JP7447144B2 - 抗ｔｉｅ２抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＩＥ２（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＩＥ－２）に特異的に結合し、受容体のリン酸化によって血管を正常化（ｖｅｓｓｅｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させる機能を保有している抗体に関し、抗ＴＩＥ２抗体、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体の製造方法、これを含む血管安定化剤及び新生血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連した疾病の治療用組成物、腫瘍又は癌治療用薬学的組成物、及びＴＩＥ２に結合する抗体以外の組成物との併用投与用組成物に関する。

新生血管形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）とは、内皮細胞の成長、分裂、移動などによって既存の血管から新しい血管が生成される機序であって、傷の治癒や女性の生理周期を含む正常な成長過程において重要な役割を担当している（Ｒｉｓａｕ，Ｎａｔｕｒｅ，３８６：６７１，１９９７）ことの他、異常に過度な新生血管形成は、腫瘍の成長と転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、加齢黄斑変性（ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＡＲＭＤ）、糖尿性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、慢性炎症（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａ ｍＭａｔｉｏｎ）のような疾患に決定的な役割を担うことも知られている（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ ａｎｄ Ｊａｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７：２４９，２０００）。

新生血管形成過程の進行の様相は、新生血管形成誘発因子と新生血管形成阻害因子の総合的なバランスによって決定され、多い段階の複雑で順次の過程によって進行される。その過程を説明すると、まず、腫瘍や傷の組織から分泌される血管内皮成長因子（Ｖａｓｉｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）をはじめとする様々な新生血管形成誘発因子が、周辺にある既存血管内皮細胞の該当の受容体に結合することにより、血管内皮細胞を活性化させて血管内皮細胞の透過性を増加させ、基底膜タンパク分解酵素（ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ｍＭＰ）のようなタンパク質分解酵素を分泌することにより、血管内皮細胞周辺の基底膜と細胞外基質を分解させ、血管内皮細胞が既存の毛細血管から離れて新生血管形成誘発因子を分泌する組織に向かって移動・増殖する。

移動・増殖した血管内皮細胞は血管内の管構造をなし、最後に、血管内皮細胞の構造的支持台である血管周囲細胞が流入しながら安定で成熟した血管が形成される。このとき、血管内皮細胞から分泌されるＡＮＧ１は、それの受容体であるＴＩＥ－２と結合することにより、血管周囲細胞の流入と血管の安定化に重要な役割を果たすものと知られている（Ｓｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８７：１１７１，１９９６）。

一方、血管新生形成の程度が大きい癌組織や血管リモデルリングが活発な正常組織である胎盤、子宮、卵巣などにおいてＡＮＧ２が過発現様相を示し（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６１：６２４８，２００１；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，９２：１１３８，２００１）、相対的にＡＮＧ２がＡＮＧ１よりも高くなると、結果的に腫瘍新生血管の形成につながる（Ｌｉｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３（５）；３０９－３１７，２００３）。したがって、ＡＮＧ２がＴＩＥ－２信号伝達機序において拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として働きつつ新生血管生成を促進させ、ＡＮＧ１は、作用剤（ａｇｏｎｉｓｔ）として血管構造を正常化させる役割を担うものと解釈されている。

新生血管形成過程は、上にも述べたように、主に、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ信号機序によってなされるが、新生血管形成により血管漏れ（ｌｅａｋａｇｅ）現象を克服できる方法は、ＡＮＧ１－ＴＩＥ２信号伝達機序において、血管内皮細胞の連接（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）増加と血管周辺細胞の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）が重要であることが分かる。

特に、腫瘍内新生血管は、血管漏れによって間質圧（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が増加すると、血管圧迫（ｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）によって低酸素症（ｈｙｐｏｘｉａ）及び組織中心の壊死まで発生する（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３３３：１７５７－６３，１９９５）。このような原因により、腫瘍治療薬物を処理しても組織内部までには薬物の接近性が劣るため、治療効果が減少する（Ｇｉａｎｆｒａｎｃｏ Ｂａｒｏｎｚｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｏｎｃｏｌ．５：１６５，２０１５）。

したがって、ＴＩＥ２リン酸化信号伝達機序を活性化させて、腫瘍内新生血管の漏れ現象を血管正常化（ｖｅｓｓｅｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）により改善させようとし、これは、究極としては薬物伝達を増加させ、既存に使用していた治療剤の単独療法効能よりも優れた抗癌活性を示すと期待される。また、血管正常化により組織内間質圧を下げて低酸素症を減少させるので、足部潰瘍、高血圧、糖尿病網膜疾患などの、血管漏れにより発生する疾患などに対しても治療可能性が高いと期待される。

さらに、腫瘍内微細環境は、血管安定化剤の処理時に、免疫効果Ｔ細胞（ｉｍｍｕｎｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）の流入が血管正常化によって増加し、既存の免疫抑制（ｉｍｍｕｎｅｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ）状態から免疫支持（ｉｍｍｕｎｅｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ）状態へと再プログラミングされる（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）ので、抗ＴＩＥ２抗体は血管正常化を誘導し、免疫関門抑制剤などの併用投与時に免疫効果Ｔ細胞の流入が増加することにより免疫活性まで強化させ、抗癌活性を倍加させると期待される。

このような技術的背景下に、本出願の発明者らは、抗ＴＩＥ２抗体を開発するために努力してきた。その結果、本発明者らは、ＴＩＥ２に目的とする結合力を示す抗ＴＩＥ２抗体を開発し、このような抗ＴＩＥ２抗体が、目的とする血管安定化剤（ｖｅｓｓｅｌ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）として、血管漏れによって発生する血管漏れ現象を改善させることができる効能を確認し、このことから、大部分の癌腫に治療剤として適用可能であり、癌腫の他に、異常の新生血管形成に関連した足部潰瘍、糖尿網膜疾患などの治療にも適用可能であると考えられる。特に、癌に対して抗ＴＩＥ２抗体は、既存治療剤との併用投与によって血管安定化機能を示し、既存治療剤の薬物伝達率を高めることができ、腫瘍内微細環境における免疫環境を改善させ、免疫抗癌剤とも優れた抗癌効果を示すと期待し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、ＴＩＥ２に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分とする腫瘍又は新生血管形成に関連した疾病の予防及び／又は治療のための薬学的組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分とする血管安定及び／又は正常化のための薬学的組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分とするアンジオポエチン－２活性化及び／又は過生成に関連した疾病の治療のための薬学的組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分とする単独治療及び／又は他の治療剤との併用治療のための薬学的組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１、７、１３、１９、２５及び３１からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２、８、１４、２０、２６及び３２からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号３、９、１５、２１、２７及び３３からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び
配列番号４、１０、１６、２２、２８及び３４からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号５、１１、１７、２３、２９及び３５からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号６、１２、１８、２４、３０及び３６からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

本発明は、また、前記核酸を含むベクターを提供する。

本発明は、また、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。本発明は、また、次の段階を含む、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管安定化剤及び／又は新生血管形成に関連した疾病の治療用組成物を提供する。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管安定化剤及び／又は新生血管形成に関連した疾病の診断用組成物を提供する。

本発明は、また、前記抗体を含む腫瘍、癌及び／又は新生血管形成に関連した疾病の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明は、ＴＩＥ２抗体と併用投与するための組成物を提供する。

それぞれ、抗ＴＩＥ２抗体のヒト及びマウスＴＩＥ２発現細胞に対する結合を評価した流細胞分析結果である。

一時発現及び精製した抗ＴＩＥ２抗体のヒト及びマウスＴＩＥ２に対する結合を評価したＥＬＩＳＡ結果である。

ＨＵＶＥＣ細胞株を用いて抗ＴＩＥ２抗体の細胞移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）に対する効果を評価した結果である。

選別された抗ＴＩＥ２抗体がＡＮＧ１又はＡＮＧ２と非競合的にＴＩＥ２に結合することを示す結果である。

選別された抗ＴＩＥ２抗体がＶＥＧＦによって誘導された血管透過度（ｖｅｓｓｅｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）を阻害できることを示す結果である。

選別された抗ＴＩＥ２抗体が、ＡＮＧ１と類似に、ＴＩＥ２下位信号伝達機序に従っていることを示す結果である。

選別された抗ＴＩＥ２抗体の血管安定化（ｖｅｓｓｅｌ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）効果を確認するために、細胞間密着連接（ｃｅｌｌ ｔｏ ｃｅｌｌ ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を細胞株のタンパク質レベルで示す結果である。

