TWI830003B - 小分子化合物在治療肺上皮細胞損傷和/或血管內皮細胞損傷介導的疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本發明公開了5α-雄甾-3β,5,6β-三醇及其類似物、其氘代物或其藥學上可接受之鹽在製備治療患者之肺部疾病之藥物中之應用。本發明證實這些化合物可以顯著抑制PFKFB3表達上調、顯著抑制乳酸堆積、顯著減輕血管內皮細胞損傷、顯著減輕肺泡上皮細胞損傷、顯著抑制肺泡間隔增厚、顯著減輕肺泡損傷，藉以能夠用於治療肺部等肺上皮細胞損傷及/或血管內皮細胞損傷介導之疾病。

Description

小分子化合物在治療肺上皮細胞損傷和/或血管內皮細胞損傷介導的疾病中的用途

本發明係關於小分子化合物在治療肺上皮細胞損傷和/或血管內皮細胞損傷介導之疾病中之用途，具體涉及5α-雄甾-3β,5,6β-三醇（在本文中有時簡稱「YC-6」或「YC6」）及其類似物之上述用途，特別是這些化合物在肺損傷和腦小血管病之治療中之應用。

肺損傷常見於肺部疾病，特別是如急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合症（ALI/ARDS）、肺動脈高壓、敗血症等疾病中，嚴重危害身體健康，有些還具備很高死亡率。

急性肺損傷（Acute lung injury, ALI）係指由非心源性之各種嚴重肺內、外致病因素（如病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷、其他毒素導致之中毒等）導致之急性低氧性呼吸功能不全或衰竭，其病理特徵表現為肺泡上皮和肺毛細血管內皮通透性增加所致之肺水腫、肺泡塌陷和擴張、肺泡壁增厚和炎性細胞浸潤等（Buttet al. , 2016）。ALI發展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合症（Acute respiratory distress syndrome, ARDS），表現為頑固性低氧血症和呼吸窘迫，可出現呼吸衰竭、多器官功能障礙甚至死亡。ALI/ARDS死亡率能達到40%～60%，當前仍無特效藥物療法。

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）（Wu Fet al , 2020）引起之2019冠狀病毒疾病（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）中之29％併發急性呼吸窘迫綜合症（Acute respiratory distress syndrome, ARDS）（Huang C et al, 2020）。新型冠狀病毒病引發ARDS進一步得到病理學證據之證實（Xu Z et al, 2020），在兩例死亡患者之組織學檢查中發現雙側彌漫性肺泡損傷，伴隨細胞纖維粘液樣滲出物，存在肺水腫、肺細胞脫落和肺透明膜形成，從而嚴重影響肺之通氣/換氣功能，發展為ARDS。如何防止患者轉為重型和對數以萬計之重型/危重型患者進行救治係緊迫的醫學與社會需求。

肺泡係肺臟進行氣體交換之基本單位，其內表面覆蓋著I型和II型肺泡上皮細胞。I型扁平細胞構成90%之肺泡表面積並且容易受傷。II型立體細胞構成剩餘10%之肺泡表面積且不易受損，它們的功能包括產生表面活性劑、轉運離子以及對I型細胞損傷後之增殖和分化。肺泡上皮除了形成緻密的屏障以隔絕外源性致病原外，也通過其表面受體和分泌產物與免疫細胞相互作用來維持肺部之穩態及相對無菌性。其中，肺泡上皮細胞在肺部穩態中占主導作用，和肺部相關疾病如急性肺損傷、肺纖維化以及組織重建疾病都直接相關。

肺血管內皮細胞形成脈管系統內襯之單層，由於其生理位置暴露於多種損傷因素，例如LPS、內毒素、TNF-α和氧化應激，因此肺血管內皮細胞係各種肺損傷因素攻擊之靶細胞，在ALI/ARDS之發病機制中擔當著重要角色。研究表明處於危險期或具有早期和晚期ARDS患者之支氣管肺泡灌洗液對人肺微血管內皮細胞具有細胞毒性。肺血管內皮細胞在細菌內毒素（lippopolysaccharide, LPS）、細胞因子、氧自由基等之作用下，導致毛細血管通透性增加和肺含水量增加，從而出現肺水腫，呼吸困難；分泌和釋放各種炎性介質和細胞因子，使得促炎和抗炎介質失衡，同時凝血與抗凝系統失衡，引起肺微循環障礙和肺動脈高壓，可以促進肺間質水腫、肺出血和進行性呼吸困難，導致患者出現進行性低氧血症和呼吸窘迫（杜景霞等，2012）。篩選可減輕不利因素導致之肺血管內皮細胞損傷之藥物，有望應用於各種肺損傷相關之疾病之防治，包括各種感染性肺炎、急性肺損傷、ARDS、肺動脈高壓等。

磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3（phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3, PFKFB3）係糖代謝通路中糖酵解途徑之關鍵調節蛋白。PFKFB3在肺損傷過程中扮演關鍵角色。糖酵解酶PFKFB3抑制劑可以改善盲腸結紮和穿刺（CLP）誘導之ALI小鼠之存活率、肺部炎症、乳酸增加和肺細胞凋亡損傷（Gong Y et al, 2017）。厭氧糖酵解也是膿毒症相關ALI細胞凋亡之重要因素，PFKFB3抑制劑可顯著減輕LPS誘導之急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合症（ALI/ARDS）實驗動物之肺損傷（Wang L et al, 2019）。在血管內皮細胞特異性敲除PFKFB3後，顯著降低了內皮細胞之糖酵解水平，使生長因子、促炎細胞因子和細胞黏附因子之表達降低，進而抑制肺血管平滑肌細胞之異常增殖，以及肺血管周炎症細胞之浸潤，抑制了缺氧誘導之肺動脈高壓之發展（Cao Y, 2019）。在平滑肌細胞特異性敲除Pfkfb3後，糖酵解之代謝產物乳酸含量減少，導致依賴ERK1/2之calpain-2的磷酸化激活被減少，引起肺血管平滑肌細胞中骨膠原合成減少，平滑肌細胞之異常增殖也減弱，進而抑制了肺動脈高壓發展過程中之肺血管重構（Kovacset al. , 2019）。

血腦屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）係中樞神經系統與循環系統之間之細胞界面，是腦屏障的一種。血腦屏障之結構包括血管內皮細胞、周細胞、星形膠質細胞足突、基膜等，並與神經元一起構成神經血管單元。血管內皮細胞構成血腦屏障之解剖基礎，允許各種選擇性轉運系統轉運營養物質及其他物質進出腦，保證細胞間隙對親水性溶質之低通透性。越來越多的來自臨床研究、神經病理、流行病學及動物模型等的證據表明，血管通透性增加引起的血腦屏障破壞是腦小血管病的始動因素之一。血管內皮細胞損傷以及內皮組織功能紊亂會引發血腦屏障的通透性增加，導致血液中的成分進入潛在的血管周圍間隙及腦實質，造成神經細胞及膠質細胞的損害。有報道指出血腦屏障的通透性增加早於神經損害及臨床症狀的出現。

多項臨床研究顯示，腦小血管病患者存在腦血流量減少和血管自動調節功能存在障礙，PET和MRI檢查提示白質高信號患者呈現低灌注狀態並存在血管通透性增加以及血腦屏障損害，而灰質無明顯變化，提示血腦屏障受損區域以白質為主。研究顯示，白質病變患者存在血腦屏障通透性之長期改變，同時臨近皮質之白質高信號進展與血腦屏障之受損程度有關，血腦屏障通透性變化造成血漿外滲和周圍組織損害係導致白質病變持續惡化之重要原因。利用DCE-MRI進行之研究顯示，腦小血管病患者較多腦組織存在潛在之血腦屏障滲漏，進一步支持血腦屏障完整性受損係腦小血管病之主要發病機制。

目前臨床上仍然缺乏有效之藥物來治療各種肺部疾病之肺損傷或血管內皮細胞受損介導之疾病，因此提供一種能夠有效治療這些疾病之藥物具有重要之臨床意義。

發明人意外發現，化合物5α-雄甾-3β,5,6β-三醇可以顯著抑制PFKFB3表達上調、顯著抑制乳酸堆積、減輕血管內皮細胞損傷、減輕肺泡上皮細胞損傷、抑制肺泡間隔增厚、減輕肺泡損傷和肺炎性細胞浸潤，從而能夠用於治療由肺泡上皮細胞損傷和/或血管內皮細胞損傷介導的各種疾病。

因此，本發明一方面提供式I的化合物、其氘代物或藥學上可接受的鹽在製備用於預防或治療肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病之藥物中之應用：（式I） 其中R₁ 選自H、-CN、氟、氯、C_1-10 烷基、氟或氯取代之C_1-10 烷基、C_1-10 烷氧基、氟或氯取代之C_1-10 烷氧基和C_3-10 環烷基。在一些實施方式中，所述R₁ 是H、-CHCH₂ CH₃ 、-CH(CH₃ )₂ 、-CH(CH₂ )₃ CH₃ 或-CH(CH₃ )(CH₂ )₃ CH(CH₃ )₂ 。在優選的實施方式中，所述R₁ 是H。

在另一個方面，本發明提供上述任一化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽用於預防或治療肺上皮細胞受損和/或血管內皮細胞受損介導之疾病。

在又一個方面，本發明提供一種預防或治療肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病之方法，所述方法包括向有此需要之對象施用預防上或治療上有效量之上述任一化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽。

在本公開中，對於上述任一個方面：在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓、肺水腫、肺纖維化、早產兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病、肺孢子菌病和肺栓塞中之一種或多種。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的，並且不是由低氧（例如高原環境低氧）引起的。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒或其組合。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）。在一些實施方式中，所述急性肺損傷是手術導致之肺損傷，所述手術例如是亞肺葉切除術、肺葉切除術或全肺切除術等肺切除術、肺部腫瘤切除術或肺移植。在一些實施方式中，所述肺纖維化是特發性肺纖維化或塵肺病。

在本公開中，對於上述任一個方面：在一些實施方式中，所述血管內皮細胞受損介導之疾病包括由血腦屏障破壞介導之腦小血管病，但不包括腦微出血、腦卒中以及腦水腫。在一些實施方式中，所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之通透性增加。在一些實施方式中，所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之血管內皮細胞的損傷。在一些實施方式中，由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之臨床表現為認知損害、步態障礙、情緒障礙、尿失禁和/或抑鬱。在一些實施方式中，由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現包括腦白質病變。在一些實施方式中，由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現僅為腦白質病變。

在本公開中，對於上述任一個方面：在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是心血管疾病或糖尿病血管併發症。在一些實施方式中，所述心血管疾病選自急性心肌梗死（AMI）、心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓、心血管介入術血栓形成中之一種或多種。在一些實施方式中，所述糖尿病血管併發症是糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性傷口癒合受損中之一種或多種。

如本文所用，術語“組合物”指適於給預期動物對象施用以達到治療目的之製劑，其含有至少一種藥物活性組分，例如化合物。任選地，所述組合物還含有至少一種藥物學上可接受之載體或賦形劑。

術語“藥學上可接受之”表示所述物質不具有這樣的特性，即考慮到將被治療之疾病或病症以及各自之施用途徑，該特性將會使理性謹慎之醫學從業者避免給患者服用該物質。例如，對於可注射物來說，通常要求這樣的物質是基本無菌的。

在本文中，術語“預防有效量”和“治療有效量”表示所述物質和物質之量對於預防、減輕或改善疾病或病症之一種或多種症狀，和/或延長接受治療之對象之存活是有效的。

本文使用之“治療”包括給予本申請之化合物或其藥學上可接受之鹽，以減輕疾病或病症之症狀或併發症，或消除疾病或病症。本文使用的術語“減輕”用於描述病症之跡象或症狀之嚴重性降低的過程。症狀可減輕而沒有消除。在一種實施方案中，給予本申請之藥物組合物導致消除跡象或症狀。

本文使用的“預防”包括給予本申請之化合物或其藥學上可接受之鹽，以防止或組織產生特定疾病、症狀或併發症。

本文使用的術語“C_1-10 ”或“C_3-10 ”或類似表達是指具有1至10個或3至10個碳原子。例如C_1-10 烷基是指具有1至10個碳原子之烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、戊基、癸基等。

本文使用之術語“肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病”包括肺上皮細胞受損介導之疾病、血管內皮細胞受損介導之疾病以及肺上皮細胞和血管內皮細胞受損介導之疾病。 式I的化合物、其氘代物及藥學上可接受之鹽

可用于本發明的方法或應用之化合物包括式I之化合物、其氘代物或其藥學上可接受之鹽，（式I）

其中R₁ 選自H、-CN、氟、氯、C_1-10 烷基、氟或氯取代之C_1-10 烷基、C_1-10 烷氧基、氟或氯取代之C_1-10 烷氧基和C_3-10 環烷基。式I之化合物、其氘代物或其藥學上可接受之鹽在本文也稱為“本發明之化合物”或“所述化合物”。

在一種實施方式中，其中R₁ 為H，即所述化合物為5α-雄甾-3β,5,6β-三醇（簡稱 “YC-6”或“YC6”），其結構式如式(II)所示。（式II）

在一個實施方式中，R₁ 為-CHCH₂ CH₃ ，所述化合物是17-亞丙基-雄甾-3β,5α,6β-三醇。在一個實施方式中，R₁ 為-CH(CH₃ )₂ ，所述化合物是17-異丙基-雄甾-3β,5α,6β-三醇。在一個實施方式中，R₁ 為-CH(CH₂ )₃ CH₃ ，所述化合物是17-丁基-雄甾-3β,5α,6β-三醇。在一個實施方式中，R₁ 為-CH(CH₃ )(CH₂ )₃ CH(CH₃ )₂ ，所述化合物是膽甾烷-3β，5α，6β-三醇。

本發明之化合物可以被配製為藥學上可接受鹽之形式。預期之藥學上可接受之鹽形式包括，但不限於，單鹽、雙鹽、三鹽、四鹽等。藥學上可接受鹽在它們被施用之量和濃度下是無毒的。在不阻止其發揮生理效應的情況下，通過改變化合物之物理特性，這樣的鹽之製備可以便於藥理學應用。在物理性質上有用之改變包括降低熔點以便經粘膜給藥，以及增加溶解度以便施用更高濃度之藥物。

藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽，例如那些含硫酸鹽、氯化物、氫氯化物、延胡索酸鹽、馬來酸鹽、磷酸鹽、氨基磺酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、環己氨基磺酸鹽和奎尼酸鹽之鹽。藥學上可接受之鹽可以從酸獲得，所述酸例如鹽酸、馬來酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環己氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。

