JP7464737B2 - 肺上皮細胞の損傷及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患の治療における低分子化合物の用途 - Google Patents

Description

本発明は、肺上皮細胞の損傷及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患の治療における低分子化合物の用途に関し、より詳しく言えば、５α－アンドロスタ－３β，５，６β－トリオール（本明細書では「ＹＣ－６」又は「ＹＣ６」と略称する場合がある）及びその類似体の前記用途、特に肺損傷及び脳小血管病の治療におけるこれらの化合物の使用に関する。

肺損傷は、肺疾患、特に急性肺損傷／急性呼吸窮迫症候群（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）、肺高血圧症、敗血症などの疾患によく見られ、健康に深刻な影響をもたらすだけでなく、一部は死亡率が非常に高い。

急性肺損傷（Ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ、ＡＬＩ）とは、心臓以外の様々な深刻な肺内外の病原性因子（例えば、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷、他の毒素による中毒など）によって引き起こされる急性低酸素性呼吸不全を指し、その病理学的特徴としては肺胞上皮及び肺毛細血管内皮の透過性亢進による肺水腫、肺胞虚脱及び拡張、肺胞壁の肥厚及び炎症細胞浸潤などが挙げられる（Ｂｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。重篤な段階に発展しているＡＬＩは急性呼吸窮迫症候群（Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）と呼ばれ、難治性低酸素血症と呼吸困難として現われ、呼吸不全、多臓器不全ひいては死亡になる場合がある。ＡＬＩ／ＡＲＤＳの死亡率は４０～６０％まで達しているが、現在、効果的な薬物療法はまだない。

新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）（Ｗｕ Ｆ ｅｔ ａｌ．，２０２０）によって引き起こされる２０１９新型コロナウイルス感染症（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）のうち、急性呼吸窮迫症候群（Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＡＲＤＳ）を合併したものが２９％であった（Ｈｕａｎｇ Ｃ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。新型コロナウイルス感染症がＡＲＤＳを誘発させることが病理学的証拠から一層裏付けられ（Ｘｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、２例の死亡患者に対する組織学的検査で、両側に細胞性線維粘液性浸出液を伴うびまん性肺胞損傷が発見され、肺水腫、肺細胞の脱落及びヒアリン膜の形成が確認され、これによって肺の通気／換気機能に深刻な影響を与え、ＡＲＤＳに発展している。どうすれば患者の重症化を防止できるのかと万単位で数えられる多い重症／重篤患者を治療することが、医療上そして社会的な差し迫ったニーズである。

肺胞は肺におけるガス交換の基本単位であり、その内面がＩ型及びＩＩ型肺胞上皮細胞によって覆われている。Ｉ型の扁平な細胞は損傷しやすいが、肺胞の表面積の９０％を構成している。ＩＩ型の立体的な細胞が、残りの１０％の肺胞の表面積を構成しており、しかも損傷しにくく、その機能は界面活性剤の生成、イオン輸送、Ｉ型細胞の損傷後の増殖と分化を含む。肺胞上皮は緻密な障壁を形成させて外因性病原体を隔離するだけでなく、その表面受容体及び分泌産物と免疫細胞の相互作用により肺の恒常性と相対的な無菌性を維持させる。中でも、肺胞上皮細胞は肺の恒常性において主な役割を果たしており、急性肺損傷、肺線維症などの肺関連疾患と、組織リモデリング関連疾患のいずれにも直接関係している。

肺血管内皮細胞は血管系内膜の単層を形成させており、その生理学的位置が様々な損傷因子、例えば、ＬＰＳ、エンドトキシン、ＴＮＦ－α、酸化ストレスにさらされているため、肺血管内皮細胞は様々な肺損傷因子の攻撃する標的細胞であり、ＡＬＩ／ＡＲＤＳの発生機序において重要な役割を果たす。危篤状態にあり又は早期若しくは晩期ＡＲＤＳを有している患者の気管支肺胞洗浄液はヒト肺微小血管内皮細胞に細胞毒性を有することが研究で明らかになっている。肺血管内皮細胞は細菌性エンドトキシン（リポ多糖、ｌｉｐｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、ＬＰＳ）、サイトカイン、酸素フリーラジカルなどの作用で、毛細血管の透過性亢進と肺水分量の増加を引き起こして、肺水腫、呼吸困難が発生する。様々な炎症性メディエーターとサイトカインを分泌及び放出することによって、炎症誘発性メディエーターと抗炎症性メディエーターのバランスが崩れると同時に、凝固系と抗凝固系のバランスが崩れ、肺微小循環障害と肺高血圧症が引き起こされると、間質性肺浮腫、肺出血、進行性呼吸困難が促進され、患者には進行性低酸素血症と呼吸困難が現れる可能性がある（杜景霞ら，２０１２）。有害因子によって引き起こされる肺血管内皮細胞の損傷を軽減できる薬物をスクリーニングすることは、様々な感染性肺炎、急性肺損傷、ＡＲＤＳ、肺高血圧症などを含め、様々な肺損傷関連疾患の予防と治療に使用することが期待できよう。

ホスホフルクトキナーゼ－２／フルクトース－２，６－ビスホスファターゼ３（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ－２／ｆｒｕｃｔｏｓｅ－２，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３、ＰＦＫＦＢ３）は、糖代謝経路の解糖経路における重要な調節タンパク質である。肺損傷においてＰＦＫＦＢ３は重要な役割を果たす。解糖酵素ＰＦＫＦＢ３の阻害剤は、盲腸結紮及び穿刺（ＣＬＰ）によって誘発されるＡＬＩマウスの生存率や、肺炎、乳酸増加及び肺におけるアポトーシス損傷を改善できる（Ｇｏｎｇ Ｙ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。嫌気性解糖は敗血症関連ＡＬＩにおけるアポトーシスの重要な要因であり、ＰＦＫＦＢ３阻害剤はＬＰＳによって誘発される急性肺損傷／急性呼吸窮迫症候群（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）実験動物の肺損傷を有意に軽減できる（Ｗａｎｇ Ｌ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＰＦＫＦＢ３を特異的にノックアウトされた血管内皮細胞では、内皮細胞の解糖レベルが有意に低下しているため、成長因子、炎症誘発性サイトカインと細胞接着因子の発現が低下し、肺血管平滑筋細胞の異常な増殖と、肺血管周囲の炎症細胞の浸潤が阻害され、低酸素誘発性肺高血圧症の進行が阻害されている（Ｃａｏ Ｙ，２０１９）。Ｐｆｋｆｂ３を特異的にノックアウトされた平滑筋細胞では、解糖代謝産物である乳酸の含有量が減少することで、ＥＲＫ１／２に依存するカルパイン２（ｃａｌｐａｉｎ－２）のリン酸化の活性化が低減し、肺血管平滑筋細胞におけるコラーゲンの合成減少が引き起こされ、平滑筋細胞の異常な増殖も弱められ、さらに肺高血圧症の進行中の肺血管リモデリングが阻害される（Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。

血液脳関門（Ｂｌｏｏｄ－Ｂｒａｉｎ Ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＢ）は、中枢神経系と循環器系の間の細胞界面で、脳関門の１種である。血液脳関門の構造は、血管内皮細胞、周皮細胞、アストロサイトの足突起、基底膜などを含み、ニューロンと共に神経血管ユニットを構成している。血管内皮細胞は血液脳関門の解剖学的基盤を構成し、様々な選択的輸送システムが栄養素と他の物質を脳内又は脳外に輸送することを可能とし、親水性溶質に対する細胞間隙の低い透過性を保つ。臨床研究、神経病理学、疫学、動物モデルなどの証拠によって、血管透過性亢進によって引き起こされる血液脳関門の破壊は脳小血管病の開始要因の１つであることが示されてきている。血管内皮細胞の損傷と内皮組織の機能障害は血液脳関門の透過性亢進を誘発させ、これによって血液中の成分が潜在的な血管周囲腔と脳実質に入り、神経細胞と膠細胞を損傷させる。血液脳関門の透過性亢進は神経学的損傷及び臨床症状より先に出現することも報告されている。

複数の臨床研究は、脳小血管病患者において脳の血流量が減少しており血管の自己調節機能が障害していることを示しており、ＰＥＴとＭＲＩ検査で白質高信号患者は低灌流状態にあり血管透過性亢進と血液脳関門損傷が認められるが、灰白質には明らかな変化がないことから、血液脳関門の損傷領域は白質が主であることを示唆している。白質病変患者において血液脳関門の透過性の長期的な変化があるとともに、皮質に隣接する白質高信号の進行は血液脳関門の損傷の程度に関係しており、血液脳関門の透過性の変化による血漿遊出と周囲組織損傷は白質病変の持続的な悪化をもたらす重要な要因であることが研究で示されている。ＤＣＥ－ＭＲＩによる研究では、脳小血管病患者は脳組織の多くには血液脳関門漏出の可能性があることが示されたため、血液脳関門の完全性の損傷が脳小血管病の主な発生機序であることが一層裏付けられている。

現在、臨床では様々な肺疾患による肺損傷又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を効果的に治療する薬物がまだないため、それらの疾患を効果的に治療できる薬物を提供することは臨床的に大きな意味を有する。

発明者らは、化合物５α－アンドロスタ－３β，５，６β－トリオールは、ＰＦＫＦＢ３発現の上方調節を有意に阻害し、乳酸の蓄積を有意に阻害し、血管内皮細胞の損傷を軽減させ、肺胞上皮細胞の損傷を軽減させ、肺胞中隔の肥厚を阻害し、肺胞損傷及び肺への炎症細胞浸潤を軽減させることができるため、肺胞上皮細胞の損傷及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される様々な疾患の治療に用いることができるという予期せぬ事実を発見した。

そこで、本発明の一態様において、肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療するための薬物の製造における式Ｉの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩の使用を提供する。
（式Ｉ）
式中、Ｒ_１は、Ｈ、－ＣＮ、フッ素、塩素、Ｃ_１～１０アルキル基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルキル基、Ｃ_１～１０アルコキシ基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルコキシ基及びＣ_３～１０シクロアルキル基から選ばれる。一部の実施形態では、前記Ｒ_１は、Ｈ、－ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３、－ＣＨ（ＣＨ_３）_２、－ＣＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３又は－ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＣＨ_３）_２である。好ましい実施形態では、前記Ｒ_１は、Ｈである。

本発明の別の態様において、肺上皮細胞の損傷及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療するための前記いずれかの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩を提供する。

本発明の更なる態様において、予防上又は治療上の有効量の前記いずれかの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩を必要とする対象に投与することを含む、肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療する方法を提供する。

本開示では、上記のいずれかの態様において、一部の実施形態で、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺水腫、肺線維症、早産児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、ニューモシスチス肺炎及び肺塞栓症の１つ又は複数である。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされ、ただし低酸素（例えば、高地環境での低酸素）によって引き起こされるのではない。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。一部の実施形態では、前記急性肺損傷は、手術によって引き起こされる肺損傷であり、前記手術は、例えば、縮小手術、肺葉切除術又は肺全摘術などの肺切除術、肺腫瘍切除術又は肺移植である。一部の実施形態では、前記肺線維症は、特発性肺線維症又はじん肺である。

本開示では、上記のいずれかの態様において、一部の実施形態で、前記血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病を含み、ただし微小脳出血、脳卒中、脳浮腫を含まない。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の透過性亢進として現われる。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の血管内皮細胞の損傷として現われる。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の臨床症状は、認知障害、歩行障害、気分障害、尿失禁及び／又はうつ病である。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変を含む。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変だけである。

本開示では、上記のいずれかの態様において、一部の実施形態で、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、心血管疾患又は糖尿病性血管合併症である。一部の実施形態では、前記心血管疾患は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、狭心症、冠状動脈性心疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧、心血管インターベンション術による血栓形成から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記糖尿病性血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性創傷治癒遅延の１つ又は複数である。

図１は、グルタミン酸によって引き起こされるＰＦＫＦＢ３の発現上昇に対するＹＣ－６の有意な阻害である。２００μＭ グルタミン酸で初代培養ニューロンを５分間及び１５分間刺激し、１０μＭ ＹＣ－６、対応する溶媒ＨＰ－β－ＣＤ及びＮＭＤＡ受容体遮断薬１０μＭ ＭＫ－８０１で２０分間プレインキュベートしたものを実験群、溶媒対照群及び陽性対照薬物群とした。タンパク質を回収した後にＰＦＫＦＢ３ウエスタンブロット解析を行った。 図２は、グルタミン酸によって引き起こされるＰＦＫＦＢ３の下流の解糖最終産物である乳酸の細胞内蓄積に対するＹＣ－６の有意な阻害である。２００μＭ グルタミン酸で初代培養ニューロンを１５分間刺激し、１０μＭ ＹＣ－６、対応する溶媒ＨＰ－β－ＣＤで２０分間プレインキュベートしたものを実験群、溶媒対照群及び陽性対照薬物群とした。細胞を回収した後に細胞内乳酸含有量を測定した。 図３は、ＯＧＤ－Ｒによって引き起こされる血管内皮細胞の損傷に対するＹＣ－６の有意な軽減である。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びラット血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ）は酸素－グルコース欠乏損傷を４時間与えた後、通常の培養条件に再酸素化して２４時間後に、ＬＤＨの検出及び分析を行った。ＹＣ－６を予防的に投与した細胞は、酸素－グルコース欠乏処理を行う前に、溶媒又は薬物（最終濃度１μＭ、３μＭ、１０μＭ）を１時間プレコートし、治療的投与は、再酸素化処理と同時に溶媒又はＹＣ－６（最終濃度１μＭ、３μＭ、１０μＭ）を与えることであった。 図４は、低酸素及びＬＰＳによって引き起こされるヒト肺胞上皮細胞の損傷に対するＹＣ－６の有意な軽減である。１μＭ、５μＭ、１０μＭの最終濃度でＹＣ－６を１時間プレインキュベートした後に、１０μＭ デキサメタゾンを薬物対照と、対応する量の２０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリンを溶媒対照とし、次に細胞に２０μｇ／ｍＬ ＬＰＳ及び１％Ｏ_２低酸素処理を２４時間行った。 図５は、ＬＰＳによって引き起こされる急性肺損傷に対するＹＣ－６の保護についての病理学的結果である。赤い矢印が肺胞及び間質性肺浮腫を示し、青い矢印が血管外側のゆるい病変組織を示し、黄色い矢印が炎症細胞浸潤を示し、緑の矢印が損傷した気管支粘膜上皮の脱落を示し、オレンジ色の矢印が肺胞うっ血を示す。黒いスケールバーは１００μｍを表す。 図６は、ＬＰＳ誘発性ラット急性肺損傷の病理学的スコアに対するＹＣ－６の有意な低下である。ｎ＝９又は１０であり、＊はｐ＜０．０５であり、＊＊はｐ＜０．０１であり、＊＊＊はｐ＜０．００１である。 図７は、急性低圧低酸素誘発性カニクイザル肺損傷モデルの作成プロセスである。３２０メートル（Ａ）、３０００メートル（Ｂ）、４５００メートル（Ｃ）、６０００メートル（Ｄ）、７５００メートルにおける２４時間（Ｅ）及び７５００メートルにおける４８時間（Ｆ）の低酸素及び薬物処理後、最後にカニクイザルの肺サンプルを採取した。注射器が投与時刻を示す。 図８は、急性低圧低酸素によって引き起こされるカニクイザルの肺血管のうっ血及び肺胞中隔の肥厚に対するＹＣ－６の阻害である。常圧正常酸素群（Ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ ｎｏｒｍｏｘｉａ、ＮＮ）、急性低圧低酸素群（Ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ、ＨＨ）、ＹＣ－６投与群（ＨＨ＋ＹＣ－６）であった。赤い矢印がうっ血して腫れた肺組織の血管の断面を示す。２行目の画像は１行目の画像の青枠領域の拡大図であり、２行目の赤枠は、黒枠領域をさらに拡大した図であった。黒いスケールバーは５００μｍを表し、赤いスケールバーは１００μｍを表す。 図９は、急性低圧低酸素によって引き起こされるカニクイザルの肺胞中隔の肥厚に対するＹＣ－６の有意な阻害についての統計分析である。ＮＮ（Ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ ｎｏｒｍｏｘｉａ）は、常圧正常酸素群で、ｎ＝３であり、ＨＨ（Ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ）は、急性低圧低酸素群で、ｎ＝５であり、ＨＨ＋ＹＣ－６は、ＹＣ－６投与群で、ｎ＝５であった。＊＊は、ＮＮとの比較で、ｐ＜０．０１であり、＃は、ＨＨ群との比較でｐ＜０．０５であった。 図１０は、急性低圧低酸素によって引き起こされるカニクイザルの肺胞腔におけるタンパク質ヒアリン膜の形成及び赤血球の漏出に対するＹＣ－６の阻害である。ＮＮ（Ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ ｎｏｒｍｏｘｉａ）は、常圧正常酸素群であり、ＨＨ（Ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ）は、急性低圧低酸素群であり、ＨＨ＋ＹＣ－６は、ＹＣ－６投与群であった。赤い矢印が肺胞腔内のタンパク質ヒアリン膜を示し、黒い矢印が肺胞中隔の線維性過形成を示し、青い矢印が肺胞腔内の赤血球を示す。黒いスケールバーは１００μｍを表す。 図１１は、急性低圧低酸素によって引き起こされるカニクイザルの肺組織の炎症性浸潤に対するＹＣ－６の阻害である。ＮＮ（Ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ ｎｏｒｍｏｘｉａ）は、常圧正常酸素群であり、ＨＨ（Ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ）は、急性低圧低酸素群であり、ＨＨ＋ＹＣ－６は、ＹＣ－６投与群であった。黒い矢印が肺胞間質の炎症細胞浸潤を示し、赤い矢印が肺胞腔内の炎症細胞浸潤を示し、青い矢印が脱落した肺上皮細胞を示す。黒いスケールバーは１００μｍを表す。 図１２は、酸素－グルコース欠乏－再酸素化／低酸素刺激下における血管内皮細胞のＮＲ４Ａ３タンパク質の発現に対するＹＣ－６の上方調節及び細胞損傷の軽減である。（ａ）は、通常培養、酸素－グルコース欠乏及び酸素－グルコース欠乏－再酸素化状態下のＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣ細胞におけるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルに対するウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）検出であった。溶媒又はＹＣ－６は再酸素化処理と同時に与えた。（ｂ）は、図ａと同じ処理下のＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣ細胞におけるＮＲ４Ａ３免疫蛍光染色の代表的な画像であった。スケールバーは５０μｍを表す。（ｃ）は、図ｂの処理のＮＲ４Ａ３平均蛍光強度に対する定量化であった。（ｄ）正常環境（常圧正常酸素）、低圧低酸素及び低圧低酸素＋ＹＣ－６条件下での非ヒト霊長類であるカニクイザルの肺組織のＮＲ４Ａ３／ＣＤ３１の蛍光二重染色の代表的な画像であった。白いスケールバーは１００μｍを表す。（ｅ）は、図ｄの処理におけるＣＤ３１信号と共局在するＮＲ４Ａ３の平均蛍光強度及びＣＤ３１の平均蛍光強度の定量であった。正常、低圧低酸素及び低圧低酸素＋ＹＣ－６のサンプル数は、それぞれ、３、５、５であった。図ｃ、図ｅの統計方法として一元配置分散分析を採用して統計分析を行い、テューキーの多重比較法を併用した。ｎ．ｓ．は、統計的有意差がないことを表し、＊＊は、Ｐが０．０１より小さいことを表し、＊＊＊は、Ｐが０．００１より小さいことを表す。 図１３は、酸素－グルコース欠乏－再酸素化によって引き起こされる血管内皮細胞のＮＲ４Ａ３のユビキチン化分解に対するＹＣ－６の阻害である。（ａ）は、通常培養、酸素－グルコース欠乏、酸素－グルコース欠乏－再酸素化及び酸素－グルコース欠乏－再酸素化＋ＹＣ－６処理下のＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣ細胞におけるＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡの相対発現量に対するリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検出である。溶媒又は１０μＭ ＹＣ－６は再酸素化処理と同時に細胞に与えた。（ｂ）は、通常培養、酸素－グルコース欠乏、酸素－グルコース欠乏－再酸素化及び酸素－グルコース欠乏－再酸素化＋異なる薬物処理下のＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣ細胞におけるＮＲ４Ａ３タンパク質発現量に対するウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）検出であった。ＣＨＸ、ＭＧ１３２及びＣＱは再酸素化処理の時に与えた。（ｃ）は、酸素－グルコース欠乏－再酸素化及び酸素－グルコース欠乏－再酸素化＋薬物処理後のＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾の変化に対する抗ユビキチン抗体の免疫沈降実験による検出であった。ＹＣ－６の使用濃度は１０μＭであり、ＭＧ１３２の使用濃度は１００ｎＭであった。図ａのＮＲ４Ａ３ ｍＲＮＡの相対発現量の統計方法として一元配置分散分析を採用して統計分析を行い、テューキーの多重比較法を併用した。ｎ．ｓ．は、統計的有意差がないことを表し、＊＊は、Ｐが０．０１より小さいことを表し、＊＊＊は、Ｐが０．００１より小さいことを表す。ＣＨＸは、シクロヘキシミドを表し、ＣＱは、クロロキンを表す。インプット（Ｉｎｐｕｔ）は、免疫沈降に使用される初期サンプルを表し、ＩＢは、ウエスタンブロット検出を表す。

