JP7476796B2

JP7476796B2 - 哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査方法

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Publication number: JP7476796B2
Application number: JP2020552607A
Authority: JP
Inventors: 千織伊地知; 健二近藤; 絢香白澤; 國夫中田; 和高新保; 豊丸山; 弥生河戸
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2019-10-24
Publication date: 2024-05-01
Anticipated expiration: 2039-10-24
Also published as: WO2020085458A1; JPWO2020085458A1; EP3872493A1; US20210239714A1; EP3872493A4

Description

本発明は、哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査方法および検査試薬に関する。

現在、臨床現場では、嗅覚障害の診断は、嗅素を患者にかいでもらい、においの存在を検知できるか、およびにおいの種類を認識できるかを判定することにより行われている。嗅覚障害の診断に関して国内外に複数の検査キットがあるが、いずれも患者の返答に基づいた自覚的な検査法である。他覚的・客観的な嗅覚検査は、匂い刺激を行った際の嗅電図測定など実験室レベルの方法しかなく、臨床応用されている技術は存在しない。

三輪高喜「嗅覚検査の現状と今後の展望」耳展５４：２；７０～７９，２０１１

本発明は、嗅覚を他覚的・客観的に診断し得る、臨床応用し易い技術を開発することを目的とする。

本発明者らは、鋭意検討した結果、嗅粘膜で特異的に産生され、嗅粘液中に分泌される分泌タンパク質としてリポカリン１５が存在することを見出した。かかる知見を応用すれば、嗅粘膜が嗅覚と密接に関連し得るという事実に照らすと、哺乳動物から採取された嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプル中のリポカリン１５の量を測定することにより、嗅覚を検査し得ると考えられる。

すなわち、本発明者らは、以下の発明を着想することに成功し、本発明を完成するに至った。
〔１〕哺乳動物から採取された嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプル中のリポカリン１５の量を測定することを含む、哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査方法。
〔２〕リポカリン１５に対する抗体を用いてリポカリン１５のタンパク質量が測定される、〔１〕の検査方法。
〔３〕哺乳動物から採取された嗅粘液サンプルにおいてリポカリン１５のタンパク質量が測定される、〔１〕または〔２〕の検査方法。
〔４〕哺乳動物がヒトである、〔１〕～〔３〕のいずれかの検査方法。
〔５〕リポカリン１５の検出手段を含む、哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査試薬。
〔６〕検出手段が抗体である、〔５〕の検査試薬。

本発明の方法は、リポカリン１５の量の測定により、嗅粘膜、または嗅粘膜に関連する機能（例、嗅覚）もしくは障害（例、嗅覚障害）を他覚的・客観的に診断し得る。
本発明の方法はまた、リポカリン１５の量の測定という点で、嗅電図測定など実験室レベルに限定される方法ではなく、臨床応用し易い簡便な技術である。
本発明の方法はさらに、哺乳動物から採取された嗅粘液をサンプルとして使用する場合、侵襲性が低いという利点を有する。
本発明の試薬は、本発明の方法の実施に好適に利用することができる。