當酸性官能團例如羧酸或酚存在時，藥學上可接受的鹽也包括鹼加成鹽，例如那些含有苄星青黴素、氯普魯卡因、膽鹼、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁胺、乙二胺、葡甲胺、普魯卡因、鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、銨、烷基胺和鋅的鹽。使用合適之相應之鹼可以製備此類鹽。

通過標準技術，可以製備藥學上可接受的鹽。例如，將游離鹼形式的化合物溶解在合適的溶劑中，例如含有適宜酸的水性溶液或水-醇溶液中，然後蒸發溶液進行分離。在另一個實例中，通過使游離鹼和酸在有機溶劑中反應來製備鹽。

例如，如果特定化合物是鹼，則可以通過本領域可得到的任何合適方法製備所需的藥學上可接受的鹽，例如，用無機酸或有機酸處理游離鹼，所述無機酸例如是鹽酸、氫溴酸、 硫酸、硝酸、磷酸和類似酸，所述有機酸例如是乙酸、馬來酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水楊酸、吡喃糖苷酸（pyranosidyl acid）（如葡糖醛酸或半乳糖醛酸）、α-羥基酸（如檸檬酸或酒石酸）、氨基酸（如天冬氨酸或麩胺酸）、芳香酸（如苯甲酸或肉桂酸）、磺酸（如對甲苯磺酸或乙磺酸）或類似物。

同樣，如果特定化合物是酸，則可以通過任何合適方法製備所需之藥學上可接受之鹽，例如，用無機鹼或有機鹼處理游離酸，所述無機鹼或有機鹼例如是胺（伯胺、仲胺或叔胺）、鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物或類似物。合適之鹽之示範性例子包括有機鹽，其衍生自胺基酸（如L-甘胺酸、L-離胺酸和L-精胺酸）、氨、伯胺、仲胺和叔胺，以及環胺（如羥乙基吡咯烷、呱啶、嗎啉和呱嗪），以及無機鹽，其衍生自鈉、鈣、鉀、鎂、錳、鐵、銅、鋅、鋁和鋰。

化合物的藥學上可接受之鹽可以作為絡合物存在。絡合物之例子包括8-氯茶鹼絡合物（例如，茶苯海明：苯海拉明8-氯茶鹼（1:1）絡合物；暈海寧）和各種包含環糊精之絡合物。

本發明還預期包括使用該化合物之藥學上可接受之氘代化合物或其他非放射性取代化合物。氘代是將藥物活性分子基團中之一個或多個或全部氫替換成同位素氘，因其無毒無放射性，又比碳氫鍵穩定約6~9倍，可以封閉代謝位點而延長藥物之半衰期，從而降低治療劑量，同時又不影響藥物之藥理活性，而被認為是一種優良之修飾方法。 藥物組合物

本發明另一方面提供一種藥物組合物，其包含有效量之式I之化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽，以及藥學上可接受之載體。

在本發明中，“藥物組合物”是指包含式I化合物和藥學上可接受之載體之組合物，其中化合物和藥學上可接受之載體以混合形式存在於組合物中。所述組合物一般將被用於人類對象之治療。然而，它們也可以被用於治療在其它動物對象中之相似之或相同之病症。在本文中，術語“對象”、“動物對象”和類似術語指人和非人類脊椎動物，例如哺乳動物，如非人類靈長類，競技動物和商業動物，例如馬、牛、豬、綿羊、齧齒類動物，和寵物（如狗和貓）。

合適之劑型，部分地取決於用途或給藥之途徑，例如經口、經皮、經粘膜、吸入或通過注射（腸胃外）。此類劑型應當使該化合物能夠到達靶細胞。其它因素在本領域中是熟知的，包括需要考慮之事項，諸如毒性和延遲化合物或組合物發揮其效應之劑型。

載體或賦形劑可以被用於生產組合物。所述載體或賦形劑可以被選擇為促進化合物之給藥。載體之例子包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖（例如乳糖、葡萄糖或蔗糖）、或澱粉類型、纖維素衍生物、明膠、植物油、聚乙二醇和生理相容性溶劑。生理上相容性溶劑之例子包括注射用水（WFI）無菌溶液、鹽溶液和葡萄糖。

可以通過不同之路徑施用組合物或組合物之組分，包括靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、經口、經粘膜、直腸、經皮或吸入。在一些實施方式中，優選注射劑或凍乾粉針劑。對口服而言，例如，化合物可以被配製為常規口服劑型，例如膠囊、片劑，以及液體製劑，例如糖漿、酏劑和濃縮滴劑。

可以獲得口服用途之藥物製劑，例如通過將組合物或其組分與固體賦形劑組合，任選研磨所形成之混合物，以及在加入合適之輔劑之後（如需要）加工顆粒之混合物，從而獲得片劑或糖衣丸。合適之賦形劑特別是填料，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇；纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉（CMC）和/或聚乙烯吡咯烷酮（PVP：聚維酮（povidone））。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或它們之鹽，例如藻酸鈉。

作為選擇，可以使用注射（腸胃外給藥），例如肌內的、靜脈內的、腹膜內的和/或皮下的。對於注射而言，本發明之組合物或其組分被配製為無菌液體溶液，優選在生理相容之緩衝液或溶液中，例如鹽水溶液、Hank溶液或Ringer溶液。另外，組合物或其組分可以被配製為固體形式，並在使用之前一刻被再溶解或懸浮。也可以生產凍乾粉形式。

給藥也可以通過經粘膜、局部或經皮方式。對於經粘膜、局部或經皮給藥，在配方中使用適合待穿透之屏障之穿透劑。這樣的穿透劑在本領域中是普遍已知的，包括，例如，對於經粘膜給藥，膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。另外，去垢劑可以用於促進穿透。經粘膜給藥，例如，可以通過鼻噴霧或栓劑（經直腸或陰道）。

通過標準程序可以確定待施用之各種組分支有效量，考慮之因素例如所述化合物IC₅₀ 、所述化合物之生物半衰期、對象之年齡、大小和體重以及與對象有關之病症。這些因素和其它因素之重要性對本領域普通技術人員而言是熟知的。一般而言，劑量將在被治療之對象之大約0.01 mg/kg至50 mg/kg之間，優選在0.l mg/kg至20 mg/kg之間。可以使用多次劑量。

本發明之組合物或其組分還可以與治療相同疾病之其他治療劑結合使用。這種結合使用包括在不同時間施用這些化合物以及一種或多種其他治療劑，或同時使用這種化合物和一種或多種其他治療劑。在一些實施方式中，可對本發明之一種或多種化合物或結合使用之其他治療劑之劑量進行修改，例如，通過本領域技術人員已知的方法降低相對於單獨使用之化合物或治療劑之劑量。

要理解的是，結合使用或聯用包括與其他療法、藥物、醫學程序等一起使用，其中該其他療法或程序可在不同于本發明之組合物或其組分之時間（例如，在短期內（如幾個小時，如1、2、3、4-24小時）或在較長時間內（如1-2天、2-4天、4-7天、1-4周））(或在與本發明的組合物或其組分相同之時間被施用。結合使用還包括與一次或不頻繁施用之療法或醫學程序（如手術）一起使用，並伴隨本發明的組合物或其組分在該其他療法或程序之前或之後之短期或較長時間段內之施用。在一些實施方式中，本發明用於遞送本發明之組合物或其組分和一種或多種其他藥物治療劑，它們通過相同或不同給藥途徑遞送。

任何給藥途徑之結合施用包括通過相同給藥途徑將本發明之組合物或其組分和一種或多種其他藥物治療劑以任何製劑形式一起遞送，包括兩種化合物化學地相連且它們在施用時保持各自治療活性之製劑。在一個方面，該其他藥物療法可與本發明的組合物或其組分共同施用。通過共同施用之結合使用包括施用共製劑（co-formulation）或化學上連接之化合物之製劑，或在短期內（例如，1小時內、2小時內、3小時內、直至24小時內）施用兩種或多種獨立製劑形式之化合物，它們以相同或不同之途徑給藥。

獨立製劑之共同施用包括經由一個裝置之遞送之共同施用，例如相同吸入裝置、相同注射器等，或相對彼此短期內由不同裝置施用。通過相同給藥途徑遞送之本發明之化合物和一種或多種額外的藥物療法之共製劑包括將材料一起製備從而它們可通過一個裝置被施用，包括不同化合物組合在一種製劑中，或化合物被修飾從而使得它們在化學上連接在一起但仍保持各自之生物學活性。這種化學上連接的化合物可包括將兩個活性成分分開之連接體，該連接體在體內基本維持，或在體內可能降解。 醫藥用途及治療方法

在一個方面，本發明提供所述任一化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽在製備用於預防或治療肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病之藥物中之應用。在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病選自急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓、肺水腫、肺纖維化、早產兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病、肺孢子菌病和肺栓塞中之一種或多種。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的，並且不是由低氧引起的。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒或其組合。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）。在一些實施方式中，所述急性肺損傷是手術導致的肺損傷，所述手術例如是亞肺葉切除術、肺葉切除術或全肺切除術等肺切除術、肺部腫瘤切除術或肺移植術。在一些實施方式中，其中所述肺纖維化是特發性肺纖維化或塵肺病。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導的疾病是肺損傷。在優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導的疾病是急性肺損傷。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性呼吸窘迫綜合症。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是肺動脈高壓。

在一些實施方式中，所述血管內皮細胞受損介導之疾病包括由血腦屏障破壞（或受損）介導之腦小血管病，但不包括腦微出血、腦卒中以及腦水腫。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之通透性增加。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障的血管內皮細胞之損傷。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之臨床表現為認知損害、步態障礙、情緒障礙、尿失禁和/或抑鬱。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現包括腦白質病變。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現僅為腦白質病變。

在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是心血管疾病或糖尿病血管併發症。在一些實施方式中，所述心血管疾病選自急性心肌梗死（AMI）、心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓、心血管介入術血栓形成中之一種或多種。在一些實施方式中，所述糖尿病血管併發症是糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性傷口癒合受損中之一種或多種。

在一個方面，本發明提供一種預防或治療肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病之方法，所述方法包括向有此需要之對象施用預防上或治療上有效量之本發明之任一化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽。在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病選自急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓、肺水腫、肺纖維化、早產兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病、肺孢子菌病和肺栓塞中之一種或多種。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的，並且不是由低氧引起的。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒或其組合。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）。在一些實施方式中，所述急性肺損傷是手術導致之肺損傷，所述手術例如是亞肺葉切除術、肺葉切除術或全肺切除術等肺切除術、肺部腫瘤切除術或肺移植術。在一些實施方式中，其中所述肺纖維化是特發性肺纖維化或塵肺病。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是肺損傷。在優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性肺損傷。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性呼吸窘迫綜合症。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是肺動脈高壓。

在一些實施方式中，所述血管內皮細胞受損介導之疾病包括由血腦屏障破壞（或受損）介導之腦小血管病，但不包括腦微出血、腦卒中以及腦水腫。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之通透性增加。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之血管內皮細胞之損傷。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之臨床表現為認知損害、步態障礙、情緒障礙、尿失禁和/或抑鬱。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現包括腦白質病變。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現僅為腦白質病變。

在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是心血管疾病或糖尿病血管併發症。在一些實施方式中，所述心血管疾病選自急性心肌梗死（AMI）、心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓、心血管介入術血栓形成中之一種或多種。在一些實施方式中，所述糖尿病血管併發症是糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性傷口癒合受損中之一種或多種。

本發明另一方面提供本發明之任一化合物、其氘代物或藥學上可接受之鹽用於預防或治療肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病。在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病選自急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓、肺水腫、肺纖維化、早產兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病、肺孢子菌病和肺栓塞中之一種或多種。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的。在一些實施方式中，所述急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合症、肺動脈高壓或肺水腫是由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷和/或中毒引起的，並且不是由低氧引起的。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒或其組合。在一些實施方式中，所述病毒是冠狀病毒（例如是新型冠狀病毒SARS-CoV-2）。在一些實施方式中，所述急性肺損傷是手術導致之肺損傷，所述手術例如是亞肺葉切除術、肺葉切除術或全肺切除術等肺切除術、肺部腫瘤切除術或肺移植術。在一些實施方式中，其中所述肺纖維化是特發性肺纖維化或塵肺病。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是肺損傷。在優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性肺損傷。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是急性呼吸窘迫綜合症。優選之實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是肺動脈高壓。

在一些實施方式中，所述血管內皮細胞受損介導之疾病包括由血腦屏障破壞（或受損）介導之腦小血管病，但不包括腦微出血、腦卒中以及腦水腫。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之通透性增加。在一些實施方式中，其中所述血腦屏障破壞表現為血腦屏障之血管內皮細胞之損傷。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病的臨床表現為認知損害、步態障礙、情緒障礙、尿失禁和/或抑鬱。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現包括腦白質病變。在一些實施方式中，其中由血腦屏障破壞介導之腦小血管病之影像學表現僅為腦白質病變。

在一些實施方式中，所述肺上皮細胞和/或血管內皮細胞受損介導之疾病是心血管疾病或糖尿病血管併發症。在一些實施方式中，所述心血管疾病選自急性心肌梗死（AMI）、心絞痛、冠心病、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓、心血管介入術血栓形成中之一種或多種。在一些實施方式中，所述糖尿病血管併發症是糖尿病性視網膜病變、糖尿病性腎病、糖尿病性傷口癒合受損中之一種或多種。 疾病或病症急性肺損傷 / 急性呼吸窘迫綜合症（ ALI/ARDS ）

急性肺損傷（ALI）是肺臟炎症和肺微血管通透性增加的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，其最終階段即急性呼吸窘迫綜合症（ARDS）。多種因素可引起急性肺損傷，包括但不限於，高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷、中毒等。例如，在感染性肺炎（如細菌性肺炎或病毒性肺炎）中之或由其引起之急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合症。例如，新型冠狀病毒感染的肺炎（Corona Virus Disease 2019, COVID-19）之病理生理學特徵包括：新型冠狀病毒主要攻擊患者肺部，導致患者彌漫性肺泡損傷，伴隨細胞纖維黏液樣滲出物，同時可見肺細胞脫落和肺透明膜形成。從而嚴重影響肺之通氣/換氣功能，發展為急性呼吸窘迫綜合征。臨床研究還發現，有些患者在病毒核酸檢測轉陰之後，肺部損傷仍然長時間存在，甚至還會進一步惡化。

在ALI中，肺血管內皮細胞之改變尤為引人注目，血管內皮細胞受損已被視為ALI發生、發展之病理基礎。肺動脈高壓（PAH）是各種原因引起ALI早期之主要表現之一。PAH可以促進肺間質水腫，肺出血和進行性呼吸困難，肺血管內皮細胞之功能障礙和損傷可能是ALI時PAH形成之關鍵因素。血管內皮功能紊亂出現於血管改變之前，是可逆的，因此研究和認識其發生和發展規律及其調控機制，對防治ALI具有重要意義。