本明細書で使用される用語「組成物」とは、治療の目的で所定の動物対象に投与するのに適する製剤を指し、少なくとも１つの薬学的活性成分、例えば、化合物を含む。任意選択で、前記組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。

用語「薬学的に許容される」は、対象物質には、理性的で慎重な医療従事者は被治療疾患又は症状及びそれぞれの投与経路を考慮すると、患者への当該物質の投与を避けるという特性がないことを表す。例えば、注射可能な物質の場合、一般にそのような物質は実質的に無菌であることが求められる。

本明細書で、用語「予防有効量」及び「治療有効量」は、対象物質とその量が、疾患又は障害の１つ又は複数の症状に対する予防、軽減若しくは改善、及び／又は被治療対象の生存に対する延長に効果的であることを表す。

本明細書で使用される「治療」は、疾患若しくは症状の程度若しくは合併症を軽減させ、又は疾患若しくは症状を解消させるために、本願の化合物又は薬学的に許容されるその塩を与えることを含む。本明細書で用語「軽減」は、症状の徴候又は症状の重症度が低下する過程を説明するために使用される。症状は解消せず軽減はしている場合がある。一実施形態では、本願の医薬組成物を与えると、徴候又は症状の解消につながる。

本明細書で使用される「予防」は、本願の化合物又は薬学的に許容されるその塩を与えて、特定の疾患、症状又は合併症の発生を防止又は阻止することを含む。

本明細書で使用される用語「Ｃ_１～１０」若しくは「Ｃ_３～１０」又は類似している表現とは、１から１０個又は３から１０個の炭素原子を有することを指す。例えば、Ｃ_１～１０アルキル基とは、１から１０個の炭素原子を有するアルキル基を指し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、デシル基などである。

本明細書で使用される用語「肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患」は、肺上皮細胞の損傷によって媒介される疾患、血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患、及び肺上皮細胞と血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を含む。

「式Ｉの化合物、その重水素化物、及び薬学的に許容される塩」
本発明の方法又は用途に適用される化合物は、式Ｉの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容されるその塩を含み、
（式Ｉ）
式中、Ｒ_１は、Ｈ、－ＣＮ、フッ素、塩素、Ｃ_１～１０アルキル基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルキル基、Ｃ_１～１０アルコキシ基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルコキシ基及びＣ_３～１０シクロアルキル基から選ばれる。式Ｉの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容されるその塩は、本明細書で「本発明の化合物」又は「前記化合物」とも呼ばれる。

一実施形態では、式中、Ｒ_１は、Ｈであり、即ち、前記化合物は、５α－アンドロスタ－３β，５，６β－トリオールであり（「ＹＣ－６」又は「ＹＣ６」と略称する）、その構造式は、式（ＩＩ）に示されるとおりである。
（式ＩＩ）

一実施形態では、Ｒ_１は－ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３で、前記化合物は、１７－プロピレン－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオールである。一実施形態では、Ｒ_１は－ＣＨ（ＣＨ_３）_２で、前記化合物は、１７－イソプロピル－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオールである。一実施形態では、Ｒ_１は－ＣＨ（ＣＨ_２）_３ＣＨ_３で、前記化合物は、１７－ブチル－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオールである。一実施形態では、Ｒ_１は－ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_３ＣＨ（ＣＨ_３）_２で、前記化合物は、コレスタン－３β，５α，６β－トリオールである。

本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態として製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩の所定の形態は、一塩、二塩、三塩、四塩などを含むが、それらに限定されない。薬学的に許容される塩は、その投与量と濃度において無毒である。生理学的効果の発揮が妨げられない限り、化合物の物理的特性を変えることによって、薬理学的使用に適するようにこのような塩を製造することができる。物理的特性の役立つ変化としては、経粘膜投与のための融点低下、及びより高い濃度での薬物投与のための溶解度増加を含む。

薬学的に許容される塩は、酸付加塩を含み、例えば、硫酸塩、塩化物、塩酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩、キナ酸塩を含む塩である。薬学的に許容される塩は、酸から得られてもよく、前記酸は、例えば、塩酸、マレイン酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、フマル酸、キナ酸である。

酸性官能基、例えば、カルボン酸又はフェノールが存在する場合に、薬学的に許容される塩は塩基付加塩も含み、例えば、ベンザチンベンジルペニシリン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、アンモニウム、アルキルアミン及び亜鉛を含む塩である。このような塩は、適切な対応する塩を使用して製造してもよい。

薬学的に許容される塩は、標準的な技術によって製造してもよい。例えば、遊離塩基形態の化合物を適切な溶媒、例えば、適切な酸を含む水溶液又は水－アルコール溶液に溶解し、次に溶液を蒸発して分離させる。別の例として、遊離塩基と酸を有機溶媒において反応させて塩を製造する。

例えば、特定の化合物が塩である場合に、当技術分野において得られる任意の適切な方法で薬学的に許容される所望の塩を製造してもよい。例えば、無機酸又は有機酸で遊離塩基を処理し、前記無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、類似している酸であり、前記有機酸は、例えば、酢酸、マレイン酸、コハク酸、マンデル酸、フマル酸、マロン酸、ピルビン酸、シュウ酸、グリコール酸、サリチル酸、ピラノシジル酸（ｐｙｒａｎｏｓｉｄｙｌ ａｃｉｄ）（例えば、グルクロン酸若しくはガラクツロン酸）、α－ヒドロキシ酸（例えば、クエン酸若しくは酒石酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸）、芳香族酸（例えば、安息香酸若しくはケイ皮酸）、スルホン酸（例えば、ｐ－トルエンスルホン酸若しくはエタンスルホン酸）又は類似体である。

同様に、特定の化合物が酸である場合に、任意の適切な方法で薬学的に許容される所望の塩を製造してもよい。例えば、無機塩基又は有機塩基で遊離酸を処理し、前記無機塩基又は有機塩基は、例えば、アミン（第一級アミン、第二級アミン若しくは第三級アミン）、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物又は類似体である。適切な塩の例は、アミノ酸（例えば、Ｌ－グリシン、Ｌ－リシン、Ｌ－アルギニン）、アンモニア、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、及び環状アミン（例えば、ヒドロキシエチルピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン）から誘導された有機塩、及びナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、アルミニウム、リチウムから誘導された無機塩を含む。

化合物の薬学的に許容される塩は、錯体として存在してもよい。錯体の例は、８－クロロテオフィリン錯体（例えば、ジメンヒドリナート：ジフェンヒドラミン８－クロロテオフィリンの１：１錯体）、様々なシクロデキストリン含有錯体を含む。

本発明は、当該化合物が使用された薬学的に許容される重水素化化合物又は他の非放射性によって置換された化合物も含む。重水素化とは、薬物活性分子の官能基における１つ若しくは複数又は全ての水素を同位体の重水素に置き換えたものであり、無毒で非放射性であり、また炭素－水素結合よりもさらに約６～９倍安定しており、代謝部位をブロックして薬物の半減期を延長できるため、治療用量が低下されるとともに、薬物の薬理活性に影響はないことから、優れた修飾方法と見なされる。

「医薬組成物」
本発明の別の態様において、有効量の式Ｉの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

本発明で「医薬組成物」とは、式Ｉの化合物と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を指し、前記化合物と薬学的に許容される担体は混合物の形態で組成物に存在している。前記組成物は一般にヒト対象の治療に使用される。また、他の動物対象における類似している又は同じ症状の治療にも使用できる。本明細書で、用語「対象」、「動物対象」及び類似している用語とは、ヒト、及びヒト以外の脊椎動物を指し、例えば、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類）、競技用動物及び商用動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、げっ歯類動物）、愛玩用動物（例えば、イヌ、ネコ）である。

適切な剤形は、部分的に用途又は投与経路（例えば、経口、経皮、経粘膜、吸入又は注射（非経口））によって決定される。そのような剤形は、当該化合物を標的細胞に送達できるものである。他の要因も当技術分野で知られており、毒性や化合物又は組成物の効果発揮を遅延させる剤形などの考慮事項を含む。

担体又は賦形剤は、組成物の製造に使用することができる。前記担体又は賦形剤として、化合物の投与を促進するものを選択できる。担体の例は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖（例えば、ラクトース、グルコース若しくはスクロース）、又はデンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール及び生理学的に適合する溶媒を含む。生理学的に適合する溶媒の例は、注射用水（ＷＦＩ）、無菌溶液、塩溶液、グルコースを含む。

静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経口、経粘膜、経直腸、経皮、吸入を含め、様々な経路によって組成物又は組成物の成分を投与することができる。一部の実施形態では、注射剤又は凍結乾燥注射剤であることが好ましい。経口投与の場合に、例えば、化合物は通常の経口投与剤形（例えば、カプセル、錠剤）、液体製剤（例えば、シロップ、エリキシル、濃縮ドロップ）として製剤化することができる。

経口投与用薬物製剤を得ることができ、例えば、組成物又はその成分を固体の賦形剤と組み合わせ、任意選択で粉砕することによって形成させた混合物、及び（必要ならば）適切な助剤を加えて顆粒に加工した混合物から、錠剤又は糖衣錠を得る。適切な賦形剤は、特に、フィラー（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールなどの糖）、セルロース製剤（例えば、コーンスターチ、小麦デンプン、メートルデンプン、ポテトスターチ、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン（ｐｏｖｉｄｏｎｅ））である。必要ならば、崩壊剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天若しくはアルギン酸又はそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））を加えてもよい。

オプションとして、注射用（非経口投与用）、例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内及び／又は皮下投与用のものを使用できる。注射用の場合に、本発明の組成物又はその成分は無菌の液体溶液として、好ましくは、生理学的に適合する緩衝液又は溶液、例えば、生理食塩水、ハンクス（Ｈａｎｋ）溶液又はリンガー（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液において調製される。また、組成物又はその成分は、固体の形態として調製され、使用直前に再び溶解又は懸濁されてもよい。凍結乾燥粉末として製造されてもよい。

経粘膜、局所又は経皮の方式で投与してもよい。経粘膜、局所又は経皮投与の場合は、配合において浸透されるバリアに適する浸透剤が使用される。そのような浸透剤は、当技術分野で一般に知られているもので、例えば、経粘膜投与の場合に、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を含む。また、アルキル（Ｃ_{１２～１４}）ジメチルベタインは浸透を促進するために利用できる。経粘膜投与の場合に、例えば、鼻スプレー又は坐剤（経直腸若しくは経膣）を利用できる。

標準的な手順によって、投与される様々な成分の有効量を決めることができ、考慮すべき要因として、例えば、前記化合物のＩＣ_５０、前記化合物の生物学的半減期、対象の年齢、大きさ、体重及び対象に関連する症状である。これらの要因と他の要因の重要性は、当業者に熟知されている。一般に、被治療対象への用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間であり、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間である。複数の用量にしてもよい。

本発明の組成物又はその成分は、同じ疾患に対する他の治療剤と組み合わせて使用されてもよい。組み合わせて使用するのは、これらの化合物と１種又は複数種の他の治療剤を異なる時間で投与すること、又はそのような化合物と１種若しくは複数種の他の治療剤を同時に使用することを含む。一部の実施形態では、本発明の１種若しくは複数種の化合物又は組み合わせて使用される他の治療剤の用量を変えてもよく、例えば、当業者の知っている方法で、単独で使用する化合物又は治療剤の用量を低減する。

なお、組み合わせての使用又は併用は、他の療法、薬物、医療処置などと共に使用することを含み、当該他の療法又は処置は、本発明の組成物又はその成分の投与と異なる時間で（例えば、短期間内に（例えば、数時間（例えば、１、２、３、４～２４時間）又は長い期間内に（例えば、１～２日間、２～４日間、４～７日間、１～４週間））、又は本発明の組成物若しくはその成分と同じ時間に投与されてもよい。組み合わせての使用は、１回限りの又は頻度の高くない投与療法又は医療処置（例えば、手術）と共に用いられ、且つ当該他の療法又は処置の前に又はその後の短い期間又は長い期間内に本発明の組成物若しくはその成分が投与されることを含む。一部の実施形態では、本発明は、本発明の組成物又はその成分と１種又は複数種の他の治療薬を送達するために利用され、それらは同じ又は異なる投与経路によって送達される。