抗Ｔｉｅ２抗体による細胞間密着連接の改善結果を示す図である。

抗ＴＩＥ２抗体が、ＶＥＧＦによって誘発された血管漏れ現象を、ＴＩＥ２信号伝達によって正常化させることができることを確認した結果を示す図である。

抗Ｔｉｅ２抗体の網膜新生血管形成抑制機能を評価した結果である。

抗Ｔｉｅ２抗体の癌血管正常化機能を評価した結果である。

抗Ｔｉｅ２抗体の抗腫瘍効能を評価した結果である。

抗Ｔｉｅ２抗体の低酸素症改善の評価結果を示す図である。

別に断りのない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

本出願の発明者らは、新規の抗ＴＩＥ２抗体を選別した。本発明に係るＴＩＥ２に結合する抗体又は抗原結合断片により、ＴＩＥ２を活性化すると血管を正常化し、腫瘍又は癌内部の低酸素症増加を解消し、腫瘍又は癌内部に血流を増加させて十分の酸素供給がなされ、その他、別の抗癌薬物の伝達量と免疫細胞への侵入を増加させることを確認した。

このような観点において、本発明は、配列番号１、７、１３、１９、２５及び３１からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、８、１４、２０、２６及び３２からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３、９、１５、２１、２７及び３３からなる群から選ばれる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４、１０、１６、２２、２８及び３４からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５、１１、１７、２３、２９及び３５からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６、１２、１８、２４、３０及び３６からなる群から選ばれる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

本明細書で使われる用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、Ｔｉｅ２に特異的に結合する抗体を意味する。本発明の範囲には、ＴＩＥ２に特異的に結合する完全な抗体形態の他、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

抗体の抗原結合断片又は抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の一番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する最小の抗体片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ末端で直接連結されており、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、又は遺伝子組換え技術で作製してもよい。

一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選ばれてよい。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型でよい。

本明細書で使われる用語“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨと３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使われる用語“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬとを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、これらの抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

前記単一クローン抗体は、実質的に同質的な抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が、微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異の以外には同一であるものを指す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に、異なる決定因子（エピトープ）に対して指示された異なる抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは違い、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。

“エピトープ”は、抗体が特異的に結合可能なタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、一般に化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他に、特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失されるが、後者に対しては消失されないという点で区別される。

前記“ヒト化”形態の非ヒト（例えば、ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ））抗体は、非ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有する一つ以上の非ヒト抗体（供与体又は供給源抗体）から由来した一つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。ヒト化のために、受容者ヒト抗体の可変領域の一つ以上のフレームワークドメイン（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｄｏｍａｉｎ，ＦＲ）内の残基が、非ヒト種供与体抗体から相応する残基に置き替えられてよい。これにより、グラフトされたＣＤＲの適切な３次元構成を維持するように助け、結果として、親和性及び抗体安定性を改善させることができる。ヒト化された抗体は、例えば、抗体性能をさらに細密化するために、追加の受容者抗体又は供与体抗体に見られない新しい残基を含むことができる。

前記“ヒト抗体”とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、又は特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性であるのに対し、残りの鎖はさらに他の種から由来したり、又はさらに他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）の他、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。

本願に使われている“抗体可変ドメイン”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインのことを指す。

“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。

具体的に、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号９の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
配列番号３１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号３３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、及び配列番号３４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３５の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３６の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

ＴＩＥ２抗体は、１価又は２価であり、一本鎖又は二本鎖を含む。機能的に、ＴＩＥ２抗体の結合親和性は、１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍ範囲内にある。例えば、ＴＩＥ２抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－７Ｍ、又は１０^－５Ｍ～１０^－６Ｍである。

前記ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３８、４２、４６、５０、５４及び５８からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。また、配列番号４０、４４、４８、５２、５６及び６０からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。

具体的に、前記ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
配列番号４２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
配列番号５４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号５６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；又は
配列番号５８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。

“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば線維状ファージ粒子の表面上に、外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速ながらも効率的に分類できるということにある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有するポリペプチドを見出すために、数百万個のポリペプチドをスクリーニングすることに用いられてきた。

ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例えば、抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供している。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発されている。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して粒子感染性が維持される。

線維状ファージの表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多数の方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法、又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。

ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べて、いくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造又はヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間がかかり得る。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか又は抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。また、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。

ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫又は非免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。

ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーのサイズは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面又は選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一要素である。

高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、それらがしばしば抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列及び構造的立体形態面において非常に様々であり、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。

また、各位置において２０個アミノ酸を全て使用して可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。

本発明の抗体又は抗体断片は、ＴＩＥ２を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗ＴＩＥ２抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態及び種類に対する分析により、アルギニン、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは、類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形態を有するということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づき、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体が有するアミノ酸配列又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界における通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。

これに基づき、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知の方法による配列比較及び／又は整列によって決定されてよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。

前記核酸は、重鎖可変領域をコードする配列番号３７、４１、４５、４９、５３及び５７からなる群から選ばれてよい。又は、前記核酸は、軽鎖可変領域をコードする配列番号３９、４３、４７、５１、５５及び５９からなる群から選ばれてよい。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組み換えて生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して、さらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づき、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

“核酸”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形されてよい。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

“作動的に連結”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合座及び転写／解読終結配列を含むのが一般である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。

場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは、選択標識として当業界において通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明は、さらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために用いられた細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞でよいが、これに制限されるものではない。

エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビルス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０でよいが、これに制限されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種の培地で培養できる。市販用の培地はいずれも培養培地として使用可能である。当業者に公知のその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者にとって明白であろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物に関する。

前記血管新生は、従前より存在していた血管からの新しい血管の形成又は成長を意味し、“血管新生関連疾患（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）”は、血管新生の発生又は進行に関連した疾患を意味する。前記抗体で治療し得るものであれば、その疾病はいずれも血管新生関連疾患の範囲に含まれ得る。血管新生関連疾患の例には、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒絶反応（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅皮症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、糖尿病性足部潰瘍（ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｆｏｏｔ Ｕｌｃｅｒｓ）、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を含むが、これに限定されるものではない。

また、前記癌は、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選ばれるが、これに限定されるものではない。

ここに使われた用語“予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｒ ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）”は、本発明の抗体又は組成物を投与して、関心疾患の開始を抑制又は遅延させる全ての措置を指す。用語“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ）”は、本発明の抗体又は組成物を投与して、関心疾患の症状を改善又は好転させる全ての措置を指す。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗体を含む有効成分として含む血管安定化用組成物に関する。

ここに使われた用語“血管安定化”とは、血管の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を損傷させ得る要因を緩和、軽減又は除去するか、血管の損傷を抑制、軽減又は除去することにより、血管の機能を維持できることを意味できる。具体的に、血管の透過性抑制、血管損傷抑制、及び／又は損傷した血管の完全性復旧を含むことができる。

本発明の抗体を含む組成物は好ましくは、薬学的組成物であり、本分野において典型的に使用されるビヒクル、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。

薬学的に許容可能なビヒクルを含む薬学的組成物は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップ、滅菌水溶液、非水溶液、サスペンション、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅｓ）及び坐薬のような様々な経口又は非経口服用の形態であってもよい。これと関連して本発明の薬学的組成物は、フィラー、増粘剤、バインダー、湿潤剤、錠剤分解物質（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、界面活性剤などのような希釈剤又は賦形剤で組み合せて剤形化することができる。経口投与のための固相製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒剤、カプセル剤などのような形態であってもよい。それら固相剤と関連して、本発明の化合物は、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、又はゼラチンのような一つ以上の賦形剤を組み合せて剤形化することができる。簡単な賦形剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤をさらに使用することができる。経口投与のための液体製剤は、サスペンション、内服液、エマルジョン、シロップなどであってもよい。水又は液体パラフィンのような簡単な希釈剤、湿潤剤、甘味剤、芳香族、防腐剤などのような様々な賦形剤を液体製剤中に含めることができる。また、本発明の薬学的組成物は、滅菌水溶液、非水溶性溶媒、サスペンション、エマルジョン、凍結乾燥物、坐薬などのような非経口服用の形態であってもよい。注入可能なプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油及びオレイン酸エチルのようなエステルが非水溶性溶媒及びサスペンションに適合し得る。坐薬の基本物質は、ウィテップゾール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（ｍａｃｒｏｇｏｌ）、ツイン６１（Ｔｗｅｅｎ ６１）、カカオバター（ｃａｃａｏ ｂｕｔｔｅｒ）、ラウリンバター（ｌａｕｒｉｎ ｂｕｔｔｅｒ）及びグリセロゼラチン（ｇｌｙｃｅｒｏｇｅｌａｔｉｎ）を含む。