研究證實，ALI/ARDS死亡之患者中肺泡上皮細胞之破壞非常明顯，儘管肺毛細血管也有一定程度之損傷，但是仍以上皮細胞之損傷為主。在肺泡之液-氣界面，肺泡上皮細胞使肺泡內襯液維持適當之水和溶質含量，這對氣體交換以及宿主抵抗病毒及細菌等病原體至關重要。若肺內存在內皮通透性改變，肺間質及肺泡腔內之水腫液最終將被清除，也不會發展為肺間質纖維化。相反，肺泡上皮細胞之大量損傷會增加蛋白通透性、降低肺泡液體和肺泡蛋白清除率，進而造成肺泡內聚集大分子量之蛋白及無序修復，導致氣體交換惡化。在ALI過程中肺泡上皮之破壞導致上皮細胞的脫落及隨之富含蛋白的水腫液滲入肺泡腔，加速肺泡屏障的破壞。上皮細胞破壞之形式包括凋亡及壞死。在ARDS死亡患者及高氧環境、LPS刺激、盲腸結紮穿孔、缺血再灌注、呼吸機相關肺炎及呼吸機相關肺損傷動物模型均可發現肺泡壁存在這兩種死亡方式。壞死導致細胞膜破壞，胞質溢出，進一步激發炎症反應。肺泡收到機械損傷、高溫、局部缺血或細菌產物刺激均可直接導致壞死。凋亡與表面死亡受體相關，通過細胞清除僅引起輕微炎症。廣泛上皮細胞凋亡及分離導致細胞基底膜暴露於肺泡腔之炎症產物，如氧化劑、蛋白酶及炎症因子。上皮細胞破壞引起成纖維細胞的增殖及膠原形成可能導致肺纖維化。在損傷之後，修復肺泡上皮完整性對於恢復上皮細胞之正常功能及清除肺水腫十分重要。一系列研究證實ALI/ARDS患者自身產生或是否入肺泡腔內之某些因子會促進上皮修復。這些可溶性因子來自於患者肺內之成纖維細胞、巨噬細胞、內皮細胞、上皮細胞、細胞外基質、血漿滲出物，組成細胞因子、趨化因子、生長因子、前列腺素及機制成分。儘管對ALI/ARDS研究很多，但是患者病死率居高不下。由於現有藥物治療效果不佳，所以ARDS的治療仍以支持治療為主。決定ALI嚴重性和進展之主要因素之一是肺泡上皮損傷成都。從上皮細胞的治療角度出發，抑制上皮細胞的早起損傷，加速上皮細胞修復，消除肺水腫，都將是提高患者生存率之有效措施。特發性肺纖維化（ IPF ）

特發性肺纖維化（IPF）是肺泡上皮細胞損傷、組織異常增生導致之肺部疾病。研究證實，發病機制為多種原因導致肺泡上皮細胞之損傷，最後導致成纖維細胞增殖和肌成纖維細胞聚集，形成成纖維細胞灶。上皮細胞凋亡可能是IPF早期發生發展之重要因素。炎症反應、細胞內張力、端粒酶活性等因素參與了肺泡上皮細胞凋亡，並在肺纖維化發病之早期階段起到重要作用。IPF的重要病理特徵表現為成纖維細胞活躍增殖形成之纖維化灶。成纖維細胞灶是上皮細胞損傷和修復之部位，上皮細胞損傷後能分泌之多種介質促使成纖維細胞之遷移、增殖、分化，從而引起肺泡內廣泛之纖維化，最終導致進行性呼吸困難。IPF之發病機制可能是肺泡上皮細胞損傷後之異常再上皮化和成纖維細胞異常增殖所致。IPF中之細胞死亡表現為上皮細胞損傷後之細胞凋亡，在疾病發生中起重要作用。研究證實，誘導肺上皮細胞凋亡能導致肺組織發生纖維化。肺泡上皮細胞損傷作為肺纖維化發生之最初因素是目前最為學者們接受之理論假設，靶向降低肺泡上皮細胞凋亡之藥物可能為防止IPF提供新的治療方案。研究表明，肺組織中之有氧糖酵解與肺纖維化密切相關。Hu等（2020）發現PFKFB3抑制劑3PO可以逆轉LPS誘導之肺纖維化之小鼠模型中PFKFB3表達之顯著上調和有氧糖酵解增強。塵肺病

塵肺病是長期吸入生產性粉塵引起之以肺組織不可逆性纖維化為主之全身性疾病。目前塵肺病尚缺乏特效治療方法，再粉塵導致肺纖維化的病理過程中，部分肺泡上皮細胞異常激活，也有損傷和凋亡，由於上皮細胞修復紊亂、促纖維化因子釋放以及上皮間質轉化（EMT）等過程，促進成纖維細胞灶和肌成纖維細胞灶形成以及大量細胞外基質產生，最終引起肺泡結構破壞和肺纖維化發生。高氧肺損傷

高氧肺損傷是一種以彌漫性肺細胞損傷為基礎，可迅速影響氣體交換之肺部炎症性疾病。高氧肺損傷是呼吸高於常壓下體積分數為21%之高分壓氧氣或高於1個絕對大氣壓之高壓氧而發生之包括肺型氧中毒在內的急慢性非損害之統稱。由於新生兒，特別是早產兒，抗氧化酶系統和肺表面活性物質發育不成熟，高氧進入肺部後，產生氧自由基，引起細胞損傷、凋亡、壞死，同時產生炎症介質，炎症細胞浸潤，從而導致肺部炎症反應、組織損傷和異常修復之發生。高氧引起肺泡上皮細胞氧化損傷，抑制了肺泡化之進程，廣泛肺泡上皮細胞之損傷及損傷修復能力之下降使氣血屏障通透性明顯增加出現肺水腫之表現，促進了ALI之發生。早產兒慢性肺疾病

早產兒慢性肺疾病(chronic lung disease, CLD)是早產兒長時間吸入高濃度氧或機械通氣治療或感染後最常見之和最嚴重之併發症。早產兒CLD作為早產兒肺透明膜病治療之併發症在1967年首次被Northway描述，也稱為支氣管肺發育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)。氧療法是患有心肺疾病之早產兒最常應用的一種治療手段。這一措施雖可改變患兒之低血氧狀態、挽救患兒的生命，但長期吸入高濃度的氧氣，可引起不同程度的肺損傷，嚴重者可發展為CLD。隨著機械通氣的廣泛開展、早產兒管理技術的日益提高及肺表面活性物質之普遍應用，使早產兒，特別是超低出生體重兒(extremely low birth weight, ELBW)(出生體重1000g存活率有了明顯改善,但隨之而來的是早產兒慢性肺疾病發生率之提高,國外已達30%-40%,國內也有上升趨勢。由於尚缺乏有效的監控和防治手段,其中10%-15%CLD患兒因嚴重肺功能障礙而死於呼吸衰竭,存活者也需長期依賴氧氣或機械通氣治療。初期肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cell，AEC)損傷和晚期肺纖維化是CLD主要病理特徵。目前多試圖通過減輕AEC損傷程度或減少肺組織膠原沉積而達到有效防止CLD之目的。慢性阻塞性肺病

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是全球範圍內呼吸系統疾病中發病率和死亡率居於前位之疾病，並且其發病還呈蔓延之勢。已知吸煙是導致COPD之主要病因，香煙煙霧(cigarette smoke，CS)是一種富含氧化劑成份的複雜之混合物，在構成肺臟之多種細胞類型中，肺泡上皮細胞是遭受CS中氧化劑損傷之主要部位。研究顯示，COPD患者肺泡上皮細胞凋亡指數明顯高於肺血管內皮細胞凋亡指數，且二者呈正相關。內皮細胞之損傷與凋亡首先破壞肺泡結構之完整性，而後可能出現肺泡上皮細胞之損傷或凋亡。內皮細胞損傷或凋亡後，可能通過直接之細胞間相互作用和間接之某種機制，啟動觸發了其他細胞尤其是肺泡上皮細胞凋亡，從而形成COPD及肺氣腫。此外，COPD患者存在血管內皮功能紊亂，且與疾病之嚴重程度具有相關性。血管內皮細胞功能異常與COPD的發生、發展有著緊密之關聯。炎症、血管損傷、血液動力學改變、低氧、氧化應激和凋亡等可促進血管內皮細胞功能紊亂。研究顯示，即使是COPD早期，甚至在肺功能正常之健康吸煙者中，血管內皮細胞功能已發生改變。血管內皮細胞功能之異常變化可能在COPD之發生、發展以及相關之心血管事件高發中具有重要作用。肺孢子菌病

肺孢子菌病是由肺孢子菌引起之間質性肺炎（肺孢子菌肺炎，PCP），臨床主要表現為發熱、乾咳、進行性呼吸困難等，單純吸氧不能緩解，經對因治療後可迅速恢復，多發生於免疫功能低下者，艾滋病患者的發病率高達70-80%。肺孢子菌毒力弱，健康人多呈隱性感染，只有在宿主免疫功能低下時，潛伏之肺孢子菌才大量繁殖，導致PCP發生。吸入下呼吸道之肺孢子菌直接導致I型肺泡上皮細胞損傷並壞死，肺泡毛細血管通透性增加，肺泡內充滿肺孢子菌和泡沫狀嗜酸性物質，使肺泡的表面活性物質減少，影響氣體交換，出現低氧血症（PCP患者最主要的特點）。肺泡II型上皮細胞代償性肥大，肺泡間隙上皮細胞增生、肥厚、部分脫落，同時間質內巨噬細胞和漿細胞增生，間質纖維化，造成肺功能嚴重障礙。肺栓塞

肺栓塞是脫落之血栓或其他物質阻塞肺動脈或其分支之病理過程，是一種具有較高發病率和死亡率之常見疾病。血管內皮細胞損傷是引發肺栓塞之第一要素。內皮細胞通過微粒、組織因子等生物分子作用于血小板和中性粒細胞，參與血栓形成。由於血管內皮細胞損傷和修復在肺栓塞過程中具有重要地位，近年來關於肺栓塞的發生、發展機制的研究也越來越著重于對內皮細胞損傷和修復的分子學、細胞學、病理學之探索。心血管疾病

血管內皮細胞受損與許多心血管疾病的發生和發展有關，血管內皮損傷引發血栓形成是許多心血管疾病的病理基礎。最早在亞急性心內膜炎病人的外周血中發現有脫落的血管內皮細胞，隨著研究的深入，人們發現許多心血管疾病的循環內皮細胞均有不同程度的變化。急性心肌梗死（AMI）和心絞痛患者的循環內皮細胞明顯增加並可持續數天。冠心病急性發作和家中是由於內皮細胞損傷後發生功能變化，血管內皮細胞損傷程度和病情嚴重程度一致。國內研究發現，缺血性心臟病中AMI 46小時內循環內皮細胞較正常人明顯增加，可持續24小時。再灌注時造成的損傷亦可致循環內皮細胞增多。冠心病合併其他危險因素如心力衰竭（CHF）時，可使循環內皮細胞升高明顯。研究發現，CHF越重，血管內皮受損越明顯，血管內皮受損反過來加重病情。此外，很多研究表明，內皮細胞損傷導致的功能障礙與高血壓密切相關，一方面血管內皮功能障礙在高血壓的發生、發展過程中起重要作用，另一方面高血壓本身又加重血管內皮障礙，形成惡性循環。高血壓大鼠的內皮細胞在損傷的臟器血液中明顯提高，高血壓患者的循環內皮細胞明顯高於常人，其增加數量較冠心病患者更高。心血管介入術主要是機械刺激血管內皮，導致損傷。不同術式對血管內皮的損傷程度不同。血管內皮細胞受損時引起內皮功能失調，血液動力學發生改變，由此引發大量誘聚物和血管活性物質在損傷血管局部堆積，血小板活化，是心血管介入術血栓形成的主要病理生理機制。糖尿病血管併發症

研究證實，無論是長期高血糖還是急性高血糖都能對人和動物內皮功能造成損傷。血管內皮功能障礙是糖尿病血管併發症（尤其是視網膜病變、腎病和傷口癒合受損）發生之重要原因，血管內皮功能之改變也是糖尿病其他發病機理之重要因素，主要體現在胰島素抵抗、脂毒性和胰島素分泌受損。目前認為，血管內皮功能損傷是糖尿病血管病變發生之始動因素和主要病理生理學基礎，甚至尚未出現慢性血管併發症之糖尿病患者已出現內皮功能明顯降低。腦小血管病

腦小血管指腦之小的穿支動脈和小動脈(直徑40~200μm)、毛細血管及小靜脈,它們構成了腦組織血供之基本單位，對腦功能之維持起著重要作用。腦大、小血管共同構成了腦血管樹（vascular tree），它們在結構上有連續性，共同受到血流動力學影響，共同暴露於危險因素，因此腦大、小血管病變從理論上應具有嚴重程度之平行相關性。但在臨床工作中常常會發現二者之不一致性，例如常常發現有嚴重腦小血管病變但並不合併腦大動脈狹窄之患者，反之亦然。

腦小血管病(cerebral small vessel disease , CSVD) 泛指上述小血管之各種病變所導致之臨床、認知、影像學及病理表現之綜合症，習慣上多指小的穿支動脈和小動脈病變所導致的臨床和影像學表現。CSVD 主要以卒中(深部小梗死、腦出血)、認知和情感障礙及總體功能下降為突出的臨床表現，影像學上則突出表現為腔隙性梗死（lacunar infarction，LI）、腔隙(lacune)、腦白質病變(white matter lesions, WML)、血管周圍間隙擴大（enlarged perivascular space, EPVS）及腦微出血（cerebral microbleeds, CMB）等。

腦小血管病可以累及小動脈、毛細血管以及小靜脈，以穿通動脈受累最為常見。高血壓、血管炎症或遺傳缺陷引起之血管內皮細胞損傷、平滑肌增生、小血管壁之基底膜增厚都可以引起慢性腦組織缺血。血管平滑肌細胞丟失和增生、血管壁增厚、血管官腔狹窄，引起慢性、進行性之局部甚至是彌散性亞臨床缺血，神經細胞脫髓鞘、少突膠質細胞丟失、軸索損傷，造成不完全性缺血。此階段沒有臨床症狀，核磁共振檢查顯示為腦白質病變。此外，另一些研究結果認為內皮損傷後血管通透性增加導致血管內物質外滲，引起血管及血管周圍組織損傷，對這一階段疾病之進展可能也發揮著重要作用。