いずれの投与経路で組み合わせて投与することは、同じ投与経路で本発明の組成物又はその成分と１種又は複数種の他の治療薬を、任意の製剤の形態で同時に送達することを含み、当該製剤は、化学的に結合された２種の化合物が投与時にそれぞれの治療活性が保持されるようなものを含む。一態様では、当該他の薬物療法は、本発明の組成物又はその成分と同時に投与されてもよい。同時に投与するように組み合わせて使用することは、合剤（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）又は化学的に結合された化合物の製剤の投与、又は短い期間内（例えば、１時間以内、２時間以内、３時間以内、あるいは２４時間以内）における２種又は複数種の独立した製剤形態の化合物の投与を含み、それらは同じ又は異なる経路で投与される。

独立した製剤の同時投与は、同一の装置、例えば、同一の吸入装置、注射器などでの送達により同時に投与すること、又は互いに短い間隔で異なる装置で投与することを含む。同じ投与経路により送達される本発明の化合物と１種又は複数種の追加の薬物療法による合剤は、同一の装置から投与されるように材料を同時に調製したもの、異なる化合物が１つの製剤に組み合わされたもの、又は化合物が化学的に結合されていてもそれぞれの生物学的活性が保持されるように修飾されたものを含む。そのような化学的に結合された化合物は、２つの活性成分を分離させるリンカーを含んでもよく、当該リンカーは、生体内で実質的に維持されるもの、又は生体内で分解されるものである。

「医薬用途と治療法」
本発明の一態様において、肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療するための薬物の製造における前記いずれかの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩の使用を提供する。一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺水腫、肺線維症、早産児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、ニューモシスチス肺炎及び肺塞栓症から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされ、ただし低酸素によって引き起こされるのではない。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。一部の実施形態では、前記急性肺損傷は、手術によって引き起こされる肺損傷であり、前記手術は、例えば、縮小手術、肺葉切除術又は肺全摘術などの肺切除術、肺腫瘍切除術又は肺移植術である。一部の実施形態では、前記肺線維症は、特発性肺線維症又はじん肺である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性呼吸窮迫症候群である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺高血圧症である。

一部の実施形態では、前記血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、血液脳関門の破壊（又は損傷）によって媒介される脳小血管病を含み、ただし微小脳出血、脳卒中、脳浮腫を含まない。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の透過性亢進として現われる。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の血管内皮細胞の損傷として現われる。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の臨床症状は、認知障害、歩行障害、気分障害、尿失禁及び／又はうつ病である。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変を含む。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変だけである。

一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、心血管疾患又は糖尿病性血管合併症である。一部の実施形態では、前記心血管疾患は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、狭心症、冠状動脈性心疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧、心血管インターベンション術による血栓形成から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記糖尿病性血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性創傷治癒遅延の１つ又は複数である。

本発明の一態様において、予防上又は治療上の有効量の本発明のいずれかの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩を必要とする対象に投与することを含む、肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療する方法を提供する。一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺水腫、肺線維症、早産児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、ニューモシスチス肺炎及び肺塞栓症から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされ、ただし低酸素によって引き起こされるのではない。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。一部の実施形態では、前記急性肺損傷は、手術によって引き起こされる肺損傷であり、前記手術は、例えば、縮小手術、肺葉切除術又は肺全摘術などの肺切除術、肺腫瘍切除術又は肺移植術である。一部の実施形態では、前記肺線維症は、特発性肺線維症又はじん肺である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性呼吸窮迫症候群である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺高血圧症である。

一部の実施形態では、前記血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、血液脳関門の破壊（又は損傷）によって媒介される脳小血管病を含み、ただし微小脳出血、脳卒中、脳浮腫を含まない。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の透過性亢進として現われる。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の血管内皮細胞の損傷として現われる。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の臨床症状は、認知障害、歩行障害、気分障害、尿失禁及び／又はうつ病である。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変を含む。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変だけである。

一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、心血管疾患又は糖尿病性血管合併症である。一部の実施形態では、前記心血管疾患は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、狭心症、冠状動脈性心疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧、心血管インターベンション術による血栓形成から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記糖尿病性血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性創傷治癒遅延の１つ又は複数である。

本発明の別の態様において、肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療するための本発明のいずれかの化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩を提供する。一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症、肺水腫、肺線維症、早産児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、ニューモシスチス肺炎及び肺塞栓症から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされる。一部の実施形態では、前記急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺高血圧症又は肺水腫は、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷及び／又は中毒によって引き起こされ、ただし低酸素によって引き起こされるのではない。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス（例えば、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。一部の実施形態では、前記急性肺損傷は、手術によって引き起こされる肺損傷であり、前記手術は、例えば、縮小手術、肺葉切除術又は肺全摘術などの肺切除術、肺腫瘍切除術又は肺移植術である。一部の実施形態では、前記肺線維症は、特発性肺線維症又はじん肺である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性呼吸窮迫症候群である。好ましい実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、肺高血圧症である。

一部の実施形態では、前記血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、血液脳関門の破壊（又は損傷）によって媒介される脳小血管病を含み、ただし微小脳出血、脳卒中、脳浮腫を含まない。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の透過性亢進として現われる。一部の実施形態では、前記血液脳関門の破壊は、血液脳関門の血管内皮細胞の損傷として現われる。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の臨床症状は、認知障害、歩行障害、気分障害、尿失禁及び／又はうつ病である。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変を含む。一部の実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病の画像所見は、脳白質病変だけである。

一部の実施形態では、前記肺上皮細胞及び／又は血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、心血管疾患又は糖尿病性血管合併症である。一部の実施形態では、前記心血管疾患は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、狭心症、冠状動脈性心疾患、虚血性心疾患、心不全、高血圧、心血管インターベンション術による血栓形成から１つ又は複数選ばれる。一部の実施形態では、前記糖尿病性血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、糖尿病性創傷治癒遅延の１つ又は複数である。

「疾患又は症状」
「急性肺損傷／急性呼吸窮迫症候群（ＡＬＩ／ＡＲＤＳ）」
急性肺損傷（ＡＬＩ）は、肺の炎症と肺微小血管の透過性亢進による急性又は進行性の低酸素性呼吸不全であり、その最終的な段階は急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。急性肺損傷を引き起こす要因は様々であり、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷、中毒などを含むが、それらに限定されない。例えば、感染性肺炎（例えば、細菌性肺炎又はウイルス性肺炎）における又はそれによって引き起こされる急性肺損傷／急性呼吸窮迫症候群である。例えば、新型コロナウイルス感染による肺炎（Ｃｏｒｏｎａ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）の病態生理学的特徴として次のものが挙げられる。新型コロナウイルスは主に患者の肺を攻撃して、細胞性線維粘液性浸出液を伴うびまん性肺胞損傷を患者に引き起こすとともに、肺細胞の脱落とヒアリン膜の形成が見られる。これによって肺の通気／換気機能に深刻な影響を与え、急性呼吸窮迫症候群に発展している。臨床研究で、一部の患者はウイルス核酸検査が陰性になった後も、肺損傷が依然として長期的に存在し、ひいては一層悪化する場合もあるということを発見した。

ＡＬＩでは、肺血管内皮細胞の変化が特に顕著であり、血管内皮細胞の損傷はＡＬＩの発生、進行の病理学的根拠と見なされる。肺高血圧症（ＰＡＨ）は、様々な要因が引き起こすＡＬＩの早期の主な症状の１つである。ＰＡＨは間質性肺浮腫、肺出血、進行性呼吸困難を促進する可能性があり、肺血管内皮細胞の機能障害と損傷が、ＡＬＩ中のＰＡＨを形成させる主要な要因の１つでもある。血管内皮機能障害は血管変化より先に出現し、可逆的であるため、その発生と進行のルール及びその調節メカニズムを研究及び理解するのは、ＡＬＩの予防と治療に大きな意味を有する。

ＡＬＩ／ＡＲＤＳで死亡した患者では肺胞上皮細胞の破壊が非常に明らかなもので、肺毛細血管にもある程度の損傷があるが、上皮細胞の損傷が主であることが研究に裏付けられた。肺胞の液体－気体界面において、肺胞上皮細胞が肺胞内膜液に適切な水と溶質の含有量を維持させ、これはガス交換及び宿主におけるウイルスと細菌などの病原体への耐性にとっては極めて重要なことである。肺内に内皮の透過性変化が起これば、肺間質と肺胞腔内の浮腫液が最終的に除去され、肺線維症に発展せずに済む。逆に、大量の肺胞上皮細胞が損傷するとタンパク質の透過性が上昇し、肺胞液と肺胞からのタンパク質の除去率を低下させ、これが肺胞内での高分子量のタンパク質の凝集と無秩序な修復を引き起こし、ガス交換を悪化させてしまう。ＡＬＩ中に肺胞上皮の破壊が上皮細胞の脱落を引き起こすと、タンパク質を豊富に含む浮腫液が肺胞腔に浸潤して、肺胞バリアの破壊を加速させる。上皮細胞破壊の方式は、アポトーシス、ネクローシスを含む。ＡＲＤＳで死亡した患者及び高酸素環境、ＬＰＳ刺激、盲腸結紮と穿孔、虚血再灌流障害、人工呼吸器関連肺炎と人工呼吸器関連肺損傷動物モデルでは、いずれも肺胞壁にこの２つの方式の死亡が発見された。ネクローシスが細胞膜の破壊を引き起こすと、細胞質が流出し、さらに炎症反応につなげる。肺胞は機械的損傷、高温、虚血又は細菌産物からの刺激を受けるといずれもネクローシスが起こる。アポトーシスは細胞表面の細胞死受容体に関連しており、細胞によって除去すると軽度の炎症だけが起こる。広範な上皮細胞のアポトーシスと分離により細胞基底膜は肺胞腔の炎症性物質、例えば、酸化剤、プロテアーゼ及び炎症性因子にさらされる。上皮細胞破壊が引き起こす線維芽細胞の増殖とコラーゲン形成は、肺線維症を引き起こす可能性がある。損傷後の肺胞上皮の完全性修復は、上皮細胞の正常な機能の回復と肺水腫の除去に特に重要である。ＡＬＩ／ＡＲＤＳ患者自身において生成される又は肺胞腔に入る一部の因子が、上皮の修復を促進することが一連の研究に裏付けられた。これらの可溶性因子は、患者の肺内の線維芽細胞、マクロファージ、内皮細胞、上皮細胞、細胞外マトリックス、血漿滲出液から来ており、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、プロスタグランジン及び機能性成分を構成している。ＡＬＩ／ＡＲＤＳに関して多くの研究がなされているものの、患者の死亡率が高止まりしている。従来の薬物治療は効果が優れないため、ＡＲＤＳの治療では支持療法を主としている。ＡＬＩの重症度と進行を決める主な要因の１つは肺胞上皮の損傷程度である。上皮細胞の治療の観点から見ると、上皮細胞の早期損傷の阻害、上皮細胞の修復の加速、肺水腫の解消は、いずれも患者の生存率を高めるための効果的な措置である。

「特発性肺線維症（ＩＰＦ）」
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺胞上皮細胞の損傷と組織の異常な過形成によって引き起こされる肺疾患である。発生機序は様々な要因が肺胞上皮細胞の損傷を引き起こし、最終的に線維芽細胞の増殖と筋線維芽細胞の凝集を引き起こして、線維芽細胞病巣を形成させることであるということは、研究に裏付けられた。上皮細胞のアポトーシスは早期ＩＰＦの進行の重要な要因である可能性がある。炎症反応、細胞内張力、テロメラーゼ活性などの要因が肺胞上皮細胞のアポトーシスに関与しており、肺線維症の発生の初期段階で重要な役割を果たす。ＩＰＦの大きな病理学的特徴は、線維芽細胞の活発な増殖で形成している繊維性病巣である。線維芽細胞病巣は上皮細胞が損傷及び修復される部位で、上皮細胞損傷後に線維芽細胞の移動、増殖、分化を促す様々なメディエーターを分泌して、肺胞内の広範な繊維化を引き起こし、最終的に進行性呼吸困難が起こる。ＩＰＦの発生機序としては肺胞上皮細胞の損傷後の異常な再上皮化と線維芽細胞の異常な増殖が考えられる。ＩＰＦにおける細胞の死亡は上皮細胞損傷後のアポトーシスとして現れ、疾患の発生で重要な役割を果たす。肺上皮細胞のアポトーシスを誘発するのは肺組織の繊維化を引き起こすことが研究に裏付けられた。肺胞上皮細胞の損傷は肺線維症の発生の最初の要因として現在学者に最も受け入れられている理論的な仮説であり、肺胞上皮細胞のアポトーシスを標的として低下させる薬物はＩＰＦの防止のため新しい治療法を提供できるのだろう。肺組織における好気性解糖が肺線維症に密接に関係していることが研究で明らかになっている。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０２０）では、ＰＦＫＦＢ３阻害剤３ＰＯが、ＬＰＳ誘発性肺線維症マウスモデルにおいてＰＦＫＦＢ３発現の有意な上方調節と好気性解糖の増加を逆転できることを発見した。

「じん肺」
じん肺は、生産粉塵の長期吸入によって引き起こされる、肺組織の不可逆的な繊維化を主とする全身疾患である。現在、じん肺に対する効果的な治療法はまだなく、粉塵が肺線維症を引き起こす病理学的な過程で、一部の肺胞上皮細胞が異常に活性化し、損傷とアポトーシスも見られ、上皮細胞の修復障害、線維化促進因子放出及び上皮間葉転換（ＥＭＴ）などの過程が、線維芽細胞病巣と筋線維芽細胞病巣の形成及び細胞外マトリックスの大量生成を促進し、最終的に肺胞構造の破壊と肺線維症を引き起こす。

「高酸素肺損傷」
高酸素肺損傷は、びまん性肺細胞損傷による、速やかにガス交換に影響を与える炎症性肺疾患である。高酸素肺損傷は、常圧下体積分率が２１％より高い高分圧酸素又は１絶対気圧より高い高圧酸素を吸い込むことで発生した、肺酸素中毒をはじめとする急性及び慢性の肺損傷の総称である。新生児、特に早産児では、抗酸化酵素系と肺サーファクタントが完全に発達していないため、高酸素が肺に入った後、酸素フリーラジカルが発生し、細胞損傷、アポトーシス、ネクローシスを引き起こすと同時に、炎症メディエーター、炎症細胞浸潤が発生し、肺炎症反応、組織損傷と異常な修復を引き起こす。高酸素は肺胞上皮細胞の酸化的損傷を引き起こし、肺胞化の進行を阻害し、広範な肺胞上皮細胞の損傷と損傷修復能力の低下で血液空気関門の透過性が明らかに向上して肺水腫が起こり、ＡＬＩの発生を促進する。

「早産児慢性肺疾患」
早産児慢性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＬＤ）は、早産児における高濃度酸素の長期吸入又は人工呼吸器治療又は感染後の最も一般的で深刻な合併症である。早産児ＣＬＤは、気管支肺異形成症（ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｙｓｐｌａｓｉａ、ＢＰＤ）とも呼ばれ、早産児ヒアリン膜疾患の治療の合併症として１９６７年にＮｏｒｔｈｗａｙによって最初に説明された。酸素療法は、心肺疾患を有する早産児に最も用いられる治療手段の１つである。これは患児の低酸素血症を改善し、患児の命を救うことができるが、高濃度酸素の長期吸入が、異なる程度の肺損傷を引き起こす可能性があり、深刻な場合にＣＬＤにも発展している。人工呼吸器の広範な開発、早産児管理技術が日ごとに高度化し肺サーファクタントが一般的に用いられることにより、早産児、特に極低出生体重児（ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＥＬＢＷ、出生体重が１０００ｇ未満の産児）の生存率が明らかな改善されているが、早産児慢性肺疾患の発生率が高まり、海外では３０～４０％に達しており、国内でも上昇する傾向にある。効果的な監視及び予防と治療手段が欠如しているため、ＣＬＤ患児の１０～１５％が深刻な肺機能障害により呼吸不全で死亡し、生存している者でも酸素又は人工呼吸器での治療に長期的に依存している。初期の肺胞上皮細胞（ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＡＥＣ）損傷と晩期の肺線維症は、ＣＬＤの主な病理学的特徴である。現在、ＡＥＣ損傷の程度を軽減させ又は肺組織におけるコラーゲンの沈着を減少することによってＣＬＤの効果的な防止の目的を達成するために多くの試みが行われている。

