており、ここでの好適な例には、例えば、欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１(Vipergen - YoctoReactor(登録商標)(yR)library technology)、欧州特許第１４０２０２４号Ｂ１（Nuevolution)、欧州特許第１４２３４００号Ｂ１(David Liu)、Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark)、国際公開ＷＯ第００／２３４５８号(Harbury)、Nature Methods(2006)、3(7)、561-570、2006(Miller)、Nat.Biotechnol.2004;22、568-574(Melkko)、Nature.(1990);346(6287)、818-822(Ellington)、又はProc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)、国際公開ＷＯ２００６／０５３５７１号Ａ２(Rasmussen)が挙げられる。
例えば上述の先行技術に記載されているように、今日、非常に多く（例えば１０１５）の特異的結合実体（例えば１０１５個の異なる化学化合物）を含むインビトロディスプレイライブラリを作製することができる。
この多数の特異的結合実体を考慮すると、例えば、目的の標的（例えば、医療上重要な受容体分子）に結合する特異的結合実体（例えば、化学化合物）の構造を効率的に同定することを可能にするには、濃縮ライブラリを作製するためのそのようなライブラリの選択／濃縮工程が重要であることは明らかである。
欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１(Vipergen)の図３には、欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１(Vipergen-YoctoReactor（登録商標）(yR)library technology)に記載されているようなインビトロディスプレイ技術の一例が示されており、欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１の図３に見られるように、この例の選択工程は、標的（例えば、受容体）を固体表面（例えば、ビーズ又はガラスプレート）に固定化することによって行われ、非結合剤及び低親和性結合剤は典型的には洗い流されるが、結合剤が濃縮された集団は固体支持体から回収される。そのような固体支持体に基づく選択／濃縮方法の多数の例が当技術分野に記載されている。
欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１(Vipergen)は、共区画化による濃縮（ＥＣＣ）と呼ばれる、又は代替的にＢｉｎｄｅｒ Ｔｒａｐ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（登録商標）（ＢＴＥ）と呼ばれる濃縮ライブラリを作製するための改良されたインビトロディスプレイに基づく方法に関する。例えば、欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１の図１、図２又はVipergen社のホームページhttp://www.vipergen.comを参照されたい。
上述のように、多くの先行技術に記載されている「インビトロディスプレイライブラリ」法である特異的結合実体（例えば、化合物）を目的の標的（例えば、医療上重要な受容体分子）に結合させる選択／濃縮工程は、例えば標的（例えば、受容体）を固体表面（例えば、ビーズ又はガラスプレート）に固定化すること等、天然ではない人工的な状況で精製された異種発現タンパク質に依存すると呼ばれ得る方法で行われる。
そのようないわゆる人工的な状況における結合／選択に関連して、Lynn MM et al.の論文(Identification of Ligand-Target Pairs from Combined Libraries of Small Molecules and Unpurified Protein Targets in Cell Lysates’’;J.Am.Chem.Soc.2014,136,3264-3270)は、「固定化された標的に対する選択の結果は、細胞状況から取り出された際の非天然の立体配座をとるタンパク質に対する生物学的関連性を欠くか、又はそれらの機能に不可欠な結合パートナ若しくは補因子を欠く場合がある」と記載している。
これを考慮して、Lynnの論文は、細胞溶解物中のＤＮＡ結合リガンド及び未精製タンパク質標的のワンポット混合物からリガンド＋標的対を同定するためのいわゆる未精製タンパク質を使用する相互作用決定（ＩＤＵＰ）について記載している。
Zining Wu et al.の論文(Cell-Based Selection Expands the Utility of DNA-Encoded Small-Molecule Library Technology to Cell Surface Drug Targets..’’;ACS Comb.Sci.2015,17,722-731)は、小分子ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）からの、細胞表面標的に対する高親和性及び選択的リガンドを同定するための細胞系選択方法、すなわち結合が細胞表面上で行われ、それ自体は細胞内にはない方法について記載している。
M.Schurmann et al.の論文(Small-Molecule Target Engagement in Cells’’;Cell Chemical Biology 23,April 21,2016)は、単一の特異的小分子化合物を細胞に導入することができ、次いで、時にはこの単一の（１つの特異的）化合物が標的（例えば、受容体）に結合するかどうかを同定／検出することが可能であり得ることを記載している。
本文脈において当業者によって理解されるように、このM.Schurmannによる論文は、インビトロディスプレイライブラリ（例えば、ＤＮＡコード化ライブラリ等）、すなわち多数（例えば１０１０）の異なる結合実体を含むライブラリをスクリーニングする方法に関するものではない。
簡潔には、このM.Schurmannの論文は、本質的に、目的の小分子が目的の標的（例えば、受容体）に結合することが既にわかっており、本質的に単に目的の細胞内でこれを確認したい、又は結合が物理的に起こる細胞の場所（例えば、どの区画であるか）を研究したい状況に関する。
要約すると、理論に限定されるものではないが、本発明者らは、「細胞内で」小分子化合物の、ライブラリの結合実体を、目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合させるためのインビトロディスプレイライブラリ（例えば、ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ））をスクリーニングする方法、すなわち、特異的結合実体（例えば、化合物）を目的の標的（例えば、医療上重要な受容体分子）に結合させるライブラリ選択／濃縮工程が「細胞内で」行われる方法について直接的かつ明確に記載している先行技術文献はないと考える。
欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１ 欧州特許第１４０２０２４号Ｂ１ 欧州特許第１４２３４００号Ｂ１ 国際公開ＷＯ第００／２３４５８号 国際公開ＷＯ２００６／０５３５７１号Ａ２ 欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１
（本明細書末の［参考文献一覧（REFERENCE LIST）］参照）
本発明が解決しようとする課題は、目的の小分子化合物を目的の標的（例えば、医療関連受容体）に結合させるためのインビトロディスプレイライブラリをスクリーニングするための改善された方法を提供することである（と見なし得る）。
ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）スクリーニングの以前の例のほとんどは、細胞状況から取り出される組換え精製タンパク質に対して行われる。精製されたタンパク質は、それらの機能に必須の結合パートナ又は補因子を欠き、非天然立体配座をとり得る。したがって、細胞状況外の精製タンパク質に対するＤＥＬスクリーニングで同定された化学結合実体は、生物学的関連性を欠いている可能性がある。本発明では、細胞内で発現されたタンパク質に対してＤＥＬスクリーニングを行う。細胞内で、目的のタンパク質は、天然の環境において必須の結合パートナ及び補因子と相互作用することができる。したがって、細胞内のＤＥＬスクリーニングから同定された化学結合実体は、生物学的に活性である可能性がより高い。後者は、創薬に適用される化学結合実体に対して特に重要である。
本発明は、細胞内で発現されたタンパク質に対してＤＥＬスクリーニングを実施することを可能にする。従って本発明は、ＤＥＬスクリーニングの以前の例のほとんどに必要な組換え発現及び精製タンパク質を得るための労力のかかるプロトコルに依存しない。
本明細書の実施例では、本発明者らが、「細胞（すなわち、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞）内の」インビトロディスプレイライブラリ（ＤＮＡコード化ライブラリ）をスクリーニングの実施に成功した方法、及び、「細胞内で」目的のタンパク質標的に結合することができるライブラリの多くの個々の化合物結合実体（リガンド）の同定に成功した方法について記載する。
上で議論されるように、また、理論に限定されることなく、本発明者らは、どの先行技術文献も、そのような「細胞内」方法、すなわち、特異的結合実体（例えば、化合物）を目的の標的（例えば、医療上重要な受容体分子）に結合させるライブラリ選択／濃縮工程が「細胞内で」行われる方法について直接的かつ明白に記載していないと考える。
理論に限定されるものではないが、本明細書の実施例において記載された「細胞内」の非常に陽性な(positive)スクリーニング結果を得ることが可能であったことは、本発明者らにとっては一見したところ明白ではなく、これに関しては例えば、本明細書の実施例１の結論を参照されたい。
この理由の１つは、細胞が非常に多くのタンパク質及び他の区画(compartments)を含むため、細胞内の「タンパク質密度」が非常に高いことが当技術分野で知られていることに関し、例えば、Ron Miloの論文(What is the total number of protein molecules per cell volume?..’’;Bioessays 35:1050-1055,2013)は、「我々は、細菌、酵母、及び哺乳動物細胞において、立法マイクロメートル（すなわち、１ｆＬ）当たり２百万～４百万の範囲のタンパク質が存在すると推定する」と示している。
本発明のインビトロディスプレイライブラリをスクリーニングする方法に関連して、インビトロディスプレイライブラリは非常に多く（例えば１０１０）の異なる化合物結合実体を含むため、細胞内の高い「タンパク質密度」は、当業者にとっては一見したところ問題であると思われ、ライブラリ内の相当量の「良好な結合剤」が、実際に目的の標的（例えば、受容体）を見つけ、それによって目的の標的に結合することができることは、一見したところ理にかなっていないように思われる。
言い換えれば、本「細胞内」発明の開示の前では、ライブラリ化合物結合実体のいずれも実際には細胞内の目的の標的（例えば、受容体）を見つけて、それによって結合することができない（又はごくわずかしか結合できない）、すなわち、そのようなシナリオでは、ライブラリの代表的な良好な結合剤化合物の量を同定しないため、「細胞内」のライブラリ結合剤スクリーニングは技術的に関連／有用ではないと一見したところ考えたかもしれない。
本明細書で説明するように、本発明の「細胞内」ライブラリスクリーニング方法を使用することによって、本発明者らは、多くの個々の異なる良好な結合剤化合物結合実体、すなわち、ライブラリの許容可能な非常に多くの代表的良好な結合剤化合物を同定した。
したがって、本発明の１つの関連する技術的寄与は、本発明が、「細胞内の」インビトロディスプレイライブラリ（ＤＮＡコード化ライブラリ）のスクリーニングの実施に成功し、それによって「細胞内で」目的のタンパク質標的に結合することができるライブラリの許容可能な代表的な非常に多くの個々の化合物結合実体（リガンド）を同定することが実際に可能であることを実証したという事実に関連すると見なすことができる。
本明細書の実施例では、使用した細胞はアフリカツメガエル卵母細胞であった。
しかし、上述の起こり得る問題／課題である細胞内の「タンパク質密度」は、アフリカツメガエル卵母細胞に関連するだけでなく、反対に、実質的に目的のどの細胞に対しても一般的な懸念事項と見なすことができる。
したがって、本明細書の実施例が、アフリカツメガエル卵母細胞に作用する本発明の方法を実証する本明細書の実施例の事実によって、相当量の他の異なる細胞型（例えば、他の真核細胞型、例えばヒト（例えばＣＨＯ）細胞等）でも作用することが理にかなっている。
したがって、本発明の第１の態様は、細胞内で、ライブラリの小分子化合物結合実体を目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合させて、細胞内で目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合することができるライブラリの少なくとも１つの個々の化合物結合実体を同定する、インビトロディスプレイライブラリのスクリーニング方法であって、
当該方法は、
（ｉ）： 少なくとも１つの標的Ｔｎ（式中、ｎ＝１以上）を細胞において発現させる工程であって、少なくとも１つの標的がタンパク質又はＲＮＡであり、標的の構造体は、本明細書においてＴ構造体と呼ばれる、工程と、
（ｉｉ）： インビトロディスプレイライブラリを（ｉ）の細胞に導入する工程であって、
（ａ）：ライブラリが、少なくとも１０００個の異なる結合実体Ｂｎ（ｎ＝１０００以上）のライブラリであり、各結合実体は核酸分子に結合しており、核酸分子は、結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含み、核酸分子の特異的核酸配列情報がわかると、核酸分子に結合した特異的結合実体の構造が直接わかり、ライブラリの結合実体は、平均分子量ＭＷが１００００ダルトン未満の化合物であり、核酸分子に結合した結合実体の構造体は、本明細書ではＢ構造体と呼ばれ、
（ｂ）：標的分子に結合することができる結合実体を含むＢ構造体は、同じ標的に結合することができない結合実体を含むＢ構造体よりも、対応するＴ構造体により効率的に結合する条件である結合条件下において、ライブラリが細胞に導入され、細胞内で、結合実体の少なくとも１つを少なくとも１つの標的に結合させ、それにより、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体と呼ばれる、Ｔ構造体に結合したＢ構造体を含む複合体を細胞内に作製する、