本発明の組成物は薬学的に有効な量で投与される。ここに使われた用語“薬学的に有効な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）”は、いずれの医学的治療にも適用可能なリーズナブルな利益と危険との比率（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ ｒａｔｉｏ）であり、十分の疾患治療用薬学的組成物の量のことを指す。有効量は、治療すべき疾患の重症度、患者の年齢及び性別、疾患の種類、薬剤の活性度、薬剤に対する敏感度、投与時間、投与経路、分泌速度、治療期間、薬剤の共投与及び本分野で知られた他のパラメータを含む様々な要因によって変わる。本発明の組成物は単独で又は他の治療法と組み合せて投与し得る。この場合に、従来の治療法と共に順に又は同時に投与できる。また、前記組成物は１回量又は複数回量で分けて投与できる。これらの要因を完全に考慮する時、副作用無しで最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、この服用量は分野の専門家によって容易に決定され得る。本発明の薬学的組成物の服用量は特別に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変更される。組成物は１日に１回量又は多回容量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許容された経路、例えば、経口で、直腸に、静脈に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）又は脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与され得る。

本発明は他の観点において、前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む血管新生を抑制する方法、血管新生関連疾患予防又は治療方法に関する。

本発明の方法は、血管新生の抑制を必要とする個体に薬学的に有効な量の薬学的組成物を投与する段階を含む。前記個体はイヌ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ及びヒトのような哺乳類であるが、これに限定されるものではない。薬学的組成物は非経口的に（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、腹腔内に（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｌｙ）、肺内に（ｉｎｔｒａｐｕｌｍｏｎａｒｉｌｙ）又は鼻内に（ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ）、必要によって、局所治療のために病巣内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）投与を含む適切な方法によって投与できる。本発明の薬学的組成物の好ましい服用量は個体の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含む様々な要因によって変わり、本分野の当業者によって容易に決定され得る。

本発明はさらに他の観点において、前記抗体を含む癌予防又は治療用薬学的組成物、又は前記抗体又は前記組成物を必要とする個体に投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。用語‘抗体’、‘予防’及び‘治療’は上述した通りである。

本発明の抗体で治療可能であれば癌に制限はない。詳細には、本発明の抗体は血管新生を抑制することによって癌の発生又は進行を予防することができる。癌の例には、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、大腸癌（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、直膓癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｘ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、子宮頸癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜癌（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、睾丸癌（ｔｅｓｔｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌（ｒｅｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、骨癌（ｂｏｎｅ ｃａｎｃｅｒ）、結合組織癌（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ）及び多発性骨髄血液癌（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｂｌｏｏｄ ｃａｎｃｅｒ）を含むが、これに限定されるものではない。

また、本発明の抗体は、他の抗体又は生物学的活性剤又は種々の目的のための物質と組み合わせて用いられてよい。本発明は、このような観点で、前記抗体又はその抗原結合断片を含む、他の血管新生疾患治療剤との併用投与用組成物に関する。

前記他の血管新生疾患治療剤は、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を挙げることができる。これにより、相互の抵抗性を克服させ、効能を増進させることができる。

本発明に係る組成物において、他の血管新生疾患治療剤と併用投与される場合に、ＴＩＥ２抗体と他の血管新生疾患治療剤は、順次に又は同時に投与されてよい。例えば、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を対象体に投与した後に、活性成分として、ＴＩＥ２に対する抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を、前記対象体に投与するか、或いは、前記組成物を対象体に投与した後に、抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物を前記対象体に投与する。場合によって、前記組成物を抗血管新生薬物、消炎薬物及び／又は抗癌薬物と同時に対象体に投与してもよい。

さらに他の観点において、本発明は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む血管新生疾患の診断用組成物である。本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を処理して血管新生疾患を診断する方法に関する。

前記抗体又はその抗原結合断片を通じてサンプルにおけるＴＩＥ２発現レベルを測定することによって血管新生疾患を診断することができる。発現レベルは、通常の免疫分析方法によって測定でき、前記抗体を用いた放射能免疫分析、放射能免疫沈殿、免疫沈殿、免疫組織化学染色、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂａｎｔ ａｓｓａｙ）、キャプチャー－ＥＬＩＳＡ、抑制又は競合分析、サンドイッチ分析、流細胞分析（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、免疫蛍光染色及び免疫親和性精製によって測定できるが、これに限定されるものではない。

前記免疫分析過程による最終的なシグナルの強度を分析することによって癌を診断することができる。すなわち、生物学的試料で本発明のマーカーの蛋白質が高発現され、シグナルが正常生物学的試料（例えば、正常胃組織、血液、血漿又は血清）に比べて強く表れる場合には癌と診断される。

さらに他の観点において、本発明は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。本発明に係るキットは、抗ＴＩＥ２抗体を含み、試料と抗体が反応することによって表れるシグナルを分析して、癌を診断することができる。このとき、前記シグナルは、抗体に結合した酵素、例えばアルカリンフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はシトクロムＰ４５０を含むことができるが、これに制限されるものではなく、このとき、酵素に対する基質は、酵素としてアルカリンフォスファターゼが利用される場合には、基質としてブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質が利用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合にはクロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウム硝酸塩）、レセルピンベンジルエーテル、ルミノール、アムプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＨＹＲ（ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌ ａｎｄ ｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２’－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）及びナフトール／ピロニン、グルコースオキシダーゼとｔ－ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）及びｍ－ＰＭＳ（ｐｈｅｎｚａｉｎｅ ｍｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ）のような基質が利用され得るが、これに制限されるものではない。

また、本発明に係るキットは、検出可能なシグナルを発生させるラベルを含むことができ、該ラベルは化学物質（例えば、ビオチン）、酵素（アルカリンフォスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びシトクロムＰ４５０）、放射能物質（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２及びＳ３５）、蛍光物質（例えば、フルオレセイン）、発光物質、化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）及びＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。

血管新生の診断のために用いられる酵素の活性測定又はシグナルの測定は、当業界に公知の様々な方法によって実施することができる。これによってＴＩＥ２発現を定性的又は定量的に分析することができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がそれら実施例に制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１．ＴＩＥ２に結合する抗体の選別
ＴＩＥ２に結合する抗体を選別するための抗体ライブラリー及びライブラリーの準備は、韓国特許出願（公開特許第１０－２００８－０１０９４１７号公報）と同じ自体のヒト未感作ｓｃＦｖ（ｈｕｍａｎ ｎａｉｖｅ ＳｃＦｖ）ライブラリーを用いた。９６ウェルＮｉ＋プレートに抗原（ｈＴＩＥ２－ｈｉｓ：ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０７００－Ｈ０８Ｈ）を２μｇ／ｍＬで１００μＬずつウェルに入れ、４℃で一晩置く。翌日、抗原コーティングプレート（ｃｏａｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）は、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）２００μＬを入れ、室温で２時間反応させる。２×ＹＴ－ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ １０μｇ／ｍＬ）成長培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ）２ｍＬにＸＬ１－Ｂｌｕｅストック（ｓｔｏｃｋ）５０μＬを入れ、３７℃、２００ｒｐｍで２時間程度育てた後、１３ｍＬをさらに添加し、ＯＤ_６００が０．５になるまで育てる。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）２時間が経つと、１ＸＴＢＳで３回洗浄する。洗浄した各ウェルにファージライブラリーグループ（ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ ｇｒｏｕｐ）を合わせてファージライブラリー量と４％ ＢＳＡ量を同一に混ぜた後、２００μＬずつ添加し、室温で２．５時間反応させる。ファージライブラリー反応が終わると上澄液は捨て、０．１％ ＴＢＳＴで５回洗浄し、ＴＢＳで３回洗浄して各ウェルに１００ｍＭ ＴＥＡ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）１００μＬを入れた後、室温で１０分間振る。１０分後、各ウェルに１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）５０μＬを入れて混ぜる。上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）は、ＯＤ_６００ ０．５になったＸＬ１－ｂｌｕｅ １０ｍＬに入れ、３７℃で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させる。感染が終わると、１００μＬはアウトプットタイター（ｏｕｔｐｕｔ ｔｉｔｅｒ）とし、残りは６，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上澄液は捨て、沈殿物はラージスクエアプレート（ｌａｒｇｅ ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ：ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋１％グルコース）にスプレッド（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）し、３０℃で一晩インキュベーション（ｏｖｅｒｎｉｎｇｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する。アウトプットタイターとして残した１００μＬは、１／１０、１／１００、１／１０００に希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）してＣＭプレートにスプレッドし、３７℃で一晩置く。翌日、スクエアプレートに育ったコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）は、２ＸＹＴ培地５０ｍＬを入れ、ループ（ｌｏｏｐ）でかき集めた後、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して上澄液は捨て、沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）に対して１次パンニングストック（ｐａｎｎｉｎｇ ｓｔｏｃｋ）を作り、２ＸＹＴ培養培地（ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉａ：ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋１％グルコース）１００ｍＬを５００ｍＬ三角フラスコに入れた後、ＯＤ_６００値が０．２となるように細胞を入れ、２００ｒｐｍ、３７℃でＯＤ ０．５になるまで育てる。ＯＤ_６００値が０．５になるまで細胞を培養した後、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ：Ｍ１３ＫＯ７ ｍｕｔａｎｔ）を細胞の２０倍となるように入れる。ヘルパーファージを入れ、３７℃、３０分感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上澄液を捨て、細胞は２×ＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋Ｋａｎ．７０μｇ／ｍＬ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）１００ｍＬに交換して入れた後、２００ｒｐｍ、３０℃、一晩処理する。翌日、育った細胞は、７０００ｒｐｍ、１０分、遠心分離し、同じ方法で１回さらに遠心分離する。集めた上澄液は、上澄液の１／５（ｖ／ｖ）２０％ ＰＥＧ／２．５Ｍ ＮａＣｌを入れ、アイス（ｉｃｅ）で１時間沈殿させる。沈殿させた後、９０００ｒｐｍ、１時間遠心分離する。上澄液は捨て、ＴＢＳ ３ｍＬで沈殿液（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を解いた後、０．４５μｍフィルター（ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した後、４℃に保管し、これを次回のパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程で使用する。この過程を３回反復し、抗原に結合する抗体を、ＥＬＩＳＡを行って確認した。