「慢性閉塞性肺疾患」
慢性閉塞性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＯＰＤ）は、世界中の呼吸器疾患の中でも発生率と死亡率が上位に来る疾患であり、その発生がさらに拡大している。喫煙はＣＯＰＤの主な原因であることが知られており、タバコ煙（ｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ、ＣＳ）は酸化剤成分を豊富に含む複雑な混合物であり、肺を構成する様々な細胞種のうち、肺胞上皮細胞がＣＳ中の酸化剤の損傷を受ける主な部位である。ＣＯＰＤ患者の肺胞上皮細胞のアポトーシス指数が肺血管内皮細胞のアポトーシス指数より明らかに高く、しかも両者が正の相関にあることが研究で示されている。内皮細胞の損傷とアポトーシスが最初に肺胞構造の完全性を破壊し、後には肺胞上皮細胞の損傷又はアポトーシスが出現する可能性がある。内皮細胞が損傷又はアポトーシスした後、直接的な細胞間相互作用と間接的な特定のメカニズムによって、他の細胞、特に肺胞上皮細胞のアポトーシスを開始及び誘発させることによって、ＣＯＰＤと肺気腫が発生する可能性がある。さらに、ＣＯＰＤ患者は血管内皮機能障害を有しており、疾患の重症度とも相関性がある。血管内皮細胞の機能異常はＣＯＰＤの発生、進行とも密接な関係がある。炎症、血管損傷、血行動態の変化、低酸素、酸化ストレス、アポトーシスなどが血管内皮細胞機能障害を促進できる。ＣＯＰＤ早期でも、あるいは肺機能が正常な健康な喫煙者においても、血管内皮細胞機能が既に変化していることが研究で示されている。血管内皮細胞機能の異常な変化は、ＣＯＰＤの発生、進行及び関連する心血管イベントの高発生率に重要な役割を果たすという可能性がある。

「ニューモシスチス肺炎」
ニューモシスチス肺炎は、ニューモシスチス・イロベチイによって引き起こされる間質性肺炎（ニューモシスチス肺炎、ＰＣＰ）であり、主な臨床症状は発熱、空咳、進行性呼吸困難などである。酸素吸入だけでは緩和できず、対症療法で速やかに回復し、免疫機能が低下する者に多発し、ＡＩＤＳ患者で発生率が７０～８０％に達している。ニューモシスチス・イロベチイの病原性が弱く、健常者の場合は不顕性感染が多く、宿主の免疫機能が低下する時にだけ、潜伏しているニューモシスチス・イロベチイが大量に増殖し、ＰＣＰが発生する。下気道に吸入されるニューモシスチス・イロベチイは直接Ｉ型肺胞上皮細胞の損傷とネクローシスを引き起こし、肺胞毛細血管の透過性亢進が起こり、肺胞がニューモシスチス・イロベチイと泡状好酸性物質に満たされることで、肺サーファクタントが減少し、ガス交換に影響を与え、低酸素血症（ＰＣＰ患者の最も重要な特徴）が発生する。ＩＩ型肺胞上皮細胞の代償性肥大、肺胞中隔の上皮細胞過形成、肥厚、部分的脱落が起こると同時に、間質内にマクロファージと形質細胞が過形成され、間質が線維化することで、深刻な肺機能障害が起こる。

「肺塞栓症」
肺塞栓症は、脱落した血栓又は他の物質が肺動脈又はその分岐を塞ぐ病理学的過程であり、発生率と死亡率が高い一般的な疾患である。血管内皮細胞の損傷は、肺塞栓症を引き起こす一番の要因である。内皮細胞は微粒子、組織因子などの生体分子によって血小板と好中球に働きかけることで、血栓形成に関与する。血管内皮細胞の損傷と修復は肺塞栓症において重要な役割を有するため、肺塞栓症の発生、進行のメカニズムに関する研究が、内皮細胞の損傷と修復に関する分子的、細胞学的、病理学的検討に重きが置かれるようになる。

「心血管疾患」
血管内皮細胞の損傷は、多くの心血管疾患の発生と進行に関連しており、血管内皮損傷によって誘発される血栓形成は多くの心血管疾患の病理学的根拠である。最初には亜急性心内膜炎患者の末梢血から脱落した血管内皮細胞が発見され、研究が深まるにつれて、多くの心血管疾患では程度の差があるがいずれも循環内皮細胞の変化が発見された。急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と狭心症患者では、循環内皮細胞の明らかな増加が数日間持続する。冠状動脈性心疾患の急性発作と悪化の原因は内皮細胞が損傷した後に機能が変化することであり、血管内皮細胞の損傷の程度は疾患の重症度に一致している。国内の研究で、虚血性心疾患でＡＭＩが４６時間発生しているところ、健常者より循環内皮細胞が明らかに増加することが２４時間も持続していることを発見した。再灌流時の損傷も循環内皮細胞の増加を引き起こす。冠状動脈性心疾患が心不全（ＣＨＦ）などの他の危険因子を合併したとき、循環内皮細胞が明らかに増加する。ＣＨＦが重いほど、血管内皮損傷が明らかであり、血管内皮損傷が疾患を悪化させることも研究で判明した。さらに、内皮細胞損傷によって引き起こされる機能障害が高血圧に密接に関係しており、血管内皮機能障害は高血圧の発生と進行で重要な役割を果たし、また、高血圧自体が血管内皮機能障害を悪化させることで、悪循環を生み出すということも多くの研究で明らかになっている。高血圧ラットの内皮細胞は損傷した臓器の血液で明らかに増加し、高血圧患者では循環内皮細胞が健常者より明らかなより高く、増加している部分が冠状動脈性心疾患の患者を上回っている。心血管インターベンションの場合、主に血管内皮を机械的に刺激することで、損傷をもたらす。術式によって血管内皮への損傷の程度が異なる。血管内皮細胞が損傷する時に内皮機能障害が起こり、血行動態が変化し、これによって多くの重合誘発物質と血管作動性物質を損傷血管の局所に蓄積させて、血小板が活性化することが、心血管インターベンション術による血栓形成の主な病態生理学的メカニズムである。

「糖尿病性血管合併症」
慢性高血糖か急性高血糖を問わず、いずれもヒトと動物の内皮機能に損傷をきたすことが研究に裏付けられた。血管内皮機能障害は糖尿病性血管合併症（特に網膜症、腎疾患、創傷治癒障害）の発生の重要な原因であり、血管内皮機能の変化が糖尿病の他の発生機序の重要な要因でもあり、その表現は主にインスリン抵抗性、脂肪毒性、インスリン分泌障害である。現在、血管内皮機能損傷は糖尿病血管病変の発生の開始要因と主な病態生理学的基礎であると考えられ、慢性血管合併症が現れてもいない糖尿病患者には既に内皮機能の明らかな低下が出現している。

「脳小血管病」
脳小血管とは、脳内の小さな穿通動脈、小動脈（直径４０～２００μｍ）、毛細血管及び小静脈を指し、それらが脳組織への血液供給の基本単位を構成し、脳機能の維持に重要な役割を果たす。脳内の大血管と小血管が共に脳血管樹（ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｒｅｅ）を構成し、それが構造的に連続しているため、共に血行力学的な影響を受け、共に危険因子にさらされる。したがって、理論的には、脳内の大血管と小血管の病変は重症度において相関性があると考えられる。しかし、臨床では両者が一致しないものがよく見られ、例えば、深刻な脳小血管病変はあるが脳大動脈狭窄を合併しない患者が多く見られ、逆の場合も同様である。

脳小血管病（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｓｍａｌｌ ｖｅｓｓｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＣＳＶＤ）とは、一般に上記の小血管の様々な病変によって引き起こされる臨床的、認知的、画像学的及び病理学的な所見を有する症候群を指す。小さな穿通動脈及び小動脈病変によって引き起こされる臨床的及び画像学的所見を指す場合が多い。ＣＳＶＤは、主に卒中（脳深部の小さな梗塞、脳出血）、認知及び気分障害並びに全身的な機能低下が顕著な臨床的所見であり、画像学では所見として主にラクナ梗塞（ｌａｃｕｎａｒ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＬＩ）、ラクナ（ｌａｃｕｎｅ）、大脳白質病変（ｗｈｉｔｅ ｍａｔｔｅｒ ｌｅｓｉｏｎｓ、ＷＭＬ）、血管周囲腔の拡大（ｅｎｌａｒｇｅｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｓｐａｃｅ、ＥＰＶＳ）及び微小脳出血（ｃｅｒｅｂｒａｌ ｍｉｃｒｏｂｌｅｅｄｓ、ＣＭＢ）などである。

脳小血管病の影響は小動脈、毛細血管、小静脈に及び、穿通動脈に及んでいるのが最も一般的である。高血圧、血管炎症又は遺伝的欠陥によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷、平滑筋過形成、小血管壁の基底膜の肥厚はいずれも慢性脳組織虚血を引き起こす。血管平滑筋細胞の損失と過形成、血管壁肥厚、血管内腔狭窄が慢性又は進行性の局所あるいはびまん性無症候性虚血、神経細胞の脱髄、希突起膠細胞の損失、軸索の損傷を引き起こして、不完全な虚血をきたす。この段階では臨床症状がなく、核磁気共鳴検査で脳白質病変と提示する。さらに、またいくつかの研究結果から、内皮が損傷すると血管透過性亢進により血管内の物質が遊出し、血管及び血管周囲組織の損傷を引き起こすのは、この段階における疾患の進行にも重要な役割を果たすことが示されている。

本開示では、前記血管内皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、血液脳関門の破壊又は損傷によって媒介される脳小血管病を含み、ただし微小脳出血、脳卒中、脳浮腫を含まない。本発明の特に好ましい実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病は、脳白質病変を含む。本発明の特に好ましい実施形態では、血液脳関門の破壊によって媒介される脳小血管病は、脳白質病変としてだけ現われる。

実施例１：グルタミン酸によって引き起こされるＰＦＫＦＢ３の発現の上方調節に対するＹＣ－６の有意な迅速阻害
ホスホフルクトキナーゼ－２／フルクトース－２，６－ビスホスファターゼ３（ｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅ－２／ｆｒｕｃｔｏｓｅ－２，６－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ３、ＰＦＫＦＢ３）の発現上昇とその下流産物である乳酸の蓄積が、急性肺損傷、肺高血圧症などの様々な肺疾患で病理学的損傷という役割を果たすことが研究で明らかになっている。急性肺損傷、肺高血圧症などの疾患の発生と進行で病理学的損傷という重要な役割を果たす。肺損傷にとって重要な分子であるＰＦＫＦＢ３タンパク質レベルに対するＹＣ－６の影響を分析したところ、ＹＣ－６がＰＦＫＦＢ３タンパク質の発現の上方調節と乳酸の蓄積を迅速に阻害するという予期せぬ結果が得られ、これはＹＣ－６による肺保護に関する独特なメカニズムであるかもしれないということを示唆している。

初代小脳顆粒ニューロンの培養：
ＳＤ Ｐ７－８新生児マウスから細胞を採取して、小脳を取り出し、さらにマイクロピンセットを使って髄膜と血管を除去した。分離させた小脳組織を解剖液の入った別のシャーレに移した。メイヨー剪刀を使って最大限に組織をせん断した。次のとおりに消化を行った。スポイトを使ってせん断した組織を７ｍＬの０．２５％トリプシン消化液に入れ、３７℃で１５分間消化した。細胞スーパークリーンベンチの作業台を整えて器具を洗浄した。５分間ごとに数回ひっくり返して組織と消化液をより充分に接触させた。次のとおりに消化を停止させた。消化が終了すると、細胞の破砕によりＤＮＡが放出することで組織がくっついて液体に懸濁しているのが見えた。デオキシリボヌクレアーゼ含有１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を３ｍＬ加えて消化を停止させ、数回ひっくり返すとＤＮＡの加水分解で残りの組織が分散していることが観察された。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。慎重に上清を取り除いた。次のとおりに単一細胞懸濁液を回収した。スポイトを使ってデオキシリボヌクレアーゼ含有１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭ培地を７ｍＬ吸い上げ、組織ペレットを軽くピペッティングした。急速遠心分離にかけて回転数が１５００ｒｐｍになったら停止させ、単一細胞懸濁液を新しい１５ｍＬ遠心管に回収した。次のとおり細胞を播種した。１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞ペレットを回収し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を再懸濁させた。ハンディ型セルカウンターでカウントし、播種密度は４．０～５．０×１０^５個／ｍＬであった。３５ｍｍシャーレへの播種量は２ｍＬであり、４８ウェルプレートへの播種量は３００μＬであった。次のとおりに細胞を播種及び培養した。播種２４時間後、膠細胞の成長を阻害するためにシタラビン（最終濃度１０μＭ）を補足した。７日目に栄養を維持するためにグルコース（５ｍＭ）を補足し、８日目に使用した。グルタミン酸誘発性初代小脳顆粒ニューロン損傷モデル及び薬物で処理した。

細胞処理と投与：
６ウェルプレートに播種した初代小脳顆粒ニューロンの培地を２ｍＬのクレブス緩衝液（ｋｒｅｂ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）に交換し、これを正常対照群とした。最終濃度が２００μＭのグルタミン酸を加えて所定の時間即ち５分間及び１５分間処理し、これをモデル群とした。前もって１０μＭ ＹＣ－６又はＮＭＤＡ受容体遮断薬ＭＫ－８０１を２０分間プレインキュベートし、次に前記濃度のグルタミン酸を加え所定の時間で処理して、薬物処理群とした。薬物処理群と等量の溶媒ＨＰ－β－ＣＤを加えて溶媒対照群とし、そのプレインキュベート時間は薬物処理群と同じであった。

タンパク質ウエスタンブロット：
体積分率が１２％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルを調製し、１ウェル当たりロードするタンパク質の総量が２０μｇでサンプルを注入し、１００Ｖ定電圧下で電気泳動により分離させた。後に湿式転写法によりＰＶＤＦ膜に移した。５％脱脂粉乳で室温下１時間ブロックした。希釈後の一次抗体（抗体希釈液は３％ＢＳＡ、抗体希釈比は１：１０００）を加え、４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄し、１回当たり５分とし、対応する二次抗体（抗体希釈液は３％ＢＳＡ、抗体希釈比は１：５０００）を加えて、室温下で１時間インキュベートして、ＴＢＳＴで３回洗浄し、１回当たり５分とした。化学発光法により発色させ、露光して撮影した。

ＹＣ－６は、グルタミン酸によって引き起こされるＰＦＫＦＢ３の発現の上方調節を有意かつ迅速に阻害する。
図１に示されるとおり、正常対照群と比べ、グルタミン酸の刺激が細胞内のＰＦＫＦＢ３発現の急速な上方調節を引き起こし、ＹＣ－６処理はそのような急速な上昇を有意に阻害した。

実施例２：肺上皮損傷における重要な代謝分子である乳酸に対するＹＣ－６の作用
乳酸は嫌気性解糖産物であり、ＰＦＫＦＢ３によって調節される代謝経路の下流であり、肺上皮細胞に直接的な損傷を与える。Ｇｏｎｇ Ｙらの研究では、インビトロでＬＰＳがヒト肺胞上皮Ａ５４９細胞のアポトーシス、炎症性サイトカインの生成、解糖フラックスの強化と活性酸素種（ＲＯＳ）の増加を引き起こし、これらの変化がＰＦＫＦＢ３阻害剤３ＰＯによって逆転されることが判明した。さらに重要なのは、乳酸は肺損傷をきたす重要な代謝産物でもあり、乳酸でＡ５４９細胞を処理するとアポトーシスとＲＯＳの増加をきたす。これらの結果は、嫌気性解糖が敗血症関連ＡＬＩで肺上皮細胞のアポトーシス損傷の重要な要因であるかもしれないということを示している。ＹＣ－６がＰＦＫＦＢ３の発現を阻害することを踏まえ、ＹＣ－６がその下流にあり肺上皮細胞に損傷効果を有する乳酸レベルに与える影響を検討した。結果は、ＹＣ－６は解糖のための重要な酵素ＰＦＫＦＢ３を阻害すると同時に、乳酸の蓄積を有意に阻害することを示している。乳酸の蓄積への軽減はＹＣ－６が肺上皮細胞の損傷を軽減させるメカニズムの１つであるかもしれない。

細胞内乳酸測定：
次のとおりに前処理を行った。細胞内乳酸含有量の測定で使用する細胞量は（１～２）×１０^６であった。細胞前処理の実験ステップは具体的には次のことを含む。予冷したクレブス緩衝液（Ｋｒｅｂ’ｓ ｂｕｆｆｅｒ）で細胞を３回洗浄した。２２０μＬの細胞溶解液を加えて細胞を充分に溶解させた。次に、溶解液を１．５ｍＬ ＥＰ管に回収した。４℃×１６０００ｇの条件で５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を新しいＥＰ管に回収し、残りの上清はＢＣＡタンパク質定量に使った。５６μＬの４ｍＭ ＨＣｌＯ_４を加えて、ひっくり返して充分かつ均一に混合させ、氷の上で５分間反応させてサンプル自体に存在しているＬＤＨを除去することで、内因性干渉を防止し、当該ステップでは管の底部に白いタンパク質の沈殿が観察されるはずである。４℃×１６０００ｇで５分間遠心分離した。１６０μＬの上清を回収して、新しいＥＰ管に入れた。６８μＬの２ｍＭ ＫＯＨを加えてひっくり返して充分かつ均一に混合させ、氷の上で５分間反応させた。４℃×１６０００ｇの条件で１５分間遠心分離し、１６０μＬの上清を新しいＥＰ管に回収し、上清に白いフロックがあれば、再度１５分間遠心分離した。希釈倍率６００～８００で上清を細胞溶解液で希釈して、当該希釈液を被検サンプル液として保持した。