在本公開中，所述血管內皮細胞受損介導之疾病包括由血腦屏障破壞或受損介導之腦小血管病，但不包括腦微出血、腦卒中以及腦水腫。在本發明之特別優選之實施方式中，由血腦屏障破壞介導之腦小血管病包括腦白質病變。在本發明之特別優選之實施方式中，由血腦屏障破壞介導之腦小血管病僅表現為腦白質病變。實施例 實施例 1. YC-6 顯著快速抑制麩胺酸引起之 PFKFB3 之表達上調

研究表明，磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(phosphofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3, PFKFB3)表達增加及其下游產物乳酸之堆積在急性肺損傷、肺動脈高壓等多種肺部疾病中扮演病理損傷性角色。在急性肺損傷、肺動脈高壓等疾病發生發展中有關鍵性病理損傷作用。我們分析了YC-6對肺損傷關鍵分子PFKFB3蛋白水平之影響。結果出人意料地顯示，YC-6快速抑制PFKFB3蛋白表達上調和乳酸堆積，提示了這可能是YC-6肺保護之獨特機制。原代小腦顆粒神經元培養

細胞取材自 SD P7-8 新生乳鼠，取出小腦，使用顯微鑷進一步除去腦膜和血管；將分離出之小腦組織轉移至另一裝有解剖液之培養皿。利用組織剪盡可能將組織剪碎。消化：用滴管將剪碎之組織加入7 mL 0.25%胰蛋白酶消化液中，在 37℃ 消化15 mins；整理細胞超淨台檯面並清洗器械。每五分鐘上下顛倒幾次使得組織與消化液更充分接觸。終止消化：消化結束後，可以看到由於細胞破碎 DNA 釋放會使得組織粘連在一起懸浮在液體中。加入 3 mL 含DNA酶的 10%FBS DMEM培養基終止消化，上下顛倒幾次可同時觀察到由於DNA之水解使得剩餘的組織分散開來。1000 rpm 離心5 mins。小心盡可能去除上清。收集單細胞懸液：用滴管吸取 7 mL含DNA酶之 10%FBS DMEM培養基，輕柔吹打組織沉澱。快速離心使轉速達到 1500 rpm 即停止，收集單細胞懸液至一新的 15 mL 離心管中。接種細胞：1000 rpm 離心 5 分鐘，收集細胞沉澱，用含10%FBS之DMEM 重懸細胞。手持細胞計數儀進行計數，接種密度為 4.0-5.0×10⁵ 個/mL。35 mm 培養皿接種體積為 2 mL，48 孔板接種體積為 300 μL。細胞接種與培養：接種 24 小時後,補充阿糖胞苷（終濃度為 10 μM）抑制膠質細胞之生長。第七天時補充葡萄糖（5 mM）維持營養,  第八天使用。麩胺酸誘導之原代小腦顆粒神經元損傷模型及藥物處理。細胞處理與給藥

將種植在六孔板之原代小腦顆粒神經元之培養基換成2 mL kreb’s buffer, 以此作為正常對照組。加入終濃度為200 μM之麩胺酸處理5mins以及15mins相應之時間並將此作為模型組；提前20 mins預孵10 μM YC-6或者NMDA受體阻斷劑MK-801, 然後加入上述濃度的麩胺酸進行處理相應時間作為藥物處理組；加入和藥物處理組等量之溶劑HP-β-CD作為溶劑對照組，並且其預孵時間和藥物處理組相同。蛋白免疫印跡

配製體積分數為 12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠，按照每孔上樣蛋白總量為 20 μg進行樣品加注，100V恒壓條件下電泳分離；之後用濕轉法轉移到PVDF膜。5% 脫脂奶粉室溫封閉 1h；加入稀釋後之一抗（抗體稀釋液為 3% BSA，抗體稀釋比例為1：1000），4℃ 孵育過夜；TBST洗滌3次, 每次5 mins, 加入相應二抗（抗體稀釋液為 3% BSA，抗體稀釋比例為1：5000）, 室溫孵育1 h，TBST 洗滌 3次，每次5 mins。化學發光法顯色曝光拍照。YC-6 顯著快速抑制麩胺酸引起之 PFKFB3 之表達上調

如圖1所示，與正常對照組相比，麩胺酸刺激導致胞內PFKFB3表達快速上調，而YC-6處理顯著抑制這種急速上升。實施例 2. YC-6 對肺上皮損傷關鍵代謝分子乳酸之作用

乳酸係厭氧糖酵解產物，係PFKFB3調控之代謝通路下游，對肺上皮細胞直接產生損傷作用。Gong Y等研究證實，在體外LPS引起人肺泡上皮A549細胞之凋亡、炎性細胞因子產生、糖酵解通量增強和活性氧（ROS）增加，並且這些變化被PFKFB3抑制劑3PO逆轉。更為重要的是，乳酸也是導致肺損傷之關鍵代謝物，乳酸處理A549細胞會導致細胞凋亡和ROS增強。這些結果表明厭氧糖酵解可能是膿毒症相關ALI肺上皮細胞凋亡損傷之重要因素。在YC-6抑制PFKFB3表達基礎上，我們進一步探討YC-6對其下游具備肺上皮細胞損傷作用之乳酸水平之影響。結果顯示，YC-6抑制糖酵解關鍵酶PFKFB3的同時，顯著抑制了乳酸堆積。乳酸堆積之減輕可能是YC-6減輕肺上皮細胞損傷之機制之一。細胞胞內乳酸測定

預處理：胞內乳酸含量測定使用之細胞數量為 1-2*10^6。細胞前處理具體實驗步驟包括以下，用預冷之Kreb’s buffer 清洗細胞三次。加入 220 μL 之細胞裂解液充分裂解。細胞後收集裂解液至 1.5 mL EP 管內。4℃16000 g 條件下離心 5 mins，收集上清160 μL 至新的EP管內，其餘上清做BCA蛋白定量。加入56 μL 4 mM HClO₄ ,上下顛倒充分混勻，至冰上反應五分鐘除去樣品本身已有之 LDH，防止內源性干擾，此步驟應觀察到管底有白色蛋白沉澱。4℃16000g離心 5 mins。收集上清 160 μL，將其置於新的 EP 管內。加入 68 μL 2mM KOH 充分上下混勻，至冰上反應 5 mins。 4℃16000g 條件下離心 15 mins, 收集 160 μL 上清至新的 EP 管內，如果上清有白色絮狀物，則再次離心 15 mins。將上清按照 600-800 稀釋倍數用細胞裂解液稀釋，並將此稀釋液作為待測樣品液備用。

胞內乳酸含量測定方法根據L-Lactate Assay試劑盒（abcam, ab65331）說明書來測定。具體步驟為：取50 μL的稀釋液加入到96孔黑底之細胞培養板中，隨即加入等體積的含有LDHA之底物溶液，搖晃混勻後將其放置在37℃無二氧化碳之孵箱中孵育30 mins。用酶標儀在避光，激發光波長為535 nm之條件下測定熒光強度。將樣品中讀出的熒光強度帶入到不同標準品乳酸濃度對應的熒光強度的標準曲線中，將熒光強度轉化為樣品液中乳酸之實際濃度。YC-6 顯著抑制麩胺酸引起之 PFKFB3 下游糖酵解終產物乳酸之胞內堆積

將原代小腦顆粒神經元細胞置於200 uM麩胺酸刺激15 mins後收集細胞裂解液研究YC-6處理對糖酵解產物乳酸的影響（圖2），麩胺酸刺激15 mins後神經元胞內乳酸含量顯著增加，而YC-6處理抑制了這種增加。以上實驗結果表明，YC-6抑制糖酵解關鍵酶PFKFB3的同時，顯著抑制了乳酸堆積。實施例 3. YC-6 顯著減輕血管內皮細胞損傷

肺血管內皮細胞形成脈管系統內襯的單層，由於其生理位置暴露於細菌內毒素、LPS、炎症因子如TNF-α、化學毒物和氧化應激等直接刺激之下，導致內皮細胞之損傷與凋亡。肺血管內皮細胞受損傷後引起毛細血管通透性增加導致肺含水量增加，從而出現肺水腫，呼吸困難；同時肺血管內皮細胞分泌和釋放各種炎性介質和細胞因子，使得促炎和抗炎介質、凝血與抗凝系統失衡，引起肺微循環障礙和肺動脈高壓，可以促進肺間質水腫、肺出血和進行性呼吸困難，患者出現進行性低氧血症和呼吸窘迫。為評價YC-6是否對血管內皮細胞損傷具有保護作用，應用氧糖剝奪/再復氧（oxygen-glucose deprivation and restoration, OGD-R）損傷模型，通過檢測細胞LDH釋放評價預防以及治療性給藥後細胞損傷情況。結果顯示YC-6劑量依賴性地顯著減輕血管內皮細胞損傷，提示在各種病理因素引起之血管內皮細胞相關之肺損傷過程中YC-6可發揮有效保護作用。細胞培養

HUVEC細胞用含10%胎牛血清之改良型DMEM培養基培養，待細胞長至約80%融合度的時候，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然後用含10%肽牛血清的改良型DMEM培養基吹打均勻，把細胞濃度調整至1×10⁵ 個/mL，按400 uL/孔接種于24孔板，待細胞長至約70%融合度的時候進行實驗。RAOEC細胞用含10%胎牛血清之高糖DMEM培養基培養，接種條件與HUVEC一致。構建氧糖剝奪 - 復氧（ OGD-R ）損傷模型

設置缺氧工作站之氧氣濃度為1%（1% O₂ ，5% CO₂ ，94% N₂ ），溫度為37℃，濕度為85%。把無糖DMEM培養基置於缺氧工作站預缺氧3小時。吸走培養板中之培養基，用預熱之無糖DMEM培養基洗2遍，然後每孔加入100 uL之無糖DMEM培養基，將培養板置於缺氧工作站，每孔再加入300 uL預缺氧之無糖DMEM培養基，然後將培養板靜置於缺氧工作站繼續缺氧4小時。然後進行復氧處理，把培養板取出，把無糖DMEM培養基更換為400 uL含10%肽牛血清的正常培養基，然後置於37℃ 5% CO₂ 細胞培養箱繼續培養24小時。正常組的細胞僅把培養基更換為400 uL新的含10%胎牛血清之正常培養基。給藥方法

預防性給藥：細胞在進行氧糖剝奪處理前，先預敷溶劑或藥物（終濃度為1 μM、3 μM、10 μM）1小時，然後在氧糖剝奪處理時，在無糖DMEM培養基中加入對應之溶劑或藥物，復氧處理時，在正常培養基中加入對應之溶劑或藥物，直至實驗終點。模型對照組不加任何藥物處理，每個處理組進行3個複孔重複。

治療性給藥：對細胞進行氧糖剝奪處理後，在復氧處理的同時，給與溶劑或藥物（終濃度為1 μM、3 μM、10 μM），直至實驗終點。模型對照組不加任何藥物處理，每個處理組進行3個複孔重複。細胞損傷檢測（ LDH 檢測）

實驗終點時，每孔各取50 uL培養基到96孔板，然後按照LDH檢測試劑盒的操作指引進行細胞毒性檢測，結果計算如下：

實驗結果用One-way Anova單因素方差分析法進行統計分析，並使用Tukey法進行多重比較，P ＜ 0.05認為具有顯著性統計學差異。實驗結果

如圖3結果顯示，OGD-R處理引起人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和大鼠血管內皮細胞（RAOEC）LDH釋放之增加，說明OGD-R損傷處理引起了HUVEC細胞和RAOEC細胞之損傷和死亡；而無論給予損傷處理之前一小時預防性給藥還是在復氧處理時治療性給藥，YC-6劑量依賴性顯著減輕OGD-R引起之LDH釋放增加，減輕細胞損傷。YC-6劑量依賴性地顯著減輕血管內皮細胞損傷，提示在各種病理因素引起的血管內皮細胞相關的肺損傷過程中YC-6可發揮有效保護作用。實施例 4. YC-6 減輕缺氧和 LPS 引起之肺泡上皮細胞損傷

肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞係各種炎症、有毒物吸入、病毒感染以及膿毒症等損傷性致病因素打擊之直接目標，損傷後通透性增加、發生凋亡，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致進行性低氧血症和呼吸窘迫。在新冠肺炎發病過程中，肺上皮細胞就是病毒攻擊的主要目標。新型冠狀病毒（SARS-CoV-2，以下簡稱CoV）係一種單正鏈RNA病毒，長度約為27-32 kb，病毒基因組主要由複製酶編碼區和結構蛋白編碼區兩部分構成。來自NIH團隊等報道確定了2019-nCoV進入人體細胞的受體為ACE2。CoV特異識別和入侵血管緊張素轉化酶2受體ACE2表達豐富之人體細胞，尤其是呼吸道上皮細胞和肺泡細胞，因此極易在下呼吸道感染和擴散，引發肺炎。但在臨床上可以觀察到在病毒轉陰後，肺部炎症仍然可以存在甚至惡化，單純之抗病毒治療並不能挽救許多重症和危重症患者之生命。肺上皮細胞（HPAEpiC）包括全部兩種Ⅰ或Ⅱ型肺泡上皮細胞，為評價YC-6是否直接對肺上皮細胞（HPAEpiC）具有保護作用，本部分應用細菌脂多糖LPS和缺氧損傷模型，通過檢測細胞LDH釋放評價YC-6對肺上皮細胞之保護作用，為YC-6治療包括新冠病毒在內等不同因素引起之ARDS提供實驗依據。實驗結果顯示YC-6劑量依賴性顯著減輕缺氧和LPS引起之肺泡上皮細胞損傷。細胞培養

HPAEpiC 細胞用肺泡上皮細胞培養基培養，待細胞長至約80%融合度的時候，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然後用肺泡上皮細胞培養基吹打均勻，把細胞濃度調整至2×10⁵ 個/mL，按400 uL/孔接種于24孔板，待細胞長至約70%融合度的時候進行實驗。LPS + 缺氧模型之製作

設置缺氧工作站之氧氣濃度為1%（1% O₂ ，5% CO₂ ，94% N₂ ），溫度為37℃，濕度為85%。待缺氧工作站條件穩定後，將1 mg/mL的LPS直接加入細胞中，使LPS終濃度為20 μg/mL，然後把細胞放到缺氧工作站培養24小時。給藥方法

細胞在進行造模前，藥物組先預孵溶劑（20%羥丙環糊精溶液）或藥物（YC-6之終濃度為1 μM、5 μM、10 μM）1小時，然後加入LPS並置於缺氧工作站進行造模，直至實驗終點。模型對照組不加任何藥物處理，正常組置於細胞培養箱進行常規培養。10μM地塞米松為藥物對照。每個處理組進行3個複孔重複。實驗結果