実施例２．ＴＩＥ２に特異的に結合し、ＴＩＥ２との結合を中和するモノクローナルＳｃＦｖファージ選別（結合ＥＬＩＳＡ）
パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）過程が終わると、最後のラウンド細胞ストック（ｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌ ｓｔｏｃｋ）をＣＭ寒天プレート（ａｇａｒ ｐｌａｔｅ）に、２００～５００個のコロニーが形成可能なように希釈して敷いた後、３７℃で一晩置く。翌日、コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）が育つと、９６ウェルディーププレート（９６ｗｅｌｌ ｄｅｅｐ ｐｌａｔｅ）に２×ＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋１％グルコース）２００μＬを入れ、各ウェルにコロニーを一つずつ入れた後、３７℃、３０００ｒｐｍで一晩置く。翌日、新しい９６ウェルディーププレートに２×ＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋１％グルコース）２００μＬを入れ、前日に育てた細胞を各ウェルごとに２０μＬずつ入れた後、３７℃、３０００ｒｐｍ、７０分間育てる。残りの細胞は、５０％グリセロールを１００μＬずつ添加し、－７０℃に保管する。細胞が育つと、ヘルパーファージ１μＬと２×ＹＴ培地１９μＬを混ぜた後、各ウェルに２０μＬずつ添加後、３７℃で３０分間インキュベーションする。インキュベーションが終わると、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離する。上澄液を捨て、２×ＹＴ培地（ＣＭ ３４μｇ／ｍＬ＋Ｋａｎ．７０μｇ／ｍＬ＋１ｍＭ ＩＰＴＧ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）２００μＬを入れ、メガグロー（ｍｅｇａｇｒｏｗ）で３０℃、３０００ｒｐｍで一晩処理する。

ＴＩＥ２に特異的に結合するファージを選別するために、まず、９６ウェルＮｉ＋プレートに、Ａｇ（ｈＴＩＥ２－ｈｉｓ：ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０７００－Ｈ０８Ｈ）２μｇ／ｍＬに作って１００μＬ／ｗｅｌｌずつ入れ、４℃で一晩置く。翌日、前日育てた細胞は、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して４℃に保管する。敷いておいたＡｇは、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２００μＬずつ入れた後、２５℃、２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄する。各ウェルに４％ ＢＳＡ ５０μＬとダウン（ｄｏｗｎ）して４℃で保管していたファージ５０μＬを混ぜた後、室温で１時間振って反応させる。ファージ結合（ｐｈａｇｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ接合マウス抗Ｍ１３抗体１：３０００（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｍ１３Ａｂ）（Ｓｉｎｏ，１１９７３－ＭＭ０５）を１００μＬずつ入れた後、２５℃、１時間反応させる。反応が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ（＃ＢＤ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ ５５５２１４）を１００μＬずつ入れ、３～５分発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０μＬずつ入れた後、ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で分析する。

表１のようにＴＩＥ２抗原に特異的に結合するモノクローナルｓｃＦｖファージをＥＬＩＳＡで測定した結果、選別された抗体の塩基配列は、次の表２、表３の通りであった。

実施例３．細胞発現ＴＩＥ２に対する結合力を有する抗体選別
細胞発現ＴＩＥ２に対する結合を確認するために、自体確率したヒト／マウスＴＩＥ２過発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ｈＴＩＥ２／ＣＨＯ－Ｋ１、ｍＴＩＥ２／ＣＨＯ－Ｋ１）に対する結合を、流細胞分析法で測定した。各細胞を維持培養後、ｈＴＩＥ２ＣＨＯ－Ｋ１はＰＢＳで洗浄し、５ｍＭ ＥＤＴＡを添加して細胞浮遊液を取り、遠心分離によりそれぞれの細胞を回収した。ＦＡＣＳ専用バッファー（２％ ＦＢＳ、０．０５％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）を用いて５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を製造し、各チューブ当たりに１００μＬずつ分注した。２μｇ／ｍＬのクローンを各試験管に１００μＬずつ添加した後、４℃で３０分間静置して細胞結合を誘導した。その後、２ｍＬのＦＡＣＳバッファーを用いて洗浄し、１００μＬの２次抗体希釈液（１／５００、ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ－Ｆｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ，＃Ａ８０－２４８ＰＥ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．ＵＳ）を添加後に、４℃で２０分間静置して蛍光標識した。２ｍＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄後、２００μＬのＦＡＣＳバッファーを添加して細胞を浮遊させた。ＴＩＥ２に対する陽性対照群としては、ＰＥ抗マウスＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ－２，ＣＤ２０２）抗体（１２４００７，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ抗ヒトＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ２／Ｔｅｋ）抗体（３３４２０５，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ接合抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ａ９０－１３９ＰＥ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）及びＰＥ接合抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ａ８０－２４８ＰＥ，Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）で蛍光標識した。分析には、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いた。

その結果、全てのクローンが、ＣＨＯＫ１細胞株に発現したヒトＴＩＥ２への結合に優れていることを確認し、４Ｅ２クローンは、ヒトとマウスの両方においてＴＩＥ２への結合力を保有していることを確認した（図１Ａ及び図１Ｂ）。

実施例４．抗ＴＩＥ２抗体発現
選別したｓｃＦｖファージのＩｇＧ形態への転換は、分子生物学的手法を用いて行った。選別したＥ．Ｃｏｌｉクローンからファージミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄ）を抽出し、ＰＣＲ手法を用いて可変領域を増幅した。増幅した重鎖可変領域を、重鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅｓｓ－ｈｃｈｇ１）に挿入し、増幅した軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域を含む発現ベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ，ｐｆｕｓｅ２ｓｓ－ｈｃｌｋ）に挿入し、ＩｇＧ形態のＤＮＡクローニングを完了した。

ＩｇＧの一時発現には、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システムキット（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳ）を用いた。キットに含まれているＥｘｐｉ２９３細胞を、専用培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ_２環境下で１２５ｒｐｍオービタルシェーカー上で浮遊培養した。３日ごとに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように継代培養し、発現ベクター導入時には３×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞数を調整して使用した。遺伝子導入は、専用試薬であるＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用し、細胞懸濁液１ｍＬ当たりに発現ベクターＤＮＡ １μｇとＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２．７μＬを含有する脂質ＤＮＡ複合体を作製して細胞懸濁液に添加し、導入１６～１８時間後にエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）１／２を添加して発現を誘導した。その後、同一条件で３～４日間培養後に遠心分離し、ＩｇＧ含有上澄液を取った。

実施例５．抗ＴＩＥ２抗体の精製
取得した上澄液をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、親和力クロマトグラフィーでＩｇＧを精製した。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で平衡化させた後、上澄液を注入し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ポリソルベート２０（ｐＨ７．０）溶液で洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ３．５）で溶出後に、１Ｍ Ｔｒｉｓで中和した。溶出されたタンパク質は、ＭＷＣＯ １０，０００ ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ，ＵＳ）を用いた透析過程によってＰＢＳに溶媒を交換した。その後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，ＤＥ）を用いて必要濃度で濃縮し、分周後に－８０℃で保管した。