細胞内乳酸含有量の測定方法は、Ｌ－乳酸アッセイ（Ｌ－Ｌａｃｔａｔｅ Ａｓｓａｙ）キット（ａｂｃａｍ、ａｂ６５３３１）取扱説明書に従って実行した。ステップとして具体的には、５０μＬの希釈液を９６ウェル黒底細胞培養プレートに加え、直ちに等量のＬＤＨＡ含有基質溶液を加え、振とうして均一に混合させた後に３７℃の二酸化炭素不含インキュベータに静置して３０分間インキュベートした。マイクロプレートリーダを用いて、励起光波長５３５ｎｍの暗所で蛍光強度を測定した。サンプルから読み取った蛍光強度を異なる標準品乳酸濃度に対応する蛍光強度の標準曲線に代入して、蛍光強度をサンプル液中の乳酸の実際の濃度に変換した。

ＹＣ－６は、グルタミン酸によって引き起こされるＰＦＫＦＢ３の下流の解糖最終産物である乳酸の細胞内蓄積を有意に阻害する。
初代小脳顆粒ニューロン細胞を２００μＭ グルタミン酸に入れて１５分間刺激した後に細胞溶解液を回収して解糖産物である乳酸に対するＹＣ－６処理の影響を研究し（図２）、グルタミン酸で１５分間刺激した後にニューロン細胞内乳酸含有量が有意に増加し、ＹＣ－６処理はそのような増加を阻害した。上記の実験結果が、ＹＣ－６は解糖のための重要な酵素ＰＦＫＦＢ３を阻害すると同時に、乳酸の蓄積を有意に阻害することを示している。

実施例３：血管内皮細胞の損傷に対するＹＣ－６の有意な軽減
肺血管内皮細胞は血管系内膜の単層を形成させており、その生理学的位置が細菌性エンドトキシン、ＬＰＳ、炎症性因子（例えば、ＴＮＦ－α）、有毒化学物質、酸化ストレスなどの直接的な刺激にさらされているため、内皮細胞の損傷とアポトーシスをきたす。肺血管内皮細胞が損傷されると毛細血管の透過性亢進を引き起こして肺水分量を増加させることで、肺水腫、呼吸困難が発生する。同時に肺血管内皮細胞が様々な炎症性メディエーター、サイトカインを分泌及び放出することによって、炎症誘発性メディエーターと抗炎症性メディエーター、凝固系と抗凝固系のバランスが崩れ、肺微小循環障害と肺高血圧症が引き起こされると、間質性肺浮腫、肺出血、進行性呼吸困難が促進され、患者には進行性低酸素血症と呼吸困難が現れる可能性がある。ＹＣ－６が血管内皮細胞の損傷に保護効果があるかどうかを評価するために、酸素－グルコース欠乏／再酸素化（ｏｘｙｇｅｎ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ、ＯＧＤ－Ｒ）損傷モデルを用いて、細胞からのＬＤＨ放出の検出によって予防的及び治療的投与後の細胞損傷状況を評価した。結果は、ＹＣ－６が用量依存的に血管内皮細胞の損傷を有意に軽減し、様々な病理学的要因によって引き起こされる血管内皮細胞関連の肺損傷の過程でＹＣ－６は効果的な保護効果を発揮できることを示唆している。

細胞培養：
１０％ウシ胎児血清含有改良型ＤＭＥＭ培地でＨＵＶＥＣ細胞を培養し、細胞が約８０％コンフルエントに成長した時に、０．２５％トリプシンで細胞を消化し、次に１０％ウシ胎児血清含有改良型ＤＭＥＭ培地で均一にピペッティングし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整して、４００μＬ／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、細胞が約７０％コンフルエントに成長した時に実験を行った。１０％ウシ胎児血清含有高グルコースＤＭＥＭ培地でＲＡＯＥＣ細胞を培養し、播種条件はＨＵＶＥＣと一致した。

酸素－グルコース欠乏－再酸素化（ＯＧＤ－Ｒ）損傷モデルの構築：
低酸素ワークステーションの酸素濃度を１％（１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９４％Ｎ_２）に、温度を３７℃に、湿度を８５％に設定した。グルコース不含ＤＭＥＭ培地を低酸素ワークステーションに入れて予め３時間低酸素にさらした。培養プレートから培地を吸い取って、予熱したグルコース不含ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、次に１ウェル当たり１００μＬのグルコース不含ＤＭＥＭ培地を加えて、培養プレートを低酸素ワークステーションに置き、さらに１ウェル当たり３００μＬの予め低酸素にさらしたグルコース不含ＤＭＥＭ培地を加え、次に、培養プレートを低酸素ワークステーションに置いて引き続き４時間低酸素にさらした。次に再酸素化処理を行い、培養プレートを取り出し、グルコース不含ＤＭＥＭ培地を４００μＬの１０％ウシ胎児血清含有通常培地に交換し、次に３７℃×５％ＣＯ_２セルインキュベータに置いて引き続き２４時間培養した。正常群の細胞は培地を４００μＬの新しい１０％ウシ胎児血清含有通常培地に交換しただけであった。

投与方法：
次のとおりに予防的投与を行った。細胞に酸素－グルコース欠乏処理を行う前に、溶媒又は薬物（最終濃度１μＭ、３μＭ、１０μＭ）を１時間プレコートし、次に酸素－グルコース欠乏処理の時に、グルコース不含ＤＭＥＭ培地に対応する溶媒又は薬物を加え、再酸素化処理の時に、通常培地に対応する溶媒又は薬物を加え、実験が終了するまで継続した。モデル対照群には何ら薬物処理も行わず、各処理群を３ウェルで繰り返した。

次のとおりに治療的投与を行った。細胞に酸素－グルコース欠乏処理を行った後、再酸素化処理と同時に、溶媒又は薬物（最終濃度１μＭ、３μＭ、１０μＭ）を与え、実験が終了するまで継続した。モデル対照群には何ら薬物処理も行わず、各処理群を３ウェルで繰り返した。

細胞損傷検出（ＬＤＨ検出）：
実験終了時に、ウェルごとに５０μＬの培地を９６ウェルプレートに移し、次にＬＤＨ検出キットの取扱説明に従って細胞毒性を検出し、次のとおりに結果を計算した。
パーセント細胞毒性（Ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）＝１００×（[実験的ＬＤＨ放出（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＬＤＨ Ｒｅｌｅａｓｅ）]（ＯＤ_４９０）／［最大ＬＤＨ放出（Ｍａｘｉｍｕｍ ＬＤＨ Ｒｅｌｅａｓｅ）］（ＯＤ_４９０））

実験結果に対しＯｎｅ－ｗａｙ Ａｎｏｖａ一元配置分散分析で統計分析を行い、テューキーの多重比較法を併用し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意な差があると見なす。

実験結果：
図３の結果から分かるように、ＯＧＤ－Ｒ処理がヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）及びラット血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ）のＬＤＨ放出増加を引き起こすのは、ＯＧＤ－Ｒ損傷処理がＨＵＶＥＣ細胞及びＲＡＯＥＣ細胞の損傷と死亡をきたすことを示している。損傷処理前の１時間の予防的投与であれ再酸素化処理時の治療的投与であれ、ＹＣ－６は用量依存的にＯＧＤ－Ｒによって引き起こされるＬＤＨの放出増加を有意に軽減し、細胞の損傷を軽減させた。ＹＣ－６が用量依存的に血管内皮細胞の損傷を有意に軽減するのは、様々な病理学的要因によって引き起こされる血管内皮細胞関連の肺損傷の過程でＹＣ－６は効果的な保護効果を発揮できることを示唆している。

実施例４：低酸素とＬＰＳによって引き起こされる肺胞上皮細胞の損傷に対するＹＣ－６の軽減
肺胞上皮細胞及び毛細血管内皮細胞は様々な炎症、毒性物質吸入、ウイルス感染及び敗血症などの有害な病原性因子が直接攻撃をかける目標であり、損傷後の透過性亢進、アポトーシスにより、びまん性肺間質及び肺胞水腫を引き起こし、進行性低酸素血症と呼吸困難をきたす。新型コロナウイルスによる肺炎が発生する過程では、肺上皮細胞がウイルスによる攻撃の主な目標である。新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、以下ＣｏＶと略称する）は長さが約２７～３２ｋｂの一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ウイルスゲノムは主にレプリカーゼコード領域と構造タンパク質コード領域の２つの部分によって構成される。ＮＩＨの研究チームの報告などでは、２０１９－ｎＣｏＶがヒト体細胞に入る時の受容体はＡＣＥ２であると判定した。ＣｏＶがアンジオテンシン変換酵素２受容体ＡＣＥ２を豊かに発現するヒト体細胞、特に気道上皮細胞及び肺胞細胞を特異的に認識及び侵入するため、下気道に感染しそして拡散して、肺炎を誘発しやすい。しかし臨床ではウイルスが陰性になった後も、肺炎が依然として存在し、あるいは悪化することが見られ、抗ウイルス治療だけでは数多くの重症及び重篤な患者の命を救うことができない。肺上皮細胞（ＨＰＡＥｐｉＣ）はＩ型及びＩＩの２種の肺胞上皮細胞を含み、ＹＣ－６が直接肺上皮細胞（ＨＰＡＥｐｉＣ）に保護効果を有するかどうかを評価するために、本例ではリポ多糖ＬＰＳと低酸素損傷モデルを用いて、細胞のＬＤＨ放出の検出により肺上皮細胞に対するＹＣ－６の保護効果を評価し、新型コロナウイルスを含め様々な要因によって引き起こされるＡＲＤＳに対するＹＣ－６での治療について実験的証拠を提供する。実験結果が、ＹＣ－６は用量依存的に低酸素とＬＰＳによって引き起こされる肺胞上皮細胞の損傷を有意に軽減させることを示している。

細胞培養：
肺胞上皮細胞培地でＨＰＡＥｐｉＣ細胞を培養し、細胞が約８０％コンフルエントに成長した時に、０．２５％トリプシンで細胞を消化し、次に肺胞上皮細胞培地で均一にピペッティングして、細胞濃度を２×１０^５個／ｍＬに調整して、４００μＬ／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、細胞が約７０％コンフルエントに成長した時に実験を行った。

ＬＰＳ＋低酸素モデルの作成：
低酸素ワークステーションの酸素濃度を１％（１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９４％Ｎ_２）に、温度を３７℃に、湿度を８５％に設定した。低酸素ワークステーションの状態が安定した後、１ｍｇ／ｍＬのＬＰＳを直接細胞に加えて、ＬＰＳの最終濃度を２０μｇ／ｍＬとし、次に細胞を低酸素ワークステーションに入れて２４時間培養した。

投与方法：
細胞のモデリングを行う前に、薬物群は最初に溶媒（２０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリン溶液）又は薬物（ＹＣ－６の最終濃度は１μＭ、５μＭ、１０μＭ）を１時間プレインキュベートし、次にＬＰＳを加えて低酸素ワークステーションに置いてモデリングし、実験が終了するまで継続した。モデル対照群は何ら薬物処理も行わず、正常群はセルインキュベータに置いて通常培養を行った。１０μＭ デキサメタゾンを薬物対照とした。各処理群を３ウェルで繰り返した。

実験結果：
図４の実験結果から分かるように、低酸素とＬＰＳ刺激はヒト肺胞上皮細胞のＬＤＨの放出増加を引き起こすことが、低酸素とＬＰＳ処理はヒト肺胞上皮細胞の損傷を引き起こすことを示しており、ＹＣ－６は用量依存的に低酸素とＬＰＳ刺激によって引き起こされる肺胞上皮細胞の損傷を軽減できる。１０μＭ デキサメタゾンもそのような損傷を有意に軽減し、１０μＭ ＹＣ－６の保護効果がデキサメタゾンより有意に優れている。上記の結果が、ＹＣ－６は用量依存的に低酸素とＬＰＳ刺激によって引き起こされる肺胞上皮細胞の損傷を有意に軽減できることを示している。

実施例５：ＬＰＳによって引き起こされるラット急性肺損傷に対するＹＣ－６の有意な改善
動物の群分けと投与：
次のとおりに動物の群分けを行った。検疫に合格し体重が均一であった６０匹のラットを選択して実験に組み入れ、１群当たり１０匹で体重によってランダムに６群に分け、動物の群分けと各群の薬物処理の用量は次のとおりであった。

投与方法は次のとおりであった。被験薬を０．３ｍＬ／１００ｇ体重で尾静脈から投与し、ヒドロコルチゾン（２５ｍｇ／ｋｇ）を０．５ｍＬ／１００ｇ体重で腹腔内投与した。全ての被験薬はＬＰＳによるモデリングの３０分前に１回目に投与し、被験溶媒とＹＣ－６を６時間ごとに１回静脈内注射し、合計で４回注射し、ヒドロコルチゾン（ＨＣ）群は１２時間ごとに１回腹腔内注射し、合計で２回注射した。

モデリング方法：
ラットの体重を測定して、イソフルラン誘導でラットを麻酔した後、仰臥位で固定し、頚部の皮膚を除毛して、７５％エタノールで滅菌し、真中から頚部の皮膚を切開して、皮下組織を鈍的に分離し、上部の気管を露出させた。注射器を使ってそれぞれ気管から８ｍｇ／ｍＬのＬＰＳ溶液を注射し、０．２ｍＬ／匹とし、各ラットの体重が２５０ｍｇで計算して、用量は６．４ｍｇ／ｋｇであった。注射後に直ちにラットを直立させ、振とう及び回転させて、ＬＰＳ溶液を肺に均一に分布させた。皮膚を縫合して、ヨードフォアで滅菌した。

肺組織の処理：
ＬＰＳ注射で２４時間モデリングした後、６ｍＬ／ｋｇ体重の量で２０％カルバミン酸エチル溶液を腹腔内注射して動物を麻酔し、腹部大動脈からの瀉血で死亡させた後、胸腔を露出させて、肺組織を取り出した。左肺を１０％パラホルムアルデヒド溶液に入れて４８時間固定した後、左肺を冠状面に横切して同じ厚さの上半分と下半分を得て、さらに左肺の下半分を冠状面に横切して同じ厚さの２つの部分を得て、次に左肺の上半分の矢状面及び２つの左肺の下半分の冠状面をパラフィンブロックで包埋し、切片してヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色を行った。

免疫組織化学ＨＥ染色：
次のとおりに組織脱水とパラフィン包埋を行った。組織を固定液から取り出し、順に５０％エタノール（３０分）－７０％エタノール（一晩）－８０％エタノール（３０分）－９０％エタノール（３０分）－９５％エタノール（３０分）－無水エタノール（２回、１回当たり３０分）－キシレン（２回、１回当たり５～１０分、サンプルが完全に透明になるまでとした）－６２℃パラフィン（３回、１回当たり１時間）に浸し、次に組織包埋を行った。次のとおりに組織パラフィン切片を取り扱った。厚さが３μｍの切片を専用の乾燥器で水分を乾かしてから３７℃オーブンで焼いて一晩乾燥させ、次にＨＥ染色に用いた。次のとおりにＨＥ染色を行った。室温で保存していたパラフィン切片を取り出し、６５℃のオーブンに置いて３０分間焼き、次に直ちに切片をキシレンに浸して３回脱パラフィンし、それぞれ５分、２分、２分とした。次のとおりに再水和を行った。３回目にキシレンに浸した後、切片を順に１００％エタノール－１００％エタノール－９５％エタノール－９０％エタノール－８０％エタノール－７０％エタノール－５０％エタノール－蒸留水に浸して再水和させ、１回当たり１分とした。切片を取り出して少し乾かし、次に、切片をウェットボックスに置いて、ヘマトキシリン染色液を組織に滴加し、染色液が組織を完全に覆うことを保証し、室温下で５分間インキュベートした。蒸留水で切片を軽く洗い流して、余分なヘマトキシリンを洗い落とし、次に切片をウェットボックスに戻して、エオシン染色液を組織に滴加し、室温下で２分間インキュベートした。蒸留水で切片を軽く洗い流した。切片を順に９０％エタノール（１分）－９５％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－キシレン（５分）－キシレン（５分）に浸して脱水して透明化させ、次に中性樹脂（適量のキシレンで希釈、約５０％キシレン）で封止した。

肺組織の病理学的観察と評点：
次のとおりに肺組織の病理形態学的観察を行った。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ倒立蛍光光学顕微鏡下において肺組織の病理学的変化を観察した。炎症細胞浸潤、肺胞出血、肺胞壁の肥厚、肺胞拡張及び気管支上皮脱落の変化の等級に基づいて分析した。肺損傷の評点はＳｍｉｔｈ氏による評点システムで実施し、実験群分けと投与情報を知らない２名の実験者が、炎症細胞浸潤、肺胞出血、肺胞壁の肥厚、肺胞拡張及び気管支上皮脱落の６つの指標についてそれぞれ肺損傷の重症度を評点した。０点は、正常である。１点は、軽度の病変で、病変範囲が全視野領域の２５％より小さい。２点は、中等度の病変で、病変範囲が全視野領域の２５～５０％である。３点は、重度の病変で、病変範囲が全視野領域の５０～７５％である。４点は、非常に重度の病変で、病変範囲が全視野領域の７５％より大きい。肺損傷の病理学的トータルスコアは前記各項目のスコアの合計であった。