實驗結果如圖4顯示，缺氧和LPS刺激引起人肺泡上皮細胞LDH之釋放增加，說明缺氧和LPS處理引起人肺泡上皮細胞之損傷，而YC-6可以劑量依賴性地減少缺氧和LPS刺激引起之肺泡上皮細胞之損傷。10 μM之地塞米松也顯著減輕這種損傷， 10 μM之YC-6之保護效應顯著優於地塞米松。以上結果表明，YC-6可以劑量依賴性地顯著減輕缺氧和LPS刺激引起之肺泡上皮細胞之損傷。實施例 5. YC-6 顯著改善 LPS 引起之大鼠急性肺損傷 動物分組和給藥

動物分組：選取60只大鼠檢疫合格且體重均一之大鼠納入實驗，按體重隨機分為6組，10隻/組，動物分組與每組藥物處理劑量如下：

組別	處理
正常對照組	不作任何處理
LPS模型組	LPS（6.4mg/kg） +  20% HP-β-CD
低劑量藥物模型組	LPS（6.4mg/kg） +  YC-6（12 mg/kg/d）
中劑量藥物模型組	LPS（6.4mg/kg） +  YC-6（40 mg/kg/d）
高劑量藥物模型組	LPS（6.4mg/kg） +  YC-6（120 mg/kg/d）
陽性藥物模型組	LPS（6.4mg/kg） +  HC（50 mg/kg/d）

給藥方式：受試藥物按0.3 mL/100g體重尾靜脈給藥，氫化可的松（25mg/kg）按0.5 mL/100g體重腹腔給藥；所有受試試劑在LPS給予造模前0.5 h進行第一次給予藥物，受試藥物溶劑與YC-6每6 h靜脈注射一次，共注射4次，氫化可的松（HC）組每12 h腹腔注射一次，共注射2次。造模方法

大鼠秤重後，異氟烷誘導麻醉大鼠後，仰臥位固定，頸部皮膚備毛，75%乙醇消毒，正中切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露上段氣管。分別用注射器經氣管注入8 mg/mL之LPS溶液，分別0.2 mL/只，每只大鼠按照250mg體重計算，劑量為6.4mg/kg。注射後立即將大鼠立直並搖晃、旋轉，使LPS溶液均勻分佈於肺內。縫合皮膚，碘伏消毒。肺組織處理

LPS注射造模24 h後，動物按6 mL/kg體重的體積腹腔注射20%烏來糖溶液麻醉，腹主動脈放血死後，暴露胸腔，取肺組織。將左肺投入10％多聚甲醛水溶液固定48 h後，將左肺冠狀面橫切為等寬之上下兩部分，再將左肺下半部分按冠狀面橫切為等寬之兩部分，然後將左肺上半部分之矢狀面和兩截左肺下半部分冠狀面包埋在一個石蠟塊中，切片和進行蘇木素-伊紅 (HE) 染色。組織化學 HE 染色

組織脫水和石蠟包埋：將組織從固定液中取出，依次浸泡50%乙醇（30 min）- 70%乙醇（過夜）- 80%乙醇（30 min）- 90%乙醇（30 min）- 95%乙醇（30 min）- 無水乙醇（2次，每次30 min）- 二甲苯（2次，每次5~10 min，直至樣品完全透明）- 62 ℃石蠟（3次，每次1小時），然後進行組織包埋。組織石蠟切片切片：厚度為3 μm，切片在烘片機上烘乾水分後放37 ℃烘箱烘烤乾燥過夜，然後用於HE染色。HE染色：取出室溫保存之石蠟切片，置於65 ℃烘箱中烘烤30 min，然後立刻將切片浸於二甲苯中進行脫蠟三次，分別為5 min、2 min、2 min；複水：第三次浸泡二甲苯後，將切片依次浸泡於100%乙醇- 100%乙醇- 95%乙醇- 90%乙醇- 80%乙醇- 70%乙醇- 50%乙醇-蒸餾水進行複水，每次1 min；取出切片稍稍晾乾，然後將切片置於濕盒，將蘇木素染液滴加在組織上，確保染液將組織完全覆蓋，室溫孵育5 min；用蒸餾水輕輕沖洗切片，將多餘之蘇木素洗去，然後將把切片放回濕盒，將伊紅染色液滴加在組織上，室溫孵育2 min；用蒸餾水輕輕沖洗切片；將切片依次浸泡90%乙醇（1 min）- 95%乙醇（1 min）- 100%乙醇（1 min）-100%乙醇（1 min）-二甲苯（5 min）-二甲苯（5 min）進行脫水透明，然後用中性樹脂（用適量二甲苯稀釋，約50%二甲苯）封片。肺組織病理觀察與評分

肺組織病理形態學觀察：使用Nikon Eclipse Ti-U倒置熒光顯微鏡光鏡下觀察肺組織病理學變化。按炎性細胞浸潤、肺泡出血、肺泡壁增厚、肺泡擴張和支氣管上皮脫落之改變等級進行分析。肺損傷評分按照Smith評分體系，由兩位不知實驗分組和給藥信息之實驗員，對炎性細胞浸潤、肺泡出血、肺泡壁增厚、肺泡擴張和支氣管上皮脫落這6項指標分別進行肺損傷嚴重程度評分。0分：正常；1分：輕度病變，病變範圍小於整個視野面積之25％；2分：中度病變，病變範圍為整個視野面積之25％-50％；3分：重度病變，病變範圍為整個視野面積之50％-75％；4分：極重度病變，病變範圍大於整個視野面積之75％。總的肺損傷病理評分為上述各項評分之總和。實驗結果

如圖5病理鏡下觀察結果顯示，正常對照組（圖5A）大鼠肺組織結構清晰，肺泡結構為多邊形或圓形薄壁空泡，肺泡空間乾淨，邊界清楚，肺泡壁無增厚，肺泡間質沒有炎性浸潤；支氣管管壁結構清晰，未見上皮細胞脫落；血管正常。LPS模型組（圖5B）大鼠肺組織可見大量炎性細胞浸潤（黃色箭頭），肺泡腔和肺間質水腫，具有嚴重之纖維性滲出（紅色箭頭），肺泡壁增厚，肺泡擴張和萎陷；支氣管粘膜上皮脫落（綠色箭頭）；肺泡充血，肺泡內可見大量紅細胞（橙色箭頭）；肺血管周邊組織疏鬆，出現明顯之滲出（藍色箭頭），表明LPS引起肺血管通透性增加。給予不同劑量之YC-6組（圖5C-E）與LPS模型組比較，減少炎性細胞浸潤，減輕肺泡損傷，減輕血管屏障通透性增加；病理結果表明YC-6可以顯著改善LPS引起的急性肺損傷。

如圖6肺損傷病理評分統計結果所示，LPS模型組評分顯著高於正常對照組（P＜0.001）；而給予12、40、120 mg/kg/d劑量之YC-6處理組與LPS模型組比病理評分顯著降低（P＜0.01或P＜0.001）；並且低劑量組YC-6之處理顯著優於50 mg/kg/d氫化可的松之保護效果（P＜0.05）。

以上結果表明，LPS導致顯著之肺損傷，表現為大量炎性細胞浸潤、肺泡壁增厚、肺泡充血、擴張和萎陷以及支氣管粘膜上皮脫落。YC-6顯著地減輕LPS引起之血管內皮屏障通透性增加，減少炎性細胞浸潤、減輕肺泡損傷。實施例 6. YC-6 減輕急性食蟹猴肺損傷

非人靈長類動物在種系發生、解剖結構等方面更接近人類，可減少種屬差異帶來的藥效評價偏差；同時在非人靈長類得到之藥理學劑量、毒理和藥物療效之研究數據可為後續臨床試驗提供更可靠之依據。我們使用非人靈長類動物食蟹猴和高原減壓艙建立了急性低壓缺氧對食蟹猴的肺損傷模型。應用HE染色等病理生化檢測，評價YC-6是否減輕急性低壓缺氧導致之肺損傷。實驗動物分組

健康雄性食蟹猴（Macaca fascicularis）24隻，6至6.5歲，體重6.5-7.5Kg，購於廣東省高要市康達實驗動物中心。17隻雄性食蟹猴分為3組，如下表：

組別	處理
正常對照組 (Normobaric Normoxia，NN)	常壓常氧對照組（n=6）
急性低壓缺氧組 (Acute Hypobaric Hypoxia，HH)	葡萄糖生理鹽水+急性低壓缺氧處理（n=5）
藥物處理組（HH +YC-6）	葡萄糖生理鹽水和YC-6（100 mg/kg/兩天）+急性低壓缺氧處理（n=6）

低壓艙模擬 7500 米致食蟹猴急性低壓缺氧肺損傷模型之製作

將飼養於動物房之食蟹猴每次隨機選取3隻，每只採血10 ml後靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml，並做好標示。然後將動物放入低壓艙內飼養1天以適應實驗環境。急性低壓缺氧組以3米/秒速度海拔模擬上升至3000米；動物在低壓艙內模擬高度3000米停留30分鐘後，採取每隻實驗猴血10 ml，然後急性低壓缺氧組靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；以3米/秒速度海拔模擬上升至4500米；動物在低壓艙內模擬高度4500米停留30分鐘後，採取每隻實驗猴血10ml後，急性低壓缺氧組靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；以3米/秒速度海拔模擬上升至6000米；動物在低壓艙內模擬高度6000米停留30分鐘後，並採取每隻實驗猴血10 ml並靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；以2米/秒速度海拔模擬上升至7500米；動物在低壓艙內模擬高度7500米停留24小時後，以3米/秒速度將海拔下降到6000米，採取每隻實驗猴血10 ml並靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；以2米/秒速度海拔模擬上升至7500米；在7500米停留48小時後，以3米/秒速度將海拔下降到6000米，麻醉(0.06 ml/kg鹽酸氯胺酮注射液，0.02 ml/kg鹽酸賽拉嗪注射液)實驗動物，頸動脈放血處死動物，並進行解剖、取材、固定。常壓常氧對照組食蟹猴在平原（海拔352米）麻醉(0.06 ml/kg鹽酸氯胺酮注射液，0.02 ml/kg鹽酸賽拉嗪注射液)後，頸動脈放血處死動物，並進行解剖、取材、固定。給藥時間、劑量及方式

藥物處理組動物在未開始模擬升高前，YC-6注射液按10 mg/kg之劑量用葡萄糖生理鹽水稀釋至10 ml，YC-6處理組進行一次性靜脈推注；急性低壓缺氧組只靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml。藥物處理組動物在低壓艙內模擬高度3000米停留30分鐘後，YC-6注射液按10 mg/kg之劑量用葡萄糖生理鹽水稀釋至10 ml，YC-6處理組進行一次靜脈推注；急性低壓缺氧組只靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；藥物處理組動物在低壓艙內模擬高度4500米停留30分鐘後，YC-6注射液按10 mg/kg之劑量用葡萄糖生理鹽水稀釋至10 ml，YC-6處理組進行一次靜脈推注；急性低壓缺氧組只靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml；藥物處理組動物在低壓艙內模擬高度6000米停留30分鐘後，YC-6緩釋劑按30 mg/kg之劑量分成5點進行骨骼肌肌肉注射；急性低壓缺氧組只靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml。藥物處理組動物在低壓艙內模擬高度7500米停留24小時後，YC-6注射液按10 mg/kg之劑量用葡萄糖生理鹽水稀釋至10 ml，YC-6處理組進行一次靜脈推注，並且YC-6緩釋劑按30 mg/kg之劑量分成5點進行骨骼肌肌肉注射。急性低壓缺氧組只靜脈推注葡萄糖生理鹽水10 ml。在7500米停留48小時後，以3米/秒速度將海拔下降到6000米，麻醉(0.06 ml/kg鹽酸氯胺酮注射液，0.02 ml/kg鹽酸賽拉嗪注射液)實驗動物，頸動脈放血處死動物，並進行解剖、取材、固定。常壓常氧組食蟹猴在平原（海拔320米）麻醉(0.06 ml/kg鹽酸氯胺酮注射液，0.02 ml/kg鹽酸賽拉嗪注射液)後，頸動脈放血處死動物，並進行解剖、取材、固定。組織石蠟包埋固定 、切片和蘇木素 - 伊紅（ HE ）染色

組織石蠟包埋固定：進行肺部組織取材後將肺組織修整為厚度不超過1cm之組織塊，放進10倍體積之多聚甲醛中固定，固定時用棉花將漂浮之肺組織壓到液面下使組織充分固定。48小時後更換一次固定液繼續固定48小時，然後可以用於石蠟包埋。將組織從固定液中取出，依次浸泡50%乙醇（30 min）- 70%乙醇（過夜）-  80%乙醇（30 min）- 90%乙醇（30 min） - 95%乙醇（30 min）- 無水乙醇（2次，每次30 min）- 二甲苯（2次，每次5~10 min，直至樣品完全透明）- 62℃石蠟（3次，每次1小時），然後進行組織包埋。組織石蠟切片切片：厚度為3 mm，切片在烘片機上烘乾水分後放37度烘箱烘烤乾燥過夜，然後用於HE染色。蘇木素-伊紅（HE）染色：取出室溫保存的石蠟切片，置於65℃烘箱中烘烤30 min，然後立刻將切片浸於二甲苯中進行脫蠟三次，分別為5 min、2 min、2 min；複水：第三次浸泡二甲苯後，將切片依次浸泡於100%乙醇 - 100%乙醇 - 95%乙醇 - 90%乙醇 - 80%乙醇 - 70%乙醇 - 50%乙醇 - 蒸餾水進行複水，每次1 min；取出切片稍稍晾乾，然後將切片置於濕盒，將蘇木素染液滴加在組織上，確保染液將組織完全覆蓋，室溫孵育5 min；用蒸餾水輕輕沖洗切片，將多餘之蘇木素洗去，然後將切片放回濕盒，將伊紅染色液滴加在組織上，室溫孵育2 min；用蒸餾水輕輕沖洗切片，將多餘之伊紅染色液洗去，然後用試劑盒配套之增色液輕輕沖洗兩次，再用蒸餾水稍稍沖洗；將切片依次浸泡90%乙醇（1 min） - 95%乙醇（1 min）- 100%乙醇（1 min）-100%乙醇（1 min）- 二甲苯（5 min）- 二甲苯（5 min）進行脫水透明，然後用中性樹脂（用適量二甲苯稀釋，約50%二甲苯）封片。YC-6 對肺血管充血腫脹和肺泡間隔增厚的影響

如圖7所建立的模型，隨著海拔上升，食蟹猴表現出顯著之急性高原病症狀，例如呼吸急促、嘔吐、共濟失調、意識模糊等，表明非人靈長類食蟹猴急性高原病模型之複製成功。ALI/ARDS早期病理特徵在於肺泡壁毛細血管擴張、肺泡間隔增寬，存在肺泡腔內漿液、嗜中性粒細胞和巨噬細胞滲出，進而發展為肺彌漫性充血、水腫，肺泡內透明膜形成和局灶性肺萎陷。本研究應用HE染色觀察YC-6是否減輕急性低壓缺氧導致之肺損傷。