図１は、Ｈｉｓ－ｈＬＣＮ１５のＥ．ｃｏｌｉ中における発現を示す図である。レーン１：タンパク質マーカー（ナカライ社）；レーン２：Ｈｉｓ－ｈＬＣＮ１５発現菌体。図２は、ｈＬＣＮ１５の精製度および分子質量の解析を示す図である。レーン１：タンパク質マーカー（ナカライ社）；レーン２：精製したｈＬＣＮ１５。図３は、嗅粘液におけるｈＬＣＮ１５の検出、および呼吸上皮粘液におけるｈＬＣＮ１５の非検出を示す図である。図４は、ヒト鼻切片のｈＬＣＮ１５抗体を用いた免疫染色を示す図である。ａ：ヒト鼻大切片のＨ－Ｅ染色；ｂ：嗅球直下の嗅粘膜部分のｈＬＣＮ１５抗体染色像；ｃ：中鼻甲介のｈＬＣＮ１５抗体染色像；ｄ：下鼻甲介のｈＬＣＮ１５抗体染色像。図５は、ヒト鼻切片のＯＭＰ抗体（嗅神経細胞マーカー）を用いた免疫染色を示す図である。ａ：嗅球直下の嗅粘膜部分のヒトＯＭＰ（ｈＯＭＰ）抗体染色像；ｂ：拡大図。図６は、ヒト鼻切片のｈＬＣＮ１５抗体を用いた免疫染色（図４ｂの拡大図）を示す図である。ａ：嗅球直下の嗅粘膜のｈＬＣＮ１５抗体染色像；ｂ：拡大図（漿液腺）。図７は、ヒト検体（個体１：嗅神経の少ない検体）におけるＰＧＰ９．５（嗅神経）、ＣＫ１８（支持細胞）、およびＬＣＮ１５に対する免疫染色の結果を示す図である。図８は、ヒト検体（個体２：嗅神経の多い検体）におけるＰＧＰ９．５（嗅神経）、ＣＫ１８（支持細胞）、およびＬＣＮ１５に対する免疫染色の結果を示す図である。図９は、ｈＬＣＮ１５抗体を用いたヒト嗅粘液中のｈＬＣＮ１５の定量のための検量線の１例を示す図である。図１０は、嗅覚正常群及び嗅覚障害群におけるＬＣＮ１５タンパク質量の比較を示す図である。嗅覚正常群に比較して嗅覚障害群では有意（Ｗｅｌｃｈｔ－ｔｅｓｔ，ｐ＝０．００９）にＬＣＮ１５タンパク質量が少なかった。

本発明は、哺乳動物から採取された嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプル中のリポカリン１５の量を測定することを含む、哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査方法を提供する。

リポカリン１５は、嗅粘膜で産生され、嗅粘液中に分泌される分泌タンパク質である。リポカリン１５としては、後述するような種々の哺乳動物種に応じたものを利用することができるが、臨床応用の観点より、ヒトリポカリン１５が好ましい。ヒトリポカリン１５は、配列番号１のアミノ酸配列を有することが知られている。

哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、齧歯類（例、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ）、家畜および使役用の哺乳動物（例、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）が挙げられる。好ましくは、哺乳動物は、臨床応用の観点より、ヒトである。

哺乳動物からの嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプルの採取は、任意の方法により行うことができる。例えば、哺乳動物からの嗅粘膜サンプルの採取は、生検により行うことができる。また、哺乳動物からの嗅粘液サンプルの採取は、生理食塩水等の溶液で鼻腔上方の嗅部を洗浄し、洗浄液を回収することにより行うことができる。非侵襲性の観点からは、嗅粘液サンプルを採取することが好ましい。

嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプルにおけるリポカリン１５の量の測定は、任意の方法により行うことができる。例えば、リポカリン１５の発現部位である嗅粘膜サンプルにおけるリポカリン１５の量の測定は、ｍＲＮＡ量またはタンパク質量を測定することにより行うことができる。また、リポカリン１５の分泌部位である嗅粘液サンプルにおけるリポカリン１５の発現量の測定は、タンパク質量を測定することにより行うことができる。ｍＲＮＡ量の測定方法としては、例えば、プローブを用いるハイブリダイゼーション法、プライマー（例、２、３、または４個のプライマー）を用いる遺伝子増幅法、質量分析法が挙げられる。ｍＲＮＡ量の測定は、ｍＲＮＡの逆転写と組み合わされて用いられてもよい。タンパク質量の測定方法としては、例えば、抗体を用いるイムノアッセイ法、抗体以外の親和性物質（例、アプタマー）を用いるアッセイ法、質量分析法が挙げられる。イムノアッセイ法としては、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）〔例、化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）〕、免疫比濁法（ＴＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、ラテックス凝集反応法、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、およびイムノクロマトグラフィー法、ウェスタンブロッティング、および免疫染色が挙げられる。

好ましくは、リポカリン１５の量の測定は、非侵襲性の観点から、嗅粘液サンプルを解析対象として、抗体を用いたイムノアッセイ法により行うことができる。

イムノアッセイで用いられる抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体は、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。抗体はまた、全長抗体またはその断片であってもよい。抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖが挙げられる。本発明では、用いられるイムノアッセイ法の種類に応じて、１種の抗体のみならず、２種以上（例、２種、３種）の抗体を用いることができる。