インビトロディスプレイライブラリを（ｉ）の細胞に導入する工程と、
（ｉｉｉ）： （ｉｉ）の細胞の溶解を行い、細胞膜を破壊し、
（Ａ）：細胞から（ｉｉ）のＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を取り出し、それによってＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を含む溶液を得ること、そして当該ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体は細胞内にはないこと、又は、
（Ｂ）：工程（ｉｉ）で標的に結合し且つ工程（ｉｉｉ）の前に標識されたＢ構造体を、工程（ｉｉ）で標的に結合しなかったＢ構造体から当該標識されたＢ構造体を区別することを可能にするような方法で細胞から取り出し、それにより、結合剤標識されたＢ構造体を含む溶液を得ること、そして当該結合剤標識されたＢ構造体は細胞内にはない、
（細胞の溶解を行う）工程と、
（ｉｖ）： （ｉｉｉ）の溶液と、Ｂ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含む核酸分子の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも１つの個々の結合実体の同定を可能にする工程と、
を（当該方法は）含む。
細胞において少なくとも１つの標的を発現させることに関する工程（ｉ）は、当技術分野に従って行うことができ、目的の細胞において目的のタンパク質又はＲＮＡ標的を発現させることは、当業者にとって日常的な作業である。
多くの場合、標的は異種発現標的であることが好ましい可能性がある。
当該技術分野によれば、用語「異種」(heterologous)は、通常、標的（例えば、タンパク質）を作製（すなわち発現）しない細胞に実験的に入れられる標的（例えば、タンパク質）に関する。
しかし、いくつかの場合において、標的は、細胞において天然に発現される標的、例えば、ヒト（例えばＣＨＯ）細胞において天然に発現されるヒト受容体標的であることが好ましい場合がある。標的は、トランスジェニック宿主に由来する細胞、例えばヒト受容体標的の改変バージョンで発現されることが好ましい場合がある。
上述のように、先行技術は、インビトロディスプレイライブラリ自体を作製するための多くの異なる方法について記載しており、したがって、工程（ｉｉ）のインビトロディスプレイライブラリ自体を作製することは、そのようなインビトロディスプレイライブラリを作製するための既知の先行技術の技術に従って行うことができる。
工程（ｉｉ）は、「インビトロディスプレイライブラリを（ｉ）の細胞に導入する工程」を指し、本質的に、この工程は、従来技術の既知の技術に基づいて行うことができる。
本明細書の実施例で説明するように、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合、先行技術の既知の注入技術を介してライブラリを卵母細胞に導入することができ、注入（例えば、マイクロインジェクション）が相当量の他の哺乳動物細胞型では機能しないと考える理由はない。
あるいは、目的の細胞型に応じて、例えばトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション又は化学ベース）によって行うことができる。
工程（ｉｉ）（ｂ）に従って好適な「結合条件」を同定することは当業者にとって日常的な作業である。
本質的に、工程（ｉｉ）（ｂ）の「結合条件」は、一般に、細胞内の天然の結合条件であり、すなわち、本発明の利点の１つは、結合実体（リガンド）が、細胞内で天然の結合条件であり得る工程（ｉｉ）（ｂ）の「結合条件」下で標的に結合することができることである。
工程（ｉｉｉ）は、「（ｉｉ）の細胞を溶解して、細胞膜を破壊する工程」を指し、本質的に、この工程は、従来技術の既知の技術に基づいて行うことができる。
また、工程（ｉｖ）は、例えば上述のような従来技術の既知の技術に基づいて行うことができる。
簡潔には、本明細書で更に詳細に説明するように、工程（ｉｖ）のこの「（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定する工程」は、異なる方法で行うことができ、共通の一般知識及び本明細書の技術的教示に基づいて、この工程（ｉｖ）を行うことは当業者にとって日常的な作業である。
簡潔には、本明細書の詳細な説明及び共通の一般知識に基づいて、当業者は、多くの異なる方法／実施形態で第１の態様の各工程（ｉ）～工程（ｉｖ）のすべてを実行することができる。
本発明の実施形態が、単なる例示的方法として以下に記載される。
本願の第１の態様（すなわち、クレーム１）の方法の実施形態の例を表す図である。 プレイ－ベイトを使用した場合の、本願の第１の態様（すなわち、クレーム１）の方法の実施形態の例を表す図である。 本願の実施例１の結果であり、更なる詳細については実施例１を参照のこと。
発明の詳細な説明
［第１態様の工程（ｉ）］
上述のように、工程（ｉ）は、「（ｉ）少なくとも１つの標的Ｔｎ（式中、ｎ＝１以上）を細胞において発現し、少なくとも１つの標的はタンパク質又はＲＮＡであり、当該標的の構造体は、本明細書ではＴ構造体と呼ばれる」ことを示す。
標的は、目的の任意の好適なタンパク質又はＲＮＡ標的であり得る。
上述のように、目的の細胞において目的のタンパク質又はＲＮＡ標的を発現させることは当業者にとって日常的な作業（ルーチンワーク）である。
本明細書の実施例で説明され、当技術分野で知られているように、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合、標的の発現はｍＲＮＡの注入によって行うことができ、それが好ましい場合がある。
しかし、細胞における標的の発現は、他の周知の好適な方法によって、例えば、目的の細胞における目的の標的の日常的な組換え発現（例えばＤＮＡから作製された発現ベクタの使用）によって行うことができる。
多くの場合、標的は異種発現標的であることが好ましい可能性がある。
当該技術分野によれば、用語「異種」(heterologous)は、通常、標的（例えば、タンパク質）を作製（すなわち発現）しない細胞に実験的に入れられる標的（例えば、タンパク質）に関する。
いくつかの場合、標的は、細胞内の特定の細胞区画、例えば核内で異種発現されることが好ましい場合がある。当業者にとって、これは、標的構築物にリーダ配列、すなわちシグナル配列を導入することで行うことができる。
好ましくは、標的はタンパク質である。
当技術分野で知られているように、好適な標的は、例えばヒトの体内に存在する受容体分子であり得、その受容体に結合することができる結合実体（例えば、化合物）を同定することに関心があるであろう。
従って、標的は、好ましくは受容体、例えば受容体タンパク質分子等であり得る。
先行技術によれば、好適な例では、標的は、自己抗原、細菌タンパク質、血液タンパク質、細胞接着タンパク質、サイトカイン、細胞骨格タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質、発生タンパク質、人口タンパク質、酵素、細胞外マトリックスタンパク質、ＧＴＰ結合タンパク質レギュレータ、糖タンパク質、成長因子、熱ショックタンパク質、リポタンパク質、膜タンパク質、金属タンパク質、モータタンパク質、リンタンパク質、プリオン、タンパク質複合体、タンパク質ドメイン、ＲＮＡ結合タンパク質、受容体、組換えタンパク質、種子貯蔵タンパク質、構造タンパク質、転写コレギュレータタンパク質、輸送タンパク質、ウイルスタンパク質又はそれらの断片であり得る。
簡潔には、当業者は、本文脈において目的とすることができるよりも非常に多くの異なる可能な標的を認識している。
場合によっては、発現した標的タンパク質を、例えばリン酸化、メチル化、アセチル化又は脱リン酸化によって修飾することが好ましい可能性がある。当業者によって、修飾酵素、例えば、キナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ又はホスファターゼを、標的タンパク質と一緒に共発現させることにより、発現した標的タンパク質の修飾を行うことができる。
上で説明したように、本明細書の実施例が、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合、本発明の方法が作用することを実証する本明細書の実施例の事実によって、相当量の他の異なる細胞型（例えば、他の真核細胞型、例えばヒト（例えばＣＨＯ）細胞等）でも作用することは理にかなっている。
好ましくは、細胞は真核細胞、例えば哺乳動物細胞であり、好ましくは、哺乳動物細胞はヒト（例えばＣＨＯ）である。
本明細書の実施例では、非常に多くの異なる結合実体を含むインビトロディスプレイライブラリを単一の個々の細胞（すなわち、アフリカツメガエル卵母細胞）に（注入によって）導入することが可能であることが示されている。
したがって、好ましい実施形態では、細胞は、例えば、ゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）卵母細胞又はアフリカツメガエル卵母細胞等のセノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞であり、最も好ましくはアフリカツメガエル卵母細胞である。
工程（ｉ）の用語「細胞」は、単一の細胞（例えば、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合）であってもよい。
しかし、本文脈において当業者によって理解されるように、工程（ｉ）の用語「細胞」は、実際には多くの場合、細胞の集団を指してもよく、集団の個々の細胞は、目的の標的を組換え発現する。
例えば、標的が、例えば、目的の細胞型（例えばヒトＣＨＯ細胞）における標的の標準的／日常的な組換え発現で発現ベクタの使用によって発現される場合、これは、一般に、細胞の集団を示し、集団の個々の細胞は、目的の標的を組換え発現する。
第１の態様の工程（ｉ）は、「少なくとも１つのＴｎ（ｎ＝１以上）」を示す。
本明細書に記載の方法の利点は、効率的かつ迅速な方法で、例えば２つ以上の標的に結合することができる結合実体を同時にスクリーニングできることである。
例えば、標的は２つの異なる受容体分子であり得、次いで、本明細書に記載の方法は、受容体のうちの１つに結合する１つの結合実体及び他の受容体に結合する他方の結合実体を同時に同定することができる。
上記の例（２つの異なる、例えば受容体標的を有する）では、標的Ｔｎ（ｎ＝２）又は代替的にＴ２を表す状況を有するであろう。
上記に沿って、工程（ｉ）において少なくとも２個の異なる標的を有すること［すなわち、Ｔｎ（ｎ＝２以上）］、又は工程（ｉ）において少なくとも３個の異なる標的を有すること［すなわち、Ｔｎ（ｎ＝３以上）］、又は工程（ｉ）において少なくとも１０個の異なる標的を有すること［すなわち、Ｔｎ（ｎ＝１０以上）］、又は工程（ｉ）において少なくとも１００個の異なる標的を有すること［すなわち、Ｔｎ（ｎ＝１００以上）］は関連し得る。
理論に限定されるものではないが、工程（ｉ）において１０００個を超える異なる標的、すなわち細胞において１０００個を超える異なるＴ構造体を有することは困難であり得る。
［第１の態様の工程（ｉｉ）］
上述のように、工程（ｉｉ）は以下のもの、即ち、
「（ｉｉ）インビトロディスプレイライブラリを（ｉ）の細胞に導入する工程であって、
（ａ）前記ライブラリが、少なくとも１０００個の異なる結合実体Ｂｎのライブラリであり、・・・ライブラリの結合実体が、１００００ダルトン未満の平均分子量ＭＷを有する化合物であり、
（ｂ）前記ライブラリが結合条件下で細胞に導入されること、・・・」
に関する。
工程（ｉｉ）は、「インビトロディスプレイライブラリを（ｉ）の細胞に導入する」ことに言及し、本質的にこの工程は、従来の既知の技術に基づいて行うことができる。
本明細書の実施例で説明するように、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合、先行技術の既知の注入技術を介してライブラリを卵母細胞に導入することができ、注入（例えば、マイクロインジェクション）が相当量の他の哺乳動物細胞型では機能しないと考える理由はない。
あるいは、目的の細胞型に応じて、例えばトランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション又は化学ベース）によって行うことができる。
本明細書の実施例では、多数（約１０８）の異なる結合実体を含むインビトロディスプレイライブラリを、単一の個々の細胞（すなわち、アフリカツメガエル卵母細胞）に（注入によって）導入することが可能であることが示されている。
工程（ｉｉ）の用語「細胞」は、単一の細胞（例えば、細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である場合）であってもよい。
しかし、上述のように、工程（ｉ）の用語「細胞」は、実際には多くの場合、細胞の集団を指すことがあり、そのような場合、工程（ｉｉ）の用語「細胞」は、実際には工程（ｉ）の細胞の集団であってよい。
本文脈において当業者によって理解されるように、工程（ｉｉ）において、例えば、トランスフェクションによって、例えば、１０６個の異なる結合実体のインビトロディスプレイライブラリを工程（ｉ）の細胞の集団（例えば、組換え発現した標的を有するヒトＣＨＯ）に導入する場合、例えば、集団のいくつかの細胞は、５個未満の結合実体（例えば１つの結合実体）を含むことができ、集団の他の細胞は、１０００個を超える異なる結合実体を含むことができる等の、集団の各細胞に異なる数の結合実体を導入することができる。
用語「インビトロディスプレイライブラリ」は、当技術分野に従って理解され、すなわち、ライブラリは非常に多くの異なる結合実体を含んでおり、各結合実体が核酸分子に結合し、核酸分子は結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含んでおり、すなわち、核酸分子の特異的核酸配列情報がわかると、核酸分子に結合した特異的結合実体の構造が直接わかり、核酸分子に結合した結合実体（すなわち、表現型）の構造（遺伝子型）は、本明細書ではＢ構造体と呼ばれる。
結合した核酸分子がＤＮＡ分子である場合、用語「インビトロディスプレイライブラリ」は、当技術分野では「ＤＮＡコード化ライブラリ（ＤＥＬ）」と呼ばれることがある。
用語「結合実体」は、当技術分野では「リガンド」と呼ばれることがある。
本明細書で説明されるように、先行技術は、そのようなインビトロディスプレイライブラリ、すなわち工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリを作製するための多くの異なる方法について記載する。
言い換えれば、核酸分子（遺伝子型）に結合した結合実体（すなわち、表現型）の構造体、すなわち本明細書で「Ｂ構造体」と呼ばれるものを好適に作製することは、今日では、当業者にとって日常的な作業（ルーチンワーク）である。
当技術分野で既知のように、結合実体（すなわち、表現型）は、例えば共有結合又は例えば高親和性非共有結合によって核酸分子（遺伝子型）に結合することができる。