如圖8所示，正常對照組之食蟹猴肺組織肺泡結構為多邊形或圓形薄壁空泡，邊界清楚，肺泡上皮細胞間為薄壁肺泡隔，隔內可見毛細血管斷面。如圖8結果所示，急性低壓缺氧引起肺泡間隔顯著增厚；而YC-6給藥處理後得到顯著改善。對各組肺泡間隔厚度進行測量並統計顯示（圖9），YC-6顯著減輕肺泡間隔增厚性損傷。以上結果顯示YC-6可以有效減輕急性低壓缺氧引起之肺泡間隔增厚，提示YC-6 維繫肺血管、肺泡正常組織結構與功能，減輕氣血屏障通透性損傷，有望對新冠肺炎等肺損傷疾病有治療作用。YC-6 對肺泡腔蛋白透明膜形成和紅細胞滲漏之影響

已有報道指出，人類急性肺損傷標誌性之病理改變之一是彌漫性肺泡損傷（diffuse alveolar damage, DAD），彌漫性肺泡損傷其中一個重要特徵性表現是肺泡通透性改變導致血液蛋白進入肺泡、蛋白沉積形成的透明膜^[8] 。同時，透明膜之形成也是ARDS之特徵性病理之一，在新冠肺炎患者病理檢查中被發現^[1] 。透明膜是在呼吸細支氣管、肺泡管、肺泡表面形成一層均勻紅染之膜狀物，由滲出的血漿蛋白、纖維素及崩解之肺泡上皮細胞碎屑構成。透明膜形成、肺泡間質纖維性增生使肺泡間隔增，導致肺泡膜通透性降低，引起血氣交換功能障礙。如圖10所示，急性低壓缺氧引起肺泡間隔纖維性增生（黑色箭頭），同時引起部分肺泡腔內蛋白透明膜之形成（紅色箭頭），說明急性低壓缺氧引起彌漫性肺泡損傷；急性低壓缺氧還引起紅細胞滲漏進入肺泡腔（藍色箭頭），說明急性低壓缺氧引起了氣血屏障之破壞；而YC-6藥物組未觀察到這種明顯變化，提示YC-6對肺泡上皮細胞和血管內皮細胞具有保護作用。以上結果提示，YC-6可能通過保護肺泡上皮細胞和血管內皮細胞，減輕急性低壓缺氧引起之氣血屏障通透性增加，維持了正常的結構和功能。YC-6 對肺上皮細胞損傷 、炎細胞浸潤之影響

ALI/ARDS除與原發疾病有關外，炎性細胞浸潤和肺泡上皮損傷是重要病理因素。肺泡毛細血管壁彌漫性損傷和通透性增強，發生肺水腫和纖維素滲出。Ⅱ型肺泡上皮細胞損傷，肺泡表面活性物質減少或消失，導致肺透明膜形成和肺萎陷。上述改變均可引起肺泡內氧彌散障礙，通氣血流比值失調，發生低氧血症和呼吸窘迫。如圖11所示，和正常組比較，急性低壓缺氧引起炎性細胞之肺組織之浸潤，在肺泡膜間質（黑色箭頭）和肺泡腔（紅色箭頭）中可觀察到大量炎性細胞，部分肺泡腔可見脫落受損的肺上皮細胞（藍色箭頭），而YC-6處理組沒有觀察到明顯之炎性浸潤和受損的肺上皮細胞脫落。以上結果顯示YC-6減輕血管通透性，可以有效減輕肺組織之炎性浸潤以及肺上皮細胞損傷。實驗結論

應用體內急性低壓缺氧導致之食蟹猴肺損傷模型，通過病理學檢測發現，YC-6顯著抑制肺血管充血腫脹和肺泡間隔增厚、減輕肺氣血屏障損傷，YC-6表現出顯著肺保護之藥效。實施例 7. YC-6 通過促進 NR4A3 之蛋白表達減少缺氧相關刺激引起之血管內皮細胞損傷

核受體亞家族4，A組，成員3（Nuclear Receptor Subfamily 4 Group A Member 3，NR4A3），也被稱為神經元衍生孤兒素受體1（Neuron-derived Orphan Receptor-1，NOR1）。NR4A3作為一個轉錄因子，參與代謝、炎症、細胞增殖、凋亡和分化等生理和病理過程之調節。敲低NR4A3顯著抑制血管內皮細胞之毛細血管轉化能力，表明了NR4A3在血管內皮細胞中具有重要之生理功能。以往的研究表明，NR4A3之上調可以促進細胞在不同病理損傷下之存活。例如，在血管內皮細胞中增加NR4A3表達可以通過上調細胞凋亡抑制因子2（cellular inhibitor of apoptosis 2，cIAP2）來抑制細胞凋亡，從而提高缺氧條件下血管內皮細胞之存活；在神經元中增加NR4A3之表達可以減少氧化應激和麩胺酸誘導之興奮性毒性造成之神經元損傷。

本實驗探究YC-6是否對缺氧相關刺激引起的血管內皮細胞損傷具有保護作用，以及相關保護作用是否與調節NR4A3的表達相關。實驗材料 細胞株

人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）購於廣州賽庫生物技術有限公司，培養於含10%胎牛血清之改良型DMEM培養基（CellCook，CM2007）。大鼠血管內皮細胞（RAOEC）購於廣州吉妮歐生物科技有限公司，培養於含10%胎牛血清之DMEM培養基（Coring，10-013-CV）。組織切片

食蟹猴肺組織石蠟切片，包括正常對照組3個（normobaric normoxia，NN），急性低壓缺氧處理組5個（hypobaric hypoxia，HH），急性低壓缺氧+YC-6處理組5個（HH+YC-6）。主要試劑和藥物

高糖DMEM培養基（corning，10-03-CV）

改良型DMEM培養基（CellCook，CM2007）

澳洲胎牛血清（Gibco，10099141）

0.25%胰蛋白酶（Gibco，25200072）

無糖DMEM培養基（Gibco，A1443001）

LDH檢測試劑盒（Promega，G1780）

20%羥丙環糊精溶液（Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin，HP-β-CD）（廣州市賽普特醫藥科技股份有限公司，安瓿瓶裝，批號為180502，規格5 mL：1 g，濃度為0.2 g/mL）

YC-6注射液（廣州市賽普特醫藥科技股份有限公司，安瓿瓶裝，批號20010201，規格5 mL：50 mg，濃度為10 mg/mL，溶於20%羥丙環糊精溶液）

放線菌酮cycloheximide（MCE，HY-12320）

氯喹chloroquine（MCE，HY-17589）

MG132（Selleck，S2619）

NAC（Selleck，S1623）

PBS（Gibco，C10010500BT）

蛋白酶抑制劑（Targetmol，C0001）

磷酸酶抑制劑（Targetmol，0004）

細胞裂解液（Thermofisher Scientific，78501）

BCA蛋白定量試劑盒（Thermofisher Scientific，23225）

5×蛋白上樣緩衝液（Beyotime，P0015L）

SDS-PAGE分離膠緩衝液（Bio-rad，161-0798）

SDS-PAGE濃縮膠緩衝液（Bio-rad，161-0799）

10% SDS溶液（Bio-rad，161-0416）

30% Acr-Bis丙烯醯胺（MIK，DB240）

過硫酸銨（MPbio，193858）

TEMED（Macklin，T6023-100mL）

PVDF膜（Roche，3010040001）

脫脂奶粉（Wako，190-12865）

TBS（Boster，AR0031）

Anti-NR4A3 antibody（Santa cruz，sc-393902）

Anti-actin antibody（Arigo，arg62346）

Anti-CD31 antibody（Abcam，ab28364）

Goat anti-mouse IgG antibody （HRP）二抗（Arigo，arg65350）

Donkey anti-Mouse IgG （H+L） Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488熒光二抗（Invitrogen，A-21202）

Donkey anti-Rabbit IgG （H+L） Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555熒光二抗（Invitrogen，A-31572）

Hoechst33342（Sigma-Aldrich，14533，使用濃度為5 μg/mL）

水溶性封片劑（Boster，AR1018）

化學發光液（Merck Millipore，WBKLS0500）

10×EDTA抗原修復液（Boster，AR0023）

DAKO抗體稀釋液（Dako，S-3022）

二甲苯（廣州化學試劑廠，33535）

無水乙醇（廣州化學試劑廠，32061）

Mayer蘇木素染色液（MIK，BL003）

伊紅Y（威佳科技，17372-87-1）.

Trizol（Invitrogen，15596）

逆轉錄酶（Thermofisher Scientific，EP0442）

dNTPs（Sigma-Aldrich，D7295）

SuperReal PreMix SYBR Green qPCR試劑盒（Tiangen, FP205）

IP裂解液（Beyotime，P0013）

IP磁珠（Bimake，B23202）主要實驗設備

超淨工作臺、細胞培養箱、缺氧工作站、酶標儀、化學發光成像儀、激光共軛焦顯微鏡、低溫高速離心機、實時熒光定量PCR系統實驗方法 細胞培養 、氧糖剝奪 - 復氧（ oxygen-glucose deprivation and restoration, OGD-R ）損傷模型和藥物處理

HUVEC細胞用含10%胎牛血清之改良型DMEM培養基培養，待細胞長至約80%融合度的時候，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然後用含10%胎牛血清之改良型DMEM培養基吹打均勻，把細胞濃度調整至1×10⁵ 個/mL，按400 uL/孔接種於24孔板，待細胞長至約70%融合度的時候進行實驗。RAOEC細胞用含10%胎牛血清之高糖DMEM培養基培養，接種條件與HUVEC一致。進行OGD-R損傷處理時，設置缺氧工作站之氧氣濃度為1%（1% O₂ ，5% CO₂ ，94% N₂ ），溫度為37℃，濕度為85%。把無糖DMEM培養基置於缺氧工作站預缺氧3小時。吸走培養板中之培養基，用預熱之無糖DMEM培養基洗2遍，然後每孔加入100 uL之無糖DMEM培養基，將培養板置於缺氧工作站，每孔再加入300 uL預缺氧之無糖DMEM培養基，然後將培養板靜置於缺氧工作站繼續缺氧4小時。然後進行復氧處理，把培養板取出，把無糖DMEM培養基更換為400 uL含10%胎牛血清之正常培養基，然後置於37℃、5% CO₂ 細胞培養箱繼續培養24小時或指定之時間。正常組之細胞僅把培養基更換為400 uL新的含10%胎牛血清之正常培養基。藥物處理組之細胞，在對細胞進行氧糖剝奪處理後，在復氧處理的同時，給與指定終濃度之藥物（YC-6之終濃度為1 μM、3 μM或10 μM，溶劑對照給與相應之20%羥丙環糊精，放線菌酮（cycloheximide，CHX）之終濃度為100 μM，氯喹（chloroquine，CQ）之終濃度為10 μM、30 μM或100 μM，MG132之終濃度為10 nM、30 nM或100 nM），直至實驗終點。模型對照組不加任何藥物處理。免疫印跡（ Western blot ）

細胞用預冷之PBS洗2次，然後用細胞刮把細胞刮下來並轉移至1.5 mL之離心管，於4℃、1000 g離心5分鐘，棄去上清，向細胞沉澱加入適量之含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑之細胞裂解液，充分重懸細胞並於冰上放置5分鐘使細胞充分裂解。然後4℃、12000 g離心10分鐘，分離上清，上清即為提取之細胞蛋白。然後用BCA蛋白定量試劑盒對各蛋白樣品進行定量。蛋白定量後，用蛋白裂解液把各樣品之蛋白濃度調整至與最低濃度之蛋白樣品一致，然後分別把各蛋白樣品與5×蛋白上樣緩衝液按4:1之比例充分混勻，在沸水浴中煮5分鐘，然後渦旋混勻，短暫離心收集樣品至管底，置於冰上備用或凍存於-80℃。對蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳，然後把分離之蛋白轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶在室溫對PVDF膜進行封閉2小時。封閉結束後，用TBST（即含1‰吐溫20之TBS）洗膜3次，每次5分鐘。然後用5% BSA稀釋好對應之抗體，把PVDF膜置於相應之稀釋好之抗體中，4℃過夜孵育。孵育結束後，用TBST洗膜3次，每次5分鐘。用5% BSA稀釋好對應之二抗，把PVDF膜置於相應之稀釋好之二抗中，室溫孵育1小時。孵育結束後，用TBST洗膜3次，每次5分鐘，把PVDF膜置於化學發光液中，用化學發光成像儀進行成像。組織免疫熒光

把石蠟切片置於65℃烘箱30分鐘，然後迅速轉移至100%二甲苯中進行脫蠟，按照常規流程（100%二甲苯，5min——100%二甲苯，2min——100%二甲苯，2min——100%乙醇，1min——100%乙醇，1min——95%乙醇，1min——90%乙醇，1min——80%乙醇，1min——70%乙醇，1min——50%乙醇，1min——蒸餾水，1min×3）進行複水，然後用EDTA抗原修復液（微波加熱）進行抗原修復。修復結束後自然冷卻至室溫，然後用PBS洗3次，每次5分鐘。甩乾組織切片上殘餘之PBS，用免疫組化筆在組織外周畫一圈，然後把對應之稀釋於DAKO抗體稀釋液之一抗滴加在組織上，使其完全覆蓋組織。把組織切片置於4℃ 濕盒中過夜孵育。然後用PBS洗3次，每次5分鐘。然後在組織上滴加對應之稀釋好之熒光二抗，於濕盒中避光室溫孵育1小時。然後用PBS洗3次，每次5分鐘。用Hoechst33342染核，濕盒中避光室溫孵育5分鐘。然後用PBS洗3次，每次5分鐘，用水溶性封片劑封片，然後用激光共軛焦顯微鏡進行圖像拍攝。蘇木素 - 伊紅（ hematoxylin-eosin ， HE ）染色

按之前所述對石蠟切片進行複水。然後將切片浸泡於蘇木素染色液中，室溫染色10分鐘。用流水輕輕沖洗切片，將多餘之蘇木素洗去，然後用1%鹽酸乙醇分化10秒。用流水輕輕沖洗切片5分鐘，然後用1%氨水返藍10秒或流水沖洗30分鐘。用流水輕輕沖洗切片5分鐘，然後浸泡于1%伊紅中，室溫染色5分鐘。用流水輕輕沖洗切片，將多餘之伊紅染色液洗去。將切片依次浸泡70%乙醇（1min）-80%乙醇（1min）-90%乙醇（1min） - 95%乙醇（1min）- 100%乙醇（1min）-100%乙醇（1min）- 二甲苯（5min）- 二甲苯（5min）進行脫水透明，然後用中性樹脂（用適量二甲苯稀釋，約50%二甲苯）封片。把切片置於通風櫥中，待封片劑乾透後，使用Nikon Eclipse Ti-U倒置熒光顯微鏡進行明場拍照，每個個體進行隨機視野拍照，供後續病理分析。細胞免疫熒光染色