抗体は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、酵素（例、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質またはタンパク質（例、フルオレセイン、ローダミン、緑色蛍光タンパク質）、発光又は吸光物質（例、ルシフェリン）、放射性物質（例、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２５Ｉ）が挙げられる。

イムノアッセイ法としては、例えば、直接競合法、間接競合法、およびサンドイッチ法が挙げられる。また、イムノアッセイ法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射イムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法、ラテックス凝集反応法、ウェスタンブロッティングが挙げられる。

本発明の方法では、測定されたリポカリン１５の量に基づき、嗅粘膜に関連する機能（例、嗅覚）もしくは障害（例、嗅覚障害）が評価されてもよい。嗅粘膜は嗅覚と密接に関連し得るので（例、山岸ら，耳鼻臨床（１９９９年）８３巻３号３８３－８９０頁；Ｍｉａｎｉｅｔａｌ．，ＥｕｒＡｒｃｈＯｔｏｒｈｉｎｏｌａｒｙｎｇｏｌ，２００３，ｖｏｌ．２６０，ｐ．５２９－５３５；Ｎｅｔｚｅｒｅｔａｌ．，ＪＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．，２００２，ｖｏｌ．３１（１），ｐ．９－１２；Ｋｏｎｄｏｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ，２００９，ｖｏｌ．３３５（３），ｐ．４８９－５０３）；Ｈｕｒｔｔｅｔａｌ．，ＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１９８８，ｖｏｌ．９４（２），ｐ．３１１－３２８；Ｋｉｍｅｔａｌ．，ＯｔｏｌａｒｙｎｇｏｌＨｅａｄＮｅｃｋＳｕｒｇ．，２０１０，ｖｏｌ．１４３（６），ｐ．８３７－４２；Ｋｉｋｕｔａｅｔａｌ．，ＳｃｉＲｅｐ．，２０１６，ｖｏｌ．６，ｐ．３５３６１）、嗅粘膜により特異的に産生されるリポカリン１５は、正常な嗅粘膜の量、ひいては嗅覚の指標となり得る。例えば、嗅粘膜が異常な状態（例、傷害または障害）にある場合、嗅粘膜におけるリポカリン１５のｍＲＮＡ量およびタンパク質量、ならびに嗅粘液に分泌されるリポカリン１５のタンパク質量は減少し得るため、リポカリン１５は上記のような指標として有用であり得る。

上記のような評価は、例えば、測定されたリポカリン１５の量を、カットオフ値等の基準値と比較することにより、行うことができる。カットオフ値等の基準値の算出は、当該分野において周知である。例えば、正常群及び異常群においてリポカリン１５の量を解析し、リポカリン１５の所定量における正常群と異常群との診断感度及び診断特異度を求め、これらの値に基づいて、ＲＯＣ（ＲｅｃｅｉｖｅｒＯｐｅｒａｔｉｎｇＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を作成する。そして、診断感度及び診断特異度が最大となるようなリポカリン１５の量を求め、その値をカットオフ値とすることができる。また、リポカリン１５の任意の量における診断効率（全症例数に対する、正常正診症例と異常正診症例の合計数の割合）を求め、最も高い診断効率が算出されるポカリン１５の量をカットオフ値とすることもできる。あるいは、異常群に属する被験体が、正常群に属する（偽陽性）と誤って評価されることを極力排除する観点から、診断特異度をより重視してカットオフ値を決定してもよい。

本発明はまた、リポカリン１５の検出手段を含む、哺乳動物の嗅粘膜または嗅粘液の検査試薬を提供する。

リポカリン１５、および哺乳動物の詳細は、上述したものと同様である。

リポカリン１５の検出手段は、ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出手段である。

ｍＲＮＡの検出手段としては、例えば、用いられる遺伝子増幅法の種類に応じたプライマー（例、２個以上のプライマー）、および核酸プローブが挙げられる。核酸プローブは、遊離の形態、又は固相に固定された形態において用いることができる。固相としては、例えば、アレイ、メンブレン（例、ニトロセルロース膜、ろ紙）、カラム等の支持体；及びプレート（例、マルチウェルプレート）、チューブ等の容器が挙げられる。