精製後、各抗体は、非還元及び還元ＬＤＳサンプルバッファー（Ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ及びＲｅｄｕｃｉｎｇ ＬＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に処理し、ＮｕＰＡＧＥシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて電気泳動した。その結果、５０ｋＤａの重鎖及び２５ｋＤａの軽鎖を含む合計分子量約１５０ｋＤａのＩｇＧを得た。

実施例６．抗ＴＩＥ２抗体のヒト及びマウスＴＩＥ２に対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）確認
ＳｃＦｖファージクローンにおけるＴＩＥ２の結合がＩｇＧにおいても維持されるかどうかをＥＬＩＳＡで確認した。９６ウェル免疫プレートに、Ａｇ（ｈＴＩＥ２－ｈｉｓ：ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０７００－Ｈ０８Ｈ；ｍＴＩＥ２－ｈｉｓ：ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，５１０８７－Ｍ０８Ｈ）１μｇ／ｍＬに作って１００μＬ／ｗｅｌｌずつ入れ、４℃で一晩置く。翌日、前日に育てた細胞は３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、４℃に保管する。敷いておいたＡｇは、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、２％ ＢＳＡ遮断バッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２００μＬずつ入れ、２５℃、２時間インキュベーションする。遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄する。各ウェルに４％ ＢＳＡ５０μＬとダウン（ｄｏｗｎ）して４℃で保管したファージ５０μＬを混ぜた後、室温で１時間振って反応させる。ファージ結合（ｐｈａｇｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＨＲＰ接合ヤギ抗ヒト抗体１：３０００（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ａｂ）（Ｓｉｎｏ，１１９７３－ ＭＭ０５）を１００μＬずつ入れ、２５℃、１時間反応させる。反応が終わると、０．１％ ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＴＭＢ（＃ＢＤ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｓｅｔ ５５５２１４）を１００μＬずつ入れ、３～５分発色させた後、停止溶液（ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を５０μＬずつ入れ、ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ）で分析する。

その結果、ＳｃＦｖにおける同様に、１Ａ６、１Ａ９、２Ｆ２、４Ｅ２及び３Ｄ６クローンがヒトＴＩＥ２に結合し、４Ｅ２クローンは、ヒトとマウスＴＩＥ２の両方に結合することを確認した（図２）。

実施例７．抗ＴＩＥ２抗体の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）活性測定
抗ＴＩＥ２抗体のうち、最も優れた血管安定化剤として働くクローンを探すために、血管正常化機序において初期段階（ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ）を担当する血管内皮細胞の移動特徴を用いて選別しようとした。そのために、ヒト血管内皮細胞株であるＨＵＶＥＣ細胞を用いた移動アッセイ（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。

２４ウェルトランスウェルポリカーボネートインサート（８．０μｍ孔サイズ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を０．１％ゼラチン溶液でコートし、常温で約１０分間乾燥させた。各薬物を６００μＬ基本培地（ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ）に希釈し、下部チャンバーに入れた。その後、インサートチャンバーを、培地の入っている下部チャンバーに入れ、１×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬのＨＵＶＥＣ細胞をインサートチャンバーに接種した。３７℃で４時間培養した後、インサートチャンバーを取り出して蒸留水に３回洗浄した後、インサートチャンバーに付着している細胞を０．５％クリスタルバイオレットで常温で１０分間染色した。その後、綿棒を用いて、インサート内部の移動していない細胞を拭き、光学顕微鏡を用いて、インサートチャンバーの内部から外部に移動した細胞を、２００倍率で撮影し、Ｉｍａｇｅ－Ｊ ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＨ）を用いて定量した。

その結果、陽性対照群である５００ｎｇ／ｍＬ ＡＮＧ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，９２３－ＡＮ－０２５）をグラスタリンングした群は、そうでない群に比べてよく移動させることが見られ、陰性対照群である５００ｎｇ／ｍＬ ＡＮＧ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，６２３－ＡＮ－０２５）においては、グラスタリンングの有無に関係なく、移動効能は見られなかった。特に、試験群のうち、３０μｇ／ｍＬ ４Ｅ２及び２Ｆ２クローンの移動効果が増加したことが確認された。１Ａ６、１Ａ９、１１Ｆクローンは、移動が基本レベル程度と確認され、むしろ３Ｄ６は移動を減少させた（図３Ａ）。

移動結果に基づき、４Ｅ２と２Ｆ２クローンの濃度別活性、及びＡｎｇ１との併用処理時における相乗効果を確認するために、前述の方法を用いて移動活性を測定した。その結果、４Ｅ２と２Ｆ２クローンの濃度依存的な活性を示し、Ａｎｇ１との併用処理時に相加効果（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ）を示すことを確認した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。したがって、４Ｅ２及び２Ｆ２クローンがＡＮＧ１との相乗効果を示し、血管正常化（ｖｅｓｓｅｌ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）の初期段階（ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅ）で起こる移動を速く誘導し、血管正常化効果をよく示すと考えられる。

実施例８．抗ＴＩＥ２抗体と競合物質（Ａｎｇ１及びＡｎｇ２）との結合特性比較
移動アッセイにより血管安定化剤として選別された抗体である２Ｆ２と４Ｅ２がＴＩＥ２に結合して機能を示すとき、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２と競合して結合するか否かを、競合ＥＬＩＳＡを用いて確認した。９６ウェル免疫プレートにｈＴＩＥ２（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０７００－Ｈ０８Ｈ）を１μｇ／ｍＬの濃度にして１００μＬ／ｗｅｌｌずつ入れ、４℃で一晩置く。敷いておいたｈＴＩＥ２は、１×ＰＢＳで２回洗浄した後、２％ ＢＳＡ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を２００μＬずつ入れ、ＲＴで２時間インキュベーションする。遮断が終わると、０．１％ ＰＢＳＴで２回洗浄する。抗ＴＩＥ２候補抗体は２μｇ／ｍＬの濃度、ＡＮＧ１＆ＡＮＧ２タンパク質は５０μｇ／ｍＬの最高濃度から１０倍ずつ段階希釈によってＴＩＥ２と結合させた。その後、ＰＢＳＴで３回洗浄後、１：２０００の割合に希釈したＨＲＰ接合ヤギ抗ヒト抗体１：３０００（ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ａｂ）（Ｓｉｎｏ，１１９７３－ ＭＭ０５）を１００μＬ添加し、常温で１時間反応させて結合を誘導し、ＰＢＳＴで３回洗浄後にＴＢＭ基質試薬を用いて発色させた。発色反応は、５０μＬの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を添加することで停止させ、ｓｕｎｒｉｓｅマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ，ＣＨ）を用いて特異的吸光度ＯＤ_{４５０－６３０}を測定した。

図２に見られるように、選別された抗体（２Ｆ２及び４Ｅ２）は、ヒトＡＮＧ１及びＡＮＧ２と競合しないでＴＩＥ２に結合することを確認した（図４）。

実施例９．抗ＴＩＥ２抗体の結合親和度評価
選別された抗ＴＩＥ２抗体である４Ｅ２、２Ｆ２及び１１ＦのヒトＴＩＥ２－ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，１０７００－Ｈ０８Ｈ）及びマウスＴｉｅ２－ｈｉｓ（ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，５１０８７－Ｍ０８Ｈ）への親和度分析をＯｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．ＵＳ）を用いて測定した。抗ＴＩＥ２抗体をバイオセンサーに固定化し、メーカーのマニュアルに従って実験した。ヒトＴＩＥ２及びマウスＴｉｅ２の濃度別結合動力学を測定し、結合速度定数（ｋ_ｏｎ）、解離速度定数（ｋ_ｏｆｆ）及び結合定数（Ｋ_Ｄ）を算出した（表４）。

１１Ｆ抗体は、ヒトＴＩＥ２とマウスＴｉｅ２間の交差反応性を有することを確認し、ＥＬＩＳＡで確認したマウスＴｉｅ２（ＫＤ：２．０９Ｅ－０５Ｍ）において非常に弱い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有するということを証明した。４Ｅ２においても同様に、ヒトとマウスＴｉｅ２の両方で付着し、ヒトＴＩＥ２に対する結合親和度（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）が、ＫＤ値が１．０Ｅ－１２Ｍと高い親和度を示すことを確認しし、マウスＴｉｅ２に対する親和度（１．３８Ｅ－０８Ｍ）も有することを確認した。２Ｆ２は、ヒトＴＩＥ２にのみ特異的な結合力を示すことを確認し、ＫＤ値が７．９４Ｅ－１０Ｍと高い親和度を示すことを確認した。