実験結果：
図５の病理顕微鏡下の観察結果に示されるように、正常対照群（図５Ａ）はラットの肺組織の構造が明確であり、肺胞構造が多角形又は円形の薄壁空胞で、肺胞腔がきれいで、境界がはっきりしており、肺胞壁の肥厚はなく、肺胞の間質に炎症性浸潤がなかった。気管支壁は構造が明確であり、上皮細胞の脱落が見られず、血管が正常であった。ＬＰＳモデル群（図５Ｂ）ではラットの肺組織に大量の炎症細胞浸潤が見られ（黄色い矢印）、肺胞腔と間質性肺が浮腫しており、深刻な線維性浸出（赤い矢印）、肺胞壁の肥厚、肺胞拡張と虚脱があった。気管支粘膜上皮脱落（緑の矢印）があった。肺胞うっ血があり、肺胞内に多くの赤血球（オレンジ色の矢印）が見られた。肺血管の周りの組織が緩んでおり、明らかな浸出（青い矢印）があったのは、ＬＰＳが肺血管透過性亢進を引き起こすことを示している。異なる用量のＹＣ－６投与群（図５Ｃ～図５Ｅ）とＬＰＳモデル群を比べると、炎症細胞浸潤が減少し、肺胞損傷が軽減され、血管バリアの透過性亢進が軽減された。病理学的結果が、ＹＣ－６はＬＰＳによって引き起こされる急性肺損傷を有意に改善できることを示している。

図６の肺損傷病理学的スコアの統計結果に示されるように、ＬＰＳモデル群のスコアが正常対照群より有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。１２、４０、１２０ｍｇ／ｋｇ／ｄ用量でＹＣ－６を与えた処理群はＬＰＳモデル群と比べて病理学的スコアが有意に低下した（Ｐ＜０．０１又はＰ＜０．００１）。また、低用量群のＹＣ－６処理が５０ｍｇ／ｋｇ／ｄのヒドロコルチゾンの保護効果より有意に優れていた（Ｐ＜０．０５）。

上記の結果が、ＬＰＳは、大量の炎症細胞浸潤、肺胞壁の肥厚、肺胞うっ血、拡張、虚脱及び気管支粘膜上皮脱落として現われている肺損傷を有意に引き起こすということを示している。ＹＣ－６は有意にＬＰＳによって引き起こされる血管内皮バリアの透過性亢進を軽減させ、炎症細胞浸潤を減少させ、肺胞損傷を軽減させた。

実施例６：カニクイザルの急性肺損傷に対するＹＣ－６の軽減
非ヒト霊長類動物は系統発生、解剖学的構造などがヒトに近いため、種差による薬効評価のズレを軽減することができ、また非ヒト霊長類において得られた薬理学的用量、毒性学及び薬効の研究データは、その後の臨床試験により信頼性のある証拠を提供できる。我々は非ヒト霊長類動物であるカニクイザルと高原環境をシミュレートする減圧チャンバーで急性低圧低酸素によるカニクイザル肺損傷モデルを確立した。ＨＥ染色などの病態生化学的検査を用いて、ＹＣ－６は急性低圧低酸素によって引き起こされる肺損傷を軽減できるかどうかを評価した。

実験動物の群分け：
２４匹の健常な雄のカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）であり、６から６．５歳で、体重は６．５～７．５ｋｇであった。広東省高要市康達実験動物センターより購入した。１７匹の雄のカニクイザルを次のとおりに３群に分けた。

低圧チャンバー・シミュレーションによる７５００メートルにおけるカニクイザル急性低圧低酸素肺損傷モデルの作成：
動物飼育室で飼育したカニクイザルから１回当たりランダムに３匹選択し、各１０ｍＬ採血した後に１０ｍＬのグルコース生理食塩水を静脈内ボーラスで注入し、マークを付けた。次に、動物を低圧チャンバーに入れて実験環境に順応するように１日飼育した。急性低圧低酸素群は３メートル／秒の速度で海抜が３０００メートルに上昇することをシミュレートした。低圧チャンバー内で動物が高度３０００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後、各実験サルから１０ｍＬ採血し、次に急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水を静脈内ボーラス注入した。３メートル／秒の速度で海抜が４５００メートルに上昇することをシミュレートした。低圧チャンバー内で動物が高度４５００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後、各実験サルから１０ｍＬ採血して、急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水を静脈内ボーラス注入した。３メートル／秒の速度で海抜が６０００メートルに上昇することをシミュレートした。低圧チャンバー内で動物が高度６０００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後に、各実験サルから１０ｍＬ採血して１０ｍＬのグルコース生理食塩水を静脈内ボーラス注入した。２メートル／秒の速度で海抜が７５００メートルに上昇することをシミュレートした。低圧チャンバー内で動物が高度７５００メートルに２４時間滞在していることをシミュレートした後、３メートル／秒の速度で海抜が６０００メートルに下降し、各実験サルから１０ｍＬ採血して１０ｍＬのグルコース生理食塩水を静脈内ボーラス注入した。２メートル／秒の速度で海抜が７５００メートルに上昇することをシミュレートした。７５００メートルで４８時間滞在した後、３メートル／秒の速度で海抜が６０００メートルに下降し、実験動物を麻酔し（ケタミン塩酸塩注射液０．０６ｍＬ／ｋｇ、キシラジン塩酸塩注射液０．０２ｍＬ／ｋｇ）、頸動脈からの瀉血で動物を死亡させ、解剖し、サンプルを採取して、固定した。常圧正常酸素対照群ではカニクイザルを平原（海抜３５２メートル）で麻酔した（ケタミン塩酸塩注射液０．０６ｍＬ／ｋｇ、キシラジン塩酸塩注射液０．０２ｍＬ／ｋｇ）後、頸動脈からの瀉血で動物を死亡させ、解剖し、サンプルを採取して、固定した。

投与時間、用量と方式：
薬物処理群では動物に上昇をシミュレートする前に、ＹＣ－６注射液を１０ｍｇ／ｋｇの用量でグルコース生理食塩水によって１０ｍＬに希釈し、ＹＣ－６処理群は一度に静脈内ボーラス注入した。急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水だけを静脈内ボーラス注入した。薬物処理群では低圧チャンバー内で動物が高度３０００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後、ＹＣ－６注射液を１０ｍｇ／ｋｇの用量でグルコース生理食塩水によって１０ｍＬに希釈し、ＹＣ－６処理群は静脈内ボーラス注入を１回行った。急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水だけを静脈内ボーラス注入した。薬物処理群では低圧チャンバー内で動物が高度４５００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後、ＹＣ－６注射液を１０ｍｇ／ｋｇの用量でグルコース生理食塩水によって１０ｍＬに希釈し、ＹＣ－６処理群は静脈内ボーラス注入を１回行った。急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水だけを静脈内ボーラス注入した。薬物処理群では動物が低圧チャンバー内で高度６０００メートルに３０分間滞在していることをシミュレートした後、ＹＣ－６徐放製剤を３０ｍｇ／ｋｇの用量で５箇所の骨格筋に筋肉内注射した。急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水だけを静脈内ボーラス注入した。薬物処理群では低圧チャンバー内で動物が高度７５００メートルに２４時間滞在していることをシミュレートした後、ＹＣ－６注射液を１０ｍｇ／ｋｇの用量でグルコース生理食塩水によって１０ｍＬに希釈し、ＹＣ－６処理群は静脈内ボーラス注入を１回行い、且つＹＣ－６徐放製剤を３０ｍｇ／ｋｇの用量で５箇所の骨格筋に筋肉内注射した。急性低圧低酸素群は１０ｍＬのグルコース生理食塩水だけを静脈内ボーラス注入した。７５００メートルで４８時間滞在した後、３メートル／秒の速度で海抜が６０００メートルに下降し、実験動物を麻酔し（ケタミン塩酸塩注射液０．０６ｍＬ／ｋｇ、キシラジン塩酸塩注射液０．０２ｍＬ／ｋｇ）、頸動脈からの瀉血で動物を死亡させ、解剖し、サンプルを採取して、固定した。常圧正常酸素群ではカニクイザルを平原（海抜３２０メートル）で麻酔した（ケタミン塩酸塩注射液０．０６ｍＬ／ｋｇ、キシラジン塩酸塩注射液０．０２ｍＬ／ｋｇ）後、頸動脈からの瀉血で動物を死亡させ、解剖し、サンプルを採取して、固定した。

組織のパラフィン包埋・固定、切片とヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色：
次のとおりに組織のパラフィン包埋・固定を行った。肺組織サンプルを採取した後、肺組織を整えて厚さが１ｃｍを超えない組織塊を得て、１０倍量のパラホルムアルデヒドに入れて固定し、固定時はコットンで浮かんでいた肺組織を液面以下に押えて組織を充分に固定させた。４８時間後に固定液を１回交換して引き続き４８時間固定し、その後、パラフィン包埋に用いることができる。組織を固定液から取り出し、順に５０％エタノール（３０分）－７０％エタノール（一晩）－８０％エタノール（３０分）－９０％エタノール（３０分）－９５％エタノール（３０分）－無水エタノール（２回、１回当たり３０分）－キシレン（２回、１回当たり５～１０分、サンプルが完全に透明になるまでとした）－６２℃パラフィン（３回、１回当たり１時間）に浸し、次に組織包埋を行った。次のとおりに組織パラフィン切片を取り扱った。厚さが３ｍｍの切片を専用の乾燥器で水分を乾かしてから３７℃オーブンで焼いて一晩乾燥させ、次にＨＥ染色に用いた。次のとおりにヘマトキシリン－エオシン（ＨＥ）染色を行った。室温で保存していたパラフィン切片を取り出し、６５℃のオーブンに置いて３０分間焼き、次に直ちに切片をキシレンに浸して３回脱パラフィンし、それぞれ５分、２分、２分とした。次のとおりに再水和を行った。３回目にキシレンに浸した後、切片を順に１００％エタノール－１００％エタノール－９５％エタノール－９０％エタノール－８０％エタノール－７０％エタノール－５０％エタノール－蒸留水に浸して再水和させ、１回当たり１分とした。切片を取り出して少し乾かし、次に、切片をウェットボックスに置いて、ヘマトキシリン染色液を組織に滴加し、染色液が組織を完全に覆うことを保証し、室温下で５分間インキュベートした。蒸留水で切片を軽く洗い流して、余分なヘマトキシリンを洗い落とし、次に切片をウェットボックスに戻して、エオシン染色液を組織に滴加し、室温下で２分間インキュベートした。蒸留水で切片を軽く洗い流し、余分なエオシン染色液を洗い落とし、次にキットに備え付けた発色増強液で２回軽く洗い流し、次に蒸留水で少し洗い流した。切片を順に９０％エタノール（１分）－９５％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－キシレン（５分）－キシレン（５分）に浸して脱水して透明化させ、次に中性樹脂（適量のキシレンで希釈、約５０％キシレン）で封止した。

肺血管のうっ血して腫れた状態と肺胞中隔の肥厚に対するＹＣ－６の影響：
図７のように確立したモデルでは、海抜が上昇するにつれて、カニクイザルには、例えば、呼吸窮迫、嘔吐、運動失調、意識混濁などの顕著な急性高山病の症状が現れていたため、非ヒト霊長類カニクイザル急性高山病モデルの複製が成功したことを示している。ＡＬＩ／ＡＲＤＳ早期の病理学的特徴は肺胞壁毛細血管の拡張、肺胞中隔の拡大であり、肺胞腔内漿液、好中球及びマクロファージの浸出もあり、さらに肺のびまん性うっ血と浮腫、肺胞内ヒアリン膜の形成及び限局性肺虚脱に発展する。本研究ではＨＥ染色を利用してＹＣ－６は急性低圧低酸素によって引き起こされる肺損傷を軽減できるかどうかを観察した。

図８に示されるとおり、正常対照群のカニクイザルは肺組織の肺胞構造が多角形又は円形の薄壁空胞で、境界がはっきりしており、肺胞上皮細胞の間は薄壁の肺胞中隔であり、中隔の内部に毛細血管断面が見られた。図８の結果に示されるとおり、急性低圧低酸素は肺胞中隔の有意な肥厚を引き起こした。ＹＣ－６投与処理後に有意に改善された。各群の肺胞中隔の厚さを測定して統計学的に表示すると（図９）、ＹＣ－６は肺胞中隔の肥厚損傷を有意に軽減したことが分かった。上記の結果が、ＹＣ－６は急性低圧低酸素によって引き起こされる肺胞中隔の肥厚を効果的に軽減できることを示しており、ＹＣ－６は肺血管、肺胞の正常な組織構造と機能を維持し、血液空気関門の透過性損傷を軽減させ、新型コロナウイルスによる肺炎などの肺損傷疾患に治療効果が期待できることを示唆している。

肺胞腔におけるタンパク質ヒアリン膜の形成及び赤血球の漏出に対するＹＣ－６の影響：
ヒト急性肺損傷の特徴的な病理学的変化の１つはびまん性肺胞損傷（ｄｉｆｆｕｓｅ ａｌｖｅｏｌａｒ ｄａｍａｇｅ、ＤＡＤ）であることを述べた報告があり、びまん性肺胞損傷の１つの重要な特徴は肺胞の透過性変化により血液のタンパク質が肺胞に入り、タンパク質が沈着してヒアリン膜を形成したことである^［８］。また、ヒアリン膜の形成はＡＲＤＳの病理学的特徴の１つでもあり、新型コロナウイルスによる肺炎患者に対する病理検査で発見された^［１］。ヒアリン膜は呼吸細気管支、肺胞管、肺胞の表面に形成された赤く染色された均一な膜状物であり、浸出した血漿タンパク質、セルロース及び崩壊した肺胞上皮細胞の破片によって構成される。ヒアリン膜の形成、肺胞の間質の線維性過形成が肺胞中隔を増厚させて、肺胞膜の透過性を低下させることで、血液ガス交換機能障害を引き起こす。図１０に示されるとおり、急性低圧低酸素が肺胞中隔の線維性過形成（黒い矢印）を引き起こすと同時に、一部の肺胞腔内でタンパク質ヒアリン膜の形成を引き起こした（赤い矢印）のは、急性低圧低酸素がびまん性肺胞損傷を引き起こすことを示している。急性低圧低酸素はまた赤血球が漏出して肺胞腔に入る（青い矢印）ことを引き起こし、急性低圧低酸素が血液空気関門の破壊を引き起こしたことを示している。ＹＣ－６薬物群でそのような明らかな変化が観察されていないのは、ＹＣ－６が肺胞上皮細胞と血管内皮細胞に保護効果を有することを示唆している。上記の結果が、ＹＣ－６は肺胞上皮細胞及び血管内皮細胞を保護することによって、急性低圧低酸素によって引き起こされる血液空気関門の透過性亢進を軽減させ、正常な構造と機能を維持しているという可能性を示唆している。

肺上皮細胞の損傷、炎症細胞浸潤に対するＹＣ－６の影響：
ＡＬＩ／ＡＲＤＳは原発性疾患に関係している他に、炎症細胞浸潤と肺胞上皮損傷も重要な病理学的要因である。肺胞毛細血管壁のびまん性損傷と透過性亢進で、肺水腫とセルロース浸出が発生した。ＩＩ型肺胞上皮細胞の損傷、肺サーファクタントの減少又は消失が、ヒアリン膜の形成と肺虚脱を引き起こす。前記変化はいずれも肺胞内の酸素拡散障害、換気血流比の不均衡を引き起こして、低酸素血症と呼吸困難をきたす。図１１に示されるとおり、正常群と比べて、急性低圧低酸素が炎症細胞の肺組織浸潤を引き起こし、肺胞間質（黒い矢印）と肺胞腔（赤い矢印）では大量の炎症細胞が見られ、一部の肺胞腔では脱落した損傷肺上皮細胞（青い矢印）が見られたのに対し、ＹＣ－６処理群では明らかな炎症性浸潤と損傷した肺上皮細胞の脱落が観察されなかった。上記の結果が、ＹＣ－６は血管透過性を軽減させ、肺組織の炎症性浸潤及び肺上皮細胞の損傷を効果的に軽減できることを示している。

実験結論：
インビボ急性低圧低酸素誘発性カニクイザル肺損傷モデルを用いて、病理学的検出により、ＹＣ－６は肺血管のうっ血して腫れた状態と肺胞中隔の肥厚を有意に阻害し、肺の血液空気関門の損傷を軽減させることが発見されたため、ＹＣ－６は顕著な肺保護効果を有する。