タンパク質の検出手段としては、例えば、抗体、およびアプタマーが挙げられる。これらの検出手段は、上述したような標識物質で標識されていてもよい。また、これらの検出手段が標識物質で標識されていない場合、本発明の検査試薬は、標識物質で標識された抗体を適宜調製することができるように、標識物質を含むように構成されていてもよい。

リポカリン１５の検出手段としては、タンパク質の検出手段が好ましく、抗体がより好ましい。抗体の詳細は、上述したものと同様である。

本発明の検査試薬はまた、リポカリン１５ｍＲＮＡまたはタンパク質（標品）を含んでいてもよい。このような標品は、例えば、ポジティブコントロールとして、および／または定量のための検量線の作成に用いることができる。

本発明の検査試薬はさらに、抗体を含む場合、抗体によるイムノアッセイに必要な構成要素を含んでいてもよい。このような構成要素としては、上述したような標識物質および酵素の基質、ならびに希釈液、２次抗体、および抗体の安定化剤、哺乳動物から試料を採取し得る器具（例、生検針）または溶液（例、生理食塩水）が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明の検査試薬は、鼻内内視鏡検査試薬として使用することができる。このような場合、本発明の検査試薬は、リポカリン１５を介して嗅粘膜を染色できるように、標識物質で標識された抗体を含むか、または抗体および標識物質を個別に含むことが好ましい。染色は、スプレーまたは塗布等の任意の様式で行うことができる。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１）ヒトＬＣＮ１５発現ベクターの構築
ヒトＬＣＮ１５（ｈＬＣＮ１５）の１次配列情報はＲＳＣＢ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／）より取得した。いずれもシグナルペプチドを排した成熟体としてユーロフィン社にて合成し（配列番号１）、発現時にｈＬＣＮ１５のＮ末端にＨｉｓタグが遺伝的に融合されるよう、定法に従いｐＥＴ１６ｂのマルチクローニングサイトにサブクローニングした。

（実施例２）大腸菌を用いたｈＬＣＮ１５タンパク質の調整
得られたプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）にヒートショック法にて形質転換し、ＬＢプレート（アンピシリン１００μｇ／Ｌ含む）に播種し、３７℃・１３時間静置培養した。形成したコロニーをピックし、６００ｍＬの培地（ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を張り込んだ２Ｌフラスコに移し、３７℃・１６時間・２００ｒｐｍで培養後、更に、２０℃・２０時間培養した。６０００ｘｇ、１０分の遠心分離により菌体を回収し、破砕するまで－８０℃冷凍庫にて保存した。また、一部菌体を１０－２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ジェレックスインターナショナル社）にて展開し、Ｈｉｓ－ｈＬＣＮ１５の発現を確認した。

発現菌体２００ｍＬ分をｌｙｓｉｓバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ９，１ＭＮａＣｌ，２ｍＭＭｇａＣｌ_２，２ｍＭＣａＣｌ_２，４ｍＭＤＴＴ，１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で溶解したのち、超音波破砕（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ２０１Ｍ、久保田商事社：１８０Ｗ／３０ｍｉｎ／４℃）し、８００ｘｇ、１０分間遠心分離したのち、ＡＶＡＮＴＩＪＸＮ－３０（ベックマン社）にて１０８０００ｘｇ、３０分間超遠心分離した。得られた上清を、ｅｃｏｎｏｐａｃｋｃｏｌｕｍｎ（ＢｉｏＲａｄ社）にＢＶ＝１ｍＬにて張り込んだＨｉｓ・ｔａｇカラムにアプライし、ｌｙｓｉｓバッファーで洗浄し、更に、１０ｍＬＰＢＳ（－）で洗浄した。次に、ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＣａＣｌ_２）を５ｍＬ添加し、５μＬＦａｃｔｏｒＸａ（Ｍｅｒｃｋ社）を添加したのち、３７℃・１２時間インキュベートした。その後、Ｈｉｓ上清を回収し、ａｍｉｃｏｎｕｌｔｒａＭＷＣＯ１０ｋ（Ｍｅｒｃｋ社）にて濃縮し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度解析を実施した。当該ＰＡＧＥ上で、夾雑タンパク質由来のバンドが検出されておらず、ｈＬＣＮ１５に相当する単一バンドであるため、純度は９０％以上と考えられる（図１）。