実施例１０．抗ＴＩＥ２抗体の血管漏れ回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）活性測定
抗ＴＩＥ２抗体の血管安定化剤としての活性を確認するために、血管内皮細胞を用いて血管漏れ回復試験を行った。血管新生発生時にＶＥＧＦの過発現によって血管の接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が切れてしまい、血管漏れ現象が発生する。これをｉｎ ｖｉｔｒｏレベルで具現するために、ＨＵＶＥＣ細胞株を用いて血管透過性アッセイを行った。

２４ウェルトランスウェルポリカーボネートインサート（０．４μｍ孔サイズ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を０．１％ゼラチン溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇ１８９０）でコートした後、常温で約１０分間乾燥させた。その後、インサートチャンバーを培地の入っている下部チャンバーに入れ、６×１０^４ｃｅｌｌｓ／２００μＬのＨＵＶＥＣ細胞をインサートチャンバーに接種した。その後、３７℃条件の５％ ＣＯ_２培養器で培地交換無しに７２時間培養した。インサートチャンバー内の培地を除去した後、基本培地に各薬物を処理した。３７℃で３０分間細胞を培養した後、１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，２９３－ＶＥ－０５０）を処理し、１５０分間反応させた。その後、０．５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣデキストラン（７０ｋＤａ，Ｓｉｇｍａ）をインサートチャンバーに処理し、室温で３０分間反応させた。下部チャンバーに抜け出したＦＩＴＣデキストランを５０μＬ採取し、ＰＢＳに１：２０に希釈した。その後、希釈された試料を４９２ｎｍ／５２０ｎｍ（励起／放出）波長で蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）をマイクロプレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ）で測定した。

その結果、ＶＥＧＦのみ処理した群において血管内皮細胞の密着連接（ｔｉｇｈｔ－ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が切れてＦＩＴＣデキストランの移動量が多くなったが、陽性対照群であるＡｎｇ１を処理した時、ＦＩＴＣデキストランの移動量が減少することを確認した。一方、陰性対照群であるＡｎｇ２は、ＶＥＧＦのみ処理したグループと類似の透過性を示し、２Ｆ２及び４Ｅ２を処理したグループでは透過性が減少した。また、同じ実験方法で１１Ｆの活性を確認した結果、１１Ｆも同様、血管透過性を減少させることを確認した（図５Ａ及び図５Ｂ）。

上の結果から、抗ＴＩＥ２抗体は、ＶＥＧＦによって誘導された血管漏れを改善させることができる活性を有していることを確認した。さらに、抗ＴＩＥ２抗体が疾患モデルと類似の培養条件においても血管漏れを回復させることができるかどうか、ＶＥＧＦとＡｎｇ２が同時に処理された群における活性を確認した。

その結果、２Ｆ２は、基本（ｂａｓａｌ）レベルと類似する程度の血管透過性を減少させることを確認し、４Ｅ２も、基本レベル分程度減少させることを確認した。血管透過性結果に基づき、２Ｆ２及び４Ｅ２クローンは、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２によって誘導された血管漏れを正常化させることができることを確認した（図５Ｃ）。

実施例１１．抗ＴＩＥ２抗体の血管正常化に対する機序研究
選別された抗ＴＩＥ２抗体の血管漏れ改善効果が血管正常化信号伝達機序によって現れるのかどうか確認するために、ＴＩＥ２下位信号伝達機序を測定した。そのために、ヒト血管内皮細胞株であるＨＵＶＥＣ細胞に薬物を処理した後、ウェスタンブロット分析法で血管正常化に関連したタンパク質発現を確認した。

ウェスタンブロットを行うために、各薬物反応済みのＨＵＶＥＣ細胞株をＰＢＳで２回洗浄後に、細胞抽出物を得るために、溶解バッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ ＆ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を入れてアイスで２０分反応させる。その後、１３，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離後に、上澄液のみを得る。ＢＣＡタンパク質定量法を用いて定量後に、１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに溶解産物（ｌｙｓａｔｅ）をロード後に、電気泳動する。ニトロセルロース膜（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて移植（ｔｒａｎｓｆｅｒ）を行った後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０ ＴＢＳＴバッファーに５％スキムミルクを希釈し、常温で１時間遮断を行う。その後、１次抗体（ｐ－ＴＩＥ２、ＴＩＥ２、ｐ－ＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐ－ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐ－ＶＥＧＦ、ｐ－ＶＥカドヘリン、及びＶＥカドヘリン及びヒストン；Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１：１０００に希釈し、４℃で一晩シェークし、ペルオキシダーゼ接合（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）２次抗体（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ）を１：５０００に希釈し、常温で１時間反応させる。ＥＣＬ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）反応を行い、目的とするタンパク質のバンドを観察する。まず、時間帯別ＴＩＥ２信号伝達機序に対して確認した。その結果、抗ＴＩＥ２抗体である２Ｆ２は、ＡＮＧ１と類似に、ＴＩＥ２リン酸化反応を誘発させ、血管正常化信号であるＡＫＴもリン酸化させた。抗ＴＩＥ２抗体の４Ｅ２及び１１Ｆに対しても確認した結果、これと類似の結果が得られた。したがって、２Ｆ２、４Ｅ２及び１１Ｆ抗体は、ＴＩＥ２リン酸化により血管正常化剤としての可能性を確認した（図６）。

したがって、血管漏れ環境下でも抗ＴＩＥ２抗体が血管安定化信号伝達によって血管漏れを回復させたかどうか確認するために、ＶＥＧＦ含有培地に抗ＴＩＥ２抗体２Ｆ２を処理し、上と同じウェスタンブロット分析法により、血管内皮細胞の密着連接回復を担当するＶＥＧＦＲとＶＥカドヘリンのリン酸化信号を測定した（図７）。

その結果、新生血管生成を担当するＶＥＧＦ群において、ＶＥＧＦＲのリン酸化が増加し、細胞間密着連接をなすＶＥカドヘリンのリン酸化の増加を確認した。陽性対照群であるＡｎｇ１では、これと逆に、ＶＥＧＦＲとＶＥカドヘリンのリン酸化を阻害させ、これと同様に、２Ｆ２もＶＥＧＦＲとＶＥカドヘリンのリン酸化を阻害させた。このような信号伝達は、抗ＴＩＥ２抗体がＴＩＥ２リン酸化によってＶＥＧＦＲの活性化を阻害させ、阻害したＶＥＧＦＲは、細胞膜で細胞間密着連接を担当するＶＥカドヘリンのリン酸化を阻害させ、細胞間密着連接が回復したと見なされる。結果的に、抗ＴＩＥ２抗体は、血管漏れ現象回復機能及び信号伝達を有する血管安定化剤であることが示唆される。

実施例１２．抗Ｔｉｅ２抗体による細胞間密着連接維持
抗Ｔｉｅ２抗体が血管正常化に影響を及ぼすかどうか確認するために、ＨＵＶＥＣ細胞株を用いて免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）試験を行った。ＩＣＣ用４ウェルチャンバースライドにＨＵＶＥＣ細胞株を８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ濃度で播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間後に１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、１０ｕｇ／ｍＬ抗Ｔｉｅ２抗体（２Ｆ２、４Ｅ２）を分注し、２４時間インキュベーションした。その後、４％ ＰＦＡで１５分間固定後に、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で細胞膜を透過処理（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）し、１０％ ヤギ血清で遮断した。ＰＢＳで洗浄後に、Ａｌｅｘａ－４８８接合抗ＶＥカドヘリン（Ｔｈｅｒｍｏ）を１：２００の濃度で一晩結合させ、１ｎｇ／ｍＬ ＤＡＰＩを１０分間反応させた。その後、ＰＢＳで洗浄し、マウンティング溶液で固定させた後、蛍光顕微鏡で撮影した。

ＶＥカドヘリン発現を観察した結果、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２同時処理群において細胞間密着連接分子であるＶＥカドヘリン発現が減少したことが確認でき、陽性対照群であるＡｎｇ１処理時に連接（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）が回復することが観察できた。抗Ｔｉｅ２抗体（２Ｆ２）を処理した時、陽性対照群のように有意のＶＥカドヘリン発現増加を示し、Ａｎｇ２と併用処理時にＶＥカドヘリン発現増加傾向性を示した。抗Ｔｉｅ２抗体（４Ｅ２）も、陽性対照群のように有意のＶＥカドヘリン発現増加を示し、Ａｎｇ２と併用処理時にも単独処理群と類似のＶＥカドヘリン発現増加レベルを示した（図８）。このことから、抗Ｔｉｅ２抗体（２Ｆ２、４Ｅ２）がＶＥカドヘリン発現を増加させ、結果的に血管正常化させると考えられる。