本明細書では、結合実体（すなわち、表現型）が共有結合によって核酸分子（遺伝子型）に結合していることが好ましい場合がある。
工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリは、多くの異なるＢ構造体、すなわち、上記に沿ったものを含み、工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリを作製することは、当業者にとって日常的な作業である。
本明細書における好適な例には、例えば、欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１（Vipergen）、欧州特許第１４０２０２４号Ｂ１（Nuevolution）、欧州特許第１４２３４００号Ｂ１（David Liu）、Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark)、国際公開第００／２３４５８号(Harbury)、Nature Methods(2006),3(7),561-570,2006(Miller)、Nat.Biotechnol.2004;22,568-574(Melkko)、Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington)、又はProc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)が挙げられる。
言い換えれば、第１の態様の工程（ｉ）のインビトロディスプレイライブラリは、先行技術に記載されているような多くの方法で作製することができる。
理論に限定されるものではないが、インビトロディスプレイライブラリ技術の本明細書における好適な例としては、ＤＮＡコード化化学ライブラリ技術、アプタマ技術、ＲＮＡ／ＤＮＡディスプレイ技術、例えばＣＩＳディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ又はビーズディスプレイシステム（コード化のために核酸を使用する）が挙げられる。
先行技術（例えば、欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１（Vipergen）を参照されたい）に記載されているように、Ｂ構造体の核酸分子は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせとすることができる。好ましくは、Ｂ構造体の核酸分子はＤＮＡである。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、２本鎖核酸分子でもよい。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも０％の２本鎖（すなわち、１本鎖）であってよく、少なくとも１０％の２本鎖、少なくとも２０％の２本鎖、少なくとも３０％の２本鎖、少なくとも４０％の２本鎖、少なくとも５０％の２本鎖、少なくとも６０％の２本鎖、少なくとも７０％の２本鎖、少なくとも８０％の２本鎖、少なくとも９０％の２本鎖、又は１００％の２本鎖であってよい。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、１つのＰＣＲプライミング部位又はその一部を含むことができる。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、２つのＰＣＲプライミング部位又はその一部を含むことができる。
本発明の好ましい実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、少なくとも３つのＰＣＲプライミング部位又はその一部を含むことができる。
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲプライミング部位の一部は、少なくとも５ヌクレオチド、少なくとも６ヌクレオチド、少なくとも７ヌクレオチド、少なくとも８ヌクレオチド、少なくとも９ヌクレオチド、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１１ヌクレオチド、少なくとも１２ヌクレオチド、少なくとも１３ヌクレオチド、少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１６ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、又は少なくとも２０ヌクレオチドを含む。
本発明のいくつかの実施形態では、Ｂ構造体の結合実体（表現型）に結合した核酸分子（遺伝子型）は、本明細書に記載の方法で使用される別の関連する核酸分子（遺伝子型）の１本鎖オーバーハングに対する１本鎖オーバーハング逆相補体を含むことができる（例えば、以下で説明するようにベイトに結合した核酸分子）。オーバーハングは、好ましくは、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、又は１０ヌクレオチド長であってよい。
結合実体は、目的の任意の好適な結合実体であってよく、ライブラリの結合実体は、平均分子量ＭＷが１００００ダルトン未満、より好ましくは平均分子量ＭＷが５０００ダルトン未満、更により好ましくは平均分子量ＭＷが１０００ダルトン未満の化合物である。
本明細書に関連する化合物結合実体の好適な例は、先行技術において見出すことができ、例えば、欧州特許第１８０９７４３号Ｂ１（Vipergen）、欧州特許第１４０２０２４号Ｂ１（Nuevolution）、欧州特許第１４２３４００号Ｂ１(David Liu)、Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark)、国際公開第００／２３４５８号（Harbury)、Nature Methods(2006),3(7),561-570,2006(Miller)、 Nat.Biotechnol.2004;22,568-574(Melkko)、 Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington)、又はProc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)を参照されたい。
簡潔には、当業者は、本文脈において目的とすることができるよりも非常に多くの異なる可能な結合実体を認識している。
第１の態様の工程（ｉｉ）は、「少なくとも１０００個の異なる結合実体Ｂｎ（式中、ｎ＝１０００以上）」を示す。
実際には、工程（ｉ）のライブラリには、更に多くの異なる結合実体、例えば少なくとも１０４、少なくとも１０６又は少なくとも１０８の異なる結合実体が存在でき、すなわちｎ＝少なくとも１０４、ｎ＝少なくとも１０６又はｎ＝少なくとも１０８である。
本明細書の実施例では、多数（約１０８）の異なる結合実体を含むインビトロディスプレイライブラリを、単一の個々の細胞（すなわち、アフリカツメガエル卵母細胞）に（注入によって）導入することが可能であることが示されている。
したがって、ライブラリがちょうど１０４個の異なる結合実体を含む理論的状況を本明細書ではＢｎ（ｎ＝１０４）又はＢ１０ ４として表すことができる。
理論に限定されるものではないが、１０２０を超える異なる結合実体を有するライブラリを作製することは困難であり得る。
工程（ｉｉ）（ｂ）は、
「（ｂ）：標的分子に結合することができる結合実体を含むＢ構造体は、同じ標的に結合することができない結合実体を含むＢ構造体よりも、対応するＴ構造体により効率的に結合する条件である結合条件下において、ライブラリが細胞に導入され、細胞内で、結合実体の少なくとも１つを少なくとも１つの標的に結合させ、それにより、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体と呼ばれる、Ｔ構造体に結合したＢ構造体を含む複合体を細胞内に作製する」
ことを示す。
用語「より効率的に結合する」は、例えば、より高い親和性、より速いオンレート、又はより遅い解離速度等の一般的な方法に従って理解されるべきである。
当業者に知られているように、本文脈において、この「より効率的に結合する」効果が得られる条件下で工程（ｉｉ）（ｂ）を実施することは当業者にとって日常的な作業（ルーチンワーク）である。
工程（ｉｉ）（ｂ）の結合条件を最適化して、工程（ｉｉ）（ｂ）の必要な「より効率的に結合する」効果を得ることは、当業者にとって日常的な作業であろう。
上述のように、工程（ｉｉ）（ｂ）の「結合条件」は、一般に、細胞内の天然の結合条件であり、すなわち、本発明の利点の１つは、結合実体（リガンド）が、細胞結合条件内で天然であり得る工程（ｉｉ）（ｂ）の「結合条件」下で標的に結合できることである。
当業者に知られているように、本明細書では、関連する最適化パラメータは、例えば、非イオン強度、温度等であってもよい。
したがって、いずれの実際的な本明細書の関連状況下では、当業者は、（例えば結合条件の適切な日常的調整の後で）工程（ｉｉ）（ｂ）の結合条件下で機能するか否かについて合理的な疑いはない。
好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）（ｂ）は、標的分子に結合することができる結合実体を含むＢ構造体が、同じ標的に結合することができない結合実体を含むＢ構造体よりも１０倍（より好ましくは１００倍、更に好ましくは１０００倍）効率的に対応するＴ構造体に結合する結合条件下で実施される。
本明細書に記載の方法は、結合実体の標的への結合について主要な結合特性を最適化することを可能にする。例えば、結合実体及び標的の効力（親和性）、会合速度（オンレート）又は解離半減期（オフレート）である。
親和性に基づいた選択は、結合工程（ｉｉ）（ｂ）において、例えば平衡条件を使用することによって達成され、結合工程における標的濃度によって制御され、例えば、標的濃度より１０倍小さいＫｄを有するディスプレイライブラリの結合実体の分子の９０％が結合した標的である結合条件、又は標的濃度より２倍小さいＫｄを有するディスプレイライブラリの結合実体の分子の９０％が結合した標的である結合条件である。
本発明の好ましい実施形態では、「結合工程の工程（ｉｉ）（ｂ）」におけるＴ構造体の濃度は、少なくとも１０－１５Ｍ、少なくとも１０－１４Ｍ、少なくとも１０－１３Ｍ、少なくとも１０－１２Ｍ、少なくとも１０－１１Ｍ、少なくとも１０－１０Ｍ、少なくとも１０－９Ｍ、少なくとも１０－８Ｍ、少なくとも１０－７Ｍ、少なくとも１０－６Ｍ、少なくとも１０－５Ｍ、又は少なくとも１０－４Ｍである。
本明細書の実施例（以下を参照）では、「結合工程」工程（ｉｉ）（ｂ）のＴ構造体の濃度は約２００ｘ１０－９Ｍであった。
あるいは、会合速度に基づく選択は、結合工程の工程（ｉｉ）（ｂ）を可能とする時間を制御することによって達成され、したがって、「結合工程」は、結合平衡条件に達するのに必要な時間よりも短い期間実行され得る。
［第１の態様の工程（ｉｉｉ）］
上で説明されたように、工程（ｉｉｉ）は、
「（ｉｉｉ）：（ｉｉ）の細胞を溶解して、細胞膜を破壊し、
（Ａ）：細胞から（ｉｉ）のＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を取り出し、それによってＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を含む溶液を得ること、そして当該ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体は細胞内にはないこと、又は、
（Ｂ）：工程（ｉｉ）で標的に結合し且つ工程（ｉｉｉ）の前に標識されたＢ構造体を、工程（ｉｉ）で標的に結合しなかったＢ構造体から当該標識されたＢ構造体を区別することを可能にするような方法で細胞から取り出し、それにより、結合剤標識されたＢ構造体を含む溶液を得ること、そして当該結合剤標識されたＢ構造体は細胞内にはないこと」
を示す。
工程（ｉｉｉ）は、「（ｉｉ）の細胞を溶解して、細胞膜を破壊する」ことに言及し、本質的に、この工程は、例えば機械破砕（例えば、遠心分離又はピペット操作）又は化学的溶解（例えば、ＳＤＳを使用して膜を溶解することによって）等の従来技術の既知の技術に基づいて行うことができる。
当業者に共通の一般知識及び本明細書の技術的教示（以下を参照されたい）を考慮して、当業者は、多くの異なる好適な方法で工程（ｉｉｉ）を実行することができる。
当業者によって理解され、本明細書で論じられるように、選択的な工程（ｉｉｉ）（Ａ）を使用するか工程（ｉｉｉ）（Ｂ）を使用するかは、同定工程（ｉｖ）をどのように行うことが好ましいかに関連すると見なし得る。
工程（ｉｉｉ）は工程（ｉｉｉ）（Ａ）であることが好ましい場合がある。
本願の図１に示すように、工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉｉ）（Ａ）である状況では、例えば、工程（ｉｖ）は、
－ ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の標的を固体支持体に結合させることを介して、溶液（ｉｉｉ）（Ａ）のＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を固体支持体に結合させ、標的に結合せずそれによって固体支持体に結合しないＢ構造体を除去すること、及び、
－ 固体支持体に結合したＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定すること、
によって行われる。
本願の図２及び本明細書の実施例に表されるように、工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉｉ）（Ａ）である状況において、本明細書に記載の方法は、好ましくは、以下の方法によって行われる。即ち、
－ 第１の態様の（ｉ）のＴ構造体はプレイ（例えば、標的－プレイ融合タンパク質）を含み、第１の態様の工程（ｉｉ）では、核酸分子に結合した導入されたベイト（例えば、Ｂ構造体の核酸分子に相補的な付着末端を有する）も存在し、核酸分子は、特定の標的を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含み、ベイトは工程（ｉｉ）の標的のプレイに結合することによって、ベイトが標的のプレイに結合したＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を作製すること、
－ 溶解工程（ｉｉｉ）（Ａ）後、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を標的のプレイに結合したベイトと融合させることであって（例えば、リガーゼの使用によるライゲーションによって）、融合した核酸分子は結合実体及び標的を同定することを可能にする配列情報を含むこと、及び、
－ 結合実体及び先行工程の融合した（例えばライゲーションした）核酸分子を、標的を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定こと、
によって行うことができる。
「ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を、標的のプレイに結合したベイトと融合させる（例えば、リガーゼの使用を介してライゲーションすることによって）」工程の前に、希釈工程（例えば、細胞溶解工程（ｉｉｉ）から得られた溶液（例えば、上清）の希釈工程）を行うことが好ましい場合がある。
細胞溶解工程（ｉｉｉ）（好ましくは工程（ｉｉｉ）（Ａ））から得られた溶液（例えば、上清）の希釈工程は、溶液を少なくとも１０２倍、例えば少なくとも１０３倍、少なくとも１０４倍又は少なくとも１０５倍に希釈することが好ましい場合がある。
本明細書の実施例（下記参照）では、溶液の希釈は約１０４倍であった。
この希釈工程の利点は、結合していないＢ構造体及びＴ構造体（すなわち、それ自体単独のＢ構造体及びＴ構造体）が希釈後に溶液中で更に物理的に互いに離れることができ、「ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を融合する」工程後の「偽陽性」が少なくなることである。
「ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を、標的のプレイに結合したベイトと融合させる（例えば、リガーゼの使用を介してライゲーションすることによって）」工程の後、例えば後に続く増幅（例えばＰＣＲによる）工程のために、例えばより純粋な核酸分子（例えばＤＮＡ）を有するために、融合（例えば、ライゲーションされた）核酸分子の精製を行うことが好ましい場合がある。
当業者は、限定されることなく例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、スピンカラム等によって、目的の核酸分子（例えばＤＮＡ）を精製するために、多くの異なる戦略を日常的に同定することができる。
「同定する」工程（ｉｖ）は、好ましくは、結合実体及び標的についての配列情報を含む融合核酸分子が（好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用によって）増幅される工程を含む。
明らかなように、ただ１つの標的（すなわち、工程（ｉ）においてｎ＝１）が存在する場合、少なくとも１つの個々の結合実体の同定は、結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用によって本質的に行われる。
本明細書に関連するバイオテクノロジーの分野内の先行技術には、例えば、
－プレイ：四量体ストレプトアビジン及びベイト：ビオチン、
－プレイ：単量体ストレプトアビジン（例えば、ｍＳＡ２）及びベイト：ビオチン、
－プレイ：Ｈｉｓ－タグ及びベイト：ＮＴＡ、
－プレイ：ＳＮＡＰ－ｔａｇ（登録商標）、及びベイト：ベンジルグアニン（ＢＧ）、
－プレイ：Ｈａｌｏ－Ｔａｇ（登録商標）及びベイト：官能基に結合した反応性クロロアルカンリンカー、
－プレイ：炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）及びベイト：ＶＤ１１－４－２、又は
－プレイ：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びベイト：マルトース又はマルトトリオース
などの多数の本明細書に好適な「プレイ－ベイト」系が記載されている。
本明細書の実施例では、「プレイ－ベイト」系は、プレイ：炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）及びベイト：ＶＤ１１－４－２であり、したがって、これは好ましい「プレイ－ベイト」系である。
「プレイ－ベイト」系、プレイ：炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）及びベイト：ＶＤ１１－４－２は、例えば、V.Dudutiene et al.の論文(Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX’’;J.Med.Chem.2014,57,9435-9446)に記載されており、そこでは、ＶＤ１１－４－２は、次の構造を有する小型化合物（低分子化合物）であると記載されている。
好ましくは、プレイを含む第１の態様の（ｉ）のＴ構造体は、標的－プレイ融合タンパク質（例えば、標的－ＣＡＩＸ）を細胞内で発現させることによって得られ、この例については、例えば、本明細書の実施例を参照されたい。
目的の細胞内で標的－プレイ融合タンパク質を発現させることは、当業者にとって日常的な作業である。
可能な実施形態は、ベイトが、結合実体（すなわちリガンド）の結合部位とは異なる標的の結合部位に実際に結合する場合であり得る。
本文脈において、「ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を標的のプレイに結合したベイトと融合させること（例えば、ライゲーションによって）」は、２つの遺伝子型（すなわち、結合実体に関する配列情報を有する核酸分子及び標的に関する配列情報を有する核酸分子）によって保持される遺伝情報を結合することとして理解されるものとする。
当業者に知られているように（例えば欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１(Vipergen)の段落[０１６６]を参照されたい）、この「融合」は、例えば、
ａ）例えばオーバーラップＰＣＲ又はオーバーラップゲノム伸長による、情報伝達；
ｂ）例えば各核酸分子からの鎖の少なくとも１つの間にホスホジエステル結合を形成するＤＮＡリガーゼによって、酵素が増幅可能な促進結合を形成することにより触媒される情報連結
などのいくつかの方法によって達成することができる。
好ましくは、融合は、リガーゼの使用によるライゲーションによって行われる。
例えばリガーゼ酵素を使用して核酸分子の融合を行う場合、核酸分子間に塩基対形成重複領域を有する必要はない。
しかし、ベイトに結合した核酸分子が、Ｂ構造体の核酸分子に対して相補的付着末端を有する核酸分子であることが好ましく（例えばリガーゼが使用されるか否かにかかわらず独立して）、より好ましくは、Ｂ構造体の核酸分子及びベイトに結合した核酸分子の両方の核酸分子の相補的な付着末端にホスホロチオエート結合が存在することである。
好ましくは、Ｂ構造体の核酸分子及びベイトに結合した核酸分子の相補的付着末端のリン酸骨格にホスホロチオエート結合が存在することである。ホスホロチオエート結合の数は、各核酸分子について、優先的には、少なくとも１つのホスホロチオエート結合、少なくとも２つのホスホロチオエート結合、又はより好ましくは少なくとも３つのホスホロチオエート結合であり得る。
本明細書の実施例１では、３つのホスホロチオエート結合を使用し、本明細書の実施例２の結果は、３つのホスホロチオエート結合の使用が、未修飾ＤＮＡ（すなわち、０個のホスホロチオエート結合）の使用と比較して、本状況において驚くべき有意な技術的利点を与えることを実証している。
いくつかの場合、ホスホロチオエート結合の数は、各核酸分子に対して、優先的には少なくとも４個のホスホロチオエート結合、例えば少なくとも１０個のホスホロチオエート結合又は少なくとも２０個のホスホロチオエート結合であってよい。
Ｂ構造体と同様に、ベイトに結合した核酸分子は、例えばＰＮＡ、ＬＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はそれらの組み合わせであり、好ましくは、核酸分子はＤＮＡである。
上記のＢ構造体の核酸分子の他の好ましい実施形態（例えば、２本鎖核酸分子とすることができる、ＰＣＲプライミング部位を含むことができる等）もまた、ベイトに結合した核酸分子の好ましい実施形態とすることができる。
「核酸分子を融合すること（例えば、ライゲーションによって）」は、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の標的に対する結合実体の有意な結合が存在する場合に行うことができ、この例を本願の図２及び本明細書の実施例に表す。
しかし、例えば、欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１（Vipergen）で論じられているように、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の標的に対する結合実体の結合が本質的に存在しない「核酸分子の融合（例えば、ライゲーションによって）」が行われてもよく、すなわち、これもまた、本明細書に記載の方法に関して可能な選択肢である。
したがって、例えば欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１（Vipergen）に沿って、溶解工程後に、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を標的のプレイに結合したベイトと融合（例えば、リガーゼの使用を介してライゲーションすることによって）する（ｉｉｉＡ）の工程を、欧州特許第２６２２０７３号Ｂ１（Vipergen）の請求項１の工程（ｉｖ）～（ｖｉ）に従って行うことができ、すなわち、
（Ａ）標的分子に結合することができる結合実体を含むＢ構造体が、同じ標的に結合することができない結合実体を含有するＢ構造体よりも、対応するＴ構造体により効率的に結合する条件である結合条件下で、標的のプレイに結合したベイトを有する作製されたＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体をインビトロ区画化システムに適用することであって、好ましくは、Ｂ構造体、Ｔ構造体及びＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体が個々の区画に無作為に入る条件下で、工程（ｉｉ）で導入されたＢ構造体の数よりも、区画化システムが少なくとも２倍多い個々の区画を含むこと、及び、
（Ｂ）Ｂ構造体の核酸分子をＴ構造体の核酸分子に融合することであって、双方とも同じ個々の区画内に存在し、Ｂ構造体の核酸分子をＴ構造体の核酸分子と融合させ、この構造体は、本明細書ではＢＴＦｕｓｅｄ構造体と呼ばれ、ＢＴＦｕｓｅｄ構造体は、結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報及び特異的標的を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含むこと、及び、
（Ｃ）Ｂ構造体及びＴ構造体の核酸分子の融合が存在しない条件下で工程（Ｂ）の個々の区画の内容物を組み合わせることであって、ＢＴＦｕｓｅｄ構造体のライブラリを得るための、いずれの新たなＢＴＦｕｓｅｄ構造体は工程（Ｂ）で作製されず、標的及び結合実体の非結合対に由来するＢＴＦｕｓｅｄ構造体と比較した場合、ライブラリが、標的及び結合実体の結合対に由来するＢＴＦｕｓｅｄ構造体の種の濃縮ライブラリであり、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体は、工程（Ａ）の個々の区画内で溶液中に懸濁されたままであり、及び／又は
方法が、固体支持体への標的固定化に依存せず、
工程（Ｃ）の濃縮ライブラリに存在するＢＴＦｕｓｅｄ構造体の核酸を増幅させること、
によって行うことができる。
第１の態様の工程（ｉｉｉ）は、工程（ｉｉｉ）（Ｂ）であることが好ましい場合がある。
工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉｉ）（Ｂ）である場合、本明細書に記載の方法は、好ましくは、
－ 第１の態様の（ｉ）のＴ構造体が、標的に融合した酵素を含み、この酵素は、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体のＢ構造体に対して反応させることを可能にする第１の態様の（ｉｉ）のＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の結合実体及び標的の結合によって作り出された近接性に起因し、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体はＢ構造体を標識し、それによって、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体のＢ構造体を、標的に結合していないＢ構造体と区別することを可能にする。
一つの例は、例えば、標的に融合した酵素がリガーゼであり、第１の態様の工程（ｉｉ）において、Ｂ構造体の核酸分子に対する相補的付着末端を有する導入された核酸分子も存在し、近接に起因するリガーゼが、導入された核酸分子をＢ構造体の核酸分子にライゲーションし、それによってＢ構造体を標識することであり得る。
別の例は、例えば、標的に融合した酵素が、近接に起因してＢ構造体の核酸分子を基質として使用して反応を行い、それによってＢ構造体を標識することができる酵素であってもよく、一例は、例えば核酸分子をビオチン化することができる酵素とすることができる。
［第１の態様の工程（ｉｖ）］
上記のように工程（ｉｖ）は、
「（ｉｖ）： （ｉｉｉ）の溶液及び、Ｂ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含む核酸分子の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定すること」を示す。
当業者によって理解されるように、結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用は、好ましくは、ある種の配列決定を必要とするであろう。
目的の核酸分子を配列決定することは、当業者にとって日常的な作業である。
工程（ｉｖ）は、例えば本明細書で論じるような従来技術の既知の技術に基づいて行うことができる。
当業者によって理解され、本明細書で論じられるように、選択的な工程（ｉｉｉ）（Ａ）を使用するか工程（ｉｉｉ）（Ｂ）を使用するかは、同定工程（ｉｖ）をどのように行うことが好ましいかに関連すると見なすことができる。
第１の態様の「同定する」工程（ｉｖ）は、好ましくは、Ｂ構造体の結合実体を同定することを可能にする特定の核酸配列情報を含む核酸分子を増幅させる工程を含む。
当業者は、融合遺伝子型において核酸を増幅するために、非常に多くの異なる戦略、例えば限定されることなく、ＰＣＲ（United States Patent 4,683,202;Mullis)、エマルジョンＰＣＲ（Nakano et al.,J Biotechnol.2003;102(2):117-24)、デジタルＰＣＲ(Vogelstein,B;Kinzler KW(1999).’’Digital PCR’’.Proc Natl Acad Sci U S A.96(16):9236-41)、ＮＡＳＢＡ(Compton J.Nucleic acid sequence-based amplification.Nature.1991;350(6313):91-2)、又はローリングサークル増幅(American Journal of Pathology.2001;159:63-69)などを日常的に認めることができる。