實驗終點時，用PBS迅速洗細胞2次，然後加入4%多聚甲醛，室溫放置15分鐘。然後用含0.2% TritonX-100之PBS室溫孵育15分鐘進行破膜。用PBS洗細胞三次，然後加入相應之用DAKO抗體稀釋液稀釋好之一抗，4℃孵育過夜。吸走一抗，用PBS洗細胞3次，然後加入稀釋好之熒光二抗，室溫避光孵育1小時。吸走二抗，用PBS洗細胞3次，然後加入hoechst33342對細胞核進行染色，室溫避光孵育5分鐘。吸走hoechst33342，用PBS洗3次，加入200 uL PBS，然後用激光共軛焦顯微鏡進行圖像拍攝。實時熒光定量 PCR

實驗終點時，棄去細胞培養基，然後直接加入適量之Trizol試劑，冰上充分裂解細胞後，把Trizol裂解物轉移至無RNA酶之1.5 mL離心管，然後加入Trizol用量之20%之氯仿，劇烈搖晃15秒，冰上放置10分鐘，於4℃ 12000 g離心15分鐘，然後把上層液體轉移至新的1.5 mL離心管（不要觸碰到中間層和下層），加入0.8倍上層液體體積之異丙醇，顛倒數次混勻，冰上放置10分鐘。然後4℃ 12000 g離心15分鐘，小心棄去異丙醇，向管底沉澱加入1 mL預冷之75%乙醇（用DEPC水稀釋無水乙醇至75%），顛倒離心管使管底沉澱漂浮。然後於4℃ 12000 g離心15分鐘，棄去75%乙醇，用新的預冷之75%乙醇再洗一次。4℃ 12000 g離心15分鐘，棄去75%乙醇，然後再短暫離心，用移液槍吸走剩餘之乙醇。把離心管置於超淨工作臺，敞開管口放置5~10分鐘，讓乙醇揮發乾淨。加入適量之DEPC水溶解RNA，使用Nanodrop超微量紫外分光光度計測OD值定量，OD260/280在1.8-2.0範圍內表明RNA質量較高。按以下方法對RNA進行逆轉錄和實時熒光定量PCR： 1）預變性：Total RNA 2 μg、Oligo dT 1 μL、DEPC·H₂ O to 13 μL混勻，65℃，5 min，結束後立即置於冰上 2）逆轉錄：5×Reaction Buffer 4 μL、dNTP mix 2 μL、Reverse Transcriptase 1 μL混勻，42℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃ forever 3）Real-time PCR（ABI 7500 fast real-time PCR system）

應用引物母液：100 nmol/μL（引物凍乾粉 + nmoles*10 μL RNase-free ddH₂ O）、引物工作液2 nmol/μL（4 μL FP + 4 μL RP + 192 μL RNase-free ddH₂ O）以及SYBR Green Mix/ROX = 1.25 mL/50 μL，混勻以下溶液SYBR Green/ROX 5 μL、cDNA 1 μL、Primer 2 μL、DEPC·H₂ O 2 μL混勻；進行PCR反應，循環參數Holding stage：95℃, 15 min；Cycling stage（40 cycles）：95℃, 10 s → 56℃, 20 s → 72℃, 30 s；Melt Curve stage（continuous）：95℃, 15 s → 65℃, 60 s → 95℃, 15 s →65℃, 15 s；相對表達量的計算採用Comparative ΔΔCt 法（RQ = 2^-∆∆Ct ）進行數據分析。引物序列包括：β-actin （human） forward: 5’-GATTCCTATGTGGGCGACGA-3’; reverse: 5’- AGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3’;NR4A3 （human） forward: 5’-AGCGGCGGCATCCTC-3’; reverse: 5’- CTAAGGGTCCAGGCTCAGG-3’; β-actin （rat） forward: 5’-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’; reverse: 5’- CGTCATCCATGGCGAACTGG-3’;NR4A3 （rat） forward: 5’-GGAAACGTGGCGACATCCT-3’; reverse: 5’- CAGTGGGCTTTGGGTTCTGTG-3’。免疫沉澱

細胞用預冷之PBS洗2次，然後用細胞刮把細胞刮下來並轉移至1.5 mL之離心管，於4℃、1000 g離心5分鐘，棄去上清，向細胞沉澱加入適量之含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑之IP裂解液，充分重懸細胞並於冰上放置5分鐘使細胞充分裂解。然後4℃、12000 g離心10分鐘，分離上清，上清即為提取之細胞蛋白。然後用BCA蛋白定量試劑盒對各蛋白樣品進行定量。蛋白定量後，用IP裂解液把各樣品之蛋白濃度調整至1 mg/mL，各樣品取等體積至一個新離心管（每個樣品剩餘少量作為input），按照抗體說明書加入相應量之抗體，於4℃緩慢顛倒混勻過夜。然後用IP裂解液洗IP磁珠兩次，向各樣品分別加入等量之IP磁珠，繼續於4℃緩慢顛倒混勻2小時。然後分離磁珠，用IP裂解液洗IP磁珠5次，每次於4℃顛倒混勻5分鐘。最後一次分離磁珠後，各樣品加入等量之1×蛋白上樣緩衝液（IP裂解液與5×蛋白上樣緩衝液按4:1的比例混勻），短暫離心後，在沸水浴中煮5分鐘，然後短暫離心收集樣品至管底，轉移煮沸後之樣品至一個新離心管，棄去磁珠，樣品可置於冰上備用或凍存於-80℃。對蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳，後續操作與免疫印跡一致。數據統計

統計結果以均值±標準差呈現。運用單因素方差分析法（ONE-WAY ANOVA）進行統計分析，並使用Tukey法進行多重比較，P ＜ 0.05認為具有顯著性統計學差異。實驗結果 氧糖剝奪 - 復氧 / 缺氧刺激下 YC-6 提高血管內皮細胞 NR4A3 蛋白表達和減少細胞損傷

已有報道指出，血管內皮細胞在缺氧刺激下通過上調NR4A3促進下游cIAP2表達從而減少細胞凋亡，說明缺氧相關刺激下NR4A3之表達對促進血管內皮細胞之存活具有重要作用。我們的結果顯示，氧糖剝奪4小時引起HUVEC和RAOEC之NR4A3之蛋白表達增加，但復氧24小時引起NR4A3蛋白水平之下調（圖12a），同時引起細胞LDH之釋放增加（圖3），提示了氧糖剝奪-復氧可能通過下調NR4A3之表達而促進細胞損傷。復氧損傷同時給與YC-6可以劑量依賴地提高NR4A3之蛋白表達（圖12a），同時劑量依賴地減少氧糖剝奪-復氧引起之細胞損傷（圖3），說明YC-6可以通過上調NR4A3之表達發揮保護血管內皮細胞之作用。通過細胞免疫熒光之方法對NR4A3之表達進行分析，與免疫印跡之結果一致，復氧損傷同時給與YC-6可以劑量依賴地提高NR4A3之蛋白表達（圖12b-c）。

我們在急性低壓缺氧致食蟹猴肺組織損傷之病理模型上進一步考察YC-6對NR4A3之表達影響。結果顯示，在急性低壓缺氧刺激下YC-6顯著提高食蟹猴肺組織內皮細胞NR4A3之蛋白表達，以及抑制急性低壓缺氧引起之血管內皮細胞標誌物CD31之表達下調（圖12d-e）。而之前組織病理學結果顯示（圖8-圖11），正常對照組之食蟹猴肺組織肺泡結構為多邊形或圓形薄壁空泡，邊界清楚，肺泡隔為薄壁結構，隔內可見毛細血管斷面。急性低壓缺氧引起嚴重之組織疏鬆、血管充血、肺泡壁增厚、肺泡腔內紅細胞之滲出和透明膜之形成，以及炎性細胞對肺泡之浸潤。透明膜之形成被認為是彌漫性肺泡損傷之典型病例特徵，說明急性低壓缺氧引起了彌漫性肺泡損傷以及肺內皮屏障之通透性增加。給與YC-6後能改善急性低壓缺氧引起之肺組織病理改變和減輕氣血屏障通透性增加。我們的結果顯示NR4A3在減少缺氧相關刺激引起之血管內皮細胞損傷之重要性，而YC-6可以上調NR4A3之蛋白表達和減輕氧糖剝奪-復氧引起之血管內皮細胞損傷和急性低壓缺氧引起之內皮屏障損傷。YC-6 抑制氧糖剝奪 - 復氧引起之 NR4A3 之泛素化降解

以往的研究表明NR4A3之蛋白表達主要受轉錄水平之調控，HIF-1α是缺氧刺激下調控NR4A3表達之上游轉錄因子。因此，我們考察YC-6是否通過促進NR4A3之轉錄水平來促進其蛋白表達。結果顯示（圖13），氧糖剝奪引起NR4A3轉錄水平之顯著上升，表明氧糖剝奪通過激動HIF-1α之轉錄而促進NR4A3之表達，可能是血管內皮細胞對抗缺氧相關損傷之一種自我保護機制。復氧引起NR4A3轉錄水平之下降，給與YC-6以後沒有顯著上調NR4A3之轉錄水平，說明YC-6並不是通過促進NR4A3之轉錄而增加其蛋白表達。因此，我們進一步考察YC-6抑制NR4A3降解之可能性。對HUVEC和RAOEC進行氧糖剝奪處理，復氧的同時給與放線菌酮（CHX）去抑制蛋白質之合成，結果顯示抑制蛋白合成導致NR4A3蛋白幾乎完全耗竭，說明NR4A3蛋白在復氧損傷中發生快速降解。為了進一步考察NR4A3之降解途徑，在復氧損傷給與CHX之同時，分別給與不同濃度之泛素蛋白酶體抑制劑MG132和溶酶體降解抑制劑氯喹CQ，來阻斷不同方式之蛋白質降解。結果顯示，復氧損傷下，同時給與CHX和MG132，可以抑制NR4A3之降解，但給與CHX和CQ沒有明顯抑制NR4A3之降解，表明復氧損傷過程中NR4A3之降解主要是通過泛素蛋白酶體系統。

為了進一步探索YC-6是否在復氧條件下抑制了NR4A3蛋白之泛素化降解，我們對復氧處理後之細胞進行蛋白提取和用抗泛素抗體進行免疫沉澱實驗。結果顯示，復氧損傷引起NR4A3之泛素化修飾，復氧損傷同時給與MG132能導致泛素化之NR4A3之增加，復氧後給與溶劑處理對NR4A3之泛素化修飾沒有明顯影響，但給與YC-6可以抑制復氧引起之NR4A3泛素化修飾，復氧後給與MG132和YC-6沒有明顯增加泛素化之NR4A3，表明YC-6抑制了NR4A3之泛素化修飾。