（実施例３）ｈＬＣＮ１５を抗原とした抗血清の作製
抗体はユーロフィンジェノミクス株式会社の抗体作製サービスを利用した。具体的には調製したｈＬＣＮ１５タンパク質をウサギに１回目０．３ｍｇ（０ｄａｙ）、２回目０．２ｍｇ（２８ｄａｙ）、３回目０．２ｍｇ（３５ｄａｙ）、４回目０．２ｍｇ（４２ｄａｙ）を投与して免疫した。３回目投与前（３５ｄａｙ）に試採血し、ＥＬＩＳＡで十分に抗体価が上がっていることを確認し、４９ｄａｙで全採血し、抗血清（ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体）を得た。

（実施例４）ヒト嗅粘液の採取
非侵襲的な手法でヒト嗅粘液を採取した。嗅粘液については、被験者が四つん這いの姿勢になり、頭頂部を床につけて頭部が上下逆となる姿勢を取った。片側の鼻腔に３７度に温めた生理食塩水１ｍＬを流し込み、鼻腔上方の嗅部に貯留させた。１０分静置した後、起き上がって、鼻腔から流れ出た液体をチューブで回収した。
呼吸上皮粘液については、直径１ｍｍ、長さ２ｃｍの外科用の吸収スポンジ（Ｍｅｒｏｃｅｌ（登録商標），ＭｅｄｔｒｏｎｉｃＪａｐａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を鼻腔内に１０分間静置した後に回収した。

（実施例５）ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いたヒト嗅粘液のＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ方法
嗅粘液・呼吸粘液を各７．５μＬと４ｘＬＤＳｓａｍｐｌｅバッファー（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混合し、１０－２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ジェレックスインターナショナル社）に６μＬずつアプライした。２００Ｖ／８０ｍＡ／３５ｍｉｎの条件で展開したのち、ｉＢｌｏｔシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて２０Ｖ／２Ａ／７ｍｉｎの条件でＰＶＤＦ膜に転写した。得られた転写膜をｉＢｉｎｄシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて抗原抗体反応に供した。なお、一次抗体はｈＬＣＮ１５ポリクロ―ナル抗体、二次抗体はＧｏａｔＡｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社、＃４７４－１５０６）を用いた。その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＷｅｓｔＤｕｒａＴｒｉａｌＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて発色反応し、ＡｍｗｅｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にてデータの取り込みを行った。この結果、作製したｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体は、ｈＬＣＮ１５タンパク質を抗原として認識することを確認した（図２）。

（実施例６）ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いたヒト嗅粘液中のｈＬＣＮ１５の検出
調製した抗ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いて、嗅粘液および呼吸上皮に対するＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ法を実施した。その結果、呼吸上皮では全例（ｎ＝３）で検出限界以下であったが、嗅粘液では全例（ｎ＝４）でｈＬＣＮ１５が検出された（図３）。以上から、調製した抗ｈＬＣＮ１５ポリクロ―ナル抗体はヒト試料中のｈＬＣＮ１５を検出可能であること、および嗅粘液中にｈＬＣＮ１５が存在することを明らかにした。

（実施例７）ヒト嗅粘膜組織の採取と固定
ヒト嗅粘膜組織サンプルは採取後１０％中性緩衝ホルマリン（武藤化学）にて室温下に１週間固定した。骨組織を含むサンプルは続いて１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）にて室温、４週間脱灰を行った。その後アルコール系列で脱水したのちパラフィンに包埋した。ＭＡＳコートされたスライドグラス（松浪硝子）に冠状断、厚さ４μｍの切片を作製した。

（実施例８）ｈＬＣＮ１５抗血清を用いたヒト鼻切片の免疫組織染色
（１）方法
作製した切片をキシレン・エタノール系列で脱パラフィン・親水化したのち、抗原賦活化液（ＤＡＫＯＳ１７００）を用い、１２１℃・２０分のオートクレーブによる抗原賦活化を行った。続いて３％過酸化水素含メタノールで１０分、内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを行った。ブロッキング液（ナカライデスクブロッキングワンＨｉｓｔｏ）にて室温で１０分処理し非特異的抗体反応を減少させた後、切片をウサギ抗ｈＬＣＮ１５抗血清（ブロッキング液をＴＢＳ－Ｔで２０倍希釈した抗体希釈液で５００倍希釈）、ウサギ抗サイトケラチン１８（ＣＫ１８）抗体（上記抗体希釈液で２５０倍希釈）、ウサギ抗ＰＧＰ９．５抗体（上記抗体希釈液で５００倍希釈）にてそれぞれ室温・１時間反応させた。反応後ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて洗浄し、ＨＲＰ付加抗ウサギＩｇＧ二次抗体（シンプルステインＭＡＸ－ＰＯ（Ｒ）、ニチレイ）にて室温・３０時間反応させた。ＨＲＰによる発色反応はジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ニチレイ）を用いた。切片はヘマトキシリンによる対比染色の後、脱水・透徹した。