好ましくは、核酸分子はＰＣＲによって増幅される。
同定工程（ｉｖ）において、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的に結合する少なくとも２つ（例えば、少なくとも３又は少なくとも６又は少なくとも１０）の異なる個々の結合実体を同定することが好ましい場合がある。
なお、本明細書の実施例（下記参照）では、同定工程（ｉｖ）において、約１０の異なる個々の結合実体を同定した。
この工程（ｉｖ）において、例えば少なくとも１０個の異なる個々の結合実体を同定することができるためには、
工程（ｉｉｉ）（Ａ）の溶液が、１０超の異なるＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を含むか、又は
工程（ｉｉｉ）（Ｂ）の溶液が、１０超の異なる「結合剤標識Ｂ構造体」を含むこと、
が必要であることは明らかである。
［実施例１］
約１０８個の異なる結合実体を含むＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリに対するｐ３８の細胞内スクリーニング及び比較インビトロ（すなわち、細胞内でない）スクリーニング
概要については、図１及び図２を参照されたい。
［方法］
使用したＤＮＡオリゴヌクレオチド
ｖｉｐ７４６０
ＡＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＣＡＣＣＡ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ
（＊＝ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基）
ｖｉｐ７４６１
Ｔ＊Ｔ＊Ｇ＊ＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡ
（＊＝ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基）
ｖｉｐ７４４２
Ａ＊Ｇ＊Ｃ＊ＡＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＡＴＧＧＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＣＴＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＡＡＧＧ
（＊＝ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基）
ｖｉｐ７４６３
ｘＣＣＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＣＣＴＴＡＧＧＧＡＧＡＡＧＴＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧＣ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ
（ｘ＝５’－アミノ修飾因子Ｃ６、＊＝ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基）
ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（Ｌｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１）の調製
ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリは、本質的に他の箇所に記載されているように(Hansen et al.J.Am.Chem.Soc.,2009,131(3),pp 1322-1327)三量体フォーマットで構築され、以下の修飾を有する：
２０量体アダプタ核酸分子（オリゴヌクレオチドｖｉｐ７４６０及びｖｉｐ７４６１からなる）をＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリにライゲーションし、それによりアダプタ修飾ライブラリ、すなわちＬｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１を作製した。
構築されたＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒ ＤＮＡは、標的ＤＮＡ上の重複領域（２ヌクレオチド３’－オーバーハング）に相補的な重複領域（２ヌクレオチド３’－オーバーハング）を有する。
［材料］
独自のＶｉｐｅｒｇｅｎ ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（ｂａｔｃｈ Ｌｉｂ０２７ｂ、約１．１ｘ１０８の異なる分子）
オリゴヌクレオチドｖｉｐ７４６０及びｖｉｐ７４６１（１００μＭ原料調製、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）
ＮａＣｌ（４Ｍ原料調製、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５（１Ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
グリコーゲン（２０ｍｇ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
エタノール（９６％、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ）
ＭｇＣｌ２（２Ｍ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
ＰＥＧ４０００（５０％、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
ＡＴＰ（１００ｍＭ原料調製、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３０Ｗｅｉｓｓ Ｕ／μｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
水（分子生物学グレード、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
２０％ ＴＢＥ－ＰＡＧＥゲル（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｃｏｌｕｍｎ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）
Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
［プロトコル］
公開されているプロトコル（ｈｔｔｐｓ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ｐａｇｅｓ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ｄｅｃｏｄｅｄ／ａｒｔｉｃｌｅ／ａｎｎｅａｌｉｎｇ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）に従って、ｖｉｐ７４６０及びｖｉｐ７４６１をアニーリングすることによって２０－ｍｅｒの核酸アダプタ分子を調製した。４ＭのＮａＣｌ２０μｌ、グリコーゲン１μｌ及び氷冷エタノール１ｍｌを３００μｌのアニーリング反応及び遠心分離（２００００ｇ、４℃で少なくとも３０分間）に加えることによって、アニーリングしたオリゴを沈殿させた。ペレットを８０％エタノールで２回洗浄し、室温で風乾し、１００μＭの濃度まで水に溶解した。濃度を（製造業者のプロトコルに従って）Ｑｕｂｉｔアッセイによって確認し、２０－ｍｅｒ核酸アダプタの完全性を２０％ＴＢＥ－ＰＡＧＥ（２００Ｖ、５５分、２０℃）で検証した。
ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（Ｌｉｂ０２７ｂ）及びアニーリングしたアダプタ（２倍モル過剰）を合計２００μＬの水中で混合し、続いて２００μＬの２Ｘライゲーションマスターミックス（８０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、４％ＰＥＧ４０００、２ｍＭのＡＴＰ及び６０Ｕ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）を添加することによって、２０ｍｅｒ－核酸アダプタを独自のＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（ｂａｔｃｈ Ｌｉｂ０２７ｂ）にライゲーションした。ライゲーションを室温で一晩進行させた。氷冷エタノール１．２ｍＬ、グリコーゲン１μＬ及び４ＭのＮａＣｌ４０μＬを添加することによって、ライゲーションしたＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリを沈殿させた。混合物を－２０℃で１時間保存した後、遠心分離（２００００ｇ、４℃で少なくとも３０分間）によってペレット化し、室温で風乾した。過剰の２０ｍｅｒ－核酸アダプタを排除するために、ライゲーションしたＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｃｏｌｕｍｎｓで精製した。精製したアダプタ修飾ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリを沈殿させ（ＮａＣｌ、グリコーゲン、及び氷冷エタノール）、４７．９μＭの濃度（製造業者のプロトコルに従ってＰｉｃｏＧｒｅｅｎ Ａｓｓａｙによって測定した）で緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解した。重要なことに、アダプタ修飾ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（すなわち、Ｌｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１）は、ｖｉｐ７４４２／ｖｉｐ７４６３標的ＤＮＡへのライゲーションにおいて１００％の反応能を有した。
標的ＤＮＡに結合したＣＡＩＸ結合剤（すなわち、ベイト＝ＶＤ１１－４－２）の調製（ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２）
小分子ＣＡＩＸ結合剤ＶＤ１１－４－２を、６０ｍｅｒ－オリゴヌクレオチド（ｖｉｐ７４６３）に共有結合させた。その後、オリゴヌクレオチドを逆相補的オリゴヌクレオチド（ｖｉｐ７４４２）と組み合わせて、ベイト化合物ＶＤ１１－４－２に結合した２本鎖核酸分子（すなわち標的ＤＮＡ）を形成した。構築された標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２）は、ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒ ＤＮＡ上の重複領域（２ヌクレオチド３’－オーバーハング）と相補的な重複領域（２ヌクレオチド３’－オーバーハング）を有する。
［材料］
ペンタフルオロフェニルスルホンアミド（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ、０３４６６４）
８－メルカプトオクタン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、６７５０７５）
無水メタノール（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０４９９５６０、４超ÅＭＳで販売）
トリエチルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９０３４０）
過酸化水素水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９５３２１）
シクロオクチルアミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ１１０６０４）
ＨＰＬＣグレード水（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０２２１７１２）
酢酸トリエチルアンモニウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、９０３５８）
アセトニトリル（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０６２９１１２）
ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ８４１８）
エチル－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅ６３８３）
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１３０６７２）
Ｎ－メチルピロリドン（ＮＭＰ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、４９４４９６）
［プロトコル］
ＶＤ１１－４－２の類似体を、V.Dudutiene et al.(’’Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX’’;J.Med.Chem.2014,57,9435-9446)の適合した手順を用いて調製した。２－メルカプトエタノールの代わりに８－メルカプトオクタン酸を使用し、遠位カルボン酸を有する類似体を生成した。
続いてＨＰＬＣ精製生成物（３．３ｍｇ）を、Ｎ－メチルピロリジン（ＮＭＰ、６０μＬ）中のエチル－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１．２ｍｇ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、０．７ｍｇ）を用いて活性化した。粗製活性化混合物（５０μＬ）を、ｖｉｐ７４６３（１０ｎｍｏｌ、１００μＭの１００μＬ）、ＨＥＰＢＳ緩衝液（１００μＬ、１Ｍ原料）、ＮＭＰ（２００μＬ）及び水（５０μＬ）の予め混合した溶液に添加した。
１６時間のカップリング後、ＤＮＡをＥｔＯＨ沈殿させ、粗製複合物を、水／ＭｅＣＮ中の酢酸トリエチルアンモニウムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって精製した。所望の複合物を含む画分を凍結乾燥によって濃縮し、最終生成物を水に溶解した。ＬＣＭＳによるＱＣ（ＥＳＩ、ｎｅｇモード）：ｏｂｓ ｍ／ｚ１９３２２、計算値１９３２４．６（以下のＨＰＬＣクロマトグラムを参照）。
続いて、精製された１本鎖複合物、すなわちｖｉｐ７４６３＿ＶＤ１１－４－２を、逆相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドｖｉｐ７４４２にハイブリダイズさせ、これによりＶＤ１１－４－２に結合した２本鎖標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２）を生成した。