実施例１３．抗ＴＩＥ２抗体の血管正常化に対するｉｎ ｖｉｖｏテスト
抗ＴＩＥ２抗体の血管正常化機能がｉｎ ｖｉｖｏレベルで見られるかどうか確認するために、ＶＥＧＦ誘発血管漏れ耳モデル（ＶＥＧＦ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｖｅｓｓｅｌ ｌｅａｋａｇｅ ｅａｒ ｍｏｄｅｌ）を用いて、マウスＴｉｅ２と結合力を有する４Ｅ２抗体を用いて抗ＴＩＥ２抗体の活性を確認しようとする。

７週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスの尾静脈に１％エバンスブルー（Ｅｖａｎｓ ｂｌｕｅ）染色薬を注射し、１０分間反応させ、血色を青く染色した。続いて、試験群ネズミの右耳の血管に１０ｍｇ／ｋｇの４Ｅ２を投与し、左耳の血管にＰＢＳを投与した。３０分後にＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，２９３－ＶＥ－０５０）を両耳の血管に投与した。対照群は、左耳の血管にＰＢＳを投与し、右耳にＶＥＧＦを投与した。３０分後、耳を切ってエタノールで２４時間エバンスブルー染色薬を抽出した。その後、マイクロプレートリーダーでＯＤ値を測定した。

その結果、陰性対照群において、ＶＥＧＦによってエバンスブルー染色薬の漏れを確認し、これは、ＰＢＳ群に比べて約２倍増加した漏れレベルを示した。試験群では、４Ｅ２処理群がＶＥＧＦ群に比べて約３０％エバンスブルー染色薬漏れ減少効果を有することが見られた。したがって、本実験から、抗ＴＩＥ２抗体が、ＶＥＧＦによって誘発された血管漏れ現象を、ＴＩＥ２信号伝達を通じて十分に血管を正常化させることができることを確認した（図９）。

実施例１４．抗Ｔｉｅ２抗体の網膜新生血管形成抑制機能評価
抗Ｔｉｅ２抗体の新生血管形成の抑制効能があるかどうか確認するために、レーザー誘発コロイダル血管新生マウス（ｌａｓｅｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｍｏｕｓｅ）モデルにおいて薬効試験を実施した。その効力は、商用薬物であるアフリベルセプト（ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）を対照群にして試験した。マウスをケタミンで全身麻酔させた後、麻酔点眼剤を眼球に点眼してさらに局所痲酔させ、散瞳剤を点眼して散瞳誘導する。マウスを載物台上に載せ、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶを用いてＣＮＶ誘導条件（波長５３２ｎｍ、直径５０μｍ、持続時間８０ｍＳ、電力レベル２００ｍＷ）にしたがってレーザー火傷（ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）を誘導し、ブルック膜（Ｂｒｕｃｈ’ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）を破壊させる。レーザー火傷誘導過程でバブリング（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）が観察されていない病変は、失敗したレーザー火傷（ｕｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）と分類し、Ｇｏｎｇ Ｙ．（Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ，１：１５，２０１５）等が提案した基準を変形した除外基準（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ）に基づき、結果分析及び統計処理過程から除外した。

ＣＮＶ誘導２４時間後、抗Ｔｉｅ２抗体（２０、４０μｇ／ｅｙｅ）と対照薬物アフリベルセプト（２０μｇ／ｅｙｅ）を投与した。これによる血管新生抑制効果を確認するために、ＣＮＶ誘導１０日後にマウスをケタミンで全身麻酔させた後、蛍光造影剤を腹腔注射した。麻酔点眼剤を眼球に点眼してさらに局所麻酔させた後、散瞳剤を点眼して散瞳を誘導した。マウスを載物台上に載せ、Ｍｉｃｒｏｎ－ＩＶの映像カメラ（ｉｍａｇｉｎｇ ｃａｍｅｒａ）で基底部（ｆｕｎｄｕｓ）に映像を合わせた後、当該眼球に潤滑ゲルを点眼した後、ＯＣＴのレンズをマウスの角膜に接触させた。ＦＦＡ／ＯＣＴ撮影を行った後、マウス眼球に抗生剤点眼液を一滴点眼した。ＦＦＡ及びＯＣＴイメージに対する分析は、‘Ｉｍａｇｅ－Ｊ’プログラムを用いて行った。ただし、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した除外基準に該当するＣＮＶ病変は、最終結果及び統計分析過程から除外された。

視神経回復効果を確認するために、網膜電位図（ＥＲＧ）検査を行った。マウスは、ＥＲＧ評価１２時間前から暗室で暗順応を誘導した。評価当日（ＣＮＶ誘導後１１日）に、ロムプン（登録商標）とケタミン（登録商標）で全身麻酔させた後、アルカイン（登録商標）を眼球に点眼してさらに局所痲酔を誘導し、散瞳剤を点眼して散瞳を誘導した。マウスをＥＲＧ載物台上に載せ、ＥＲＧのプローブをそれぞれ、尻尾、頭及び角膜に接触させた。ＥＲＧは、単一フラッシュ刺激（０．９ｌｏｇ ｃｄｓ／ｍ^２（１０ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ／ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ））に対する網膜電位図変化で測定した。ＥＲＧ評価が終了すると、マウス眼球にトブレックスを１滴点眼した。ＥＲＧ分析は、‘ＬａｂＳｃｒｉｂｅＥＲＧ（ｉＷｏｒｘ ＤａｔａＡｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）’プログラムを用いて行った。ただし、Ｇｏｎｇ Ｙ．等が提案した除外基準に該当する眼球は、最終結果及び統計分析過程から除外された。

ＣＮＶマウスモデルに対する抗Ｔｉｅ２抗体の新生血管減少効能結果は、図１０に示した。ＦＦＡ上で観察されたＣＮＶ病変のサイズにおいて、抗Ｔｉｅ２抗体を投与した全ての試験群においてＣＮＶ対照群に比べて統計的に有意な減少が観察され（それぞれ、Ｐ＜０．０００１）、アフリベルセプトを投与した試験群と比較しても、より優れた減少効果を示すことが確認された。図１０ＢにおいてＯＣＴ測定により病変の体積をＣＮＶ対照群と比較したときも、抗Ｔｉｅ２抗体を投与した全ての試験群において統計的に有意に病変の体積を減少させることを確認した（それぞれ、Ｐ＜０．０００１、Ｐ＜０．００１）。また、図１０Ｃで、ｓｃｏｔｏｐｉｃ－ＥＲＧにより網膜電位図をＣＮＶ対照群と比較したとき、アフリベルセプト投与群と同等であり、統計的に有意なＢ波の振幅（Ｂ－ｗａｖｅ ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）の増加が観察された（それぞれ、Ｐ＜０．０００１）。結果的に、ＣＮＶマウスモデルにおいて、抗Ｔｉｅ２抗体は、新生血管形成抑制及び血管漏れ現象抑制の機能を有すると考えられる。

実施例１５．抗Ｔｉｅ２抗体の癌血管正常化機能評価
抗Ｔｉｅ２抗体の癌血管正常化に対する効能を評価するために、抗ＶＥＧＦＲ抗体ＤＣ１０１を対照薬物として用い、自発性膠芽細胞腫マウスモデルにおいて試験を行った。自発性膠芽細胞腫は、ＥＧＦＲ ｖｉｉｉ／ｖｉｉｉルシフェラーゼｆｌ／＋ ｔｄＴｏｍａｔｏ ｆｌ／＋マウスを生後６～７週になった時から週１回ＩＶＩＳ撮影で腫瘍誘発程度を測定する。腫瘍発生は、ＩＶＩＳシグナル輝度（ｓｉｇｎａｌ ｒａｄｉａｎｃｅ）が３．０×１０^４（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃ／ｃｍ^２／ｓｒ）以上であり、且つマウスの脳に局所的に集中した信号が見える場合と定義した。腫瘍発生が確認されたマウスを群分離し、薬物投与前１回、投与中１回、投与終了時点１回の合計３回のＩＶＩＳイメージが撮影され、各撮影の度にシグナル輝度（ｓｉｇｎａｌ ｒａｄｉａｎｃｅ）が記録された。抗Ｔｉｅ２抗体（１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ）と抗ＶＥＧＦＲ抗体（１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ）薬物は、それぞれ、静脈投与で投与され、２週間に週２回の合計で４回容量が投与された。薬物投与前イソフルラン（Ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）呼吸麻酔によってマウスを十分に麻酔させた。ケタミン５２．５ｕＬ＋ロムプン２２．５ｕＬ＋ＰＢＳ ７５ｕＬの混合溶液をＩ．Ｐ．注入してマウスを十分に麻酔させた後、後眼窩静脈（ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｖｅｉｎ）を通じてｌｅｃｔｉｎ－６４９ ２００ｕＬをＩ．Ｖ．注入し、１０分後にマウスをさらに麻酔し、脳を摘出した。既に摘出されたマウス脳から、ＣＤ３１、ＰＤＧＦＲβ染色により血管構造変化及び血管周囲細胞のカバレッジを評価した。

Ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現の高い腫瘍形成部位を中心にＰＥＣＡＭシグナルを観察した結果、ヒトＩｇＧとＤＣ１０１に対比して、４Ｅ２処理群において癌血管の直径が広くなり、曲がり、血管枝が大きく減少する癌血管の外形的特徴が減少した形態が観察された（図１１Ａ）。また、ＰＤＧＦＲβシグナルを観察により、抗Ｔｉｅ２抗体処理群において、ＰＥＣＡＭ染色された部位に対して、概ね、血管付着細胞マーカーであるＰＤＧＦＲβタンパク質がよく付着されることが分かった。これにより、抗Ｔｉｅ２抗体は、血管内皮細胞の異常増殖を抑制し、血管内皮細胞に対する血管周辺細胞の付着を増加させることにより、癌血管の外形を正常化させる機能を有すると見なされる（図１１Ｂ）。

実施例１６．抗Ｔｉｅ２抗体の抗腫瘍効能評価
抗Ｔｉｅ２抗体の抗腫瘍効果及び癌血管正常化による腫瘍内免疫細胞移動増加を確認するために、マウス由来大腸癌細胞株であるＣＴ２６移植ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、抗マウスＰＤ－１抗体と併用投与及び単独投与の試験を行った。ＣＴ２６大腸癌細胞株を移植したマウスの腫瘍サイズを、長軸、短軸及び厚さを、ノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて測定し、同時に体重を測定した。このように測定された腫瘍のサイズを（長軸×短軸×厚さ）／２で計算し、平均で２７．５ｍｍ^３程度に腫瘍マウス群分離をした。その後、抗Ｔｉｅ２抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）、抗マウスＰＤ－１（１０ｍｇ／ｋｇ）の薬物をそれぞれ週１回及び週２回単独投与及び併用投与をした。薬物投与１０日目に、全ての個体に対してＣＯ_２ガスを用いて致死させた後、開腹して臓器の異常有無を肉眼で確認し、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は、化学はかり（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂａｌａｎｃｅ）に重さを測定し、写真撮影後に、腫瘍は、流細胞分析法で腫瘍内免疫細胞であるＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＭＤＳＣを測定し、ホルマリンに固定させた腫瘍は、免疫組織染色法を用いてＣＤ８^＋Ｔ細胞とＭＤＳＣを染色した。

その結果、抗Ｔｉｅ２抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）単独処理群において、約４０％腫瘍抑制効果を示し、抗マウスＰＤ－１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群に比して有意の減少効果を示した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。特に、抗Ｔｉｅ２抗体と抗マウスＰＤ－１抗体の併用投与時に約６４％腫瘍抑制効果を示した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。これに基づき、腫瘍内移動した免疫細胞を流細胞分析法と免疫組織染色法で測定した結果、抗Ｔｉｅ２抗体投与群において、細胞毒性細胞として知らされたＣＤ８^＋Ｔ細胞分布が、陰性対照群に比べて約３倍増加したことが観察され、抗マウスＰＤ－１抗体との併用投与においも、同等な移動量を示した（図１２Ｃ及び図１２Ｄ）。したがって、抗Ｔｉｅ２抗体は、癌血管正常化機能により、腫瘍内に免疫細胞移動を増加させ、抗腫瘍効果を奏すると考えられる。

実施例１７．抗Ｔｉｅ２抗体の低酸素症改善評価
抗Ｔｉｅ２抗体の癌血管正常化による抗腫瘍効能及び腫瘍内低酸素症改善を確認するために、マウス由来大腸癌細胞株であるＣＴ２６移植ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて薬物投与を行った。ＣＴ２６大腸癌細胞株を移植したマウスの腫瘍サイズは、長軸、短軸及び厚さをノギスで測定し、同時に、体重を測定した。このように測定された腫瘍のサイズを（長軸×短軸×厚さ）／２で計算し、平均２４．６ｍｍ^３程度に腫瘍マウス群分離をした。その後、抗Ｔｉｅ２抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、及び対照薬物である抗ＶＥＧＦＲ抗体であるＤＣ１０１（２０ｍｇ／ｋｇ）を、それぞれ、週１回、及び週２回で単独投与した。薬物投与後１０日目に、各群に２匹ずつピモニダゾール（ｐｉｍｏｎｉｄａｚｏｌｅ）をＩＶ投与し、９０分後に全ての個体をＣＯ_２ガスを用いて致死させて開腹し、臓器の異常有無を肉眼で確認し、腫瘍を摘出した。摘出した腫瘍は、化学はかりに重さを測定し、写真撮影後に、腫瘍は流細胞分析法で腫瘍内免疫細胞であるリンパ球（ＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ Ｔ細胞）を測定し、ピモニダゾール投与された腫瘍は、４％ ＰＦＡに固定させた後、免疫組織染色法を用いてｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ染色を行った。

抗Ｔｉｅ２抗体投与群と対照薬物であるＤＣ１０１における腫瘍抑制効果は約３０％と、類似の効能を示し（図１３Ａ，Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．００１）、抗Ｔｉｅ２抗体群において、腫瘍内免疫細胞であるリンパ球が、対照群に比して約２倍増加した（図１３Ｂ，Ｐ＜０．０１）。対照薬物である抗ＶＥＧＦＲ２抗体は、陰性対照群と類似のレベルで腫瘍内免疫細胞移動は測定されなかった。また、ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ染色試験法を用いて低酸素症改善評価を行った結果、抗Ｔｉｅ２抗体投与群において、蛍光染色の発色が、陰性対照群に比べて約４倍減少し（図１３Ｃ，Ｐ＜０．０１）、対照薬物である抗ＶＥＧＦＲ抗体に比べても約２．５倍減少した結果を示した（図１３Ｃ，Ｐ＜０．０１）。したがって、抗Ｔｉｅ２抗体は、癌血管を正常化させる機能により、腫瘍内免疫細胞移動を増加させ、低酸素症を改善させると考えられる。

本発明に係る抗ＴＩＥ２抗体又はその抗原結合断片は、ＴＩＥ２に、目的とする結合力を示し、目的とする癌／腫瘍又は血管安定化剤及び新生血管形成に関連した疾病の予防又は治療に有用に利用可能である。本発明によれば、既存のＴＩＥ２を標的する治療剤とは異なる標的ポイントを有する治療剤を開発することにより、腫瘍及び新生血管形成関連疾病を治療するとき、既存治療剤との併用治療及び単独治療法を提供することができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (14)

1. 配列番号１３の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号１５の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は
   配列番号２５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ２及び配列番号２７の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ２及び配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   を含む、ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片。
2. 配列番号４６の重鎖可変領域及び配列番号４８の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 配列番号５４の重鎖可変領域及び配列番号５６の軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
5. 重鎖可変領域をコードする核酸が、配列番号４５又は５３により表され、そして、軽鎖可変領域をコードする核酸が、配列番号４７又は５５により表される、請求項４に記載の核酸。
6. 請求項４に記載の核酸を含む発現ベクター。
7. 請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
8. 次の段階を含む、ＴＩＥ２に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
   （ａ）請求項７に記載の細胞を培養する段階；及び
   （ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の予防又は治療用組成物。
10. 前記血管新生疾患は、腫瘍、癌、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）、糖尿病性網膜症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、未熟児網膜症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）、角膜移植拒絶反応（ｃｏｒｎｅａｌ ｇｒａｆｔ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、血管新生緑内障（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｇｌａｕｃｏｍａ）、全身紅皮症（ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｓ）、増殖性網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、血友病性股関節炎（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、動脈硬化性プラーク（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）の毛細血管形成、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、傷顆粒化（ｗｏｕｎｄ ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、血管癒着（ｖａｓｃｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、退行性関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、レステノシス（ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、腸狭窄（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）、猫ひっかき病（ｃａｔ ｓｃｒａｔｃｈ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍（ｕｌｃｅｒ）、糖尿病性足部潰瘍（ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｆｏｏｔ Ｕｌｃｅｒｓ）、肝硬変症（ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、腎臓炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、糖尿病性腎臓疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）、慢性腎不全（ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｆａｉｌｕｒｅ）、真性糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ）、炎症疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ）、特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、急性呼吸困難症候群（Ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｔｒｅｓｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）からなる群から選択されたことを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
11. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管安定化用組成物。
12. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む血管新生疾患の診断用組成物。
13. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む腫瘍又は癌の予防又は治療用組成物。
14. 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む、他の治療剤との併用投与用組成物。