（２）結果
ヒトの鼻腔全体が含まれている大切片の染色において、抗ｈＬＣＮ１５抗体による染色は鼻腔下方の粘膜には見られず、鼻腔の最上方である嗅裂の粘膜の固有層に染色像がみられた（図４ａ－ｄ）。染色が認められた部位は隣接する切片の抗ＰＧＰ９．５抗体（神経細胞マーカー）及び抗ＣＫ１８抗体（嗅上皮支持細胞マーカー）による染色で染色がみられた位置と隣接し、嗅粘膜であると考えられた（図５ａ，ｂ）。高倍率の観察で、ｈＬＣＮ１５はボウマン腺と考えられる腺組織に反応があることが確認された（図６ａ，ｂ）。すなわち、ＬＣＮ１５の発現は、嗅粘膜（ボウマン腺）の局在と有意に相関していた。
ヒトはマウス・ラットと異なり嗅粘膜の退行変性が顕著であり、嗅神経細胞が残っている領域（ＰＧＰ９．５陽性領域）が限局している。ＣＫ１８陽性の領域は本来嗅神経上皮を覆っている支持細胞（呼吸上皮にはない）が残存していることを示している。嗅神経上皮が高度に変性すると支持細胞も失われて呼吸上皮化するが、嗅神経上皮の変性が中等度の場合は上皮中層の嗅神経細胞は失われるが支持細胞は残存する（参考文献：ＣｈｉｌｄＫＭｅｔａｌ：ＴｈｅＮｅｕｒｏｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＣａｐａｃｉｔｙｏｆＯｌｆａｃｔｏｒｙＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｓＮｏｔＬｉｍｉｔｌｅｓｓ：ＩｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｆｏｒＡｇｉｎｇ．ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ２０１８；３８：６８０６－６８２４．）。
したがって、各細胞マーカーの染色パターンによって、嗅神経上皮の状態は次のように判断される。
ＰＧＰ陽性、ＣＫ１８陽性領域：嗅神経上皮の変性がない、または軽度
ＰＧＰ陰性、ＣＫ１８陽性領域：嗅神経上皮の変性が中等度
ＰＧＰ陰性、ＣＫ１８陰性領域：嗅神経上皮の変性が高度
今回、２個体のヒト鼻大切片を免疫組織染色に使用したが、抗ＰＧＰ９．５染色により個体１は嗅粘膜の変性がより高度でＰＧＰ９．５陽性の神経の残存が少なく、個体２は神経の残存がやや多く認められた（図７、８）。抗ＣＫ１８染色はこれに合致して、個体１では範囲が狭く、個体２では残存が多かった（図７、８）。ＬＣＮ１５陽性部位も個体１は陽性部位が限局しており、個体２はより広範囲に分布していた（図７、８）。すなわち、ＬＣＮ１５の発現は、嗅粘膜に関連する機能もしくは障害と有意に相関していた。
以上より、ＬＣＮ１５は、嗅粘膜、または嗅粘膜に関連する機能もしくは障害の指標となり得ることが示された。