卵母細胞外のＤＮＡに共役したｐ３８に対するインビトロスクリーニング（ｅ１、リファレンス）
Ｌｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１（すなわち、細胞内スクリーニングに適用されたものと同じＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ）に対するＤＮＡに共役した組換えｐ３８タンパク質におけるインビトロスクリーニング（すなわち、細胞内にない）をリファレンスのために行った。標的ＤＮＡへのｐ３８タンパク質の共役、及びそれに続くＬｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１に対するスクリーニング（標的ＤＮＡに共役した２０ｎＭのｐ３８を、約５．６×１０１２ライブラリ分子／μｌに対してスクリーニングした）を、以前に記載されたように実質的に行った(Petersen et al.,’’Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from YoctoReactor DNA-encoded small molecule library’’,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)。
卵母細胞で発現したｐ３８に対する細胞内スクリーニング（ｅ２及びｅ３）
［アフリカツメガエル卵母細胞における標的－プレイ融合タンパク質（例えばＣＡＩＸ－ｐ３８）の発現］
６アミノ酸リンカーを介してヒトＣＡＩＸの触媒ドメインにＮ末端融合したｐ３８（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅ：Ｑ１６５３９）をコードする遺伝子を合成し、ｐＳＰ６４発現ベクタ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間にサブクローニングした。ベクタをＥｃｏＲＩで線状化し、Ａｍｂｉｏｎ ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ ＳＰ６ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｍＲＮＡを合成した。ｍＲＮＡをＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を介して精製した。
Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ２０１０注入器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、約５０ｎｇのＣＡＩＸ－ｐ３８ｍＲＮＡを５０ｎＬの体積（水で希釈）でアフリカツメガエル卵母細胞（Ｅｃｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。実験まで、卵母細胞を修飾したＢａｒｔｈの培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｂａｒｔｈ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ｍＭで、８８ＮａＣｌ、１ＫＣｌ、０．４ＣａＣｌ２、０．３３Ｃａ（ＮＯ３）２、０．８ＭｇＳＯ４、５Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２．４ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）で、１８℃で維持した。
［アフリカツメガエル卵母細胞における発現した標的－プレイ融合タンパク質（例えばＣＡＩＸ－ｐ３８）の定量化］
ｍＲＮＡ注入の４日後、ヒトＣＡＩＸ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ）を使用して、アフリカツメガエル卵母細胞内のＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質の発現を定量した。対照として、注入されていないアフリカツメガエル卵母細胞を並行して処理した。簡潔には、１つのアフリカツメガエル卵母細胞を遠心分離（２００００ｇ、４℃で２分間）によって２５μｌの緩衝液（ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５ｍＭのＮａＦ）内で破砕し、ＣＡＩＸ捕捉抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに上清を移し、室温で１時間インキュベートした。全てのウェルを洗浄し（洗浄緩衝液中で３回、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）、ビオチン化ＣＡＩＸ検出抗体を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、全てのウェルを洗浄した。セイヨウワサビペルオキシダーゼに共役したストレプトアビジン（ストレプトアビジン－ＨＲＰ）を添加し、プレートを暗所において室温で２０分間インキュベートした。ＨＲＰ基質ＴＭＢ ＳＥＮＳ（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ）を添加する前に、全てのウェルを洗浄した。プレートを暗所において室温で５分間インキュベートした後、２ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。４５０ｎｍにおける光学密度を、ＤＴＸ８８０マルチモード検出器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定した。組換えＣＡＩＸタンパク質と並行して作製したＣＡＩＸ標準曲線に基づいて、アフリカツメガエル卵母細胞内で発現されるＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質の濃度は約２００ｎＭであると決定した。
［アフリカツメガエル卵母細胞への標的ＤＮＡ及びＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリの導入］
約１．１×１０８個の異なる分子（すなわち、２本鎖核酸分子に結合した潜在的な結合剤）からなる多様なＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ（Ｌｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１）を、ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２（すなわち、ベイト化合物ＶＤ１１－４－２に共有結合した標的ＤＮＡ）と混合し、混合物をＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質を発現するアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ及びＴＤ＿ＶＤ１１－４－２の注入は、ＣＡＩＸ－ｐ３８をコードするｍＲＮＡの注入の４日後に行った。合計約６．６×１０１１個のＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリ分子及び１．５×１０１１個のＴＤ＿ＶＤ１１－４－２分子からなる合計５０ｎＬを各卵母細胞に注入した（ｅ２）。並行実験では、Ｌｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１／ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２混合物に、０．１μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡを注入前に補充した（ｅ３）。ＲＮａｓｅＡの注入を行って、卵母細胞内の選択プロセスに潜在的に影響を及ぼし得る内因性ＲＮＡを消化した。
アフリカツメガエル卵母細胞を１８℃で２～４時間インキュベートした。この期間内に、発現したＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質を、１）ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリリガンド（目的のタンパク質ｐ３８への結合）、及び２）ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２（ＣＡＩＸタグへの結合）に結合させた。
［アフリカツメガエル卵母細胞膜の破壊及びＤＮＡライゲーション］
アフリカツメガエル卵母細胞の膜を破壊して、細胞、すなわち、１）ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリリガンド及び２）ＴＤ＿ＶＤ１１－４－２に結合したＣＡＩＸ－ｐ３８から結合複合体を放出した。ＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質（すなわち、それぞれ標的ＤＮＡ及びＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒＤＮＡ）に結合したＤＮＡ断片は重複領域を有し、その結果、２つの断片の潜在的アッセンブリが生じて、ＤＮＡライゲーションによってその２つの断片が組み合わされる。両方のＤＮＡ断片がＣＡＩＸ－ｐ３８タンパク質に会合すると、ライゲーションは近接によって促進され、したがって所望の結合活性を有するより高い割合のメンバを有する濃縮ライブラリが作製される。
アフリカツメガエル卵母細胞膜の破壊のために、１つの卵母細胞を、ＡＴＰ及びリガーゼを含まない６００μｌのライゲーション緩衝液中で遠心分離した（２００００ｇ、４℃で２分間）。上清（６００μｌ）を、３００Ｗｅｉｓｓ ｕｎｉｔｓのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した合計１１ ｍＬのライゲーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．７５％ＢＳＡ、９ｍＭのＫＣｌ、４．５％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．４）に、２段階で希釈した。これにより、結合複合体を合計で約１０４倍に希釈し、ライゲーションを１６℃で４分間進行させた。次いで、１１ｍＬの停止緩衝液（５０ｍＭのＥＤＴＡ、０．２μｇ／μｌプロテイナーゼＫ、０．２％Ｎ－ラウリルサルコシンを補充したＮＴＩ緩衝液）の添加によりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化し、その後得られた混合物を６５℃で１時間インキュベートした。室温に冷却した後、ＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製した。
［ライゲーションしたＤＮＡの増幅］
ライゲーション及び精製したＤＮＡ断片をラムダエキソヌクレアーゼで処理し（遊離のライゲーションされていない５’－リン酸化ＤＮＡ断片を除去するため）、ＰＣＲによって増幅した。
ＰＣＲ混合物（最終濃度）：
２５μｌの精製ライゲーションＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型）
１Ｘ Ｖｅｎｔ（－ｅｘｏ）ＰＣＲ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．４ｍＭのＣｌｅａｎＡｍｐ ｄＮＴＰ（ｔｅｂｕ－ｂｉｏ）
６ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
３％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
０．２５μＭのフォワードＰＣＲプライマ
０．２５μＭの逆方向ＰＣＲプライマ
１Ｕ Ｖｅｎｔ（－ｅｘｏ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
合計１００μｌの水
ＰＣＲ機において以下のプログラムを適用することによって、混合物を熱サイクルにかけた。
９５℃１０分、（９５℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃２分３０秒）を２７サイクル、７２℃２分。
得られたＤＮＡ断片のライブラリをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）で精製し、２ラウンド目のＰＣＲにかけて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定のためのプライミング部位を導入した。
ＰＣＲ混合物：
５μｌの精製増幅ＤＮＡ（ＰＣＲ鋳型）
１Ｘ Ｖｅｎｔ（－ｅｘｏ）ＰＣＲ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
６ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
０．５Ｍのベタイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）
０．２５μＭのフォワードＩｌｌｕｍｉｎａプライマ
０．２５μＭの逆方向Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマ
１Ｕ Ｖｅｎｔ（－ｅｘｏ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）
合計１００μｌの水
混合物を、ＰＣＲ機において以下のプログラムを適用することによって熱サイクルにかけた。
９２℃２分、（９２℃３０秒、６２℃３０秒、７２℃２分３０秒）を１０サイクル、７２℃２分
得られたＤＮＡ断片のライブラリをＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び分取１０％ ＴＢＥ－ＰＡＧＥ（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ）によって精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ配列決定（Ｆｕｌｇｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）にかけた。
［Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定技術を用いたＤＮＡ配列決定による濃縮の分析］
ＤＮＡ配列決定データを、他の箇所(Petersen et al.,’’Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library’’,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)に記載されているようにデコードし、分析した。