我們的結果表明，YC-6在復氧損傷情況下通過抑制NR4A3之泛素化修飾而抑制其降解，從而促進血管內皮細胞在損傷刺激下之存活。

綜上，YC-6可以減少氧糖剝奪-復氧引起之血管內皮細胞之損傷，其機制之一是YC-6抑制NR4A3的泛素化降解，從而促進病理刺激下血管內皮細胞之存活。在整體動物上，YC-6在缺氧刺激下促進肺組織血管內皮細胞NR4A3之蛋白表達，減輕缺氧引起之肺內皮屏障通透性增加及相關病理改變，發揮肺保護之作用。參考文獻 •    杜景霞,魏國會.肺血管內皮細胞結構功能變化與急性肺損傷[J].河北醫藥,2012,34(23):3624-3626. •    吳二斌, 李莉華, 郭子健. PFKFB3在肝癌中的表達及其臨床意義[J]. 臨床腫瘤學雜誌, 2014(6):508-511. •    宋旭華. TUM2-PK、PFKFB3和TKTL1在喉癌中的表達及其臨床意義[D]. •    章密密, 何躍君. PFKFB3在結腸癌患者中的表達及其臨床意義[J]. 中國臨床醫學, 2017, 024(004):587-590. •    魏萊. 6-磷酸果糖-2-激酶在結直腸癌中的表達、臨床意義及作用[D].2017. •    崔瑩, 張豔紅, 尹秀豔, 等. PFKFB3對宮頸癌細胞影響機制探討[J]. 中華腫瘤防治雜誌, 2018, 25(24):7-13. •    薛小英. 靶向PFKFB3調控CD4~+T細胞分化緩解實驗性自身免疫性腦脊髓炎的機制研究[D]. 2018. •    陳向榮, 杜菊梅, 吳宗濤. PFKFB3在膠質瘤組織中的表達及其對H4細胞惡性生物學行為的影響 [J]. 中國腫瘤生物治療雜誌, 2018, 025(004):363-369. •    陳永誠, 羅志齋, 盧冠銘. 甲狀腺乳頭狀癌組織PFKFB3表達及其意義[J]. 中華腫瘤防治雜誌, 2018, 025(004):250-257. •    胡智慧, 段亞男, 韓魯軍. PFKFB3基因增強阿帕替尼對胃癌凋亡的影響及機制[J]. 中國中西醫結合消化雜誌, 2019. •    王春暉. PFKFB3拮抗劑PFK15抑制橫紋肌肉瘤細胞的自噬和增殖的作用研究[D].2018. •    趙佳佳, 唐清明, 於然, 等. 利用PFKFB3的生物節律性有效抑制舌癌進程的調控機制[C]// 中華口腔醫學會全科口腔醫學專業委員會第六次學術會議暨廣東省口腔醫學會全科口腔醫學專委會2015年年會論文集. 2015. •    李繼佳, 汪偉明. PFKFB3介導CD163+腫瘤相關巨噬細胞浸潤調控口腔癌血管生成[C]// 中華口腔醫學會第九次全科口腔醫學學術會議論文彙編. 2018. •    吳暉. 糖酵解對膀胱腫瘤PD-L1/PD-1分子表達的影響及機制研究[D].2019. •    秦鵬鈞. 舒尼替尼誘導腎癌細胞自噬的機理研究[D]. 2015. •    侯雲雷, 張昱, 夏娟娟等. 6-磷酸果糖-2-激酶3抑制劑的研究進展 [J]. 中國藥物化學雜誌, 2016(1):65-70. •    Atsumi T, Chesney J, Metz C, et al. High expression of inducible 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase (iPFK-2; PFKFB3) in human cancers[J]. Cancer Res. 2002, 62(20):5881-7. •    Yang JG, Wang WM, Xia HF, et al. Lymphotoxin-α promotes tumor angiogenesis in HNSCC by modulating glycolysis in a PFKFB3-dependent manner[J]. Int J Cancer. 2019, 145(5):1358-1370. •    Zheng W D , Zhou F L , Lin N . MicroRNA-26b inhibits osteosarcoma cell migration and invasion by down-regulating PFKFB3 expression[J]. Genetics and Molecular Research, 2015, 14(4):16872-16879. •    Zhu Y , Lu L , Qiao C , et al. Targeting PFKFB3 sensitizes chronic myelogenous leukemia cells to tyrosine kinase inhibitor[J]. Oncogene, 2018. •    Hu X, Xu Q, Wan H, et al. PI3K-Akt-mTOR/PFKFB3 pathway mediated lung fibroblast aerobic glycolysis and collagen synthesis in lipopolysaccharide-induced pulmonary fibrosis[J]. Lab Invest. 2020. •    Lypova N, Telang S, Chesney J, et al. Increased 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3 activity in response to EGFR signaling contributes to non–small cell lung cancer cell survival[J]. Journal of Biological Chemistry, 2019, 294. •    Laszlo Kovacs, Yapeng Cao, Weihong, et al. HanPFKFB3 in Smooth Muscle Promotes Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension[J]. American journal of respiratory and critical care medicine, 2019. •    Lina Wang, Yapeng Cao, B.Gorshkov, et al. Ablation of endothelial Pfkfb3 protects mice from acute lung injury in LPS-induced endotoxemia[J]. Pharmacological Research, 2019. •    Li X, Liu J, Qian L, et al. Expression of PFKFB3 and Ki67 in lung adenocarcinomas and targeting PFKFB3 as a therapeutic strategy. Mol Cell Biochem. 2018, 445(1-2):123-134. •    CLME B, TELANG S, CLEM A, et al. Small-molecule inhibition of 6-phosphofructo-2-kinase activity suppresses glycolytic flux and tumor growth[J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7( 1) : 110 - 120． •    BANDO H, ATSUMI T, NISHIO T, et al. Phosphorylation of the 6-phosphofructo-2-kinase /fructose 2,6-bisphosphatase/PFKFB3 family of glycolytic regulators in human cancer[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(16):5784-5792. •    Butt Y, Kurdowska A, Allen TC. Acute Lung Injury: A Clinical and Molecular Review. Arch Pathol Lab Med. 2016; 140(4): 345-50. •    Clem B, et al. Small-molecule inhibition of 6-phosphofructo-2-kinase activity suppresses glycolytic flux and tumor growth. Mol Cancer Ther. 2008 Jan;7(1):110-20. •    Gong Y, Lan H, Yu Z, Wang M, Wang S, Chen Y, Rao H, Li J, Sheng Z, Shao J. Blockage of glycolysis by targeting PFKFB3 alleviates sepsis-related acute lung injury via suppressing inflammation and apoptosis of alveolar epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2017 Sep 16;491(2):522-529. •    Cao Y, Zhang X, Wang L, Yang Q, Ma Q, Xu J, Wang J, Kovacs L, Ayon RJ, Liu Z, Zhang M, Zhou Y, Zeng X, Xu Y, Wang Y, Fulton DJ, Weintraub NL, Lucas R, Dong Z, Yuan JX, Sullivan JC, Meadows L, Barman SA, Wu C, Quan J, Hong M, Su Y, Huo Y.PFKFB3-mediated endothelial glycolysis promotes pulmonary hypertension. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Jul 2;116(27):13394-13403. •    Kovacs L, Cao Y, Han W, Meadows L, Kovacs-Kasa A, Kondrikov D, Verin AD, Barman SA, Dong Z, Huo Y, Su Y. PFKFB3 in Smooth Muscle Promotes Vascular Remodeling in Pulmonary Arterial Hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 2019 Sep 1;200(5):617-627. •    Shi L, Pan H, Liu Z, Xie J, Han W. Roles of PFKFB3 in cancer. Signal Transduct Target Ther. 2017 Nov 24;2:17044. •    Klarer AC, O'Neal J, Imbert-Fernandez Y, Clem A, Ellis SR, Clark J, Clem B, Chesney J, Telang S. Inhibition of 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) induces autophagy as a survival mechanism. Cancer Metab. 2014 Jan 23;2(1):2. •    Teuwen LA, Draoui N, Dubois C, Carmeliet P. Endothelial cell metabolism: an update, 2017. Curr Opin Hematol. 2017 May;24(3):240-247. •    Cantelmo AR, Brajic A, Carmeliet P. Endothelial Metabolism Driving Angiogenesis: Emerging Concepts and Principles. Cancer J. 2015 Jul-Aug;21(4):244-9. •    Smith KM, Mrozek JD, Simonton SC, et al. Prolonged partial liquid ventilation using conventional and high-frequency ventilatory techniques: gas exchange and lung pathology in an animal model of respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 1997; 25(11): 1888-97. •    Wu F, Zhao S, Yu B, Chen Y-M, Wang W, Song Z-G, Hu Y, Tao Z-W, Tian J-H, Pei Y-Yet al : A new coronavirus associated with human respiratory disease in China.Nature 2020. •    Huang C, Wang Y, Li X, Ren L, Zhao J, Hu Y, Zhang L, Fan G, Xu J, Gu X et al: Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. The Lancet 2020, 395(10223):497-506. •    Xu Z, Shi L, Wang Y, Zhang J, Huang L, Zhang C, Liu S, Zhao P, Liu H, Zhu L et al: Pathological findings of COVID-19 associated with acute respiratory distress syndrome.The Lancet Respiratory Medicine . 2020 •    Gong Y, Lan H, Yu Z, Wang M, Wang S, Chen Y, Rao H, Li J, Sheng Z, Shao J: Blockage of glycolysis by targeting PFKFB3 alleviates sepsis-related acute lung injury via suppressing inflammation and apoptosis of alveolar epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2017, 491(2):522-529. •    Wang L, Cao Y, Gorshkov B, Zhou Y, Yang Q, Xu J, Ma Q, Zhang X, Wang J, Mao X et al: Ablation of endothelial Pfkfb3 protects mice from acute lung injury in LPS-induced endotoxemia. Pharmacol Res 2019, 146:104292. •        Cao Y, Zhang X, Wang L, Yang Q, Ma Q, Xu J, Wang J, Kovacs L, Ayon RJ, Liu Z et al: PFKFB3-mediated endothelial glycolysis promotes pulmonary hypertension. Proc Natl Acad Sci U S A 2019, 116(27):13394-13403.

圖 1. YC-6顯著抑制麩胺酸引起之PFKFB3之表達增加。用200 μM麩胺酸刺激原代培養之神經元5 mins和15 mins，10 μM YC-6、相應溶劑HP-β-CD以及NMDA受體阻斷劑10 μM MK-801預孵20 mins作為實驗組、溶劑對照組以及陽性對照藥物組。收集蛋白後進行PFKFB3免疫印跡分析。

圖 2. YC-6顯著抑制麩胺酸引起之PFKFB3下游糖酵解終產物乳酸之胞內堆積。用200 μM麩胺酸刺激原代培養的神經元15 mins，10 μM YC-6、相應溶劑HP-β-CD預孵20 mins作為實驗組和溶劑對照組以及陽性對照藥物組。收集細胞後進行胞內乳酸含量測定。

圖 3. YC-6顯著減輕OGD-R引起的血管內皮細胞損傷。人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）和大鼠血管內皮細胞（RAOEC）給予氧糖剝奪損傷4小時後，再復氧至正常培養條件24小時後，進行LDH檢測分析。YC-6預防性給藥細胞在進行氧糖剝奪處理前，先預敷溶劑或藥物（終濃度為1 μM、3 μM、10 μM）1小時，而治療性給藥是在復氧處理的同時給與溶劑或YC-6（終濃度為1 μM、3 μM、10 μM）。

圖 4. YC-6顯著減輕缺氧和LPS引起之人肺泡上皮細胞之損傷。預孵YC-6之終濃度為1 μM、5 μM、10 μM 1小時後，10 μM地塞米松為藥物對照，相應體積20%羥丙環糊精為溶劑對照，然後細胞進行20 μg/mL LPS和1% O₂ 缺氧處理24小時。

圖 5. YC-6保護LPS引起急性肺損傷之病理學效應。紅色箭頭指示肺泡和肺間質水腫，藍色箭頭指示血管外周疏鬆之病變組織，黃色箭頭指示炎性細胞浸潤，綠色箭頭指示支氣管粘膜上皮損傷脫落，橙色箭頭指示肺泡充血。黑色標尺表示100 μm。

圖 6. YC-6顯著降低LPS致大鼠急性肺損傷之病理評分。n = 9-10；*：p ＜ 0.05；**：p ＜ 0.01；***：p ＜ 0.001。

圖7. 急性低壓缺氧導致食蟹猴肺損傷模型製作流程。在320米（A）、3000米（B）、4500米（C）、6000米（D）、7500米24小時（E）以及7500米48小時（F）缺氧並給予藥物處理後，最後採集食蟹猴之肺樣本。注射器顯示給藥時間點。

圖8. YC-6抑制急性低壓缺氧引起之食蟹猴肺血管充血和肺泡間隔增厚。常壓常氧組（Normobaric normoxia, NN）；急性低壓缺氧組（Hypobaric hypoxia，HH）；YC-6給藥組（HH+YC-6）。紅色箭頭指示肺組織充血腫脹之血管斷面。第二行圖片為第一行圖片藍框區域之放大圖，第二行紅框是黑框區域進一步之放大圖。黑色標尺表示500 μm，紅色標尺表示100 μm。

圖9. YC-6顯著抑制急性低壓缺氧引起之食蟹猴肺泡間隔增厚統計分析。NN(Normobaric normoxia):常壓常氧組，n=3；HH(Hypobaric hypoxia):急性低壓缺氧組，n=5；HH+YC-6:YC-6給藥組，n=5；**：與NN比較，p ＜ 0.01; #：與HH組比較， p ＜ 0.05。

圖10. YC-6抑制急性低壓缺氧引起之食蟹猴肺泡腔蛋白透明膜形成和紅細胞滲漏。NN(Normobaric normoxia):常壓常氧組；HH(Hypobaric hypoxia):急性低壓缺氧組；HH+YC-6:YC-6給藥組。紅色箭頭指示肺泡腔內蛋白透明膜，黑色箭頭指示肺泡間隔纖維性增生，藍色箭頭指示肺泡腔內的紅細胞。黑色標尺表示100 μm。

圖11. YC-6抑制急性低壓缺氧引起之食蟹猴肺組織炎性浸潤。NN(Normobaric normoxia):常壓常氧組；HH(Hypobaric hypoxia):急性低壓缺氧組；HH+YC-6:YC-6給藥組。黑色箭頭指示肺泡膜間質之炎性細胞浸潤，紅色箭頭指示肺泡腔內之炎性細胞浸潤，藍色箭頭指示脫落肺上皮細胞。黑色標尺表示100 μm。

圖12. 氧糖剝奪-復氧/缺氧刺激下YC-6上調血管內皮細胞NR4A3蛋白表達和減輕細胞損傷。（a）Western blot檢測HUVEC和RAOEC細胞在正常培養、氧糖剝奪和氧糖剝奪-復氧狀態下NR4A3蛋白表達水平。溶劑或YC-6在復氧處理的同時給與。（b）是a圖同樣處理下HUVEC和RAOEC細胞NR4A3免疫熒光染色的代表性圖片。標尺表示50 μm。（c）是對（b）圖處理之NR4A3平均熒光強度之定量。（d）在正常環境（常壓常氧）、低壓缺氧和低壓缺氧+YC-6條件下非人靈長類食蟹猴肺組織之NR4A3/CD31熒光雙染代表性圖片。白色標尺指示100 μm。（e）是對（d）圖處理的與CD31信號共定位之NR4A3之平均熒光強度和CD31之平均熒光強度的定量。正常、低壓缺氧和低壓缺氧+YC-6之樣本個數分別是3、5和5。（c）和（e）圖的統計方法採用單因素方差分析進行統計分析，並使用Tukey法進行多重比較；n.s. 表示沒有統計學差異；**表示P小於0.01；***表示P小於0.001。

圖13. YC-6抑制氧糖剝奪-復氧引起的血管內皮細胞NR4A3的泛素化降解。（a）實時熒光定量PCR檢測正常培養、氧糖剝奪、氧糖剝奪-復氧和氧糖剝奪-復氧+YC-6處理下HUVEC和RAOEC細胞NR4A3 mRNA的相對表達量。溶劑或10 μM的YC-6在復氧處理的同時給與細胞。（b）Western blot檢測正常培養、氧糖剝奪、氧糖剝奪-復氧和氧糖剝奪-復氧+不同藥物處理下HUVEC和RAOEC細胞NR4A3蛋白表達量。CHX、MG132和CQ在復氧處理的時候給與。（c）抗泛素抗體之免疫沉澱實驗檢測氧糖剝奪-復氧和氧糖剝奪-復氧+藥物處理後NR4A3泛素化修飾之改變。YC-6的使用濃度為10 μM，MG132之使用濃度為100 nM。（a）圖中NR4A3 mRNA 之相對表達量之統計方法採用單因素方差分析進行統計分析，並使用Tukey法進行多重比較，n.s. 指示沒有統計學差異；**表示P小於0.01；***表示P小於0.001。CHX表示放線菌酮，CQ表示氯喹。Input表示用於免疫沉澱之初始樣本，IB表示免疫印跡檢測。

Claims (10)

1. 一種式I之化合物或藥學上可接受之鹽在製備用於預防或治療對象之肺上皮細胞受損介導之疾病之藥物中之用途，

   

   其中R₁係H；其中該肺上皮細胞受損介導之疾病係急性肺損傷。
2. 如請求項1之用途，其中該急性肺損傷係由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷或中毒引起的。
3. 如請求項1之用途，其中該急性肺損傷係由高氧、病毒感染、細菌感染、創傷、休克、缺血再灌注、急性胰腺炎、吸入性損傷、彌漫性肺泡損傷及/或中毒引起的，並且不是由低氧引起的。
4. 如請求項2或3之用途，其中該病毒係冠狀病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、麻疹病毒、巨細胞病毒或其組合。
5. 如請求項4之用途，其中該病毒係冠狀病毒。
6. 如請求項5之用途，其中該冠狀病毒係新型冠狀病毒SARS-CoV-2。
7. 如請求項1之用途，其中該急性肺損傷係手術導致之肺損傷。
8. 如請求項7之用途，其中該手術係肺切除術、肺部腫瘤切除術或肺移植術。
9. 如請求項8之用途，其中該肺切除術係亞肺葉切除術、肺葉切除術或全肺切除術。
10. 如請求項1之用途，其中肺上皮細胞受損介導之疾病表現為PFKFB3蛋白之過度表達。