（実施例９）ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いたヒト嗅粘液中のｈＬＣＮ１５の評価
（１）ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いたヒト嗅粘液中のｈＬＣＮ１５のウエスタンブロット
ヒト嗅粘液・呼吸粘液を各１．８２μｇタンパク質量になるように４ｘＬＤＳｓａｍｐｌｅバッファー（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混合し、１０－２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ジェレックスインターナショナル社）に６μＬずつアプライした。２００Ｖ／８０ｍＡ／３５ｍｉｎの条件で展開したのち、ｉＢｌｏｔシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にて２０Ｖ／２Ａ／７ｍｉｎの条件でＰＶＤＦ膜に転写した。得られた転写膜をｉＢｉｎｄシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて抗原抗体反応に供した。なお、一次抗体はｈＬＣＮ１５ポリクロ―ナル抗体、二次抗体はＧｏａｔＡｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔＩｇＧ抗体（ＫＰＬ社、＃４７４－１５０６）を用いた。その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）ＷｅｓｔＤｕｒａＴｒｉａｌＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて発色反応し、ＡｍｗｅｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６００（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）にてデータの取り込みを行った。

（２）ｈＬＣＮ１５ポリクローナル抗体を用いたヒト嗅粘液中のｈＬＣＮ１５の定量
上記ウエスタンブロットを実施する際に同一ゲルにｈＬＣＮ１５を１２．５、２．５、０．５ｎｇ／ｌａｎｅになるように泳動し、一緒にＰＤＶＦ膜に転写した。このｈＬＣＮ１５の検出されたバンドの化学発光の１６ｂｉｔ画像データからｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｍを作り、波形下面積を得て、検量線を作成した。同様に検体のｈＬＣＮ１５量もバンドの化学発光の１６ｂｉｔ画像データからｄｅｎｓｉｔｏｇｒａｍを作り、波形下面積を得て、検量線を用いて換算した。検量線の１例を図９に示す（実際はゲル／膜１枚ごとに検量線を作成した）。

（３）結果
被験者を嗅覚正常群（基準嗅力検査において嗅素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれも閾値２が同定可能であった被験者）と嗅覚障害群（同検査において嗅素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれかが閾値２で判別不能であった被験者）に分け、それぞれの嗅粘液の１．８２μｇタンパク量当たりのＬＣＮ１５の量を定量し群間比較したところ、嗅覚正常群に比較して嗅覚障害群では有意（Ｗｅｌｃｈｔ－ｔｅｓｔ，ｐ＝０．００９）にＬＣＮ１５の含有量が少なかった（表１、図１０）。

（実施例１０）嗅覚受容体発現細胞を用いるレポーターアッセイ
（１）材料
（１－１）ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
ヒト嗅覚受容体はＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報を基に、ＴｒｕｅＣｌｏｎｅｃＤＮＡＣｌｏｎｅコレクション（ＯｒｉＧｅｎｅ）から購入したヒト嗅覚受容体遺伝子を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩサイトを利用して、Ｒｈｏ－ｐＭＥ１８Ｓベクター（Ｋ．Ｋａｊｉｙａｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１５Ａｕｇｕｓｔ２００１，２１（１６）６０１８－６０２５）のＲｈｏタグ配列の下流にサブクローニングし、ヒト嗅覚受容体の発現ベクターを得た。

（１－２）コウモリＲＴＰ１ｓ発現ベクターの作製
コウモリのＲＴＰ１ｓ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＸＭ＿００６７６５８５１の１０９位のＡから３’末までの塩基配列）をユーロフィンジェノミクスの人工遺伝子合成サービスを用いて合成し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩサイトを利用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングし、コウモリＲＴＰ１ｓの発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－ｍｉｃｒｏｂａｔＲＴＰ１ｓを得た。

（１－３）ヒトＧｏｌｆ発現ベクターの作成
ヒトＧｏｌｆタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡの配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿１８２９７８）。ヒトｍＲＮＡを鋳型として、プライマーを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を、ＧＥＮＥＡＲＴＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔ（Ａ１３２８８、ライフテクノロジーズ社）を用いてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ライフテクノロジーズ社）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、ヒトＧｏｌｆ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－Ｇｏｌｆを得た。

（１－４）ラットＲｉｃ８Ｂ発現ベクターの作成
ラットＲｉｃ８Ｂタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡの配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋに登録されている（ＧｅｎＢａｎｋａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿１７５５９８）。ラットｍＲＮＡを鋳型として、プライマーを用いて、ＲＴ－ＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を、ＧＥＮＥＡＲＴＳｅａｍｌｅｓｓＣｌｏｎｉｎｇａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｙＫｉｔ（Ａ１３２８８、ライフテクノロジーズ社）を用いてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ライフテクノロジーズ社）のＨｉｎｄＩＩＩ－ＸｂａＩサイトにクローニングし、ラットＲｉｃ８Ｂ発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１－Ｒｉｃ８Ｂを得た。