所与のライブラリメンバが配列決定サンプル内で観察された回数をカウントすることによって、ランダムライゲーション事象を超えて濃縮されたヒットを同定することができた。多数回観察されたライブラリメンバは標的結合剤（ヒット）であるが、わずか数回観察された化合物は主にランダム事象（バックグラウンド）の結果である。ランダム事象に基づく観察回数は、対数目盛り上で線形減少線（シグナルプロットでは赤色の球）を表す。したがって、減少相からシグナル相への遷移を上回る観測数を有するライブラリメンバは、数学的閾値（ＭＴ、シグナルプロットにおける緑色の球）を上回る。３つの個々の選択実験（ｅ１～ｅ３）から、シグナルプロットを作成した（本願の図３のパネルＡ～Ｃ）。シグナルプロットＡは、ＹｏｃｔｏＲｅａｃｔｏｒライブラリＬｉｂ０２７ｂ＿ＴＡ０１に対する標的ＤＮＡに共役したｐ３８上のスクリーニングに由来し（ｅ１、リファレンス）、シグナルプロットＢ又はＣは、ＲＮａｓｅＡ共注入なしの卵母細胞で発現したｐ３８上の細胞内スクリーニング（ｅ２）又はＲＮａｓｅＡ共注入した卵母細胞で発現したｐ３８上の細胞内スクリーニング（ｅ３）に由来する。ｅ１～ｅ３における約１．１×１０８個の異なる分子に対するスクリーニングから、本発明者らは、ＭＴ（緑色の球）を上回る合計３９個のヒットを同定した。３９個のヒットを合わせ、ＤＮＡ配列決定からの３つのデータプールにおける観察数について注釈を付けた（図３のパネルＤ）。３つの実験のうちの少なくとも１つにおいて、ＭＴを上回る３９個のヒットが観察された。有意なヒット数が、リファレンス実験（ｅ１）及び２つの細胞内スクリーニング実験（ｅ２又はｅ３）の両方において見出された。ヒットＩＤ３１番は、以前に検証されたｐ３８ａ阻害剤(vpc00249;IC500.51 μM;Petersen et al.,’’Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library’’,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)であった。
［結論］
上述のように、約１０８個の異なる結合実体のインビトロディスプレイライブラリに基づいて、この「細胞内」スクリーニング例では、同定工程（第１の態様の同定工程（ｉｖ）に対応）において、以前に検証されたｐ３８阻害剤といくつかの検証されていないヒットを含む、約１０～３０個の異なる個々の良好な結合剤化合物結合実体を同定した。本文脈において、これは、ライブラリの許容可能な代表的な多数の良好な結合剤化合物と考えられる。
同定された多くの良好な結合剤実体が許容可能であると考えられる理由は、この標的（すなわちｐ３８）について、上記のように、同じインビトロディスプレイライブラリの比較インビトロ（すなわち、細胞内でない）スクリーニングが行われ、約１０個の異なる個々の良好な結合剤が同定され、すなわち、「細胞内」スクリーニングの同定された数が、比較インビトロスクリーニングと少なくとも同等であった、すなわち許容可能であると考えられたことに関連する。
更に、本発明の細胞内スクリーニングで同定された個々の良好な結合剤は、比較インビトロスクリーニングで同定された良好な結合剤に対応していた。
例えば、この例の「細胞内」スクリーニングにおいて、１つ又は２つの個々の良好な結合剤化合物結合実体のみが同定された場合、この例で実際に特定された約１０個の異なる個々の良好な結合剤ほど良好であるとは考えられなかったであろう。この理由の１つは、１～２個の個々の良好な結合剤のみが同定された場合、可能性のある関連する良好な結合剤を失うリスクがあった可能性があること、すなわち貴重な良好な結合剤情報を失うリスクがあった可能性があることに関連する。
論じられたように、「細胞内」及び比較インビトロスクリーニングのいくつかの同定された良好な結合剤は同じであり、「細胞内」スクリーニングのいくつかの良好な結合剤は比較インビトロスクリーニングでは同定されなかった。この理由は、「現実の」良好な結合剤のいくつかは、本実施例の「細胞内」スクリーニング方法、すなわち本発明の方法の天然の「細胞内」結合条件下（すなわち、第１の態様の工程（ｉｉ）（ｂ））でのみ同定できることに関連し得る。
［実施例２］
比較例 － ３つのホスホロチオエート結合の使用を未修飾ＤＮＡ（すなわち、ホスホロチオエート結合が０である）と比較した
［方法］
使用したＤＮＡオリゴヌクレオチド（概略図）
アフリカツメガエル卵母細胞に注入された２本鎖核酸分子（即ち標的ＤＮＡ，ＴＤ）
Figure 0007526498000004
注：ＴＤ＿００１、ＴＤ＿００２及びＴＤ＿００３は、下側鎖の３’末端に２－ｎｔのオーバーハングを含み、これはライゲーションＤＮＡ（すなわちＬＤ００１）上の２－ｎｔのオーバーハングと相補的である。
２本鎖核酸ライゲーション分子（即ちライゲーションＤＮＡ，ＬＤ）
Figure 0007526498000005
注：ＬＤ＿００１は、上側鎖の３’末端に２－ｎｔオーバーハングを含み、これは標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿００１、ＴＤ＿００２、ＴＤ＿００３）上の２－ｎｔオーバーハングに相補的である。
アフリカツメガエル卵母細胞への注入及びアフリカツメガエル卵母細胞からの抽出後のホスホロチオエート結合の有無による標的ＤＮＡのライゲーション能の評価
ホスホロチオエート化ＤＮＡ塩基（すなわち、ＴＤ＿００１、ＴＤ＿００２及びＴＤ＿００３）を含む又は含まない標的ＤＮＡをアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。アフリカツメガエル卵母細胞膜が破壊され、注入された標的ＤＮＡが回収される前に、時間間隔を増加させながら、標的ＤＮＡを卵母細胞内でインキュベートした。回収した標的ＤＮＡのライゲーション能を、ライゲーションＤＮＡ（すなわち、ＬＤ＿００１）とのＤＮＡライゲーション反応において調べた。細胞内のインキュベーション後に標的ＤＮＡのライゲーション能を保持することは、細胞内スクリーニングの本状況において重要なパラメータであることに留意されたい。
［アフリカツメガエル卵母細胞への標的ＤＮＡの注入］
Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０１０注入器（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、ホスホロチオエート結合を有する又は有さない、約１～２ｐｍｏｌの標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿００１、ＴＤ＿００２又はＴＤ＿００３）を５０ｎＬの体積（水で希釈）でアフリカツメガエル卵母細胞（Ｅｃｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に注入した。卵母細胞を修飾したＢａｒｔｈの培地（ｍＭで、８８ＮａＣｌ、１ＫＣｌ、０．４ＣａＣｌ２、０．３３Ｃａ（ＮＯ３）２、０．８ＭｇＳＯ４、５Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２．４ＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４）で、１８℃で維持した。膜が破壊され、注入された標的ＤＮＡが回収される前に、時間間隔を増加させながら、卵母細胞をインキュベートした（以下に詳述する）。
［アフリカツメガエル卵母細胞膜の破壊及び注入された標的ＤＮＡの回収］
アフリカツメガエル卵母細胞の膜を破壊して、注入された標的ＤＮＡを回収した。アフリカツメガエル卵母細胞膜の破壊のために、５つの卵母細胞を２００μｌの破砕緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中で遠心分離した（２００００ｇ、４℃で２分間）。回収した標的ＤＮＡ（５つの卵母細胞に由来する）をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ及びＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｃｏｌｕｍｎｓで精製した。精製した標的ＤＮＡを沈殿させ（ＮａＣｌ、グリコーゲン、及び氷冷エタノール）、遠心分離（２００００ｇ、４℃で少なくとも３０分間）によってペレット化した。ＤＮＡペレットを室温で風乾し、水に溶解した。
［ＤＮＡライゲーション］
回収した標的ＤＮＡをライゲーションＤＮＡ、すなわちＬＤ＿０１と共にＤＮＡライゲーション反応に適用することによって、回収した標的ＤＮＡのライゲーション能を評価した。精製された標的ＤＮＡ（５つの卵母細胞に由来する）を、約１Ｗｅｉｓｓ ｕｎｉｔＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって補充されたライゲーション緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．７５％ＢＳＡ、９ｍＭのＫＣｌ、４．５％グリセロール、２ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．４）中の約２ｐｍｏｌのＬＤ＿０１ライゲーションＤＮＡと混合した。ライゲーション反応を１６℃で１～２時間進行させた。ライゲーション混合物をｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ（１０％ＴＢＥ－ＰＡＧＥ、２００Ｖ、３５分、室温）に適用して、回収された標的ＤＮＡのライゲーション能を評価した。未修飾標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿００１）のライゲーション能は、アフリカツメガエル卵母細胞内のインキュベーション後に時間依存的に失われた。具体的には、３０分間のインキュベーション後にライゲーション能の５０％が失われ、卵母細胞内における１時間のインキュベーション後にライゲーション能がほぼ完全に失われた。一方の鎖にホスホロチオエート結合が組み込まれた標的ＤＮＡ（すなわち、ＴＤ＿００２）の場合、卵母細胞内で２時間インキュベートした後、ライゲーション能の約５０％が失われた。対照的に、ホスホロチオエート結合が標的ＤＮＡの両方の鎖に導入された場合（すなわち、ＴＤ＿００３）、卵母細胞内で２時間インキュベートした後、ライゲーション能はほとんど影響を受けなかった。
［結論］
この実施例の結果は、３つのホスホロチオエート結合の使用が、未修飾ＤＮＡ（すなわち、ホスホロチオエート結合が０である）の使用と比較して、本状況において驚くべき有意な技術的利点を与えることを実証する。
［参考文献一覧（REFERENCE LIST）］
1:EP1809743B1(Vipergen)
2:EP1402024B1(Nuevolution)
3:EP1423400B1(David Liu)
4:Nature Chem.Biol.(2009),5:647-654(Clark)
5:WO 00/23458(Harbury)
6:Nature Methods(2006),3(7),561-570 7:2006(Miller)
7:Nat.Biotechnol.2004;22,568-574(Melkko)
8:Nature.(1990);346(6287),818-822(Ellington)
9:Proc Natl Acad Sci USA(1997).94(23):12297-302(Roberts)
10:WO2006/053571A2(Rasmussen)
11:EP2622073B1(Vipergen)
12:Lynn MM et al.(’’Identification of Ligand-Target Pairs from Combined Libraries of Small Molecules and Unpurified Protein Targets in Cell Lysates’’;J.Am.Chem.Soc.2014,136,3264-3270)
13:Zining Wu et al.(’’Cell-Based Selection Expands the Utility of DNA-Encoded Small-Molecule Library Technology to Cell Surface Drug Targets..’’;ACS Comb.Sci.2015,17,722-731)
14:M.Schurmann et al.(’’Small-Molecule Target Engagement in Cells’’;Cell Chemical Biology 23,April 21,2016)
15:Ron Milo(’’What is the total number of protein molecules per cell volume?..’’;Bioessays 35:1050-1055,2013)
16:V.Dudutiene et al.(’’Discovery and Characterization of Novel Selective Inhibitors of Carbonic Anhydrase IX’’;J.Med.Chem.2014,57,9435-9446)
17.Petersen et al.(’’Novel p38α MAP kinase inhibitors identified from yoctoReactor DNA-encoded small molecule library’’,Med.Chem.Commun.,2016,7,1332-1339)

Claims (15)

  1. 細胞内で、ライブラリの小分子化合物の結合実体を目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合させて、前記細胞内で目的のタンパク質又はＲＮＡ標的に結合することができる前記ライブラリの少なくとも１つの個々の化合物結合実体を同定するためのインビトロディスプレイライブラリのスクリーニング方法であって、
    当該方法は、
    （ｉ）： 細胞において少なくとも１つの標的分子Ｔｎ（ｎ＝１以上）を発現する工程であって、前記少なくとも１つの標的分子はタンパク質又はＲＮＡであり、ここで、前記標的分子の構造は、「Ｔ構造体」と呼ばれる、工程と、
    （ｉｉ）： （ｉ）の前記細胞にインビトロディスプレイライブラリを導入する工程であって、
    （ａ）：前記ライブラリは、少なくとも１０００個の異なる結合実体Ｂｎのライブラリであり、ｎ＝１０００以上であり、各結合実体は核酸分子に結合しており、当該核酸分子は、前記結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含んでおり、前記核酸分子の特異的核酸配列情報がわかると、前記核酸分子に結合した特異的結合実体の構造が直接わかり、前記ライブラリの結合実体は、平均分子量ＭＷが１００００ダルトン未満の化合物であり、ここで、前記核酸分子に結合した前記結合実体の構造は、「Ｂ構造体」と呼ばれ、
    （ｂ）：前記ライブラリは、標的分子に結合することができる結合実体を含むＢ構造体が、同じ標的分子に結合することができない結合実体を含むＢ構造体よりも、対応するＴ構造体により効率的に結合する条件であるところの結合条件下において、細胞に導入され、