実施例７：ＮＲ４Ａ３タンパク質に対するＹＣ－６の発現促進による低酸素関連刺激によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷軽減
核内受容体サブファミリー４グループＡのメンバー３（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ４ Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｍｅｍｂｅｒ ３、ＮＲ４Ａ３）は、ニューロン由来オーファン受容体１（Ｎｅｕｒｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１、ＮＯＲ１）とも呼ばれる。ＮＲ４Ａ３は転写因子として、代謝、炎症、細胞増殖、アポトーシス、分化などの生理学的及び病理学的過程の調節に関与している。ＮＲ４Ａ３のノックダウンにより血管内皮細胞の毛細血管変換能力を有意に阻害するのは、ＮＲ４Ａ３が血管内皮細胞で重要な生理機能を有することを示している。これまでの研究では、ＮＲ４Ａ３の上方調節が細胞の異なる病理学的損傷下での生存を促進できることが明らかになっている。例えば、血管内皮細胞でＮＲ４Ａ３の発現を増加させると細胞性アポトーシス抑制タンパク質２（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ２、ｃＩＡＰ２）の上方調節によりアポトーシスを阻害して、低酸素下の血管内皮細胞の生存を延長させることができる。ニューロンでＮＲ４Ａ３の発現を増加させると酸化ストレスとグルタミン酸が誘発する興奮毒性によるニューロン損傷を減少することができる。

本実験では、ＹＣ－６は低酸素関連刺激によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷に保護効果を有するかどうか、及び関連の保護効果はＮＲ４Ａ３発現の調節に関係しているかどうかを検討した。

実験材料：
細胞株：
広州賽庫生物技術有限公司よりヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を購入し、１０％ウシ胎児血清含有改良型ＤＭＥＭ培地（ＣｅｌｌＣｏｏｋ、ＣＭ２００７）で培養した。広州吉▲ニ▼欧生物科技有限公司よりラット血管内皮細胞（ＲＡＯＥＣ）を購入し、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ培地（Ｃｏｒｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）で培養した。

組織切片：
カニクイザルの肺組織パラフィン切片であって、３つの正常対照群（ｎｏｒｍｏｂａｒｉｃ ｎｏｒｍｏｘｉａ、ＮＮ）、５つの急性低圧低酸素処理群（ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｘｉａ、ＨＨ）、５つの急性低圧低酸素＋ＹＣ－６処理群（ＨＨ＋ＹＣ－６）を含む。

主な試薬と薬物：
高グルコースＤＭＥＭ培地（ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０３－ＣＶ）
改良型ＤＭＥＭ培地（ＣｅｌｌＣｏｏｋ、ＣＭ２００７）
オーストラリア産ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、１００９９１４１）
０．２５％トリプシン（Ｇｉｂｃｏ、２５２０００７２）
グルコース不含ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ１４４３００１）
ＬＤＨ検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）
２０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリン溶液（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－β－Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ、ＨＰ－β－ＣＤ）（広州市賽普特医薬科技股▲フン▼有限公司、アンプル瓶、ロット番号１８０５０２、仕様５ｍＬ：１ｇ、濃度０．２ｇ／ｍＬ）
ＹＣ－６注射液（広州市賽普特医薬科技股▲フン▼有限公司、アンプル瓶、ロット番号２００１０２０１、仕様５ｍＬ：５０ｍｇ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ、２０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリン溶液に溶解）
シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ＭＣＥ、ＨＹ－１２３２０）
クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、ＭＣＥ、ＨＹ－１７５８９）
ＭＧ１３２（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ２６１９）
ＮＡＣ（Ｓｅｌｌｅｃｋ、Ｓ１６２３）
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ１００１０５００ＢＴ）
プロテアーゼ阻害剤（Ｔａｒｇｅｔｍｏｌ、Ｃ０００１）
ホスファターゼ阻害剤（Ｔａｒｇｅｔｍｏｌ、０００４）
細胞溶解液（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７８５０１）
ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）
５×タンパク質ロード緩衝液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ００１５Ｌ）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分離ゲル緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ、１６１－０７９８）
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ濃縮ゲル緩衝液（Ｂｉｏ－ｒａｄ、１６１－０７９９）
１０％ＳＤＳ溶液（Ｂｉｏ－ｒａｄ、１６１－０４１６）
３０％Ａｃｒ－ビスアクリルアミド（ＭＩＫ、ＤＢ２４０）
過硫酸アンモニウム（ＭＰｂｉｏ、１９３８５８）
ＴＥＭＥＤ（Ｍａｃｋｌｉｎ、Ｔ６０２３－１００ｍＬ）
ＰＶＤＦ膜（Ｒｏｃｈｅ、３０１００４０００１）
脱脂粉乳（Ｗａｋｏ、１９０－１２８６５）
ＴＢＳ（Ｂｏｓｔｅｒ、ＡＲ００３１）
抗ＮＲ４Ａ３抗体（Ａｎｔｉ－ＮＲ４Ａ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、ｓｃ－３９３９０２）
抗アクチン抗体（Ａｎｔｉ－ａｃｔｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｒｉｇｏ、ａｒｇ６２３４６）
抗ＣＤ３１抗体（Ａｎｔｉ－ＣＤ３１ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｂｃａｍ、ａｂ２８３６４）
ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（ＨＲＰ）二次抗体（Ａｒｉｇｏ、ａｒｇ６５３５０）
ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸着二次抗体（Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８蛍光二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－２１２０２）
ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）高交差吸着二次抗体（Ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５蛍光二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－３１５７２）
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、１４５３３、使用濃度５μｇ／ｍＬ）
水溶性封入剤（Ｂｏｓｔｅｒ、ＡＲ１０１８）
化学発光液（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＷＢＫＬＳ０５００）
１０×ＥＤＴＡ抗原賦活化液（Ｂｏｓｔｅｒ、ＡＲ００２３）
ＤＡＫＯ抗体希釈液（Ｄａｋｏ、Ｓ－３０２２）
キシレン（広州化学試剤厂、３３５３５）
無水エタノール（広州化学試剤厂、３２０６１）
マイヤー（Ｍａｙｅｒ）・ヘマトキシリン染色液（ＭＩＫ、ＢＬ００３）
エオシンＹ（威佳科技、１７３７２－８７－１）
トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６）
逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰ０４４２）
ｄＮＴＰｓ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ７２９５）
ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＦＰ２０５）
ＩＰ溶解液（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｐ００１３）
ＩＰ磁気ビーズ（Ｂｉｍａｋｅ、Ｂ２３２０２）。

主な実験装置：
スーパークリーンベンチ、セルインキュベータ、低酸素ワークステーション、マイクロプレートリーダ、化学発光イメージャ、レーザー共焦点顕微鏡、低温高速遠心機、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲシステム。

実験方法：
細胞培養、酸素－グルコース欠乏－再酸素化（ｏｘｙｇｅｎ－ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ、ＯＧＤ－Ｒ）損傷モデル及び薬物処理とした。
１０％ウシ胎児血清含有改良型ＤＭＥＭ培地でＨＵＶＥＣ細胞を培養し、細胞が約８０％コンフルエントに成長した時に、０．２５％トリプシンで細胞を消化し、次に１０％ウシ胎児血清含有改良型ＤＭＥＭ培地で均一にピペッティングし、細胞濃度を１×１０^５個／ｍＬに調整して、４００μＬ／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、細胞が約７０％コンフルエントに成長した時に実験を行った。１０％ウシ胎児血清含有高グルコースＤＭＥＭ培地でＲＡＯＥＣ細胞を培養し、播種条件はＨＵＶＥＣと一致した。ＯＧＤ－Ｒ損傷処理を行う時に、低酸素ワークステーションの酸素濃度を１％（１％Ｏ_２、５％ＣＯ_２、９４％Ｎ_２）に、温度を３７℃に、湿度を８５％に設定した。グルコース不含ＤＭＥＭ培地を低酸素ワークステーションに入れて予め３時間低酸素にさらした。培養プレートから培地を吸い取って、予熱したグルコース不含ＤＭＥＭ培地で２回洗浄し、次に１ウェル当たり１００μＬのグルコース不含ＤＭＥＭ培地を加えて、培養プレートを低酸素ワークステーションに置き、さらに１ウェル当たり３００μＬの予め低酸素にさらしたグルコース不含ＤＭＥＭ培地を加え、次に、培養プレートを低酸素ワークステーションに置いて引き続き４時間低酸素にさらした。次に再酸素化処理を行い、培養プレートを取り出し、グルコース不含ＤＭＥＭ培地を４００μＬの１０％ウシ胎児血清含有通常培地に交換し、次に３７℃×５％ＣＯ_２セルインキュベータに置いて引き続き２４時間又は所定の時間培養した。正常群の細胞は培地を４００μＬの新しい１０％ウシ胎児血清含有通常培地に交換しただけであった。薬物処理群の細胞は、細胞に酸素－グルコース欠乏処理を行った後に、再酸素化処理と同時に、所定の最終濃度の薬物（ＹＣ－６の最終濃度は１μＭ、３μＭ又は１０μＭ）を与え、溶媒対照では対応する２０％ヒドロキシプロピルシクロデキストリンを与え、シクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ＣＨＸ）の最終濃度は１００μＭであり、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ、ＣＱ）の最終濃度は１０μＭ、３０μＭ又は１００μＭであり、ＭＧ１３２の最終濃度は１０ｎＭ、３０ｎＭ又は１００ｎＭであり、実験が終了するまで継続した。モデル対照群は何ら薬物処理も行わなかった。

ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）：
予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、次にセルスクレーパーで細胞をこすり落として１．５ｍＬ遠心管に移し、４℃×１０００ｇで５分間遠心分離して、上清を捨て、細胞ペレットに適量のプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含む細胞溶解液を加え、細胞を充分に再懸濁して氷の上に５分間静置して細胞を充分に溶解させた。次に４℃×１２０００ｇで１０分間遠心分離して、上清を分離し、上清は抽出した細胞タンパク質であった。次にＢＣＡタンパク質定量キットで各タンパク質サンプルを定量した。タンパク質を定量した後、タンパク質溶解液で各サンプルのタンパク質濃度を最低濃度のタンパク質サンプルに一致するように調整し、次にそれぞれ各タンパク質サンプルを５×タンパク質ロード緩衝液と４：１の比率で充分かつ均一に混合して、沸騰水浴に５分間浸し、次にボルテックスにて均一に混合して、短時間遠心分離してサンプルを管の底部に回収し、氷の上に置いて保持し又は－８０℃で冷凍保存した。タンパク質サンプルに対し１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次に分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。５％脱脂乳を用いて室温下でＰＶＤＦ膜を２時間ブロックした。ブロックが終了した後、ＴＢＳＴ（１‰ポリソルベート２０を含むＴＢＳ）で膜を３回洗浄し、１回当たり５分とした。次に５％ＢＳＡで対応する抗体を希釈し、ＰＶＤＦ膜を対応する希釈抗体の中に入れ、４℃で一晩インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＴＢＳＴで膜を３回洗浄し、１回当たり５分とした。５％ＢＳＡで対応する二次抗体を希釈し、ＰＶＤＦ膜を対応する希釈二次抗体の中に入れ、室温下で１時間インキュベートした。インキュベートが終了した後、ＴＢＳＴで膜を３回洗浄し、１回当たり５分とし、ＰＶＤＦ膜を化学発光液の中に入れて、化学発光イメージャで撮影した。

免疫組織化学染色：
パラフィン切片を６５℃オーブンに３０分間置き、次に直ちに１００％キシレンに移して脱パラフィンし、通常のプロセス（１００％キシレン、５分－１００％キシレン、２分－１００％キシレン、２分－１００％エタノール、１分－１００％エタノール、１分－９５％エタノール、１分－９０％エタノール、１分－８０％エタノール、１分－７０％エタノール、１分－５０％エタノール、１分－蒸留水、１分×３）で再水和させ、次にＥＤＴＡ抗原賦活化液（マイクロ波加熱）で抗原を修復した。修復終了後、室温に自然冷却し、次にＰＢＳで３回洗浄し、１回当たり５分とした。組織切片に残っていたＰＢＳを振りほどいて、免疫組織化学染色ペンを使って組織の外側に円を描き、次にＤＡＫＯ抗体希釈液で希釈した対応する一次抗体を組織に滴加して、組織を完全に覆わせた。組織切片を４℃のウェットボックスに置いて一晩インキュベートした。次にＰＢＳで３回洗浄し、１回当たり５分とした。次に、組織に対応する希釈蛍光二次抗体を滴加し、ウェットボックスの中で暗所室温下１時間インキュベートした。次にＰＢＳで３回洗浄し、１回当たり５分とした。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核染色し、ウェットボックスの中で暗所室温下５分間インキュベートした。次にＰＢＳで３回洗浄し、１回当たり５分とし、水溶性封入剤で封止し、次にレーザー共焦点顕微鏡で画像を撮影した。

ヘマトキシリン－エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ、ＨＥ）染色：
上述したとおりにパラフィン切片を再水和させた。次に切片をヘマトキシリン染色液に浸し、室温で１０分間染色した。流水で切片を軽く洗い流して、余分なヘマトキシリンを洗い落とし、次に１％塩酸エタノールで１０秒間分化させた。流水で切片を５分間軽く洗い流し、次に１％水酸化アンモニウムで１０秒間青色に戻し又は流水で３０分間洗い流した。流水で切片を５分間軽く洗い流し、次に１％エオシンに浸して、室温で５分間染色した。流水で切片を軽く洗い流して、余分なエオシン染色液を洗い落とした。切片を順に７０％エタノール（１分）－８０％エタノール（１分）－９０％エタノール（１分）－９５％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－１００％エタノール（１分）－キシレン（５分）－キシレン（５分）に浸して脱水して透明化させ、次に中性樹脂（適量のキシレンで希釈、約５０％キシレン）で封止した。切片をドラフトチャンバーに入れて、封入剤が完全に乾いたら、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｕ倒立蛍光顕微鏡で明視野撮影を行い、対象ごとにランダムな視野で撮影し、後の病理学的分析に供した。

細胞免疫蛍光染色：
実験終了時、ＰＢＳで速やかに細胞を２回洗浄し、次に４％パラホルムアルデヒドを加え、室温で１５分間静置した。次に０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで室温下１５分間インキュベートして細胞膜を破壊した。ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次に対応するＤＡＫＯ抗体希釈液で希釈した一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を吸い取って、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次に希釈蛍光二次抗体を加え、室温で暗所１時間インキュベートした。二次抗体を吸い取って、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、次にｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を加えて細胞核を染色し、室温で暗所５分間インキュベートした。ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を吸い取って、ＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳを加え、次にレーザー共焦点顕微鏡で画像を撮影した。

リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ：
実験終了時に、細胞培地を捨て、次に直接適量のトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬を加え、氷の上で細胞を充分に溶解した後、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）溶解物をリボヌクレアーゼを含まない１．５ｍＬ遠心管に移し、次にトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）の用量の２０％のクロロホルムを加えて、１５秒間激しく振とうし、氷の上に１０分間静置して、４℃×１２０００ｇで１５分間遠心分離し、次に上層の液体を新しい１．５ｍＬ遠心管に移し（中層と下層に触れない）、上層の液体の量の５分の４のイソプロパノールを加え、上下をひっくり返して複数回均一に混合して、氷の上に１０分間静置した。次に４℃×１２０００ｇで１５分間遠心分離して、慎重にイソプロパノールを捨て、管の底部の沈殿に１ｍＬの予冷した７５％エタノールを加え（ＤＥＰＣ水で無水エタノールを７５％に希釈した）、上下をひっくり返して遠心管の底部の沈殿を浮き上がらせた。次に４℃×１２０００ｇで１５分間遠心分離して、７５％エタノールを捨て、新しい予冷した７５％エタノールでもう１回洗浄した。４℃×１２０００ｇで１５分間遠心分離して、７５％エタノールを捨て、次に短時間遠心分離して、ピペットで残りのエタノールを吸い取った。遠心管をスーパークリーンベンチに置いて、管口が開いたまま５～１０分間静置して、エタノールを完全に揮発させた。適量のＤＥＰＣ水を加えてＲＮＡを溶解し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ超微量紫外可視分光光度計でＯＤ値を測定して定量し、ＯＤ２６０／２８０が１．８～２．０の範囲にあればＲＮＡの品質が高いことを示す。次の方法でＲＮＡの逆転写とリアルタイム蛍光定量ＰＣＲを行った。
１）前変性：トータルＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ） ２μｇとＯｌｉｇｏ ｄＴ １μＬにＤＥＰＣ・Ｈ_２Ｏを加え１３μＬに補足して均一に混合し、６５℃下５分間で終了した後に直ちに氷の上に置いた。
２）逆転写：５×反応緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ） ４μＬ、ｄＮＴ ｍｉｘ ２μＬ、逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）１μＬを均一に混合し、４２℃で６０分間、７０℃で１０分間、そして最後まで４℃とした。
３）リアルタイム（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ）ＰＣＲ（ＡＢＩ ７５００ 高速リアルタイムＰＣＲシステム（ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ））
プライマー原液である１００ｎｍｏｌ／μＬ（プライマー凍結乾燥粉末＋ナノモル（ｎｍｏｌｅｓ）×１０μＬ ＲＮａｓｅ不含（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）ｄｄＨ_２Ｏ）、プライマー作業溶液２ｎｍｏｌ／μＬ（４μＬ ＦＰ＋４μＬ ＲＰ＋１９２μＬ ＲＮａｓｅ不含（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）ｄｄＨ_２Ｏ）及びＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ／ＲＯＸ＝１．２５ｍＬ／５０μＬを、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ／ＲＯＸ ５μＬ、ｃＤＮＡ １μＬ、プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ） ２μＬ、ＤＥＰＣ・Ｈ_２Ｏ ２μＬと均一に混合して、ＰＣＲ反応を行い、サイクルパラメータ保持段階（Ｈｏｌｄｉｎｇ ｓｔａｇｅ）は、９５℃、１５分間であり、サイクル段階（Ｃｙｃｌｉｎｇ ｓｔａｇｅ）（４０サイクル（ｃｙｃｌｅｓ））は、９５℃、１０秒→５６℃、２０秒→７２℃、３０秒であり、融解曲線段階（Ｍｅｌｔ Ｃｕｒｖｅ ｓｔａｇｅ）（連続（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ））は、９５℃、１５秒→６５℃、６０秒→９５℃、１５秒→６５℃、１５秒であり、相対発現量の計算では比較（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ）ΔΔＣｔ法（ＲＱ＝２^{－ΔΔＣｔ}）を用いてデータを解析した。プライマー配列は、β－アクチン（ヒト）（β－ａｃｔｉｎ（ｈｕｍａｎ））フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＴＧＧＧＣＧＡＣＧＡ－３’、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＧＧＴ－３’、ＮＲ４Ａ３（ヒト（ｈｕｍａｎ））フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣ－３’、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＣＴＡＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧ－３’、β－アクチン（ラット）（β－ａｃｔｉｎ（ｒａｔ））フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＣＧＣＧＡＧＴＡＣＡＡＣＣＴＴＣＴＴＧＣ－３’、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＣＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＧＧ－３’、ＮＲ４Ａ３（ラット）（ＮＲ４Ａ３（ｒａｔ））フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’－ＧＧＡＡＡＣＧＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＴ－３’、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）：５’－ＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴＧＴＧ－３’を含む。