（１－５）嗅覚受容体発現細胞の作製
嗅覚受容体（ＯＲＸ）を発現させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を以下の手順で作製した。表２に示す組成の発現ベクター混合液を調整し、クリーンベンチ内で２０分静置した後、前日に１０ｃｍシャーレに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２．５×１０^６細胞／１０ｃｍシャーレ）に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２を保持したインキュベータ内で５時間培養した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２．５×１０^５細胞／ｍｌ）を１００μｌずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ_２を保持したインキュベータ内で一晩培養した。

（２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させた嗅覚受容体（ＯＲＸ）は、Ｇｏｌｆと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化し、以て細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本実施例において、試験物質に対する嗅覚受容体の応答の測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ由来の発光値の増加としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。「ルシフェラーゼレポータージーンアッセイ」を「ルシフェラーゼアッセイ」ともいう。ホタルルシフェラーゼは、ｐＧＬ４．２９［ｌｕｃ２Ｐ／ＣＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒに搭載されたホタルルシフェラーゼ遺伝子から、細胞内ｃＡＭＰ量依存的に発現する。併せて、ウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値を、各ウェルの遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正するための内部標準として用いた。ウミシイタケルシフェラーゼは、ｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ／ＴＫ］Ｖｅｃｔｏｒに搭載されたウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子から、ＣＭＶプロモーターの制御下で構成的に発現する。

（３）ＬＣＮ１５同時添加効果の測定
ＨＥＫ２９３細胞に嗅覚受容体（ＯＲＸ）を発現させ、ルシフェラーゼアッセイを行う。上記（１－５）で得られた培養物から培地を取り除き、ＣＤ２９３培地、イソ吉草酸（３０μＭ）、およびイソ吉草酸（３０μＭ）とＬＣＮ１５（１μＭ）の混合液を１５μｌ添加し、反応液とする。イソ吉草酸（３０μＭ）およびイソ吉草酸（３０μＭ）とＬＣＮ１５（１μＭ）の混合液は、ＣＤ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解して調製する。細胞をＣＯ_２インキュベータ内で３７℃、３時間培養し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で充分に発現させる。細胞内のホタルルシフェラーゼ由来の発光値を測定し、「Ｌｕｃ値」とする。また、細胞内のウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値を測定し、「ｈＲＬｕｃ値」とする。各ルシフェラーゼ由来の発光値は、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ^ＴＭｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｓｙｓｔｅｍ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定する。試験物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値（Ｌｕｃ値）を、同一ウェルのウミシイタケルシフェラーゼ由来の発光値（ｈＲｌｕｃ値）で割り、「Ｌｕｃ／ｈＲｌｕｃ値」とする。Ｌｕｃ／ｈＲｌｕｃ値を試験物質に対する嗅覚受容体（ＯＲＸ）の応答強度の指標とする。
その結果、嗅覚受容体（ＯＲＸ）はイソ吉草酸単独添加に比べ、イソ吉草酸とＬＣＮ１５の混合液により応答強度が増強し得る。すなわち、ＬＣＮ１５は、嗅覚受容体（ＯＲＸ）を介して、嗅粘膜に関連する機能もしくは障害と相関し得ると考えられる。

以上のように、本発明の方法および試薬は、ヒト等の哺乳動物の検査に有用である。

Claims

哺乳動物から採取された嗅粘膜サンプルまたは嗅粘液サンプル中のリポカリン１５の量を測定することを含む、哺乳動物の嗅覚障害の検査方法。
リポカリン１５に対する抗体を用いてリポカリン１５のタンパク質量が測定される、請求項１記載の検査方法。
哺乳動物から採取された嗅粘液サンプルにおいてリポカリン１５のタンパク質量が測定される、請求項１または２記載の検査方法。
哺乳動物がヒトである、請求項１～３のいずれか一項記載の検査方法。
リポカリン１５の検出手段を含む、哺乳動物の嗅覚障害の検査試薬。
検出手段が抗体である、請求項５記載の検査試薬。