    当該細胞内で、少なくとも１つの結合実体を少なくとも１つの標的分子に結合させ、それにより、「ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体」と呼ばれる、Ｔ構造体に結合したＢ構造体を含む複合体を前記細胞内に作製する、
    という（ｉ）の前記細胞にインビトロディスプレイライブラリを導入する工程と、
    （ｉｉｉ）： （ｉｉ）の細胞を溶解して、細胞膜を破壊し、
    （Ａ）：当該細胞から（ｉｉ）の前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を得て、それにより、ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を含む溶液を得ること、そして当該ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体は前記細胞内にはないこと、又は
    （Ｂ）：当該細胞から、工程（ｉｉ）で標的分子に結合し且つ工程（ｉｉｉ）の前に標識されたＢ構造体を、工程（ｉｉ）で標的分子に結合していないＢ構造体から当該標識されたＢ構造体を区別することを可能にするような方法で得て、それにより、結合剤標識Ｂ構造体を含む溶液を得ること、そして当該結合剤標識Ｂ構造体は細胞内にはないこと、
    という（ｉｉ）の細胞を溶解する工程と、
    （ｉｖ）： （ｉｉｉ）の溶液と、前記Ｂ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含む前記核酸分子の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的分子に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定する工程と、
    を含むインビトロディスプレイライブラリのスクリーニング方法。
  2. 前記標的分子Ｔがタンパク質であり、前記細胞が真核細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細胞が、ゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記細胞が、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 請求項１の工程（ｉｉ）の細胞へのインビトロディスプレイライブラリの導入が、前記ゼノパス卵母細胞へのインビトロディスプレイライブラリの注入によって行われ、
    請求項１の工程（ｉｉ）のインビトロディスプレイライブラリが、少なくとも１０６個の異なる結合実体Ｂｎ（ｎ＝１０６である）のライブラリである、
    請求項３又は４に記載の方法。
  6. 請求項１の結合工程（ｉｉ）（ｂ）におけるＴ構造体の濃度が、少なくとも１０－１０Ｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 請求項１の工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉｉ）（Ａ）である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 請求項１の工程（ｉｖ）が、次の二つの工程、即ち、
    固体支持体への前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の標的分子の結合を介して、前記溶液（ｉｉｉ）（Ａ）のＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を前記固体支持体に結合させて、標的分子に結合せずそれ故に前記固体支持体に結合しないＢ構造体を除去する工程と、
    前記固体支持体に結合した前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用を介して、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的分子に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定する工程と、
    によって行われる、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項７に記載の方法であって、当該方法が、
    請求項１の（ｉ）の前記Ｔ構造体が、プレイ（当該プレイは、標的分子－プレイ融合タンパク質である）を含み、請求項１の工程（ｉｉ）では、核酸分子に結合したベイトが導入され、前記核酸分子は、特異的標的分子を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含み、前記ベイトは請求項１の工程（ｉｉ）の前記標的分子のプレイに結合することによって、前記ベイトが標的分子の前記プレイに結合しているＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体を作製し、
    溶解工程（ｉｉｉ）（Ａ）後、前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を標的分子の前記プレイに結合した前記ベイトと融合させ、前記融合した核酸分子は結合実体及び標的分子を同定することを可能にする配列情報を含み、
    先行する工程の前記融合した核酸分子の前記結合実体及び標的分子を同定することを可能にする特異的核酸配列情報の使用を介して、請求項１の工程（ｉｖ）において、（ｉｉ）の細胞内で、少なくとも１つの目的の標的分子に結合する少なくとも１つの個々の結合実体を同定する、
    ことを特徴とする方法。
  10. 前記細胞がゼノパス卵母細胞であり、前記細胞がアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 請求項９又は１０に記載の方法において、
    「前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の核酸分子を標的分子の前記プレイに結合した前記ベイトと融合させること」の前に、細胞溶解工程（ｉｉｉ）から得られた溶液の希釈工程が行われ、前記希釈が、前記溶液を少なくとも１０２倍希釈することであり、
    請求項１の工程（ｉ）においてただ１つの標的分子（ｎ＝１）が存在し、
    前記「同定する」工程（ｉｖ）が、結合実体及び標的分子についての配列情報を含んでなる前記融合した核酸分子が増幅される工程を含み、
    ここで、「プレイ－ベイト」系は、
    プレイ：四量体ストレプトアビジン及びベイト：ビオチン、
    プレイ：単量体ストレプトアビジン及びベイト：ビオチン、
    プレイ：Ｈｉｓ－タグ及びベイト：ＮＴＡ、
    プレイ：ＳＮＡＰ－ｔａｇ（登録商標）及びベイト：ベンジルグアニン（ＢＧ）、
    プレイ：Ｈａｌｏ－Ｔａｇ（登録商標）及びベイト：官能基に結合した反応性クロロアルカンリンカー、
    プレイ：炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）及びベイト：ＶＤ１１－４－２、又は
    プレイ：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びベイト：マルトースもしくはマルトトリオースであり、
    前記ベイトに結合した核酸分子がＤＮＡであり、前記Ｂ構造体の核酸分子がＤＮＡである、ことを特徴とする方法。
  12. 請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法において、
    前記ベイトに結合した核酸分子が、前記Ｂ構造体の核酸分子に対して相補的な付着末端を有し、
    前記Ｂ構造体の核酸分子及び前記ベイトに結合した核酸分子の相補的付着末端のリン酸骨格に、ホスホロチオエート結合が組み込まれ、
    ホスホロチオエート結合の数は、各核酸分子について、少なくとも２つのホスホロチオエート結合である、ことを特徴とする方法。
  13. 請求項１～６のいずれか一項に記載の方法において、
    請求項１の工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉｉ）（Ｂ）であり、
    当該方法が、
    請求項１の（ｉ）の前記Ｔ構造体が、前記標的分子に融合した酵素を含み、この酵素は、Ｂ構造体を標識する前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体のＢ構造体上で反応を行うことができ、それによって、前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体のＢ構造体を、標的分子に結合していないＢ構造体から区別することを可能にする、請求項１の（ｉｉ）の前記ＢＢｏｕｎｄＴｏＴ構造体の結合実体及び標的分子の結合によって作り出された近接性に起因し、
    前記標的分子に融合された前記酵素はリガーゼであり、請求項１の工程（ｉｉ）において、前記Ｂ構造体の核酸分子に相補的な付着末端を有する核酸分子も導入され、前記近接に起因する前記リガーゼは、前記導入された核酸分子を前記Ｂ構造体の核酸分子にライゲーションし、それによって前記Ｂ構造体を標識する、
    という方法である、ことを特徴とする方法。
  14. 請求項１の前記「同定する」工程（ｉｖ）が、前記Ｂ構造体の結合実体を同定することを可能にする特異的核酸配列情報を含む核酸分子が増幅される工程を含んでいる、
    請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 請求項１の前記同定工程（ｉｖ）において、（ｉｉ）の細胞内で少なくとも１つの目的の標的分子に結合する少なくとも６つの異なる個々の結合実体が同定され、
    請求項１の工程（ｉ）において、ただ１つの標的分子（ｎ＝１）が存在する、
    ことを特徴とする請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202107913VA (en) 2019-01-22 2021-08-30 Vipergen Aps A method for screening of an in vitro display library within a cell
CN114990122A (zh) * 2022-05-18 2022-09-02 清华大学 共价抑制剂的体外筛选方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008518607A (ja) 2004-11-08 2008-06-05 ビーパーゲン アンパーツゼルスカブ 構造核酸指向化学合成
JP2013540440A (ja) 2010-09-27 2013-11-07 ビペルゲン 濃縮ライブラリーを作製する方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
CA2261704A1 (en) 1996-07-31 1998-02-05 Norbert W. Bischofberger Lipophilic oligonucleotide analogs
AU1318400A (en) 1998-10-19 2000-05-08 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Dna-templated combinatorial library chemistry
US6413731B1 (en) * 1999-05-03 2002-07-02 Synaptic Pharmaceutical Corporation Methods of screening for compounds which bind to a human SNORF36A receptor
DK1423400T4 (da) 2001-03-19 2013-09-02 Harvard College Evolution af hidtil ukendt molekylfunktion
CN1539014A (zh) 2001-06-20 2004-10-20 ŦΤ¬ɭ��˾ 模控分子和使用这种分子的方法
ATE447626T1 (de) 2003-09-18 2009-11-15 Nuevolution As Methode zur gewinnung struktureller informationen kodierter moleküle und zur selektion von verbindungen
WO2006053571A2 (en) 2004-11-22 2006-05-26 Peter Birk Rasmussen Template directed split and mix systhesis of small molecule libraries
ES2638324T3 (es) 2009-02-13 2017-10-19 X-Chem, Inc. Métodos de creación y examen de bibliotecas codificadas por ADN
LT2558577T (lt) 2010-04-16 2019-03-12 Nuevolution A/S Bifunkciniai kompleksai ir tokių kompleksų gamybos ir naudojimo būdai
EP3000898B1 (en) 2013-05-21 2020-11-18 Hitgen Inc. Drug target capturing method
GB201407852D0 (en) * 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
CN107217107A (zh) * 2017-08-03 2017-09-29 首都医科大学附属北京天坛医院 一种快速检测cyp2c19基因多态性的方法和试剂盒
SG11202107913VA (en) 2019-01-22 2021-08-30 Vipergen Aps A method for screening of an in vitro display library within a cell

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008518607A (ja) 2004-11-08 2008-06-05 ビーパーゲン アンパーツゼルスカブ 構造核酸指向化学合成
JP2013540440A (ja) 2010-09-27 2013-11-07 ビペルゲン 濃縮ライブラリーを作製する方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Comb. Sci.，2015年，Vol.17，pp.722-731
Cell Chemical Biology，2016年，Vol.23，pp.435-441
J. Am. Chem. Soc.，2014年，Vol.136，pp.3264-3270
Med. Chem. Comm.，2016年，Vol.7，pp.1332-1339

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