免疫沈降：
予冷したＰＢＳで細胞を２回洗浄し、次にセルスクレーパーで細胞をこすり落として１．５ｍＬ遠心管に移し、４℃×１０００ｇで５分間遠心分離して、上清を捨て、細胞ペレットにプロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤を含む適量のＩＰ溶解液を加え、細胞を充分に再懸濁して氷の上に５分間静置して細胞を充分に溶解させた。次に４℃×１２０００ｇで１０分間遠心分離して、上清を分離し、上清は抽出した細胞タンパク質であった。次にＢＣＡタンパク質定量キットで各タンパク質サンプルを定量した。タンパク質を定量した後、ＩＰ溶解液で各サンプルのタンパク質濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整し、各サンプルを等量で採取して新しい遠心管に入れ（インプット（ｉｎｐｕｔ）として各サンプルを少し残した）、抗体取扱説明書に従って対応する量の抗体を加え、４℃でゆっくりと上下をひっくり返して一晩均一に混合した。次に、ＩＰ溶解液でＩＰ磁気ビーズを２回洗浄し、各サンプルにそれぞれ等量のＩＰ磁気ビーズを加え、引き続き４℃でゆっくりと上下をひっくり返して２時間均一に混合した。次に磁気ビーズを分離して、ＩＰ溶解液でＩＰ磁気ビーズを５回洗浄し、各回では４℃で上下をひっくり返して５分間均一に混合した。最終回で磁気ビーズを分離した後、各サンプルに等量の１×タンパク質ロード緩衝液（ＩＰ溶解液と５×タンパク質ロード緩衝液を４：１の比率で均一に混合したもの）を加え、短時間遠心分離した後、沸騰水浴に５分間浸し、次に短時間遠心分離してサンプルを管の底部に回収し、沸騰水浴を経たサンプルを新しい遠心管に移して、磁気ビーズを捨て、サンプルを氷の上に置いて保持し又は－８０℃で冷凍保存することができる。タンパク質サンプルに対し１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、その後の手順はウエスタンブロットの部分と同じであった。

データ解析：
統計結果は平均±標準偏差で示す。一元配置分散分析（ＯＮＥ－ＷＡＹ ＡＮＯＶＡ）を採用して統計分析を行い、テューキーの多重比較法を併用し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意な差があると見なす。

実験結果：
酸素－グルコース欠乏－再酸素化／低酸素刺激下でＹＣ－６は血管内皮細胞のＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を向上させ、細胞損傷を軽減させる。
血管内皮細胞は低酸素刺激下ではＮＲ４Ａ３の上方調節により下流のｃＩＡＰ２の発現を促進させることによってアポトーシスを低減させることが、低酸素関連刺激下のＮＲ４Ａ３の発現が血管内皮細胞の生存を向上させる上で重要な役割を有することを示しているということは、報告で述べられていた。４時間の酸素－グルコース欠乏がＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣのＮＲ４Ａ３タンパク質の発現上昇を引き起こすが、２４時間の再酸素化はＮＲ４Ａ３タンパク質レベルの下方制御を引き起こす（図１２ａ）と同時に、細胞のＬＤＨ放出増加（図３）を引き起こすことが、酸素－グルコース欠乏－再酸素化はＮＲ４Ａ３の発現への下方制御により細胞損傷を促進させるという可能性を示唆していることを実験の結果が示している。再酸素化損傷と同時にＹＣ－６を与えると用量依存的にＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を向上させる（図１２ａ）とともに、用量依存的に酸素－グルコース欠乏－再酸素化によって引き起こされる細胞損傷を低減させる（図３）ことができ、これはＹＣ－６がＮＲ４Ａ３の発現への上方調節により血管内皮細胞を保護する役割を発揮できることを示している。免疫蛍光細胞染色法でＮＲ４Ａ３の発現を分析したところ、ウエスタンブロットの結果と一致しており、再酸素化損傷と同時にＹＣ－６を与えると用量依存的にＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を向上させることができる（図１２のｂとｃ）。

急性低圧低酸素誘発性カニクイザル肺組織損傷病理学的モデルにおいて、ＮＲ４Ａ３の発現に対するＹＣ－６の影響を一層検討した。結果は、急性低圧低酸素刺激下でＹＣ－６が有意にカニクイザル肺組織内皮細胞のＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を向上させ、急性低圧低酸素によって引き起こされる血管内皮細胞マーカーＣＤ３１の発現の下方制御を阻害する（図１２のｄとｅ）ことを示している。これまでの組織病理学的結果（図８～図１１）は、正常対照群のカニクイザルは肺組織の肺胞構造が多角形又は円形の薄壁空胞で、境界がはっきりしており、肺胞中隔は薄壁構造であり、中隔の内部に毛細血管断面があることを示している。急性低圧低酸素は、深刻な組織の緩み、血管のうっ血、肺胞壁の肥厚、肺胞腔内の赤血球の浸出とヒアリン膜の形成、そして肺胞に対する炎症細胞の浸潤を引き起こす。ヒアリン膜の形成はびまん性肺胞損傷の典型的な病理学的特徴とされることから、急性低圧低酸素はびまん性肺胞損傷及び肺内皮バリアの透過性亢進を引き起こすことを示している。ＹＣ－６を与えると急性低圧低酸素によって引き起こされる肺組織の病理学的変化を改善し、血液空気関門の透過性亢進を軽減させることができる。実験の結果が、低酸素関連刺激によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷を低減させる上でのＮＲ４Ａ３の重要性を示しており、ＹＣ－６はＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を上方調節し、酸素－グルコース欠乏－再酸素化によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷及び急性低圧低酸素によって引き起こされる内皮バリアの損傷を軽減することができる。

ＹＣ－６は、酸素－グルコース欠乏－再酸素化によって引き起こされるＮＲ４Ａ３のユビキチン化分解を阻害する。
これまでの研究では、ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現は主に転写レベルによって調節され、ＨＩＦ－１αは低酸素刺激下でＮＲ４Ａ３の発現を調節する上流の転写因子であることが明らかになっている。したがって、我々は、ＹＣ－６はＮＲ４Ａ３の転写レベルを促進することでそのタンパク質の発現を促進するかどうかを検討した。結果（図１３）は、酸素－グルコース欠乏はＮＲ４Ａ３転写レベルの有意な上昇を引き起こすことを示しており、酸素－グルコース欠乏はＨＩＦ－１αの転写を促進することでＮＲ４Ａ３の発現を促進するのは、血管内皮細胞の低酸素関連損傷に対抗する１種の自己保護メカニズムなのかもしれないということを示している。再酸素化はＮＲ４Ａ３転写レベルの下降を引き起こし、ＹＣ－６を与えるとＮＲ４Ａ３の転写レベルを有意に上方調節していないのは、ＹＣ－６はＮＲ４Ａ３の転写を促進することによってそのタンパク質の発現を増加させるのではないことを示している。したがって、我々は、さらに、ＹＣ－６がＮＲ４Ａ３の分解を阻害することの可能性を検討した。ＨＵＶＥＣ及びＲＡＯＥＣに酸素－グルコース欠乏処理を行い、再酸素化と同時にシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を与えてタンパク質の合成を阻害した。結果は、タンパク質の合成を阻害するとＮＲ４Ａ３タンパク質がほぼ完全に枯渇していることを示していることから、ＮＲ４Ａ３タンパク質は再酸素化損傷の中で急速に分解することを示している。さらにＮＲ４Ａ３の分解経路を検討するために、再酸素化損傷とＣＨＸを与える同時に、それぞれ異なる濃度のユビキチン・プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２及びリソソーム分解阻害剤クロロキンＣＱを与えて、異なる方式のタンパク質分解を遮断した。結果は、再酸素化損傷と同時にＣＨＸ及びＭＧ１３２を与えるのは、ＮＲ４Ａ３の分解を阻害できるが、ＣＨＸ及びＣＱを与えてもＮＲ４Ａ３の分解を明らかに阻害していないを示していることから、再酸素化損傷の過程でＮＲ４Ａ３の分解は主にユビキチン・プロテアソーム系によるものだということを示している。

さらにＹＣ－６は再酸素化の条件下でＮＲ４Ａ３タンパク質のユビキチン化分解を阻害したかどうかを検討するために、我々は、再酸素化処理後の細胞からタンパク質を抽出し抗ユビキチン抗体で免疫沈降実験を行った。結果は、再酸素化損傷はＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾を引き起こし、再酸素化損傷と同時にＭＧ１３２を与えるとユビキチン化のＮＲ４Ａ３の増加を引き起こし、再酸素化後に溶媒処理を与えるのはＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾に明らかな影響はないが、ＹＣ－６を与えると再酸素化によって引き起こされるＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾を阻害でき、再酸素化後にＭＧ１３２及びＹＣ－６を与えてもユビキチン化のＮＲ４Ａ３を明らかに増加させてないということを示すから、ＹＣ－６はＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾を阻害したということを示している。

実験の結果は、ＹＣ－６は再酸素化損傷においてＮＲ４Ａ３のユビキチン化修飾の阻害でその分解を阻害することによって、血管内皮細胞の損傷刺激下の生存を向上させるということを示している。

上記から分かるように、ＹＣ－６は酸素－グルコース欠乏－再酸素化によって引き起こされる血管内皮細胞の損傷を軽減することができ、そのメカニズムの１つは、ＹＣ－６がＮＲ４Ａ３のユビキチン化分解を阻害することによって、病理学的刺激下の血管内皮細胞の生存を向上させることである。動物個体レベルでは、ＹＣ－６が低酸素刺激下で肺組織血管内皮細胞のＮＲ４Ａ３タンパク質の発現を促進し、低酸素によって引き起こされる肺内皮バリアの透過性亢進及び関連の病理学的変化を軽減させることによって、肺保護の役割を発揮する。

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Ｓｍｉｔｈ ＫＭ，Ｍｒｏｚｅｋ ＪＤ，Ｓｉｍｏｎｔｏｎ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：ｇａｓ ｅｘｃｈａｎｇｅ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ａｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９７；２５（１１）：１８８８－９７．
Ｗｕ Ｆ，Ｚｈａｏ Ｓ，Ｙｕ Ｂ，Ｃｈｅｎ Ｙ－Ｍ，Ｗａｎｇ Ｗ，Ｓｏｎｇ Ｚ－Ｇ，Ｈｕ Ｙ，Ｔａｏ Ｚ－Ｗ，Ｔｉａｎ Ｊ－Ｈ，Ｐｅｉ Ｙ－Ｙ ｅｔ ａｌ：Ａ ｎｅｗ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．Ｎａｔｕｒｅ ２０２０．
Ｈｕａｎｇ Ｃ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｌｉ Ｘ，Ｒｅｎ Ｌ，Ｚｈａｏ Ｊ，Ｈｕ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｆａｎ Ｇ，Ｘｕ Ｊ，Ｇｕ Ｘ ｅｔ ａｌ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０２０，３９５（１０２２３）：４９７－５０６．
Ｘｕ Ｚ，Ｓｈｉ Ｌ，Ｗａｎｇ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｈｕａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｌｉｕ Ｓ，Ｚｈａｏ Ｐ，Ｌｉｕ Ｈ，Ｚｈｕ Ｌ ｅｔ ａｌ：Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ＣＯＶＩＤ－１９ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０２０
Ｇｏｎｇ Ｙ，Ｌａｎ Ｈ，Ｙｕ Ｚ，Ｗａｎｇ Ｍ，Ｗａｎｇ Ｓ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｒａｏ Ｈ，Ｌｉ Ｊ，Ｓｈｅｎｇ Ｚ，Ｓｈａｏ Ｊ：Ｂｌｏｃｋａｇｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＰＦＫＦＢ３ ａｌｌｅｖｉａｔｅｓ ｓｅｐｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｖｉａ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ａｌｖｅｏｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１７，４９１（２）：５２２－５２９．
Ｗａｎｇ Ｌ，Ｃａｏ Ｙ，Ｇｏｒｓｈｋｏｖ Ｂ，Ｚｈｏｕ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｑ，Ｘｕ Ｊ，Ｍａ Ｑ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｍａｏ Ｘ ｅｔ ａｌ：Ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｐｆｋｆｂ３ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ＬＰＳ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ ２０１９，１４６：１０４２９２．
Ｃａｏ Ｙ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｙａｎｇ Ｑ，Ｍａ Ｑ，Ｘｕ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｊ，Ｋｏｖａｃｓ Ｌ，Ａｙｏｎ ＲＪ，Ｌｉｕ Ｚ ｅｔ ａｌ：ＰＦＫＦＢ３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１９，１１６（２７）：１３３９４－１３４０３．

Claims (11)

1. 対象における肺上皮細胞の損傷によって媒介される疾患を予防又は治療するための組成物であって、
   式Ｉ：
   

   

   （式Ｉ）
   ［式中、Ｒ_１は、Ｈ、－ＣＮ、フッ素、塩素、Ｃ_１～１０アルキル基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルキル基、Ｃ_１～１０アルコキシ基、フッ素又は塩素置換Ｃ_１～１０アルコキシ基及びＣ_３～１０シクロアルキル基から選ばれる］
   の化合物、その重水素化物又は薬学的に許容される塩、を含有し、
   ここで、該肺上皮細胞の損傷によって媒介される疾患は、急性肺損傷、急性呼吸窮迫症候群、肺線維症、早産児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、およびニューモシスチス肺炎から１つ又は複数選ばれる、
   該組成物。
2. 該化合物が、
   ５α－アンドロスタ－３β，５，６β－トリオール、
   １７－プロピレン－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオール、
   １７－イソプロピル－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオール、
   １７－ブチル－アンドロスタ－３β，５α，６β－トリオール、および、
   コレスタン－３β，５α，６β－トリオール
   から選ばれる、
   請求項１に記載の組成物。
3. 該化合物が、５α－アンドロスタ－３β，５，６β－トリオールである、請求項１に記載の組成物。
4. 前記急性肺損傷、または急性呼吸窮迫症候群が、高酸素、ウイルス感染、細菌感染、外傷、ショック、虚血再灌流障害、急性膵炎、吸入傷害、びまん性肺胞損傷又は中毒によって引き起こされる、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ウイルスが、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメガロウイルス又はそれらの組み合わせである、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ウイルスが、コロナウイルスである、請求項５に記載の組成物。
7. 前記コロナウイルスが、新型コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記急性肺損傷が、手術によって引き起こされる肺損傷である、請求項１に記載の組成物。
9. 前記手術が、肺切除術、肺腫瘍切除術又は肺移植術である、請求項８に記載の組成物。
10. 前記肺切除術が、縮小手術、肺葉切除術又は肺全摘術である、請求項９に記載の組成物。
11. 肺上皮細胞の損傷によって媒介される疾患が、ＰＦＫＦＢ３タンパク質の過剰発現として現われる、請求項１に記載の組成物。